DE69630974T2

DE69630974T2 - Hyaluronsäurerezeptoren bindende stoffe und deren verwendung zur behandlung von tumoren und restenose

Info

Publication number: DE69630974T2
Application number: DE69630974T
Authority: DE
Inventors: Eva Turley
Original assignee: Jagotec AG
Current assignee: Jagotec AG
Priority date: 1995-12-27
Filing date: 1996-12-23
Publication date: 2004-10-28
Anticipated expiration: 2016-12-24
Also published as: NO982935D0; WO1997024111A2; HUP9902059A3; JP2000506502A; ATE255411T1; EP0874624A2; HU226598B1; CA2166155A1; DE69630974D1; BR9612355A; IL124828A0; KR19990072058A; ZA9610840B; CA2166155C; WO1997024111A3; KR100476782B1; PL327542A1; AU1091297A; JP4210330B2; EP0874624B1

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft neuartige bindende Stoffe zur Behandlung von Krankheiten und durch Rezeptor vermittelnde Behandlung behandelbare Zustände und die Verwendung solcher Stoffe zur Bindung von Rezeptoren an den zu behandelnden Stellen in Körpern von Säugetieren und in einer Anwendung, die Verwendung bei der Behandlung von bösartigen Tumoren im Menschen.
Hintergrund der Erfindung
Die Druckschrift WO 91/04058 der Hyai Pharmaceutical Corporation lehrt die Verwendung von Formen der Hyaluronsäure (HA) in Dosen von mindestens 10 mg, um wirksame Mengen von medizinischen und/oder therapeutischen Stoffen an die Stellen des menschlichen Körpers zu transportieren, die behandelt werden sollen, um das Gewebe an den zu behandelnden Stellen, einschließlich Nabengewebe, durch alle Membranen hindurch in die zu behandelnden Zellen zu durchdringen.
Auf Seite 25, Zeile 17, der PCT-Anmeldung wird als zusätzlicher Vorteil die Verwendung von mindestens ungefähr 200 mg von Formen der Hyaluronsäure (z. B. Natriumhyaluronate) in gemeinsamer Dosierung mit den medizinischen und/oder therapeutischen Stoffen zur Reduzierung der bei der Verabreichung auftretenden Nebenwirkungen der medizinischen und/oder therapeutischen Stoffe (wie z. B. gastro-intestinale Schmerzen, neurologische Anomalien, Depressionen, usw., die normalerweise mit den medizinischen und/oder therapeutischen Stoffen einhergehen) auch für größere Mengen als die normalerweise bei der alleinigen Verabreichung akzeptierten Dosiermengen der medizinischen und/oder therapeutischen Stoffe wie z. B. ein NSAID (nichtsteroidales entzündungshemmendes Agenz), beschrieben.
Die Druckschrift WO 96/06622 der Hyal Pharmaceutical Corporation lehrt die Modulation der Zellaktivitäten des Gewebes und von Zellen, die hoch affinitive Zelloberflächenrezeptoren für Hyaluronsäure ausschütten, durch die Verwendung von Formen der Hyaluronsäure. Diese Zelloberflächenrezeptoren weisen das Adhäsionsmolekül ICAM-1, das Adhäsionsmolekül CD44 und das Adhäsionsmolekül HARLEC (Hyaluronsäurerezeptorenleberendothelzellen) und das Regelmolekül RHAMM (Rezeptor für HA vermittelte Substrate), zur Bindung von Hyaluronan auf. HARLEC wird ausgeschüttet (produziert und auf die Zelloberfläche gebracht) in Leberendothelzellen. Die Verabreichung von hinreichenden Mengen an Formen der Hyaluronsäure zur Bindung mit Zelloberflächenrezeptoren verändert die Zellaktivität von Geweben und/oder Zellen im menschlichen Körper, die solche hoch affinitiven Zelloberflächenrezeptoren für Hyaluronsäure (wie z. B. ein Adhäsions- oder Regulatormolekül) ausschütten.
Einer der Gründe, warum Hyaluronsäure in der Lage ist, medizinische und/oder therapeutische Stoffe zu transportieren ist die selektive Bindung an die Zelloberflächenrezeptoren.
Der Körper hat mindestens 10²⁸ unterschiedliche Kombinationen von Aminosäuren (siehe Identification of Recognition Sequences of Adhesion Molecules Using Phage Display Technology, O'Neil, Karyn T., et al; Methods in Enzymology, Vol. 245, (1994), 370–386). Wenn als Form der Hyaluronsäure Natriumhyaluronate (HA) als Köder in den Körper eingebracht werden, kombinieren nur 2 Kombinationen der gesamten mindestens 10²⁸ Kombinationen von Aminosäuren mit dem HA. Diese beiden Kombinationen sind hoch spezifisch für HA.

1. Die erste schließt die Verwendung der Aminosäuresequenz wie folgt ein:

Einzelbuchstabencode: STMMSRSHKTRSHHV

Dreibuchstabencode: Ser-Thr-Met-Met-Ser-Arg-Ser-His-Lys-Thr-Arg-Ser-His-His-Val

Die unterstrichenen Teile sind die Basisaminosäuremuster für HA bindende Proteine (RHAMM, ICAM-1, CD44, HARLEC usw.) Die unterstrichenen Abschnitte sind die Bindungsdomänen.
2. Die zweite Serie von Aminosäurebindungsdomänen wird in einer zweiten Aminosäuresequenz gefunden, diese ist:

Einzelbuchstabencode: TMTRPHFHKRQLVLS

Dreibuchstabencode: Thr-Met-Thr-Arg-Pro-His-Phe-His-Lys-Arg-Gln-Leu-Val-Leu-Ser

Diese Aminosäure hat eine schmalere Bindungsdomäne. Diese Bindungsdomäne ist für den Kern. Diese schmalere Bindungsdomäne bindet auch das HA-Bindungsprotein RHAMM, welches der einzige HA-Rezeptor ist, der zum Kern wandert.

