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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Mittel, welche multiple Medikamentenresistenz
umkehren können, und
insbesondere die Verwendung von Steroid-Alkaloiden als Hemmstoffe
für multiple
Medikamentenresistenz bei Krebserkrankungen und bakteriellen, mykotischen
und parasitären
Infektionen.
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Hintergrund der Erfindung
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Krebschemotherapie
verwendet einen Bereich von cytotoxischen Arzneistoffen, welche
auf schnell teilende Zellen abzielen, und ist eine Hauptbehandlungsart
bei der klinischen Handhabung der Erkrankung. Obwohl eine Chemotherapie
das Überleben
von Krebspatienten über
längere
Sicht verbessert, ist sie jedoch ernsthaft durch die Tatsache eingeschränkt, dass
einige Formen von Krebs intrinsisch auf Chemotherapeutika nicht
ansprechen. Darüber
hinaus resultiert eine Chemotherapie oft in einer darauffolgenden
Entwicklung von Tumoren, welche gegen die meisten herkömmlich verwendeten
cytotoxischen Arzneistoffe resistent sind, was zu einer nicht behandelbaren
und unheilbaren Erkrankung führt.
Es wurde geschätzt,
dass wegen der intrinsischen oder erlangten Medikamentenresistenz
nur etwa 10 % der Patienten, welche eine systemische Chemotherapie
durchlaufen, geheilt werden können.
Zusätzlich
kann eine klinische antibakterielle, antimykotische und antiparasitäre Behandlung
in bakterieller, mykotischer oder parasitärer Resistenz gegenüber Arzneistoffen resultieren.
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Bei
der am häufigsten
auftretenden Form von Medikamentenresistenz weisen Tumorzellen entweder eine
Resistenz gegen multiple strukturell und funktionell nicht verwandte
Arzneistoffe auf oder erlangen diese. Dieses Phänomen, welches als multiple
Medikamentenresistenz (MDR) bezeichnet wird, wird oft durch eine Überexpression
einer Plasmamembran-ATPase, welche P-Glycoprotein (P-gp) genannt
wird, in den multipel medikamentenresistenten Tumorzellen verursacht
(Ling, 1995). P-gp ist ein membrangebundenes 170-kDa-Glycoprotein,
welches das Produkt des MDR1-Gens ist. P-gp wirkt als eine energieabhängige Arzneistoff-Abflusspumpe,
welche den Transport der wirksamen Arzneistoffe nach draußen erhöht und dabei
ihre intrazelluläre
Konzentration erniedrigt und ihre cytotoxische Wirksamkeit verringert.
Zusätzlich
zu P-gp wurden andere Arzneistofftransporter identifiziert, welche
in verschiedenen medikamentenresistenten Tumorzelllinien überexprimiert
werden. Das multiple Medikamentenresistenz-Protein (MRP) (Cole et
al., 1992) steht mit einem multiple Medikamentenresistenz-Phänotyp bei
einer Anzahl von Tumorzelllinien in Verbindung, welche nicht MDR1/P-gp überexprimieren.
Ein Homolog von MRP, welches an der Apikalmembran von polarisierten
Zellen lokalisiert ist, wurde cloniert und MRP2 genannt (Keppler
und Konig, 1997). Kürzlich
wurde gezeigt, dass MRP2 beim Übertragen
von MDR eine Rolle spielt (Koike et al., 1997). Andere kürzlich entdeckte
MDR-Proteine sind das mit Lungenresistenz in Verbindung stehende
Protein (LRP) (Borst et al., 1997) und das Brustkrebs-Resistenzprotein
(BCRP). P-gp, MRP und BCRP sowie bakterielle und mykotische MDR-Proteine
gehören
zur Superfamilie der ATP-Bindungskassetten
(ABC)-Proteine von Arzneistofftransportern und es scheint so, dass
trotz des Aufweisens einer unterschiedlichen Substratspezifität alle wirken,
indem sie den Abfluss von Chemotherapeutika oder ihrer Konjugate
ermöglichen.
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Jetzt
ist jedoch klar, dass P-gp und verwandte ABC-Transporteinrichtungen
nicht die einzigen Determinanten von Medikamentenresistenz sind.
Es scheint, dass MDR-Zellen multiple Strategien erworben haben, um
die letalen Wirkungen von Chemotherapeutika zu überleben, und es wird vorgeschlagen,
dass die unterschiedlichen zellulären Mechanismen, welche zur
Existenz und dem Grad der Kreuzresistenz, die MDR-Zellen zeigen,
beitragen, gleichzeitig wirken. Diese zusätzlichen Mechanismen schließen veränderte zelluläre Pharmakokinetiken
der Arzneistoffaufnahme, erhöhte
metabolische Inaktivierung von Arzneistoffen, erhöhte DNA-Reparatur über Veränderungen
bei der DNA-Topoisomerase-II-Aktivität und Verlust des programmierten Zelltods
ein. Zusammen mit dem beschleunigten Transport von Arzneistoffen
nach draußen,
welcher durch ABC-Transporter vermittelt wird, resultieren diese
Mechanismen in einer starken Abnahme der intrazellulären Arzneistoffakkumulation
und -wirksamkeit.
