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Verfahren zur Gewinnung von Ergosterin und Begleitstoffen Die Erfindung
betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Ergosterin und. Begleitstoffen, wie-Hefecerebrin
und. Fettsäuren aus lipoidhalbigen Materialien, vornehmlich aus Hefe.
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Es sind verschiedene Verfahren: zur Gewinnung von Ergosterin aus Hefe
bekannt. Nach dem Verfahren von Windaus und Großkopf (Z. f. physiol. Chemie 12q.,
8, 1522) erhitzt man z.B. Preßhefe mit alkoholischer Kalilauge, verdünnt
mit Wasser und extrahiert das Ergostemin. mit Äther. H e i d u s c h k a und L i
n d n e- r haben dieses Verfahren dahin abgeändert, daß sie die Hefe mit Alkohol
unter Zusatz von alkoholischer Kalilauge verreiben, 6 Stunden kochen und filtrieren.
Der Rückstand wird nachmals mit Alkohol und. Kalilauge ausgekocht, die vereinigten
und eingeengten Filtrate auf o° C abgekühlt, die abgeschiedenen Kristalle filtriert,
die Lauge weiter eingedaimpft und wieder gekühlt und filtriert. Das erhaltene Ro@h,-ergosterin
wird mit Äther extrahiert und aus. Alkohol umkristallisiert.
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Weitere Verfahren sind bekannt, bei denen die Hefe mit wäßrigem Alkali
unter normalem (deutsche Patentschrift 553 915) oder' unter erhöhtem Druck (deutsche
Patentschrift 54911o) verseift und anschließend die Sterine mit einem Fettlösungsmittel
extrahiert werden. Nach, der tschechischen Patentschrift 53 270 werden die
Hefen in Anwesenheit vonAmmoniak oderAmmonsalzen mit Alkohol extrahiert und der
Extrakt wieder zu einer neuen Extraktion verwendet, bis die Sättigungskonzentration
an Ergosterin erreicht
ist und dieses sich zum großen Teil ausscheidet.
Die Mutterlauge wird mit der berechneten Menge Alkali verseift und mit Äther das
Ergosterin extra.-hiert. Bei dem Verfahren nach der USA.-Patentschrift i 842 929
geht man von Lipoiden aus, verseift die Aceton,lösung mit alkoholischem Alkali,
verdünnt die Mischung mit Wasser, kühlt auf -2o° C ab und trennt nach 12 Stunden
das. ausgeschiedene Rohergasterin ab.
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Die bisher bekanntgewordenen Verfahren sind nicht nur umständlich
und zeitraubend, sondern hydrolysieren auch mit wenigen Ausnahmen die gesamte Hefesubstanz
so weitgehend, daß der extrahierte Heferückstand für eine Weiterverwertung nicht
mehr in Frage kommt. Sie beanspruchen außerdem einen erheblichen apparativen Aufwand
zur Verseifung und Extraktion der großen Hefemengen. Außer den hohen Verlusten an
Lösungsmitteln verteuert vor allem der große Bedarf an Alkali und die Anwendung
tiefer Teanperaturen diese Verfahren.. Schließlich. .ist auch die Verwendung des
besonders feuergefährlichen Äthers im Interesse der Betriebssicherheit unerwünscht.
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Das Verfahren beseitigt diese Nachteile und stellt ein überraschend
einfaches und wirtschaftliches Verfahren zur Gewinnung von Ergoeterin neben Hefecerebrin
und Fettsäuren, aufs Lipoiden beliebiger Herkunft dar.
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Besonders vorteilhaft ist das Verfahren, wenn man von Hefe direkt
ausgeht, da der extrahierte Heferückstand mit seinen wertvollen Inha,ltstoffe-n
voll erhalten bleibt und in. verschiedener Weise weiterverarbeitet werden kann.
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Gemäß der Erfindung wird. gemahlene Hefe mit Methylallfhoil heiß extrahiert,
filtriert und der Extrakt auf ein bestimmtes Volumen eingeengt. Der Heferüdzsta:n,d,
wird. mit Methanol ausgewaschen und dieses Waschmethanol zur Extraktion weiterer
Frisahbefe verwendet. Nach Zusatz von wäßrigem Alkali wird der Extrakt 1/2 Stunde
am Rückfluß verseift und, nach Abkühlen auf Zimmertemperatur das hierbei ausgeschiedene
Rohergosterin abfiltriert-Die vom Ergosterin abgetrennte alkohalilsche Lösung wiird
angesäuert und der Alkohol durch Destillation zurückgewonnen:. Dabei scheiden sich.
die Fettsäuren als dickölige Schicht auf der sauern alkoholfreien Seifenlösung fast
quantitativ ab, und. können. abdekantiert werden.