Die Buchstaben repräsentieren jeweils unterschiedliche Aminosäuren wie sie in der nachfolgenden Tabelle aufgeschlüsselt werden:
Die 20 Aminosäuren in Proteinen
Der Hinweis darauf, daß die oben genannten Muster die HA-Bindungsdomänen darstellen, ist in dem Artikel „Identification of a common hyaluronan binding motif in the hyaluronan binding proteins RHAMM, CD44 and link protein", The EMBO Journal, Vol. 13, No. 2 (1994) pp. 286–296 zu finden.
Durch Tests wurde herausgefunden, daß ein anderes Molekül PIP-2 (Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat), wovon Phosphoinositol-4,5-bis-phosphat ein Protein ist, spezifisch an dieselben Bindungsdomänen bindet. PIP2 hat die folgende Strukturformel:
worin der unten gezeigte Abschnitt der aktive Abschnitt ist:
Es ist bekannt, daß RHAMM HA bindet. Bei der Durchführung der Tests wurde entdeckt, daß RHAMM gleichfalls PIP2 bindet. Wenn ein Überschuß von PIP2 eingesetzt wird, verdrängt dieses HA. RHAMM ist ein sehr wichtiger Rezeptor dahingehend, daß er zur Tumorgenesis und Restenose und andere Stufen der Reparatur hochgeregelt wird. Darum sind PIP2 und HA wichtig in diesem Zusammenhang. HA wurde erfolgreich mit seiner Fähigkeit zur selektiven Bindung an Zelloberflächenrezeptoren (einschließlich RHAMM) zum Transport von Medikamenten an Stellen, die erkrankt sind oder der Behandlung bedürfen, eingesetzt. Aus diesen Gründen kann PIP2 zur Behandlung derselben Zustände und Erkrankungen, die auch mit HA behandelt wurden eingesetzt werden (sowohl allein oder in Kombination mit medizinischen und/oder therapeutischen Stoffen). Da PIP2 ein kleineres Molekül ist, kann PIP2 oder jede andere Verbindung, die PIP2 oder HA imitiert und jedes analoge, homologe Derivat, Komplex usw. der oder das HA und PIP2 imitiert effizient und einfacher eingesetzt werden. Diese Verbindungen können neue, synthetische oder gereinigte natürliche Verbindungen (wie sie in ihrer ungereinigten Form in der Natur gefunden werden) sein.
Es ist deshalb eine Aufgabe der Erfindung neue bindende Stoffe bereitzustellen.
Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung neue Behandlungsmethoden unter Verwendung der neuen bindenden Stoffe zur Behandlung von Erkrankungen und Zuständen in behandlungsbedürftigen Körpern von Säugetieren, die durch Rezeptor vermittelte Behandlung zur Bindung mit Rezeptoren behandelbar sind, wie z. B. die Behandlung von Restenose, bereitzustellen.
Weitere und andere Aufgaben der Erfindung werden durch den Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung aus der folgenden Zusammenfassung der Erfindung und der detaillierten Beschreibung der Beispiele erkannt.
Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung wird die Verwendung von bindenden Stoffen (andere als Hyaluron, pharmazeutisch annehmbare Salze davon oder andere Formen der Hyaluronsäure), welche ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus:

(i)
worin entweder
(a) R₁ und R₂ eine Brücke bilden, die ein geschlossenes Ringmolekül bildet; oder
(b) R₁ und R₂ nicht miteinander verbunden sind und jeweils R₁ und R₂ ein niedriges Alkyl sind und
(ii) ein bindender Stoff der Phosphoinositol-4,5-bisphosphat als aktives Protein beinhaltet, in der Herstellung von Medikamenten zur Behandlung von oder zur Prävention von bösartigen Tumoren oder Restenose, wobei der bindende Stoff an die erkrankten Stellen oder Zustände mit mindestens einer der Gruppen der Bindungsdomänen ausgewählt aus:
(a) RSHKTRSHH (Einzelbuchstabencode der Aminosäuren) auch identifiziert als: Arg-Ser-His-Lys-Thr-Arg-Ser-His-His (Dreibuchstabencode der Aminosäuren) auch codiert als: CGC-TCG-CAC-AAG-ACC-AGG-TCG-CAC-CAC
(b) RPHFHKR (Einzelbuchstabencode der Aminosäuren) auch identifiziert als Arg-Pro-His-Phe-His-Lys-Arg (Dreibuchstabencode der Aminosäuren) auch codiert als CGC-CCC-CAC-TTC-CAC-AAG-CGG binden, gezeigt.

Das Medikament kann eine hinreichende Menge an bindendem Stoff aufweisen. Der bindende Stoff kann mit medizinischen und/oder therapeutischen Substanzen gemischt werden.
Einer dieser bindenden Stoffe ist der aktive Abschnitt Phosphoinositol-4,5-bisphosphat des PIP2. Der bindende Stoff kann mit medizinischen und/oder therapeutischen Substanzen gemischt werden. Da der neue bindende Stoff an die oben beschriebenen Bindungsdomänen bindet, an welche auch Hyaluronan bindet, kann die Erfindung für jede Rezeptor vermittelte Behandlung, in der auch Hyaluronan einsetzbar ist, eingesetzt werden. Die Erfindung betrifft bindende Stoffe, die Hyaluronan ersetzen. Daher kann die Erfindung zur Restenoseprävention und anderen Behandlungen in derselben Art und Weise eingesetzt werden wie Hyaluronan. Daher kann die Erfindung zur selben Behandlung und Präventionstherapie eingesetzt werden wie sie in den folgenden veröffentlichten und unveröffentlichten Dokumenten einschließlich des kanadischen Patents Nr. 2,164,260 eingereicht beim kanadischen Patentamt am 01. Dezember 1995 mit dem Titel „Targeting of Dosage of Medicines and Therapeutic Agents" und des kanadischen Patents 2,173,037 eingereicht am 29. März 1996 mit dem Titel „Targeting of Dosages of Medicines and Therapeutic Agents and other Glycosaminoglycans (GAGS)" und den internationalen Veröffentlichungen
WO 91/04058
WO 93/16732
WO 93/16733
WO 94/07505
WO 94/23725
WO 95/29683
WO 95/26193
WO 95/30423
WO 96/15845
WO 96/06622
diskutiert werden. Mit Bezug auf jedes einzelne Dokument können die Formen von Hyaluronan z. B. durch andere bindende Stoffe wie sie hierin beschrieben werden ersetzt werden und in gleicher Weise eingesetzt werden.
Als Beispiel wurden aus der WO 91/04058 die folgenden Auszüge zur Darstellung nur einiger Einsatzmöglichkeiten ausgewählt:

(i) auf Seite 17, Zeile 3 bis Seite 18, Zeile 16: "Die Anmelder haben nun herausgefunden, daß Zusammensetzungen zur Verabreichung an ein Säugetier (z. B. ein injizierbares Arzneimittel) zur Behandlung einer Krankheit oder eines Zustandes bereitgestellt werden können, welche je nach Bedarf eine therapeutisch wirksame, nicht toxische Menge eines Arznei- und/oder therapeutischen Wirkstoffes zur Behandlung von Krankheiten oder Zuständen enthalten oder verwenden (beispielsweise einen freien Radikalfänger (z. B. Ascorbinsäure (Vitamin C), Vitamin C (zur Behandlung der Mononukleose), ein Antikrebsmittel, ein Chemotherapeutikum, antivirale Mittel beispielsweise nicht-ionische Detergenzien, z. B. das Nonoxynol-9 [Nonylphenoxypolyethoxyethanol] aus dem Verhütungsschaum Delfen^TM, anionische Detergenzien (z. B. Cetylpyridiniumchlorid) und kationische Detergenzien (z. B. Benzalkoniumchlorid), nicht steroidale Entzündungshemmer (NSAID) beispielsweise Indomethacin, Naproxen und das Ketorolac minus (+/–) minus Tromethaminsalz (vertrieben unter der Marke Toradol^TM) und steroidale Entzündungshemmer, ein Mittel gegen Pilzbefall, Entgiftungsmittel (beispielsweise zur rektalen Applikation in einem Klistier), ein Analgeticum, ein Bronchodilator, ein Mittel gegen bakterielle Infektionen, Antibiotika, Wirkstoffe zur Behandlung der vaskulären Ischämie (beispielsweise Diabetes und die Berger'sche Krankheit), ein Mittel mit einem monoklonalen Antikörper, Minoxidil zur topischen Verabreichung für den Haarwuchs, Diuretika (beispielsweise Furosemid (vertrieben unter der Marke Lasix^TM)), Immunsuppressiva (beispielsweise Cyclosporine), Lymophokine (wie Interleukin 2 und dergleichen), Alpha- und Beta-Interferon und dergleichen), die in einer ausreichenden Menge an Hyaluronsäure und/oder deren Salze (z. B. das Natriumsalz) und/oder deren Homologe, Analoge, Derivate, Komplexe, Ester, Fragmente und/oder Hyaluronsäureuntereinheiten (vorzugsweise Hyaluronsäure und Salze derselben) verabreicht oder von dieser getragen werden, um die Penetration des Mittels durch das Gewebe (einschließlich Nabengewebe) zu der zu behandelnden Stelle durch die Zellmembran in die einzelnen zu behandelnden Zellen hinein zu erleichtern. Bei Verabreichung dieser Arzneimittel an an Krankheiten oder an Zuständen leidenden Patienten bessert sich die Krankheit oder der Zustand auf unerwartete Weise. Die Arzneimittel können unter anderem intravenös, intraarteriell, intraperitoneal, intrapleural, transdermal, auf der Haut (topisch), rektal, oral oder mittels direkter Injektion (beispielsweise in einen Tumor, einen Abszeß oder einen vergleichbaren Krankheitsherd hinein) verabreicht werden oder sie können auf ein auf der Haut des Patienten zu befestigendes Kissen aufgebracht werden. Die Hyaluronsäure und/oder deren Salze sowie das Mittel können getrennt voneinander verabreicht werden, sie werden aber in zur Behandlung der Krankheit oder des Zustandes ausreichender Menge und in einem Schwung oder in Intervallen (vorzugsweise miteinander und stärker bevorzugt gleichzeitig) vorzugsweise an der gleichen Stelle (z. B. eines intravenös das andere „Huckepack") gegeben."
(ii) auf Seite 25, Zeile 18 bis Seite 26, Zeile 14: „Daher und gemäß eines weiteren Aspekts der Erfindung treten bei der Gabe von einem NSAID beispielsweise Indomethacin (gelöst in n-Methylglucamin) oder einem anderen NSAID mit mehr als 200 mg Hyaluronsäure auf 1 bis 2 mg NSAID pro kg Körpergewicht (in einem Fall Indomethacin und NMG), keine wesentlichen toxischen Nebenwirkungen wie gastro-intestinale Beschwerden, neurologische Anomalien, Depressionen und so weiter auf, sogar bei gesteigerten Mengen an Indomethacin (falls notwendig) nicht. Wird die Hyaluronsäuremenge unter diese Menge gesenkt, treten die üblichen Nebenwirkungen wieder auf. Des weiteren sind die beobachteten Reaktionen bei Kombinationen des NSAID (z. B. Indocid^TM) mit Hyaluronsäure besser, was klar belegt, daß die Kombination nur auf das pathologische Gewebe gerichtet ist, und dies auch dann, wenn sie auf systemischem Weg intravenös verabreicht wird. Es ist daher beobachtet worden, daß Patienten mit neoplastischen Erkrankungen dann, wenn sie zusätzlich zu anderen Chemikalien (z. B. Ascorbinsäure (Vitamin C), Phloretin und Antikrebsmitteln) 50 bis 200 mg NSAID – Hyaluronsäure (Natriumhyaluronat) (z. B. Indomethacin und Hyaluronsäure) erhielten, eine drastische und sofortige Befreiung von Schmerzen erlebten. An diese schließt sich innerhalb kurzer Zeit die Auflösung und Resorption der neoplastischen Läsionen unter Verbesserung der Lungen- und Leberfunktionen an, wenn ein Tumor dieser Organe vorhanden ist. Das tote Tumormaterial, dessen Bruchstücke und die Tumorgifte scheinen also vom Körper über Macrophagenaktivität besser eliminiert zu werden, wobei deren Aktivität durch die Gabe von NSAID (oder einem steroidalen Entzündungshemmer), verabreicht mit Hyaluronsäure (oder einem Salz oder einer anderen Form dieser), verstärkt ist. Daher nehmen die Anmelder an, daß die Gabe von NSAID z. B. mit Hyaluronsäure (Natriumhyaluronat) die Blockage der Macrophagen aufhebt, indem sie die enzymatische Produktion der Prostaglandinsynthetase, die die Macrophagen hemmt, unterbindet. Deswegen verstärkt Hyaluronsäure (sowie Salze und andere Formen) nicht nur die Effekte von NSAID, sondern verringert auch die Nebenwirkungen und die Toxizität, die mit der Verwendung von Prostaglandinsyntheseinhibitoren verknüpft ist. Beispiele für die Verwendung als Chemotherapeutikum geeigneter Mittel sind Novatron (Mitoxantron), Methotrexat, 5-FU (5-Fluouracil), Carboplatin, oral verabreichtes Methyl CCNU und Mitomycin C."
(iii) auf Seite 26, Zeilen 32 bis 37: „Hyaluronsäure und ihre Salze können in unterschiedlichen Dosierungen – 10 bis 1000 mg auf 70 kg Körpergewicht – eingesetzt werden, wobei die optimalen Dosierungen tendenziell zwischen 50 und 350 mg pro 70 kg Körpergewicht liegen. Da sie nicht giftig ist, kann Hyaluronsäure offensichtlich ohne nachteilige Wirkung in überschüssigen Dosen (z. B. 3000 mg auf 70 kg Körpergewicht) verabreicht werden."
(iv) auf Seite 29, Zeile 27 bis Seite 33, Zeile 31: „Eine Form der Hyaluronsäure und/oder deren Salze (z. B. das Natriumsalz) sowie Homologe, Analoge, Derivate, Komplexe, Ester, Fragmente und Untereinheiten der Hyaluronsäure, vorzugsweise der Hyaluronsäure und deren Salze, die für die Erfindung geeignet ist, ist die von Sterivet Laboratories Ltd. vertriebene Fraktion. Bei einer solchen Fraktion handelt es sich um ein 15 ml-Gefäß mit Natriumhyaluronat 20 mg/ml (300 mg/Gefäß – Charge 2F3). Diese Natriumhyaluronatfraktion ist eine 2%ige Lösung mit einem mittleren durchschnittlichen Molekulargewicht von 225000. Die Fraktion enthält außerdem Wasser q. s., welches dreifach destilliert und gemäß der U.S.P. für Injektionszubereitungen steril ist. Die Hyaluronsäure und/oder deren Salze können in einem mit einem Butylstopfen, der nicht mit dem Gefäßinhalt reagiert, verschlossenen Gefäß aus Borosilikatglas transportiert werden."