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Eine
Hemmung von multiplen Medikamentenresistenz-Proteinen kann bei der
Umkehrung des MDR-Phänotyps
von Wert sein. Eine Anzahl von Verbindungen, welche selbst eine
geringe oder keine cytotoxische Wirkung aufweisen, aber den P-gp-
oder MRP-vermittelten Arzneistoffexport hemmen, sind zur Sensibilisierung
von MDR-Zellen für
die cytotoxischen Wirkungen von Chemotherapeutika in der Lage, wodurch
so das Abtöten
von MDR-Zellen ermöglicht
wird. Solche Verbindungen werden unterschiedlich als chemosensibilisierende
Stoffe, MDR-Modulatoren oder MDR-Umkehrmittel bezeichnet. Bekannte
chemosensibilisierende Stoffe schließen Verbindungen von diverser
Struktur und Funktion wie Calciumkanalblocker (z.B. Verapamil), Immunsuppressiva
(z.B. Cyclosporin A), Antibiotika (z.B. Erythromycin), Antimalariamittel
(z.B. Chinin), Phenothiazine (z.B. Fluphenazin) und Kinasehemmstoffe
(z.B. GF120918) (Hegewisch-Becker, 1996) ein. Einige MDR-Umkehrmittel der
,ersten Generation' (z.B.
Verapamil, Cyclosporin A) durchliefen klinische Studien, aber es
wurde gefunden, dass sie bei tolerierbaren Dosen nicht wirksam waren.
Kürzlich
führten
klinische Phase II-Studien mit einem chemosensibilisierenden Stoff
der ,zweiten Generation' (PSC
833) zu im Allgemeinen positiven Ergebnissen und dieser Arzneistoff
wird momentan in einer Phase III-Studie getestet.
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Steroid-Alkaloide
sind von Pflanzen abgeleitete Stickstoff enthaltende Verbindungen
mit einem heterocyclischen Gerüst
mit 21, 24 oder 27 Kohlenstoffatomen. C27-Alkaloide leiten sich
hauptsächlich
von den Solanaceae und den Liliaceae ab und gehören zu drei strukturellen Hauptgruppen:
Solanidane, Spirosolane und Jervane. Solanidane und Spirosolane
sind wirkliche Steroide, wogegen bei Jeranen die Ringe umgelagert sind,
wobei ein C-Nor-D-homo-steroid
gebildet wird (Bruneton, 1995). Anhang A zeigt hier die Struktur
von drei repräsentativen
Steroid-Alkaloiden: Cyclopamin (ein Jervan), Tomatidin (ein Spirosolan)
und Solanidin (ein Solanidan). Eine andere Familie von C-Nor-D-homo-steroiden
umfasst Veratramin, bei welchem der E-Ring offen ist (siehe Formel
hier in Anhang B).
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Steroid-Alkaloide
sind biologisch aktiv. Einige Steroid-Alkaloide weisen teratogene
Aktivität
auf. Cyclopamin, ein Steroid-Hauptalkaloid von Veratrum californicum,
ist ein wirksames Teratogen, wenn es in einem speziellen Embryonenstadium
verabreicht wird (Keeler, 1978). Solanidin, ein Steroid-Alkaloid,
welches in Trieben von Kartoffeln (Solanum tuberosum) hoch angereichert
ist, ist als ein Teratogen weniger wirksam, während das Tomaten (Lycopersicon esculentum)-Alkaloid
Tomatidin keine teratogene Aktivität aufweist (Gaffield und Keeler,
1996).
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EP 0 020 029 betrifft Steroid-Alkaloide,
Arzneimittel, welche die Steroid-Alkaloide umfassen, ein Verfahren
für ihre
Extraktion aus einer Pflanze und die Verwendung davon als ein Chemotherapeutikum.
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WO
99/52534 betrifft die Verwendung von Steroid-Alkaloidderivaten als
Hemmstoffe der Hedgehog-Signalwege und Arzneimittel, welche das
Steroid-Alkaloid enthalten. Weiter beschreibt diese Veröffentlichung
die Verwendung der Steroid-Alkaloidderivate zur Behandlung von neoplastischer
oder hyperplastischer Transformation.
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WO
98/58543 betrifft die Verwendung von steroidähnlichen Glycoalkaloiden, welche
von Pflanzen abgeleitet sind, zur Steigerung des angeborenen Immunitätsverteidigungsmechanismus
bei Wirbeltieren.
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EP 0 361 485 betrifft die
Verwendung von Phenothiazinen und Thioxanthenen (Neuroleptika) zur
Sensibilisierung von MDR-Zellen für Antitumormittel.
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WO
97/27211 betrifft Steroid-Carbamate, ein Arzneimittel, welches sie
enthält,
und die Verwendung davon zur Sensibilisierung von MDR-Krebszellen.
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Obwohl
viele funktionelle Studien verschiedenen Steroid-Alkaloiden einen
großen
Bereich von biochemischen und pharmakologischen Eigenschaften zugeschrieben
haben, gibt es keine früheren
Berichte, welche vorschlagen, dass irgendeine dieser Verbindungen
MDR hemmen kann. Jetzt wurde unerwarteterweise gefunden, dass funktionell
nicht verwandte Steroid-Alkaloide
die gemeinsame Eigenschaft der MDR-Umkehr in Krebszellen teilen.
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Es
ist ein Zweck dieser Erfindung, Steroid-Alkaloide zur Verwendung
als Medikamente zur Hemmung oder Umkehrung von MDR bei Krebserkrankungen
oder bakteriellen, mykotischen oder parasitären Infektionen bereitzustellen.
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Es
ist ein weiterer Zweck der Erfindung, Steroid-Alkaloide zur Verwendung
in Arzneimitteln zur Behandlung von MDR bei Krebserkrankungen oder
bakteriellen, mykotischen oder parasitären Infektionen bereitzustellen.
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Es
ist noch eine andere Aufgabe der Erfindung, Steroid-Alkaloide zur
Verwendung zusammen mit Antikrebs-, antibakteriellen, antimykotischen
oder antiparasitären
Arzneistoffen zur Herstellung von Kombinationsbehandlungsarten bereitzustellen.
