DE1643864A1 - Verfahren zur Herstellung von Stoffen vom Typ des Ekdysons - Google Patents

Description

Ceskoslovenska akademie ved, Pralia 1, Uarodni 3,

( CSSR )

Verfahren zur Herstellung von Stoffen vom Typ des

Ekdysons

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Stoffen vom Typ des Ekdysons. Ferner einen neuen Stoff dieses Typs.

In letzter Zeit wird der Erforschung der Regulatoren der Lebensvorgänge im Insektenorganismus, d.i. den sogenannten Insektenhormonen, große Aufmerksamkeit gewidmet. Bei ihrer Erforschung gelang es (Butenant A., Karlson P. t If at urforsch. 9b, 389 (1954)), aus dem Insektenkörper das sogenannte Häutungshormon zu isolie-

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ren und dessen chemische Konstitution zu bestimmen. Der Stoff, der einen steroiden Charakter hat, bekam die Bezeichnung Ekdyson (I) (Karlson P., Hoffmeister H., Hoppe V., Ruber R.,; Ann.Chem.662, 1 (1963)j> dies ist ein Derivat des Cholestanols. Die Menge des gewonnenen Produkts ist jedoch äußerst gering, und das Herstellungsverfahren überaus schwierig. Zum Beispiel konnten aus 1000 kg getrockneter Larven des Seidenspinners nur 250 mg reines Ekdyson gewonnen werden.

Gleichzeitig wurde festgestellt, daß im Organismus von Krustentieren (Jasus lalandei) ein dem Ekdyson nahestehender Stoff eine analoge Funktion ausübt, wobei nachgewiesen wurde, daß dieses sogenannte Ekdysteron oder auch "Krustekdyson" (II) das Hydrooxy$derivat des Ekdysons ist (Hampshire F., Horn D.H.S.: Chem. Comm. 1966). Dieser Stoff wurde später auch aus dem Insektenkörper isoliert, d.h. wieder aus der Larve des Seidenspinners, ein Beweis, daß dieser Stoff auch ein Hormon des Insektenorganismus ist (Hocks P., Wiechert R.,: Tetrahedron Letters 2989, (1966)). In letzter Zeit wurden zwei Wege zur Synthese des Ekdysons ausgearbeitet, die jedoch als vielstufige Synthesen lediglich theoretische Bedeutung haben (Sidall J.P., Cross A.D, Pried J.H.: J.Am.Chem. 88, 863 (1966)); (Kerb U., Hocks P., Wiechert R., Furienmeier A., Füret A., Langemann A., Waldvogel Gr.: Tetrahedron Letters

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1387 (1966)). Das Ekdysteron wurde "bisher noch nicht synthetisiert.

Bisher wurde allgemein angenommen, daß die beiden erwähnten Stoffe (Ekdyson und Ekdysteron) endogene Faktoren sind und, wie richtige Hormone, Produkte des Metabolismus von Insekten oder Krustentieren darstellen. Zu dieser Annahme verleitete die Tatsache, daß die Hormone lediglich aus diesen Organismen durch geeignete Methoden gewonnen wurden.

Wie erwähnt, kann jedoch auf diese Weise der erwünschte Stoff nurunter kaum vertretbar großem Aufwand gewonnen werden. Die Erfindung benutzt nun die Erkenntnis (Jizba J., Herout V., Sorm F.: Tetrahedron Letters 1689 (1967)), daß das Ekdysteron in bedeutender Menge in den Wurzelstöcken (Ablegern) des Tüpfelfarns (Polypodium vulgäre L.) enthalten ist und schlägt vor, zur Herstellung von Stoffen vom Typ des Ekdysterons als Ausgangsstoffe Pflanzen aus der Klasse der Farnkräuter (Pteridophyta) zu verwenden. Hierdurch wird die Tatsache, daß Stoffe von der Art der Häutungshormone exogene Faktoren sein könnten, für den praktisch sehr wichtigen Zweck benutzt, daß durch die erfindungsgemäß erzielte leichte Zugänglichkeit der Stoffe die eingehende Erforschung ihrer Wirkung auf völlig neuer Grundlage und in großtechnischem Maßstab durchgeführt werden kann.

Durch die Erfindung wurde in den Wurzelstöcken (AbIe-

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gern) des Tüpfelfarns auch, noch eine weitere, bisher noch nicht beschriebene, dem Ekdyson verwandte Verbindung gefunden (Jizba J,, Herout V., Sonn J.i Tetrahedron Letters 5139 (1967))» und zwar des Hydroxyekdysteron, für das sich auf Grund chemischer und chemisch-physikalischer Daten die Struktur III ergibt und insoweit Stoffschutz beansprucht wird.

Dieser Stoff zeigt ebenfalls die hohe Aktivität des Häutungshormons. Es zeigt sich daraus übrigens ganz allgemein, daß im Pflanzenorganismus metabolische Transformationen von Stoffen stattfinden, die ähnliehen Charakter haben, wie das Bkdyson.