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Das Rohergosterin, das auch das gesamte Hefecerebrin enthält, wird
mit so viel Aceton, Äther oder Chloroform ausgekocht, daß alles Ergoisteirin und.
Cerebrin in Lösung geht, während die Kohlehydrate und andere Verunreinigungen ungelöst
zurückbleiben. Der Aceton-, Äther- oder C'hloroformextrakt-wird nun auf ein solches
Vollumen gebracht, daß das gesamte Ergosterin. darin. bei! 20 bis 30° C gelöst bleibt,
während das Cerebrin, dessen Schwerlöslichkeit in diesen Lösungsmitteln an sich
bekannt ist, beim. Abkühlen, auf diese Temperatur fast quantitativ ausflockt und
aibfltriert werden kann.
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Entscheidend für die Reinheit des Rohergosterinis ist der Wassergehalt
in der methan lischen. Seifenlösung, und zwar ist es um so reiner, je höher der
Wassera,nteill ist, da, bei zu großer Methanodkonzentraxion die Verun:r.einigtingen,
vor allein auch die Alkalisalze derFettsäuren, sich nicht mullständig lösen und
mit ausfallen. Andererseits fällt bei zu hohem Wassergehalt das Ei-gosterin in schleimiger,
schwer filtrierbarer Form an, während, gleichzeitig die absolute Ergosterünaus-beute
absinkt.
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Einen weiteren Einfluß auf die Ausbeute und Reinheit des Rohergosterins
hat die Gesamtmenge des Methano@l-Wasser-Gem'isches. Ist diese Menge zu gering,
erhält man ebenfalls ein sehr wenig konzentriertes Rohergosterin., bei zu großer
Menge aber eine geriinge Ezgoisterinausbeute.
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Die optimale Ergosterinkonzentration, im abfiltrierten Rohergosterini
liegt zwischen 2o bils 35 0/0 bel gleichzeitiger optimaler Ausbeute an E;rgoisterin
bis zu 980/0 des im Extrakt vorhandenen Gesamtergosterins.
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Außerdem :ist zu beachten, daß die Löslichkeitsverhältnisse der Na;
und. K-Seifen ganz verschieden sind. Es ist notwendig, bei Verseifung mit Ätznatron
relativ mehr Methanol einer bestimmten Konzentration als bei Ve:rseifung mit Ätzkali
zu verwenden, um die Seifen in, Lösung zu: halten.
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Unter Berücksichtigung dieser verschiedenen Faktoren hat es sich als
zweckmäßig erwiesen, die Metha:noilmenge und die Methanodkonzentration so zu wählen,
daß bei KOH-Verseifu.ng auf i kg Rohlipo,i,'de (= Meth:anolextrakt - Trockensubstanz)
die drei- bis sechsfache Voilumenmenge 6o büs go%igen, vornehmlich 75 bis go0/aigen
Methylalkohols, bei NaOH-Verseifung die vier- bis zwölffache Menge 6o bis go0/aigen,
vornehmlich 75 bis go°/oigen Methylalkohols kommt. Gegebenenfalls läßt sich. die
günstigste Methanolkonzentration für ein Rohfett sowie die günstigste Menge durch.
Orientierungsversuche schnell ermitteln.
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Besonders, einfach und wirtschaftlich ist das erfindungsgemäße Verfahren
vor allem bei der Ergosteringewinnung aus Hefe direkt, wobei. die extra hierte Hefe
im Gegensatz zu den meist üblichen Verfahren ih ihrer biologischen Zusammensetzung
erhalten bleibt und in verschiedenster Weise weiterverarbeitet werden: kainn., z.
B. als eiweißreiches Futtermittel, als Ausgangsstoff zur Herstellung von technischem
Eiweiß, zur Nucleinsäuregewinnung USW.