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Andere
Aufgaben und Vorteile der Erfindung werden mit dem Fortschreiten
der Beschreibung ersichtlich werden.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Es
wurde nun überraschenderweise
gefunden, und dies ist eine Aufgabe der Erfindung, dass Steroid-Alkaloide
zur Hemmung oder Umkehrung von multipler Medikamentenresistenz bei
menschlichen Krebszellen verwendet werden können. Ähnlich zu multipler Medikamentenresistenz
bei Krebszellen wird auch bakterielle, mykotische und parasitäre multiple
Medikamentenresistenz durch die ABC-Protein-Superfamilie der Arzneistofftransporter
vermittelt.
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Die
Erfindung ist primär
auf die Verwendung von mindestens einem Steroid-Alkaloid oder einem
pharmazeutisch verträglichen
Salz davon bei der Herstellung eines Medikaments zur Hemmung oder
Umkehrung von multipler Medikamentenresistenz bei Krebserkrankungen
oder bakteriellen, mykotischen oder parasitären Infektionen gerichtet.
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Es
ist nicht beabsichtigt, dass die Erfindung in jedweder der hier
beschriebenen Ausführungsformen auf
irgendeine spezielle Verbindung eingeschränkt ist, sondern vielmehr auf
die Gruppe der Steroid-Alkaloide als eine Klasse. Das Steroid-Alkaloid
kann ein Steroid-Alkaloid
aus einer natürlichen
Pflanze sein, entweder extrahiert aus der Pflanze oder hergestellt
durch chemische Synthese, oder ein synthetisches Derivat davon mit
Modifizierungen im Steroidgerüst
wie C-Nor-D-homo-steroide und/oder im nicht-steroidalen Teil des
Moleküls.
Beispiele von solchen Alkaloid-Steroiden schließen Solanidane, Spirosolane,
Jervane und Veratramine ein, sind aber nicht darauf eingeschränkt.
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In
einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform
ist die verwendete Steroid-Verbindung
ein Spirosolan und sie ist bevorzugt Tomatidin (Tomatin).
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In
einer anderen stärker
bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform
ist das Steroid-Alkaloid ein
C-Nor-D-homo-steroid wie zum Beispiel aus der Jervan-Familie, z.B.
Cyclopamin und Derivate davon wie N-Methylcyclopamin, Cyclopamin-4-en-3-on,
Jervin, Tetrahydrojervin und 3-O-Acetyljervin. Die Formeln dieser Jervan-Alkaloid-Steroide
sind hier in Anhang B dargestellt.
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In
einer anderen bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform ist das Steroid-Alkaloid
ein C-Nor-D-homo-steroid der Veratramin-Familie, bei welchem der
E-Ring offen ist, wie Veratramin und Dihydroveratramin (Anhang B).
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Andere
Beispiele von Steroid-Alkaloiden, welche gemäß der Erfindung verwendet werden
können, schließen (+)-Verabenzoamin,
15-O-(2-Methylbutyroyl)germin, 20-Isoveratramin, Angeloylzygadenin,
Germerin, Germanitrin, Germidin, Germin, Maackinin, Neogermbudin,
Peimisin, Rubijervin, Solanidin (Solanin), Solanocapsin, Solasodin
(Solasonin), Veralkamin, Verapatulin, Veratrin (Extraktgemisch),
Veratrosin, Verazin, Verazinin, Vertalin, Verticin, Verussurin,
Verusurinin und Zygadenin ein, sind aber nicht darauf eingeschränkt.
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Die
Erfindung stellt auch ein Steroid-Alkaloid oder ein pharmazeutisch
verträgliches
Salz davon zur Verwendung als ein Medikament bei der Behandlung
von multipler Medikamentenresistenz bei Krebserkrankungen oder bakteriellen,
mykotischen oder parasitären
Infektionen bereit.
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In
einer anderen Ausführungsform
ist die Erfindung auf die Verwendung eines Steroid-Alkaloids und eines
Mittels, welches aus Antikrebswirkstoff, antibakteriellem, antimykotischem
oder antiparasitärem
Mittel ausgewählt
ist, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von multipler
Medikamentenresistenz bei Krebserkrankungen oder bakteriellen, mykotischen
oder parasitären
Infektionen gerichtet.
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Die
Erfindung ist ferner auf die Verwendung einer Kombination eines
Steroid-Alkaloids und eines Antikrebswirkstoffes, antibakteriellen,
antimykotischen oder antiparasitären
Mittels bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von
multipel medikamentenresistenten Krebserkrankungen oder bakteriellen,
mykotischen oder parasitären
Infektionen gerichtet.
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Die
Erfindung beschreibt ferner ein Arzneimittel zur Behandlung von
multipler Medikamentenresistenz, welches als einen Wirkstoff ein
oder mehrere Steroid-Alkaloide oder pharmazeutisch verträgliche Salze
davon zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen
Trägern,
Exzipienten oder Verdünnungsmitteln
umfasst.
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Die
Erfindung beschreibt auch ein Arzneimittel zur Behandlung von multipel
medikamentenresistenten Krebserkrankungen oder bakteriellen, mykotischen
oder parasitären
Infektionen, welches als Wirkstoffe ein Steroid-Alkaloid und einen
Antikrebswirkstoff, ein antibakterielles, antimykotisches bzw. antiparasitäres Mittel oder
pharmazeutisch verträgliche
Salze davon zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen
Trägern,
Exzipienten oder Verdünnungsmitteln
umfasst.