Die Tatsache, daß das Ekdysteron und seine Hydroxyderivate bisher der Aufmerksamkeit entgangen sind, und daß aus Pflanzenmaterial, insbesondere aus dem Tüpfelfarn, dieselben in reiner Form nicht gewonnen wurden, muß damit begründet werden, daß es bisher keine geeigneten Isoliermethoden gab. Auch dieses Problem löst die vorliegende Erfindung.

Erfindungsgemäß besteht das Verfahren zur Gewinnung des Ekdysterons und seiner Hydroxyderivate zunächst darin, daß frische oder getrocknete gemahlene-Wurzel-βίο oke von Tupfelfarn oder dgl. bzw, andere Teile desselben, bis zur Erschöpfung mit Hilfe eines organischen, mit Wasser mischbaren Lösungsmittels (z.B. Methanol,

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Aethanol), oder mit Wasser allein, extrahiert werden, liaeh dem Abdampfen des Iiösungsmittels unter niedrigem Druck (8 - 25 mm Hg) wird das sirupöse Extraktionsprodukt vom lipolden Teil nach Verrühren mit Wasser durch Extraktion mit unpolaren Lösungsmitteln (z.B. Petroläther, Benzol, Chlorofrom) befreit. Der verbleibende wässrige Teil enthält 15 - 20$ Zucker (Glukose, Pruktose und insbesondere Saccharose). Es muß darum eine weitere Konzentration durch Ausschütteln mit einer 8 - 10fachen Menge von Butanol oder mit Hilfe der Chromatographie durchgeführt werden. Ein sehr geeignetes Verfahren ist die Chromatographie auf einer Säule von Polyamidpulver. Eine andereModifikation des Verfahren besteht darin, daß der Extrakt₉ der vom lipophilen Anteil befreit ist, mit etwa einem Drittel oder der Hälfte des Volums mit Methanol verrührt und dann mit Chloroform ausgeschüttelt wird. Der Chloroformextrakt wird wiederum chromategraphiert, und zwar vorteilhaft auf Polyamidpülver. In einem solchen Pail gewinnt man aus den ersten drei Praktionen ein kristallinisches Gemisch von Ekdysteron und seinem Derivat. Man kann auch die begleitenden Zucker durch Vergären mit Hilfe von Gärhefen beseitigen.

Gemäß dieser Methoden, mit Ausnahme der Chloroformextraktion, werden Konzentrate mit einem Gehalt von 25-40$' eines Gemisches der beiden Hormone gewonnen.

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Die Gewinnung der individuellen Stoffe kann durch eine nachfolgende Chromatographie des Kristallisationsgemisoh.es durchgeführt werden, insbesondere auf einer Silikagelsäule. Es wird als erstes Ekdysteron gewonnen; dieses kristallisiert aus Wasser (als Trihydrat, (Schmelzpunkt von 150 - 151⁰C), oder aus Azeton (Schmelzpunkt von 243-247°C). Als zweites Produkt wird Hydroekdysteron mit einem Schmelzpunkt von 244 - 246⁰C (aus Methanol) gewonnen. Diese Stoffe zeigen eine außerordentlich hohe Ekdyson-Aktivität bei Insekten. Ihre Wirkung wurde auf frisch gehäuteten Larven der Baumwanze, Pyrrhocoris apterus und auf larven der Fliege, Calliphora erythrocephala getestet. Mikrokristalle des Stoffes (etwa 50 g), die in die Haemolymphe der Pyrrhocoris apterus implantiert wurden, riefen eine Häutung nach zweieinhalb Tagen hervor, während die normale Häutung erst etwa nach dem 7. Tag eintritt.

Beispiele:

1. Herstellung eines Konzentrats von Stoffen mit Ekdyson-Charakter.

a) Getrocknete und gemahlene Wurzelstöcke von Tüpfelfarn (1000 g) werden bis zur Erschöpfung mit Aethylalkohol extrahiert; das Aethanol wird dann im Vakuum abdestilliert und der sirupöse Rückstand (92 g) mit 400 ml Wasser vermischt. Das Gemisch wird bis zur Erschöpfung mit Petroläther extrahiert und der gewonnene Petrolätheranteil abgestellt. Die verbliebene wässerige Lösung kann direkt auf einer Säule von Polyamidpulver (1000 g)

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Chromatograph!ert werden. Die Elution wird mit Wasser durchgeführt und Fraktionen von 500 ml aufgefangen. Die erste Fraktion enthält hauptsächlich Saccharose j aus der zweiten Fra&ktion wird nach Eindampfen eine kleine Menge eines Gemisches von Ekdysteron mit Hydroekdysteron gewonnen. Das abgesaugte und getrocknete Produkt zeigt einen Schmelzpunkt γόη etwa 235⁰C.