Bei!s:p@ie,1 i fos kg lutro Hefe (98,%
Trockengehalt), die 400-9 Ergosterin enthalten, werden in einer Stiftmühle feiest
gemahlen und mit etwa der zehn,farh.en Menge, also iooo 1 9:7,5o/äigem Methanol
ih der Siedehitze unter Rühren 1/2 Stunde gekocht. Der Metha.nolextraktwird bei
65° C abfiltriert und der Heferückstand mit der gleichen Menge siedenden Methanols
nachgewaschen. Das Waschmethanol wird zur Extraktion weiterer Frischhefe verwendet.
Der Methano@lextrakt, welcher 2o 0/0 der Hefetrockensubstanz, dairunter 385 g Ergosterin
enthält, wird auf i6o 1 Gesamtvolumen eingedampft
und nach Zusatz
von 7,2 kg go°/oiger NaOH '/2 Stunde am Rückfluß verseift. Das optimale Verhältrnis
von Rohfett, zu :@Iet'h.anal einer bestimmten Konzentration hat sich hierbei von
selbst eingestellt, und zwar bei dem vorliegenden Endvolumen des Extraktes, der
auf etwa 16% des Ausgangsvolumens eingeengt wurde, beträgt dieses Verhältnis i :
8, wobei die Methanollkonzentrati'oln etwa 85"/o, beträgt. Nach dem Abkühlen auf
Zimmertemperatur wird das ausgefallene Rohergosterin abfiltriert, das nach dem Trocknen
1165 g wiegt und 3509 reines Ergosterin enthält. Das Robergo@steri,n wird
mit insgesamt 491 Aceton heiß ausgezogen, der Aaetanextrakt auf 20° C abgekühlt
und das Hefecerebrin (6o g Trockensubstanz) abfiltriert. Dieses enthält noch etwa
4 g Ergasterin, das durch weitere Acetonreinigung gewonnen werden kann. Das Acetonfiltrat
ergibt nach Einengen durch Umkristallisation nach bekannten. Verfahren 98 bis ioo"/oiiges
Ergosterini.
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Die Mutterlauge der methanolischen Seifenlösung wird auf pH 5 gebracht
und daraus dass restliche Methanol durch: Destillation in einer Rektifiziersäule
zurückgewonnen. Aus der methanolfreien sauren: Seifenlösung sehseiden sich 3 kg
Fettsäuren als Schicht oben ab@. Be isp-iel2 Wie Beispiel i, jedoch wird der Methanolextrakt
auf i 1o 1 eingedampft und mit 10 kg 5o"/oiger Kalilauge verseift. Sonst wie Beispiel
i. Das Verhältnis Rohfett zu Methanol-Wasser beträgt in, diesem Fall i : 5, wobei
das Methanol eine Volumenkonzentration von etwa 85 % angenommen hat. Beispiel 3
1o kg Hefemethanolextrakt (ioo% TrockensubGtanz), welche 2,25 0/0 = 225 g Ergosterin
enthafen, werden m@.it 7o1 87%igem Methanol und 3,61g 5o%iger NaOH versetzt, '/2
Stunde am Rückflußkühler verseift, auf Zimmertemperatur abgekühlt und das Rohergosterin,
welches nach dem Trocknen 74o g wiegt und 213 g Ergosterin enthält, abfiltriert.
Weiterbehandlung analog Beispiel i. Beispiel .4 5 kg Reinlipoidel (ioo% Trockensubstanz),
welche 6°/o = 380 g Ergosterin enthalten, werden mit Zoo 1 85%i:gem Methanol
und 2 kg 5c,%ige,r Na0 H versetzt und '/2 Stunde am Rückfluß verseift. Nach dem
Abkühlen wird das Rohergosterin abfiltriert und getrocknet. Es enthält 340
9 Ergor sterin und wiegt 7809. Reinigung und Kristallisation wie oben.
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Beispi:el5 2 kg acetonlösliche Lipoide, welche bei der Phosphatidi:salierung
aus den Hefelipoiden angefallen sind und 12,5"/o = 250 g Ergosterinenthalten,
werden mit 6o 1 82%igem Methanol und 8oo g 50%iger Na 0 H '/2 Stunde verseift. Man
erhält 44o g Ro@hergosterin, das zu 50% aus Ergossterin besteht. Kristallisation
wie oben.