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Die
erfindungsgemäßen Arzneimittel
werden in einer Form formuliert, welche ähnlich zu jedweder Steroid-Behandlung
ist, wie für
orale Verabreichung in der Form von Kapseln, Tabletten und dergleichen,
als Emulsionen oder als Lösungen,
welche für
Infusion oder Injektion, insbesondere für intramuskuläre Injektion,
geeignet sind. Die Mengen des Steroid-Alkaloids in der Zusammensetzung werden
vom Typ und vom Stadium der Erkrankung und dem Zustand und dem Alter
des Patienten abhängen
und werden durch den Arzt bestimmt werden.
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Die
Erfindung betrifft ferner die Verwendung einer wirksamen Menge eines
Steroid-Alkaloids für
die Herstellung eines Medikaments zur Hemmung der Ausbildung von
multipler Medikamentenresistenz oder Umkehrung von multipler Medikamentenresistenz,
welche sich bei einem Krebspatienten nach Unterziehung einer Chemotherapie
ausgebildet hat. Das Steroid-Alkaloid wird die Ausbildung einer
multiplen Medikamentenresistenz hemmen und die Medikamentenresistenz
bei medikamentenresistenten Tumoren verringern, was die Wirkung
von antineoplastischen Arzneistoffen steigert.
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Gemäß dieser
erfindungsgemäßen Ausführungsform
ist das Steroid-Alkaloid zur Verabreichung an den Krebspatienten
in Kombination mit dem Antikrebswirkstoff, entweder vor oder gleichzeitig
mit dem geeigneten Antikrebswirkstoff, geeignet. Jedwedes antineoplastische
Mittel kann in Kombination mit dem Steroid-Alkaloid gemäß dem Tumortyp
und dem gewählten
Chemotherapieprotokoll verwendet werden. Beispiele von solchen antineoplastischen
Mitteln schließen
Adriamycin, Methotrexat, Taxol, 5-Fluoruracyl, Vinblastin, Vincristin,
Mitomycin, Cisplatin und dergleichen ein.
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Die
Erfindung betrifft ferner noch die Verwendung einer wirksamen Menge
eines Steroid-Alkaloids,
gegebenenfalls zusammen mit einem antibakteriellen, antimykotischen
oder antiparasitären
Mittel, zur Herstellung eines Medikaments zur Umkehrung von multipler
Medikamentenresistenz, welche sich bei einem Patienten ausgebildet
hat, der nach dem Unterziehen einer Antibiotika- oder anderen Therapie
an einer bakteriellen, mykotischen oder parasitären Infektion leidet. Das Steroid-Alkaloid
hemmt die Ausbildung von Medikamentenresistenz gegen Bakterien,
Pilze oder Parasiten und verringert die Medikamentenresistenz von
medikamentenresistenten pathogenen Organismen, wodurch die Wirkung
von antibakteriellen, antimykotischen oder antiparasitären Arzneistoffen
gesteigert wird. Das Steroid-Alkaloid kann vor oder gleichzeitig
mit dem antibakteriellen, antimykotischen oder antiparasitären Mittel
verabreicht werden.
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Alle
vorstehenden und anderen Charakteristika und Vorteile der Erfindung
werden ferner durch die folgenden veranschaulichenden und nicht-einschränkenden
Beispiele von bevorzugten Ausführungsformen
davon verstanden.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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Die
vorliegende Erfindung wird durch die detaillierte Beschreibung der
bevorzugten Ausführungsformen
und durch die angefügten
Zeichnungen klarer verstanden, wobei:
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die 1A–1B zeigen,
dass Cyclopamin und Tomatidin die Tetramethylrosaminchlorid (TMR)-Akkumulation
in multipel medikamentenresistenten MCF-7-AdrR-Brustkrebszellen
steigern. Die TMR-Akkumulation wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben,
in MCF-7-AdrR-Zellen,
welche mit den angegebenen Konzentrationen an Verapamil (1A),
Cyclopamin oder Tomatidin (1B) behandelt
wurden, bestimmt. Die Ergebnisse sind als der Mittelwert von Dreifachbestimmungen
aus einem repräsentativen
Experiment ausgedrückt.
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Die 2A–2B zeigen,
dass Cyclopamin MCF-7-AdrR-Zellen für die cytotoxische Wirkung
von Adriamycin empfindlich macht. MCF-7-AdrR-Zellen wurden mit steigenden
Konzentrationen an Adriamycin (2A) und
Cyclopamin (2B) in der Abwesenheit oder
Gegenwart von 10 μM
Cyclopamin bzw. Adriamycin behandelt. Das Überleben der Zellen wurde nach
48 Stunden Inkubation unter Verwendung des MTT-Tests, wie in Beispiel
2 beschrieben, bestimmt. Die Ergebnisse sind als Prozentsatz der
arzneistofffreien Kontrollvertiefungen ausgedrückt und geben den Mittelwert ± S.A.
von Vierfachbestimmungen aus einem repräsentativen Experiment, welches
mindestens zweimal wiederholt wurde, an.
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Die 3A–3B zeigen,
dass Tomatidin MCF-7-AdrR-Zellen für die cytotoxische Wirkung
von Adriamycin empfindlich macht. MCF-7-AdrR-Zellen wurden mit steigenden
Konzentrationen an Adriamycin (3A) und
Tomatidin (3B) in der Abwesenheit oder
Gegenwart von 10 μM
Tomatidin bzw. Adriamycin behandelt. Das Überleben der Zellen wurde nach
48 Stunden Inkubation unter Verwendung des MTT-Tests, wie in Beispiel
2 beschrieben, bestimmt. Die Ergebnisse sind als Prozentsatz der
arzneistofffreien Kontrollvertiefungen ausgedrückt und geben den Mittelwert ± S.A.
von Vierfachbestimmungen aus einem repräsentativen Experiment, welches
mindestens zweimal wiederholt wurde, an.