Die Fraktion der Hyaluronsäure und/oder deren Salze (z. B. das Natriumsalz) sowie Homologe, Analoge, Derivate, Komplexe, Ester, Fragmente und Untereinheiten der Hyaluronsäure, vorzugsweise der Hyaluronsäure und deren Salze, kann Hyaluronsäuren und/oder deren Salze mit den folgenden Eigenschaften enthalten:
Eine gereinigte, im wesentlichen pyrogenfreie Fraktion einer Hyaluronsäure aus einer natürlichen Quelle mit mindestens einer der Eigenschaften der Gruppe bestehend aus:

i) ein Molekulargewicht im Bereich von 150000 bis 225000
ii) weniger als 1,25% sulphatierte Mucopolysaccharide auf Basis des Gesamtgewichts,
iii) weniger als 0,6% Protein bezogen auf das Gesamtgewicht,
iv) weniger als etwa 150 ppm Eisen bezogen auf das Gesamtgewicht,
v) weniger als etwa 15 ppm Blei bezogen auf das Gesamtgewicht,
vi) weniger als 0,0025% Glucosamine,
vii) weniger als 0,025% Glucuronsäure,
viii) weniger als 0,025% N-Acetylglucosamin
ix) weniger als 0,0025% Aminosäuren,
x) einen UV-Extinktionskoeffizienten von weniger als 0,275 bei 257 nm,
xi) einen UV-Extinktionskoeffizienten von weniger als 0,25 bei 280 nm und
xii) einen pH-Wert im Bereich von 7,3 bis 7,9.

Vorzugsweise wird die Hyaluronsäure mit Wasser gemischt; die Fraktion der Hyaluronsäure hat vorzugsweise ein mittleres durchschnittliches Molekulargewicht im Bereich von 150000 bis 225000. Stärker bevorzugt weist die Hyaluronsäurefraktion mindestens eine Eigenschaft auf, die aus der aus den folgenden Eigenschaften bestehenden Gruppe ausgewählt ist:

i) weniger als 1% sulphatierte Mucopolysaccharide auf Basis des Gesamtgewichts,
ii) weniger als 0,4% Protein bezogen auf das Gesamtgewicht,
iii) weniger als etwa 100 ppm Eisen bezogen auf das Gesamtgewicht,
iv) weniger als etwa 10 ppm Blei bezogen auf das Gesamtgewicht,
v) weniger als 0,00166% Glucosamin,
vi) weniger als 0,0166% Glucoronsäure,
vii) weniger als 0,0166% N-Acetylglucosamin,
viii) weniger als 0,00166% Aminosäure;
ix) einen UV-Extinktionskoeffizienten von weniger als etwa 0,23 bei 257 nm,
x) einen UV-Extinktionskoeffizienten von weniger als 0,19 bei 280 nm und
xi) einen pH-Wert im Bereich von 7,5 bis 7,7.

