DE19713768B4

DE19713768B4 - Herstellung von Betulinsäure

Info

Publication number: DE19713768B4
Application number: DE19713768A
Authority: DE
Inventors: Birgit Prof. Dr. Dräger; Reinhard Prof. Dr. Neubert; Tino Galgon; Wolfgang Prof. Dr. Wohlrab
Original assignee: Martin Luther Universitaet Halle Wittenberg
Current assignee: Boehringer Ingelheim Pharma GmbH and Co KG
Priority date: 1997-04-03
Filing date: 1997-04-03
Publication date: 2006-07-13
Anticipated expiration: 2017-04-04
Also published as: US6175035B1; DE19713768A1; CA2271965A1; US20010038864A1

Abstract

Herstellung von Betulinsäure aus der trockenen pulversierten Borke von Platanus acerifolia, durch Extraktion mit Dichlormethan, Chloroform oder Diethylether als mittelpolare Lösemittel, Einengen der Extrakte und Umkristallisieren der erhaltenen Betulinsäure.

Description

Die Erfindung betrifft die Herstellung von Betulinsäure aus einer anderen Ausgangspflanze als den bisher benutzten und ein Verfahren zu ihrer Herstellung.
Betulinsäure (3b-Hydroxy-lup-20(29)-en-28-säure) ist ein Naturstoff mit einem Triterpengerüst, der in zahlreichen Pflanzen gefunden wurde. Für Betulinsäure wurde 1995 eine spezifische Wirkung gegen das Wachstum von Melanomzellen beschrieben¹, 1996 wurden Amide der Betulinsäure als anti-HIV-Wirkstoffe mit neuartigen Wirkmechanismus beschrieben², damit stieg der Bedarf an Betulinsäure stark an.

Verfahren zur Gewinnung z.B. aus der Rinde von Picramnia pentandra (Simaroubaceae)³, aus der Rinde von Arbutus menziesii (Ericaceae)⁴ oder aus der Rinde von Ziziphus mauritiana (Rhamnaceae)⁵ sind publiziert. Bruckner et al⁶ geben an, aus der Rinde von Platanus acerifolia durch Extraktion mit Methanol eine Substanz isoliert zu haben, die identisch mit Betulinsäure sei, was aus der Ähnlichkeit mit authentischer Betulinsäure gefolgert wurde. Nach dem heutigen Kenntnisstand ist das in Frage zustellen. Zudem wird mit Methanol eine Reihe weiterer Verbindungen mit extrahiert, so dass keine reine Betulinsäure erhalten werden kann.

Jaretzky⁷ beschreibt ein Verfahren, bei dem ein dem Betulin ähnliches Steroid (Platanin) aus der Rinde von Platanus orientalis mit Chloroform extrahiert wird. Aufgrund der angegebenen Summenformel handelt es sich zumindest nicht um reine Betulinsäure, eher um mit Betulinsäure verunreinigte Platanensäure.

Es wurde bereits beschrieben, dass Betulinsäure aus anderen Pflanzen mit Dichlormethan extrahiert wurde ^8–10. Dichlormethan ist jedoch eines von vielen Extraktionsmitteln für Pflanzenmaterial. Nicht jedes Extraktionsmittel ist jedoch gleich gut geeignet, Betulinsäure aus dem Extrakt rein gewinnen zu können.

Die bisherigen Verfahren verwenden entweder schwierig zu beschaffende Ausgangsmaterialien und/oder die Isolierungsverfahren sind aufwendig, weil die Betulinsäure dabei nur im Gemisch mit anderen Stoffen extrahiert werden kann und nur in geringen Anteilen im Gesamtextrakt enthalten ist. Sie muß über mehrere Stufen und mit hohem Aufwand, meist chromatographisch, gereinigt werden. Entsprechend teuer ist die Gewinnung der Betulinsäure.

Der im Patentanspruch 1 angegebenen Erfindung liegt das Problem zugrunde, Betulinsäure aus leichtzugänglichem Pflanzenmaterial mit hohem Betulinsäuregehalt nach einem einfachen Verfahren herzustellen.

Dieses Problem wird gemäß Patentanspruch 1 durch Extraktion von Betulinsäure aus der trockenen pulverisierten Borke von Platanus acerifolia mit Dichlormethan, Chloroform oder Diethylether als mittelpolare Lösemittel, Einengen der Extrakte und Umkristallisieren, vorzugsweise aus Methanol, erhalten. Die Dichlormethanextrakte sind jedoch wenig mit Begleitstoffen kontaminiert. Die mit der Erfindung erzielten Vorteile bestehen darin, dass Platanenborke als Ausgangsstoff leicht zugänglich ist. Die Besonderheit der Bäume besteht darin, dass sich die Borke im Herbst selbständig löst und abfällt, sie nur eingesammelt zu werden braucht. Die Bäume müssen nicht wie bei der Gewinnung anderer Baumrinden oder Borken gefällt werden. Ein Baum von ca. 10 m Höhe liefert jährlich mehrere Kilogramm Borke.

Zudem führt die Erfindung unter anderem durch das günstige Inhaltsstoffgemisch der Platanenborke und durch die Auswahl der Lösemittel mit wenigen Schritten ohne Chromatographie zu einem reinen Produkt, da die erhaltenen Dichlormethanextrakte kaum mit Begleitstoffen kontaminiert sind. Die Lösemittel können zurückgewonnen werden, dadurch ist das Verfahren umweltschonend, schnell und preisgünstig. Das Verfahren ist in einfachen Vorrichtungen in beliebigem Maßstab durchführbar.