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4 zeigt,
dass Cyclopamin und Tomatidin MCF-7-AdrR-Zellen für die cytotoxische
Wirkung von Vinblastin empfindlich machen. MCF-7-AdrR-Zellen wurden
mit steigenden Konzentrationen an Vinblastin in der Abwesenheit
oder Gegenwart von 10 μM
Cyclopamin oder Tomatidin behandelt. Das Überleben der Zellen wurde nach
48 Stunden Inkubation unter Verwendung des MTT-Tests, wie in Beispiel
2 beschrieben, bestimmt. Die Ergebnisse sind als Prozentsatz der
arzneistofffreien Kontrollvertiefungen ausgedrückt und geben den Mittelwert ± S.A.
von Vierfachbestimmungen aus einem repräsentativen Experiment, welches
mindestens zweimal wiederholt wurde, an.
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5 zeigt,
dass Jervan-Steroid-Alkaloide und Veratramin MCF-7-AdrR-Zellen für die cytotoxische Wirkung
von Vinblastin empfindlich machen. MCF-7-AdrR-Zellen wurden mit
steigenden Konzentrationen an Vinblastin in der Abwesenheit oder
Gegenwart von 10 μM
Jervan-Steroid-Alkaloid oder 1 μM
Veratramin behandelt. Das Überleben
der Zellen wurde nach 48 Stunden Inkubation unter Verwendung des
MTT-Tests, wie in Beispiel 2 beschrieben, bestimmt. Die Ergebnisse
sind als Prozentsatz der arzneistofffreien Kontrollvertiefungen
ausgedrückt
und geben den Mittelwert von Vierfachbestimmungen aus einem repräsentativen
Experiment, welches mindestens zweimal wiederholt wurde, an.
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Detaillierte
Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen
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Für die Zwecke
von Klarheit und als eine Hilfe beim Verstehen der Erfindung, wie
hier offenbart und beansprucht, werden die folgenden Ausdrücke und
Abkürzungen
nachstehend definiert:
- Steroid-Alkaloid – wie hier, umfasst jedwedes
Steroid-Alkaloid aus einer natürlichen
Pflanze, entweder extrahiert aus der Pflanze oder hergestellt durch
chemische Synthese, sowie synthetische Derivate davon mit Modifizierungen
im Steroidgerüst,
z.B. C-Nor-D-homo-steroide,
und/oder im nicht-steroidalen Teil des Moleküls.
- MDR – multiple
Medikamentenresistenz bei Krebserkrankungen sowie bei bakteriellen,
mykotischen und parasitären
Infektionen.
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Obwohl
nicht beabsichtigt ist, dass die Erfindung auf irgendein Steroid-Alkaloid
oder eine Strukturklasse von Alkaloiden eingeschränkt oder
beschränkt
ist, gibt die folgende Tabelle veranschaulichende Beispiele von
einigen der Verbindungen an, welche innerhalb des Umfangs der Erfindung
eingeschlossen sind. Es muss betont werden, dass diese Liste nur
für den
Zweck von Veranschaulichung und Beispiel ist und die Erfindung in
keiner Weise einschränkt:
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Teilauflistung
von Steroid-Alkaloiden
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Cyclopamin
und andere Veratrum-Steroid-Alkaloide können, wie von Keeler, R.F.
(1969, Phytochemistry 8: 223) beschrieben, erhalten werden; Solanidin
und andere Solanum-Steroid-Alkaloide,
wie von Gaffield, V. und Keeler, R.F. (1996, Chem. Res. Toxicol.
9: 426–433)
beschrieben, und Tomatidin und andere Lycopersicon-Steroid-Alkaloide,
wie von Nagoka et al. (1993, Phytochemistry 34: 1153–57) beschrieben.
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Die
Alkaloid-Steroide der Erfindung können alleine verabreicht werden,
aber im Allgemeinen werden sie als Gemische mit pharmazeutisch verträglichen
Trägern,
Verdünnungsmitteln
oder Exzipienten bereitgestellt. Die Auswahl und die Verwendung
dieser Komponenten werden mit Bezug auf den gewünschten Verabreichungsweg und
gemäß der pharmazeutischen
Standardpraxis gemacht. Wenn für
orale Verabreichung beabsichtigt ist, können sie zum Beispiel als Tabletten
bereitgestellt werden, welche Exzipienten wie Stärke oder Lactose enthalten.
Alternativ können
die Verbindungen der Erfindung als Kapseln, entweder mit oder ohne
die Zugabe der vorstehend erwähnten
Exzipienten, formuliert werden. Die Verbindungen können auch
als Sirupe, Elixiere oder Suspensionen bereitgestellt werden, welche
geeignete farbgebende Stoffe, Geschmackstoffe und Verdickungsmittel
enthalten. Für
die Zwecke von parenteraler Verabreichung (z.B. durch die intravenösen, intramuskulären, subkutanen
oder intradermalen Wege) können
beim bevorzugten Weg bei der Behandlung von Krebs die Verbindungen
als sterile wässrige
Lösungen
bereitgestellt werden, welche für
den Zweck des Erhaltens von Isotonie auch Salze, Zucker, usw. enthalten
können.
Die Alkaloide der Erfindung können
auch für
topische Verabreichung in der Form von Lösungen, Salben, Cremes, Unguenta
und dergleichen durch die Zugabe von geeigneten Trägern, Stabilisatoren
und Verdickungsmitteln bereitgestellt werden. Jeder der vorstehenden
Bereitstellungstypen kann für
die Herstellung von sowohl Arzneimitteln, welche die Steroid-Alkaloide
alleine enthalten, als auch von Kombinationszubereitungen zusammen
mit anderen Mitteln verwendet werden.