Andere Formen der Hyaluronsäure und/oder deren Salze sowie Homologe, Derivate, Komplexe, Estern, Fragmente und Untereinheiten der Hyaluronsäure können von anderen Händlern bezogen werden, beispielsweise von den in den oben erwähnten Dokumenten des Standes der Technik genannten. Außerdem haben die Anmelder das von der LifeCore^TM Biomedical, Inc. hergestellte und vertriebene Natriumhyaluronat mit Erfolg verwendet, welches die folgenden Eigenschaften aufweist:

Eigenschaft	Spezifikation
Erscheinungsbild	weiß bis cremefarben gefärbtes Teilchen
Geruch	kein wahrnehmbarer Geruch
mittleres Molekulargewicht nach	< 750.000 Dalton
Viskosität
UV/VIS-Spektrum, 190–820 nm	stimmt mit dem Referenzspektrum überein
OD, 260 nm	< 0,25 Einheiten der optischen Dichte
Hyaluronidaseempfindlichkeit	positive Reaktion
IR-Spektrum	stimmt mit Referenz überein
pH, 10 mg/g Lösung	6,2–7,8
Wasser	max. 8%
Protein	< 0,3 μg/mg NaHy
Acetat	< 10,0 μg/mg NaHy

Schwermetalle, maximale ppm

Mikrobielle Biobelastung	nicht beobachtet
Endotoxin	< 0,07 EU/mg NaHy
Test auf biologische Sicherheit	besteht den Toxizitätstest am Kaninchenauge

Die folgenden Literaturstellen offenbaren Hyaluronsäuren, Quellen derselben sowie Verfahren zu ihrer Herstellung und Wiedergewinnung.
US-A-4,141,973 offenbart Hyaluronsäurefraktionen (die Natriumsalze enthalten) mit:

„(a) einem mittleren Molekulargewicht von mehr als 750.000, vorzugsweise von mehr als 1.200.000, das heißt einer Grenzviskositätszahl von über etwa 1.400 ccm/g und vorzugsweise von über etwa 2.000 ccm/g;
(b) einem Proteingehalt von unter 0,5 Gew.-%;
(c) einer UV-Absorption einer 1%igen Natriumhyaluronat-Lösung von unter 3,0 bei einer Wellenlänge von 257 nm und unter 2,0 bei 280 nm;
(d) einer kinematischen Viskosität einer 1%igen Natriumhyaluronat-Lösung in einem physiologischen Puffer von über etwa 1000 cSt, vorzugsweise über etwa 10000 cSt;
(e) einer bei 220 nm gemessenen molaren optischen Drehung einer 0,1 bis 0,2%igen Natriumhyaluronat-Lösung in einem physiologischen Puffer von unter – 11 × 10³° – cm²/mol (Disaccharid); und ohne (f) signifikante zelluläre Infiltration des Glaskörpers und der vorderen Kammer, ohne Flackern in der Kammerflüssigkeit, ohne Trübung oder Flackern im Glaskörper sowie ohne pathologische Veränderung von Koronea, Linse, Iris, Retina und Aderhaut des Augapfels von Affen nach Einbringen von 1 ml einer 1%igen Lösung von in einem physiologischen Puffer gelösten Natriumhyaluronat in den Glaskörper, wobei etwa die Hälfte des flüssigen Glaskörpers ersetzt wird und die Hyaluronsäure
(g) steril und pyrogenfrei ist und
(h) nicht antigen wirkt."

Die kanadische Patentschrift 1,205,031 (die auf die US-A-4,141,973 als Stand der Technik verweist) nimmt auf Hyaluronsäurefraktionen mit mittlerem Molekulargewicht von 50 000 bis 100 000; 250 000 bis 350 0.00 und 500 000 bis 730 000 Bezug und bespricht Verfahren zu deren Herstellung.
Bei der Verwendung von Hyaluronsäure (oder Salzen oder anderen Formen dieser) mit hohem Molekulargewicht muß diese verdünnt werden, um eine Verabreichung zu erlauben und sicherzustellen, daß keine intramuskuläre Koagulation auftritt.

(vi) und, auf Seite 33, Zeile 37 bis Seite 35, Zeile 30: „Demzufolge haben die Anmelder Hyaluronsäure (und Natriumhyaluronat und/oder andere Formen) mit Arznei- und/oder therapeutischen Wirkstoffen mit völlig unerwarteten Ergebnissen zur Behandlung von Zuständen und Krankheiten kombiniert:

Zustand/Krankheit	Chemikalien & Wirkstoffe
1. Krebs, Steigerung der Makrophagenaktivität	freie Radikal-Fänger, Superoxiddismutase, Ascorbinsäure (Vitamin C), Antikrebsmittel, NSAID, Chemotherapeutika, Entgiftungsmittel (z. B. Cholestyramin)
1A. Verringerung der Hirnschwellung bei Patienten mit Hirntrauma	Dimethylsulfoxid (DMSO)
2. Haarwuchs	Minoxidil – Kombination – bei topischer Applikation wächst mehr Haar