Die Betulinsäure ist bereits aus den ersten Extraktionsfraktionen durch Einengen unter Rückgewinnung des Extraktionsmittels auf ca. ein Fünftel ihres Volumens und Kühlen auf unter 10°C in wenig verunreinigter Form erhältlich. Zwei- bis dreimaliges Umkristallisieren aus Methanol führt zu einem reinen, ungefärbten Produkt. Die weiteren Extraktionsfraktionen werden gemäß Patentanspruch 4 bis zur Trockene eingeengt und brauchen nur einmal umkristallisiert zu werden. Zugabe von Salzsäure zur methanolischen liefert Mutterlauge weiter Betulinsäure.

¹ Pisha et al. (1995) Nature Medicine 1, 1046 ff
² Evers et al. (1996) J. Med. Chem. 39, 1056 ff; Soler et al. (1996) J. Med. Chem. 39, 1069 ff
³ Herz et al. (1972) Phytochemistry 11, 3061 ff
⁴ Robinson et al. (1970) Phytochemistry 9, 907 ff
⁵ Chauhan, J. S.; Srivastava, S. K. (1978) Proceedings of the National Academy of Sciences, India, Section A: Physical Sciences 48, 6
⁶ Bruckner, G. Jr.; Kovacs, J.; Koczka, I. (1948) J. Chem. Soc. S. 948 ff.
⁷ Jaretzki, R. Arch. Pharm. 1944, 282, S. 75 ff.
⁸ Rocha et al. (1994) Chem. Abstr. Vol. 121, 1994, Ref. 276720j
⁹ Li et al. (1987) Chem. Abstr. Vol. 197, 1987, ref. 205267s,
¹⁰ Zeng et al. (1986) Chem. Abstr. Vol. 106, 1987, Ref. 72766j

Die Erfindung wird nachstehend anhand eines Ausführungsbeispiels beschrieben:
Die Borke von Platanus acerifolia, die sich selbständig vom Stamm löst, ist bereits relativ trocken. Als Ausgangsmaterial für saubere Extraktionen ist die Borke am besten geeignet, die von der nicht dem Regen zugewandten Seite der Bäume stammt und nicht mit Algen besetzt ist. Kurzes Nachtrocknen (2–8 Tage) der Borke bei Raumtemperatur führt zu einer gut pulverisierbaren Borke. Die Borke wird grob gebrochen und in einer Schlagwerkmühle gemahlen.
Ca. 150 g trockenes Pulver werden in einer Glassäule mit Dichlormethan durch hydrostatischen Druck extrahiert. Es werden etwa 7 Fraktionen von 1 Liter gewonnen. Die Extraktion wird beendet, wenn die Reaktion nach Liebermann- Burchardt nicht mehr positiv ist, das heißt, wenn keine Violettfärbung mehr auftritt.
Die Fraktionen 1–4 werden unter Rückgewinnung des Lösemittels eingeengt auf jeweils ca. 200 ml. Nach einigen Stunden bei –22°C fällt Betulinsäure als voluminöser Niederschlag aus, der gelb gefärbt ist. Aus den Fraktionen 5–7 kann Betulinsäure, nur leicht gelb gefärbt, durch Einengen bis zur Trockne als Pulver gewonnen werden. Alle Fraktionen des Extrakts werden durch Umkristallisieren aus Methanol gereinigt. Dabei wird das Methanol zum Lösen des Niederschlags bis zum Sieden erhitzt und langsam bis auf 4°C abgekühlt. Niederschläge aus den Fraktionen 1–4 benötigen 2–3 Umkristallisationen, bis auch die Mutterlauge farblos ist. Die Rückstände der Fraktionen 5–7 müssen nur einmal umkristallisiert werden.
Schon nach der ersten Kristallisation ist die Betulinsäure aus allen Fraktionen chromatographisch rein (Dünnschichtchromatographie, Gaschromatographie, siehe unten), aber teilweise noch gelb gefärbt. Das Methanol kann durch Destillation zurückgewonnen werden, dadurch ist auch dieser Teil des Verfahrens umwelt- und ressourcenschonend. Die Ausbeute bei der Kristallisation wird erhöht, wenn die Mutterlauge nach Abtrennen des ersten Kristallisates mit wenigen Tropfen HCl versetzt und bei 4°C einige Stunden stehen gelassen wird.
Die Identität der gewonnenen Betulinsäure wird sichergestellt durch dünnschichtchromatographische Analyse und gaschromatographische Analyse sowie durch Massenspektrometrie und 'H-NMR und ¹³C-NMR.

Claims

Herstellung von Betulinsäure aus der trockenen pulversierten Borke von Platanus acerifolia, durch Extraktion mit Dichlormethan, Chloroform oder Diethylether als mittelpolare Lösemittel, Einengen der Extrakte und Umkristallisieren der erhaltenen Betulinsäure.
Herstellung nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch fraktionierte Extraktion.
Herstellung nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass die ersten Extraktionsfraktionen eingeengt und zum Ausfällen der Betulinsäure gekühlt werden.
Herstellung nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass die letzten Fraktionen bis zur Trockne eingeengt werden.
Herstellung nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Betulinsäure aus Methanol umkristallisiert wird.