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Die
folgenden Beispiele sind aufgeführt,
um die Wirkungen der Verbindungen der Erfindung als Hemmstoffe der
multiplen Medikamentenresistenz bei Krebszellen zu veranschaulichen.
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Beispiele
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Materialien:
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Cyclopamin
und andere Jervan-Steroide wurden freundlicherweise von Dr. William
Gaffield (Western Regional Research Center, Albany, CA) bereitgestellt.
Veratramin ist kommerziell verfügbar.
Tomatidin, Solanidin, Solasodin, Adriamycin, Vinblastin, Verapamil
und (3-[4,5-Dimethylthyazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromid
(MTT) wurden von Sigma (St. Louis, MO) gekauft. Tetramethylrosaminchlorid
(TMR) wurde von Molecular Probes (Eugene, OR) gekauft. Fötales Kälberserum
(FCS) und Antibiotika von Gewebekulturqualität wurden von Biological Industries
(Beth Haemek, Israel) erhalten.
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Zellkultur:
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Menschliche
MCF-7-Brustadenokarzinomzellen und Adriamycin-resistente MCF-7-AdrR-Zellen wurden freundlicherweise
von Dr. Merrill E. Goldsmith (National Cancer Institute, Bethesda,
MD) bereitgestellt. MCF-7- und abgeleitete Zelllinien ließ man gemäß veröffentlichten
Verfahren (Fairchild, C.R. et al., Mol. Pharmacol. 37: 801–809, 1990)
wachsen.
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Beispiel 1
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Wirkung von
Steroid-Alkaloiden in einem in vitro-Arzneistoffaufnahmemodell
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Die
Wirkung von Steroid-Alkaloiden auf den Arzneistofftransport wurde
durch Messen der zellulären Akkumulation
von TMR, ein fluoreszenter Modellarzneistoff, gemäß Eytan
et al. (Eytan, G.D. et al., Eur. J. Biochem. 248: 104–112, 1997)
mit einigen Modifizierungen untersucht. Zellen wurden in Gewebekulturplatten
mit 24 Vertiefungen in einer Dichte von 0,5 × 105 Zellen/Vertiefung
ausgesät,
und man ließ sie
für 24
h in Wachstumsmedium, welches mit 0,5 % FCS ergänzt worden war, wachsen. TMR
(verdünnt
von einer 10 mM Stammlösung
in DMSO) wurde in einer Endkonzentration von 10 μM zu den Zellen in 0,5 ml Wachstumsmedium
in der Gegenwart oder Abwesenheit des getesteten Alkaloids (zugegeben vor
dem Farbstoff, wie angegeben) gegeben. Die Zellen wurden mit TMR
und dem getesteten Arzneistoff für
30 Minuten bei 37°C
inkubiert. Um den Test zu beenden, wurden die Platten auf Eis gegeben
und die Zellen wurden dreimal mit eiskalter Phosphat-gepufferter
Salzlösung
(PBS) gewaschen, um restliches TMR zu entfernen. Die Zellen wurden
dann durch Inkubation mit 0,5 ml 0,5 N NaOH für 20 Minuten bei Raumtemperatur
lysiert und die Lysate wurden mit 0,5 ml 0,5 N HCl neutralisiert
und gesammelt. Cell-assoziiertes TMR wurde durch Messen der Fluoreszenzintensität der Lysate
unter Verwendung eines Fluoreszenzspektrophotometers (Anregung bei
555 nm, Emission bei 575 nm) bestimmt. Leerwerte, welche zum Zeitpunkt
Null erhalten wurden, wurden von allen Fluoreszenzwerten subtrahiert
und die Ergebnisse wurden auf die Menge an zellulärem Protein
in jeder Vertiefung normalisiert. Die Experimente wurden in dreifacher
Ausführung
durchgeführt
und wurden mindestens zweimal wiederholt. Die Ergebnisse sind als
ein Prozentsatz von Inkubationen mit TMR alleine ausgedrückt.
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Eine
Expression von multiplen Medikamenten-Transportern verringert die
Arzneistoffakkumulation in MDR-Zellen beträchtlich. In umgekehrter Weise
wird in solchen Zellen eine Arzneistoffakkumulation durch Hemmung
von P-gp und verwandten Proteinen mit MDR-Umkehrmitteln erhöht. TMR-Akkumulation
wurde verwendet, um die Wirkung von Steroid-Alkaloiden auf P-gp
in menschlichen Adriamycin-resistenten MCF-7-AdrR-Adenokarzinomzellen
zu untersuchen. Vorexperimente zeigten, dass eine Inkubation von MCF-7-AdrR-Zellen
mit TMR in einer Akkumulation von TMR in den Zellen resultiert.
Die TMR-Akkumulation in MCF-7-AdrR-Zellen ist drei- bis sechsmal
niedriger als die der parenteralen MCF-7-Zellen (Daten nicht gezeigt).
MDR-Umkehrmittel (z.B. Verapamil) steigerten die TMR-Akkumulation
zurück
auf beinahe normale Level (1A). Cyclopamin
und Tomatidin verursachten einen konzentrationsabhängigen Anstieg
der TMR-Akkumulation in den MCF-7-AdrR-Zellen (1B).
TMR-Akkumulation wurde maximal durch Cyclopamin und Tomatidin um
das 2- bzw. 2,5-fache stimuliert und war halbmaximal wirksam bei
einer Konzentration von etwa 1 μM.