3. Herpes, Aphten, Gürtelrosen	Nichtionische (z. B. Nonoxinol-9), anionische (z. B. Cetylpyridinium-chlorid), und kationische Detergenzien (z. B. Benzalkoniumchlorid)
4. Nierenversagen, Herzinsuffizienz, Bluthochdruck Ödeme	Diuretika – Furosemid
5. Infektionen, Akne, Mononukleose	Antibiotika, antibakterielle Mittel, etc., Ascorbinsäure und Hyaluronsäure
6. Transplantate	Cyclosporine
7. Entzündungen, Beseitigung von Tumorabbaumaterial (Bruchstücke und Toxine) Verringerung von Nebenwirkungen, Befreiung von Schmerzen (z. B. Rückenschmerzen)	nichtsteroidale Entzündungshemmer, NSAID, z. B. Diclofenac, Indomethacin, Piroxicam, Ibuprofen, Ketorolactromethaminsalz, Naproxen
8. Entgiftung	Klistiere, Entgiftungsmittel, peritoneale Dialyse
9. Bronchodilatation	Bronchodilatatoren z. B. Beclomethasondipropionat (Natriumchromglycat, obwohl dies kein spezifischer Bronchodilatator ist), Theophyllin
10. vasculäre Ischämie	Behandlung von Gliedmaßen in Bezug auf Diabetes, die Berger'sche Krankheit usw. mit einer geeigneten Medizin z. B. Trental

11. HIV (AIDS)	DMSO, Vitamin C, NSAID (z. B. Indomethacin, Naproxen, Ketorolactromethamin), Interferon, Vibramycin^® (Doxycylin), Tetracylin
12. Diabetes	Insulin
13. Postmenopause	Östrogenersatz
14. Vorbeugung tropischer Infektionen	Antimetabolite z. B. Sulfonamide
15. Verringerung von Schwellungen	DMSO
16. Bluthochdruck, Herzinsuffizienz	Calciumantagonisten z. B. Nifedipin, β-Blocker z. B. Atenol, Propanolol
17. Inhibition der Prostaglandinsynthese	Acetylsalicylsäure
18. Steigerung der Sauerstoffversorgung von Gewebe durch Eintauchen des Gewebes in Perfusionslösung (für Transplantationszwecke)"	Perfusat

So wandern z. B. bei der Verabreichung einer hinreichenden Menge an Bindungsstoff bei der Prävention der Restenose die weichen Muskelzellen nicht in den stenosen Plaque und die weißen Zellen (Macrophagen) infiltrieren diesen nicht.
Hinreichende Mengen von Bindungsstoff, die als therapeutisch angesehen werden, liegen zwischen ungefähr 0,1 bis ungefähr 1,5 mg Bindungsstoff (z. B. PIP2) pro Kilogramm Körpergewicht. Bevorzugt werden ungefähr 0,2 bis 1 mg bindenden Stoffs (z. B. PIP2) pro Kilogramm Körpergewicht des zu behandelnden Patienten verabreicht. Diese Mengen können verringert oder zu größeren Dosen erhöht und effektiv eingesetzt werden. Auf jeden Fall wird der bindende Stoff bevorzugt nicht in Mengen eingesetzt, die für die Zellen oder für das Individuum toxisch sind. In einigen Fällen können jedoch Zellen durch die Verabreichung von effektiv dosierten Mengen des bindenden Stoffs, der einen positiven Effekt auf das Individuum ausübt, absterben, auch wenn die eingesetzte Menge an bindendem Stoff als nicht toxisch angesehen wird. Die Verabreichung erfolgt solange wie nötig.
PIP2 ist, wie bereits zuvor erwähnt, für die Absichten der Erfindung geeignet, wenn es in Dosierungen angewendet wird, die z. B. eine Menge von z. B. zwischen ungefähr 0,1 bis ungefähr 1,5 mg/kg Körpergewicht wie z. B. 0,2 bis 1 mg des bindenden Stoffs pro Kilogramm Körpergewicht enthalten. Um die positiven Effekte (z. B. therapeutischen Effekte) von PIP2 zu verbessern, kann PIP2 zur Reduzierung seiner Fettlöslichkeit z. B. durch Anknüpfen von PIP2 an Glycuronsäure oder andere geeignete nicht toxische hydrophile Agenzien, die die Fettlöslichkeit von PIP2 reduzieren, modifiziert werden. Ein Reaktionsprodukt kann aus PIP2 und hydrophilen Reagenzien hergestellt werden.
Das PIP2 bindende Molekül kann gleichfalls seinerseits zur Substitution des Phosphats durch andere Molekülteile wie Sulphat, Carbonat, Nitrat, Sulphit, Nitrit oder andere geeignete Strukturen modifiziert werden.
Es wird gleichfalls angenommen, daß der Inositolring in seiner Gesamtheit nicht notwendig ist, um die beabsichtigte Bindung an dem Rezeptor zu erhalten. Es erscheint, daß nur der Abschnitt der Sesselstruktur benötigt wird, der vier Kohlenstoffatome aufweist, an welche Hydroxylradikale gebunden sind. Daher kann auch ein anderes Molekül, das diese Sesselkonfiguration der Formel aus vier Kohlenstoffatomen formt, geeignet sein. So kann eine Verbindung der Strukturformel
R₁ und R₂ können nicht verbunden sein oder R₁ und R₂ können eine Brücke bilden, die ein geschlossenes Ringmolekül ausbildet und R₁ und R₂ können jeweils aus niedrigen Alkylen oder anderen geeigneten Substituenten ausgewählt sein.
geeignet sein.
Die Gegensinnpeptide von

(a) RSHKTRSHH (Einzelbuchstabencode der Aminosäuren) Arg-Ser-His-Lys-Thr-Arg-Ser-His-His (Dreibuchstabencode der Aminosäuren)
(b) RPHFHKR (Einzelbuchstabencode der Aminosäuren) Arg-Pro-His-Phe-His-Lys-Arg (Dreibuchstabencode der Aminosäuren)

Die Gegensinnpeptide können nach den dem Fachmann bekannten Methoden hergestellt werden und sind einfach aus den Peptiden zu bestimmen. Einige Anleitungen können gefunden werden in:

(i) „Identification of Recognition Sequences of Adhesion Molecules Using Phage Display Technology", Methods in Enzymology, Vol. 245 auf Seite 370 und
(ii) „Molecular Cloning of a Novel Hyaluron Receptor that Mediates Tumour Cell Motility", the Journal of Cell Biology, Vol. 117, 1992 auf Seite 1343.