b) Vorteilhafter ist es, den vorgereinigten wässrigen Extrakt des Tüpfelfarns zunächst ai* etwa mit einer gleichen Menge von Methanol zu verdünnen und mit einer gleichen Menge von n-Butanol 5-8 mal auszuschütteln. Nach dem Abdestillieren und Trocknen wird der Butanolextrakt auf einer Säule von Polyamidpulver in analoger Weise wie im Beispiel 1 a chromatograhiert.

c) Anstelle von n-Butanol kann zum Ausschütteln zuerst Chloroform (101) verwendet werden. Nach dem Abdampfen des Chloroforms wird ein Gemisch gewonnen, das durch Chromatographie auf einer Säule von Polyamidpulver in den ersten drei bis vier Fraktionen ein Kristallgemisch beider Hormone ergibt.

d.)Auf andere Weise können die Stoffe vom Zuckercharakter durch Vergären entfernt werden. Zum Beispiel wird die gemäß 1 a verbliebene Mutterlauge nach Abtrennen der Stoffe vom Charakter des Ekdysons aus der chromatographischen Fraktion und eventuell auch aus weiteren, welche noch Zuckeranteile enthalten, auf eine 15 - 20#ige

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Lösung verdünnt, mit 1 g (NH,)₉S0, versetzt und bei 36 O vergoren. Die abfiltrierte Lösung wird eingedampft und von neuem, wie unter 1 a, direkt auf Silikagel chromatographiert, wie weiter unten beschrieben ist.

2. Herstellung von reinem Ekdysteron und Hydroxyekdysteron»

Ein Kristallgemisch von Ekdysteron und Hydroxyekdysteron (5,5g) wird in Azetonlösung auf einer Silikagelsäule (250 g; Wassergehalt 15$) "chromatographiert. Durch einen automatischen Sammler werden Fraktionen von 20 ml abgenommen und der Inhalt sowie die Reinheit des EIuats chromatographisch auf einer dünnen Silikagelschicht (Eluens: Azeton resp. Chloroform - Methanol 9:1) kontrolliert. Bei eineuyfcypisehen Versuch war in den ersten 400 ml Azeton reines Ekdysteron (2,0g) enthalten, das nach dem Umkristallisieren aus Wasser einen Schmelzpunkt von 151⁰O zeigte. Die weiteren Zwischenfraktionen enthalten ein Gemisch beider Stoffe, während in den späteren Fraktionen (im Ganzen 650 ml) reines Hydroxyekdysteron. (0,37g) enthalten war, das nach Kristallisieren aus Methanol einen Schmelzpunkt von 244 - 246⁰O hatte.

- Patentansprüche -

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Claims (11)

Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von Stoffen Tom Typ des Ekdysons "bzw. Ekdysteron, dadurch gekennzeichnet, daß als Ausgangsstoffe Pflanzen aus der Klasse der Farnkräuter (Pteridphyta) verwendet werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zu verwendenden Farnkräuter der Familie des Tüpfelfarns (Polypodiaceae) angehören.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und/oder 2, dadurch f<ekennzeichnet, daß die zu verwendenden Farnkräuter vom Typ Polypodium vulgäre i sind.

4· Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet , daß Teile der Farnkräuter, vorzugsweise die Wurzelstöcke, in frischem oder getrocknetem Zustand gemahlen werden und dann "bis zur Erschöpfung mit Hilfe eines organischen, mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, beispielsweise Methanol oder Aethanol, oder mit Wasser allein, extrahiert werden, sodann das Lösungsmittel unter niedrigem Druck, beispielsweise 8 - 25 mm Hg, abgedampft wird und das sirupöee Extraktionsprodukt vom lipoiden Teil nach Verrühren mit Wasser durch Extraktion mit unpolaren Lösungsmitteln, z.B. Petroläther, Benzol, Chloroform, befreit wird, worauf der erhaltene wässerige Extrakt durch 'Ausschütteln und/oder Chromatographie und/oder Vergären mit Hilfe von Gärhefen,weiter konzentriert wird.

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5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet« daß der wässrige Extrakt zur weiteren Konzentrierung mit einer 8 ~ lOfachen Menge von Butanol ausgeschüttelt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der wässrige Extrakt mit etwa einem Drittel oder einer Hälfte des Volumens mit Methanol verrührt und dann mit Chloroform ausgeschüttelt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 4 und/oder 5 oder 4 und/oder dadurch gekennzeichnet, daß das Endkonzentrat durch Säulenchromatographie auf einer Säule aus Polyamidpulver gewonnen wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7» dadurch gekennzeichnet, daß das Endkonzentrat weiter chromatographisch "behandelt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß eine Silikagelsäule verwendet wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9» dadurch gekennzeichnet.

daß die Endprodukte (Ekdysteron "bzw. Hydroxyekdysteron) durch Umkristallisieren der aus der Chromatographie gewonnen Fraktionen gewonnen werden,

11. Hydroxyekdysterin mit einem Schmelzpunkt von 244 - 246⁰C und einer Struktur gemäß Formel III.

6. Februar 1968/431

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