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Beispiel 2
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Wirkung von
Steroid-Alkaloiden in einem in vitro-Cytotoxizitätstest
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Zellen
wurden in Platten mit 96 Vertiefungen mit einer Dichte von 4 × 103 Zellen/Vertiefung in 0,1 ml arzneistofffreiem
DMEM, welches 5 % fötales
Kälberserum
enthielt, verteilt und bei 37°C
für 48
h inkubiert. Nach dieser Zeit wurden cytotoxische Arzneistoffe (Adriamycin
oder Vinblastin) in die Vertiefungen in den angegebenen Konzentrationen
in der Abwesenheit oder Gegenwart der getesteten Steroid-Alkaloide
gegeben und die Zellen wurden weiter für zusätzliche 48 bis 72 h inkubiert.
Die cytotoxische Wirkung der Arzneistoffe wurde dann unter Verwendung
eines MTT-Zellüberlebensstandardtests
(Hansen, M.B. et al., J. Immunol. Meth. 119: 203–210) bestimmt. Das MTT-Reagenz
(verdünnt
von einer Lösung
mit 5 mg/ml in PBS) wurde in alle Vertiefungen bei einer Endkonzentration
von 0,6 mg/ml gegeben und die Zellen wurden weiter bei 37°C für 2 oder
3 h inkubiert. Die Umsetzung wurde durch Zugeben von 100 μl/Vertiefung
einer Extraktionslösung, welche
aus 20 % (Gew.Vol.) Natriumdodecylsulfat (SDS) in 50 %iger wässriger
Dimethylformamid-Lösung, pH-Wert
4,8 bestand, beendet. Man beließ die
Platten über
Nacht bei Raumtemperatur im Dunkeln, gefolgt von Lesen der Absorption
bei 570 nm unter Verwendung eines ELISA-Plattenlesegerätes. Drei
bis sechs Vertiefungen wurden mit 1 % SDS (Endkonzentration) für 5 Minuten
vor dem Zugeben des MTT-Reagenzes behandelt und die durchschnittlichen
Absorptionswerte, welche von diesen Vertiefungen erhalten wurden,
dienten als Leerwert und wurden von allen anderen Ergebnissen subtrahiert.
Datenpunkte repräsentieren
den Mittelwert ± S.A.
einer Vierfachbestimmung aus einem repräsentativen Experiment, welches
mindestens zweimal wiederholt wurde. Die Ergebnisse sind als ein
Prozentsatz der arzneistofffreien Kontrollvertiefungen ausgedrückt.
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Die
Wirkung der Steroid-Alkaloide auf die TMR-Aufnahme zeigte, dass
sie wirken können,
die cytotoxischen Wirkungen von Arzneistoffen, wie Adriamycin und
Vinblastin, auf MDR-Krebszellen zu erhöhen. Die cytotoxische Wirkung
der Arzneistoffe wurde unter Verwendung des MTT-Tests auf Überlebensfähigkeit
von Zellen, ein Standardtest zur Einschätzung von Medikamentenresistenz
und deren Umkehrung, bewertet. Routinemäßig wurden MCF-7-AdrR-Zellen
steigenden Konzentrationen an Arzneistoffen für 48 h ausgesetzt und die Anzahl
an lebensfähigen
Zellen wurde nach der Zugabe des MTT-Reagenzes quantifiziert. Vorexperimente haben
bestätigt,
dass MCF-7-AdrR-Zellen verglichen mit den parenteralen MCF-7-Zellen
wesentlich weniger empfindlich gegen Adriamycin sind und dass MDR-Umkehrmittel
(z.B. Verapamil) ihre Arzneistoffempfindlichkeit beträchtlich
erhöhen
(Daten nicht gezeigt). Bei einer maximalen Konzentration von 10 μM verringerte
Adriamycin das Überleben
von MCF-7-AdrR-Zellen um nicht mehr als 20 bis 25 % (2A;
leere Kreise). Demgegenüber
resultierte eine Inkubation der Zellen mit steigenden Konzentrationen
an Adriamycin in der Gegenwart einer festen Konzentration an Cyclopamin
(10 μM)
verglichen mit arzneistofffreien Inkubationen (2A, volle
Kreise) in einer dosisabhängigen
nahezu 90 %igen Verringerung der Zelllebensfähigkeit. Cyclopamin alleine
verringerte das Überleben
der Zellen um 10 bis 20 %. Die Abhängigkeit der chemosensibilisierenden
Wirkung von Cyclopamin von seiner Konzentration wurde durch Inkubieren
der Zellen mit einer festen Konzentration an Adriamycin (10 μM) in der
Gegenwart von steigenden Konzentrationen an Cyclopamin bestimmt.
Die Wirkung von Cyclopamin war konzentrationsabhängig. Bei dieser Konzentration
an Adriamycin machte Cyclopamin die Zellen für Adriamycin mit einem EC50-Wert
von 2,5 μM
(2B) empfindlich.
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Eine ähnliche
Reihe von Experimenten wurde mit dem Spirosolanalkaloid Tomatidin
durchgeführt.
Wie in 3 gezeigt, war Adriamycin alleine
relativ unwirksam, sogar bei der maximalen getesteten Konzentration von
10 μM. In
umgekehrter Weise wurde in der Gegenwart von Tomatidin (10 μM) die Zelllebensfähigkeit
um mehr als 90 % verringert. Tomatidin selbst wies eine milde cytotoxische
Wirkung auf die Zellen auf, wobei die Zelllebensfähigkeit
bei einer Konzentration von 10 μM
um 20 bis 25 % verringert wurde. Die sensibilisierende Wirkung von
Tomatidin auf die Adriamycintoxizität war konzentrationsabhängig (3A).
Bei einer Adriamycinkonzentration von 10 μM machte Tomatidin die Zellen
mit einem EC50-Wert von 5 μM empfindlich
(3B).