Geeignete Mengen der Gegensinnpeptide liegen in der Größenordnung der zuvor beschriebenen zwischen ungefähr 0,1 bis ungefähr 1,5 mg pro Kilogramm Körpergewicht. Diese Mengen können gesenkt oder zu größeren Dosiermengen angehoben werden und sind wirkungsvoll. Es wird noch mal darauf hingewiesen, daß der Stoff der eingesetzt wird, weder für die Zellen noch für die Individuen toxisch ist. In einigen Fällen kann es jedoch dazu kommen, daß Zellen durch die Verabreichung einer wirkungsvoll dosierten Menge des Gegensinnpeptids als bindenden Stoff, der einen positiven Effekt auf das Individuum ausüben soll, zum Tod von Zellen führen kann, auch wenn die Menge an verwendetem bindenden Stoff als nicht toxisch angesehen wird. Die Verabreichung erfolgt solange wie nötig.
Beschreibung der Zeichnungen
1
Anbindung einer Phage mit der Sequenz RSHKTRSHH an eine biotinylierte Hyaluronanprobe in Anwesenheit von (1) ausschließlich biotinyliertes Hyaluronan; (2) 5 μg/ml PIP2; (3) 50 μg/ml PIP2; (4) 250 μg/ml PIP2 und (5) 100 μg/ml unmarkiertes Hyaluronan. Die Ergebnisse zeigen, daß PIP2 wirkungsvoll die Bindung von Hyaluronan an die oben genannte Sequenz unterdrücken. Die Fähigkeit, daß unmarkiertes Hyaluronan im Wettbewerb zu biotinylierten Hyaluronan bei dieser Sequenz steht, bestätigt die spezifische Wechselwirkung zwischen Hyaluronan und dieser Sequenz.
2
Die Fähigkeit von PIP2, die Bindung von Hyaluronan an RHAMM zu unterdrücken. (a) Biotinyliertes Hyaluronan bindet an RHAMM (siehe Yang, et al., mit dem Titel „Identification of a common link protein" (The EMBO Journal, Vol. 13, No. 2, Seiten 286 bis 296, 1994) als Hinweis für Details und zur Kontrolle, welche Referenzen eingeflossen sind); (b) 250 μg/ml PIP2 heben im wesentlichen die Fähigkeiten von Hyaluronan an RHAMM zu binden auf. Da die in 1 beschriebene Sequenz RSHKTRSHH das Hyaluronan bindenden Basisaminosäuremuster aufweist (7 dazwischen liegende Aminosäuren) und diese an PIP2 binden, zeigt das Ergebnis, daß PIP2 an dieselben Muster bindet wie Hyaluronan in RHAMM.
3
Bindung von ³H-PIP2 an RHAMM in einer Transblotanordnung. ³H-PIP2 bindet an RHAMM und steht im Wettbewerb zu unmarkierten PIP2.
4
Im Zytoplasma und im Zellkern lokalisiertes RHAMM
5
Im Kern und in geringeren Mengen im Zytoplasma lokalisiertes FITC-HA.
Genaue Beschreibung der Beispiele
Methodik
1
Bakteriophagen, die die Sequenz RSHKTRSHH beinhalten, wurden durch Aussetzung von biotinyliertem Hyaluronan, welches an Streptavidin bedeckten Perlen gebunden war, isoliert. Diese Bakteriophagen wurden dann in Anwesenheit von 5 bis 250 μg PIP2 biotinylierten Hyaluronan oder 100 μg unmarkierten exogenen Hyaluronan ausgesetzt. Die Phagen, die dann unter diesen unterschiedlichen Bedingungen an die biotinylierten Hyaluronanproben gebunden waren, wurden auf Agarplatten gestrichen und wuchsen für 48 Stunden bei 37°C. Die Platten wurden fotografiert.
2
RHAMM-Variante 2 wurde mittels Übertragung von RHAMMv2 cDNA in E. Kolibakterien, wie im Detail beschrieben in Yang, B., Young, B. L., Savani, R. C. und Turley, E. A. The EMBO Journal 13, 286–296 (1994), synthetisiert. Das RHAMM-Protein wurde in SDS-PAGE einer Elektrophorese ausgesetzt (siehe oben angegebene Referenz) und auf Nitrocelluloseacetat übertragen. Das biotinylierte Hyaluronan wurde anschließend mit der Membran inkubiert und das gebundene biotinylierte Hyaluronan wurde, wie in der oberen Referenz beschrieben, durch Chemilumineszenz bestimmt. In einem anderen identischen Fleck wurde das biotinylierte Hyaluronan mit PIP2 (250 μg/ml) gemixt und die Mischung anschließend mit der RHAMM aufweisenden Membran inkubiert. Das gebundene biotinylierte Hyaluronan wurde dann wie zuvor mittels Chemilumineszenz bestimmt.
3
Tritiummarkiertes PIP2 (Amersham, 50 μCl/10 ml) wurde mit auf SDS-PAGE separierten RHAMM inkubiert und wie zuvor beschrieben auf eine Nitrocellulosemembran übertragen. Das radiomarkierte PIP2 wurde für eine Stunde mit RHAMM inkubiert, gewaschen und anschließend für einen Monat einem KODAK Autoradiographfilm ausgesetzt. Der Film wurde anschließend mit einem Biorad Densitometer gescannt. Der Punkt wurde im Lösungsmittel abgezogen und anschließend nochmals auf RHAMM mittels polyclonaler anti-RHAMM Antikörper beprobt, um zu prüfen, ob das radiomarkierte Band mit dem RHAMM-Protein zusammenfällt.
Berechnung der PIP2 Mimetika Dosis
Dosisbereich, der effektiv mit Hyaluronan konkurriert: 5–250 μg/10 ml. Das Blutvolumen einer Ratte beträgt ungefähr 15 ml und das durchschnittliche Gewicht 250 g.
Daher betrug die Menge an eingesetzten PIP2 pro Ratte 25 bis 375 μg/250 g oder 100 bis 1500 μg/kg oder 0,1–1,5 mg pro Kilogramm Körpergewicht.
Eine hinreichende Menge eines Adenovirus beinhaltenden Gentherapeutikums (z. B. GMCSF – ein Acronym für Growth in Marrow Colony Stimulating Factor) wurde zur Verabreichung in der dem Fachmann bekannten Art hergestellt. Dieser modifizierte Adenovirus ist, wenn verabreicht, ein Mittel, das Immunsystem auf einen Tumor zu lenken. Anders als in der zuvor bekannten Art zu verabreichen, schlägt der Anmelder vor, die Adenovirus beinhaltende Gentherapie weiter mit einem hier beschriebenen Gegensinnpeptid zu modifizieren, um einen weiteren modifizierten „Virusmantel" auf der Oberfläche dieses bereitzustellen, welches dann dem Patienten verabreicht wird (Der Fachmann kann dies schnell durch die bekannten Methoden erreichen.)
Es wurde gezeigt, daß HA (Hyaluronan) – Rezeptoren bei Brustkrebs, Magenkrebs oder Colorektalkrebs ansteigen (im Übermaß ausgeschüttet werden). Große RHAMM-Ausschüttungen (große HA-Rezeptor-ausschüttungen) führen zu Metastasen. Die Verabreichung von zum Transport der Gegensinnpeptide (das Spiegelbild der Bindungsdomäne) wie zuvor als Übermantel beschrieben modifizierte Adenoviren (und teilweise Gegensinn (b) oben) führt zur Bindung an das RHAMM der Krebstumore und das Adenovirus dringt direkt in den Zellkern. Der Zellkern des Tumors wird dann durch das Adenovirus verändert (es produziert das Genprodukt zu dessen Produktion es designt wurde) und der Tumor wird vom Immunsystem zerstört. Die Basis für diesen Vorschlag ist, daß in einer Zelle, die RHAMM ausschüttet, das Hyaluronan an die Zelle geht und mit dem RHAMM bindet und ungefähr 15 Minuten später das Hyaluronan in den Zellkern eingedrungen ist. Das Gegensinnpeptid, z. B. das Gegensinnpeptid (b), wird deshalb direkt in die Zelle und in den Zellkern eindringen. 4 und 5 dienen zur Beschreibung dieses Vorgangs. In 5 ist FITC-HA (Hyaluronan) teilweise in den Kernen und im Zytoplasma lokalisiert. Dasselbe wird bei den zuvor diskutierten Gegensinnpeptiden auftreten. Siehe auch „Nuclear Localization Signals Direct Nuclear Proteins to the Nucleus", The Molecular Biology of the Cell, 3^rd edition auf Seiten 563 bis 564 (B. Albertz, D. Brag, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, J. O. Watson).