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Zielgerichtete
Mutagenesestudien zeigten, dass der Transport von unterschiedlichen
Arzneistoffen durch spezifische Mutationen unterschiedlich beeinflusst
werden kann, was darauf hinweist, dass es mehr als eine Arzneistoff-Wechselwirkungsstelle
an dem P-gp-Molekül gibt.
Im Gegensatz zu Adriamycin, welches ein Topoisomerase-II-Hemmstoff
ist, ist Vinblastin ein tubulinaktives antimitotisches Mittel, wobei
es scheint, dass es mit einer unterschiedlichen Stelle am P-gp wechselwirkt.
Es war deshalb wichtig, die Wirkung von Steroid-Alkaloiden auf die
Resistenz von MCF-7-AdrR gegen Vinblastin zu untersuchen.
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Vinblastin
verursachte eine nahezu vollständige,
konzentrationsabhängige
Verringerung der Zelllebensfähigkeit
mit einem LD50-Wert von 200 nM (4).
Cyclopamin (10 μM)
verschob die Vinblastin-Konzentrations-Antwort-Kurve beträchtlich
nach links, was in einem LD50-Wert für Vinblastin
von 8 nM resultierte. Ähnliche
Ergebnisse wurden mit dem Spirosolanalkaloid Tomatidin gesehen,
außer
dass es, wie vorstehend gesehen, selbst eine moderate cytotoxische
Wirkung aufwies und es Vinblastin auf einen LD50-Wert
von 5 nM verschob. Diese Ergebnisse zeigen, dass Steroid-Alkaloide
MDR-Zellen für
strukturell und funktionell verschiedene cytotoxische Arzneistoffe
empfindlich machen können.
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Eine
Anzahl von zusätzlichen
Jervan-Familienmitgliedern und Veratramin (siehe Anhang B hier)
wurden als chemosensibilisirende Mittel bei multipler Medikamentenresistenz
getestet. Die Antwort der multipel medikamentenresistenten MCF-7/AdrR-Brust-Adenokarzinom-zellen
auf die getesteten Mittel wurde unter Verwendung des MTT-Tests auf
Lebensfähigkeit
von Zellen untersucht. So wurde das Überleben von MCF-7/AdrR-Zellen
nach Einwirkenlassen von steigenden Konzentrationen an Vinblastin
in der Abwesenheit oder in der Gegenwart einer festen Konzentration
der getesteten Verbindungen (alle bei 10 μM, außer Veratramin bei 1 μM) getestet,
wie in 5 angegeben. Die Ergebnisse zeigen, dass alle
getesteten C-Nor-D-homo-steroide
bei der Schiebung der Vinblastin-Konzentrations-Antwort-Kurve nach
links wirksam waren und dass strukturelle Modifizierungen des C-Nor-D-homo-steroid-Gerüsts die
pharmakologische Wirksamkeit der Verbindung modifizieren können. Die
wirksamsten Verbindungen waren Cyclopamin-4-en-3-on (leere Dreiecke),
Jervin (leere Kreise) und Tetrahydrojervin (schwarze/weiße Quadrate).
Die Ergebnisse weisen daraufhin, dass Steroid-Alkaloide mit einem tetracyclischen
C-Nor-D-homo-steroid-Gerüst
die Fähigkeit
zur Sensibilisierung von multipel medikamentenresistenten Krebszellen
für cytotoxische
Wirkungen von Chemotherapeutika aufweisen und folglich als MDR-Umkehrmittel
bei Kombinationskrebschemotherapie dienen können.
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Beispiel 3
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In vivo-MDR-Test
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Nach
der Ermittlung der in vitro-Aktivität einer Verbindung als ein
MDR-Modulator ist es wesentlich, seine Umkehrwirksamkeit in einem
Modell eines Tumor-tragenden Tieres zu bewerten. Dieser Test wird
gemäß Watanabe
et al. (Anti-Cancer Drugs 7: 825–832, 1996) durchgeführt. P388-VCR-Zellen
(106) werden durch intraperitoneale Injektionen
(0,1 ml in Salzlösung)
am Tag 0 in BALB/C X DBA/2 (CDF1)-Mäuse eingeimpft.
Die P388-VCR-tragenden
Mäuse (30
Mäuse in
jeder Gruppe) werden mit Kontrollvehikel, Adriamycin, getestetem Steroid-Alkaloid
oder Kombinationen von diesen an den Tagen 1, 5 und 9 behandelt.
Die getesteten Verbindungen werden 1 Stunde vor der Behandlung mit
Adriamycin verabreicht. Das Überleben
der Mäuse
in jeder Gruppe wird täglich
untersucht. Die Antitumorwirkung wird bezogen auf (1) die mittlere Überlebenszeit
der mit Arzneistoff (Adriamycin) behandelten Mausgruppe (T), dividiert
durch die mittlere Überlebenszeit
der Kontrollgruppe (C) [T/C (%)], und (2) die mittlere Überlebenszeit
der mit getesteter Verbindung behandelten Mausgruppe (A), dividiert
durch die mittlere Überlebenszeit
der mit Adriamycin behandelten Gruppe (T) [A/T (%)], bewertet. Das
Experiment wird mindestens dreimal wiederholt.
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Bezugnahmen
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- Bruneton, J. (1995) Terpenoid alkaloids, in "Pharmacognosy, Phytochemistry,
Medicinal Plants",
Heraus., Intercept Ltd., S. 863–878.
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Deeley, R.G. (1992) Overexpression of a transporter gene in a multidrug-resistant
human lung cancer cell line. Science 258: 1650–1654.
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trials designed to overcome the multidrug resistance phenotype.
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- Keeler, R.F. (1978) Cyclopamine and related steroidal alkaloid
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