Claims

Verwendung eines Bindemittels (außer Hyaluronan, einem pharmazeutisch akzeptablen Salz davon oder anderen solchen Formen der Hyaluronsäure), ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus:
(i) wobei entweder (a) R₁ und R₂ eine Brücke bilden, welche ein Molekül mit geschlossenem Ring ausbildet; oder (b) R₁ und R₂ nicht verbunden sind und jeweils R₁ und R₂ ein niedriges Alkyl sind und (ii) einem Bindemittel, das Phosphoinositol-4,5-bisphosphat als einen aktiven Teil enthält, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von oder Vorbeugung gegen bösartige Tumore oder Restenose, wobei das Bindemittel an der Stelle der Krankheit oder des Leidens mit mindestens einer Bindungsdomäne aus der Gruppe von Bindungsdomänen bindet, die ausgewählt wird aus: (a) RSHKTRSHH (Einbuchstabencode für Aminosäuren) auch identifiziert als: Arg-Ser-His-Lys-Thr-Arg-Ser-His-His (Dreibuchstabencode für Aminosäuren) auch codiert durch: CGC-TCG-CAC-AAG-ACC-AGG-TCG-CAC-CAC (b) RPHFHKR (Einbuchstabencode für Aminosäuren) auch identifiziert als: Arg-Pro-His-Phe-His-Lys-Arg (Dreibuchstabencode für Aminosäuren) auch codiert durch: CGG-CCC-CAC-TTC-CAC-AAG-CGG
Verwendung nach Anspruch 1, bei welcher das Medikament eine wirksame Menge des Bindemittels aufweist, wobei das Bindemittel mit der Medizin und/oder dem therapeutischen Mittel gemischt ist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, bei welcher das Bindemittel den aktiven Anteil Phosphoinositol-4,5-bisphosphat von PIP2 enthält.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei welcher die Menge des Bindemittels bei 0,1 bis 1,5 mg pro Kilogramm Körpergewicht des Patienten beträgt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei welcher die Menge des Bindemittels 0,2–1 mg pro Kilogramm Körpergewicht des Patienten übersteigt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei welcher das Bindemittel aus einem Derivat aus der Kombination von PIP2 und einem hydrophilen Mittel ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 6, bei welcher das hydrophile Mittel Glucoronsäure ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, bei welcher mindestens ein Phosphatanteil des PIP2 aktiven Teils durch einen Anteil ersetzt ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Sulfat, Carbonat, Nitrat, Sulfat oder Nitrit besteht.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Bindemittel ausgewählt wird aus der Verbindung:
wobei entweder (a) R₁ und R₂ eine Brücke bilden, welche ein Molekül mit geschlossenem Ring ausbildet; oder (b) R₁ und R₂ nicht verbunden sind und jeweils R₁ und R₂ ein niedriges Alkyl sind
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Bindemittel aus dem Antisense-Peptid für (a) RSHKTRSHH (Einbuchstabencode für Aminosäuren) Arg-Ser-His-Lys-Thr-Arg-Ser-His-His (Dreibuchstabencode für Aminosäuren) (b) RPHFHKR (Einbuchstabencode für Aminosäuren) Arg-Pro-His-Phe-His-Lys-Arg (Dreibuchstabencode für Aminosäuren) ausgewählt ist.