DE60128120T2

DE60128120T2 - Saururus chinensis-extrakt zur prophylaxis und behandlung neurodegenerativer krankheiten

Info

Publication number: DE60128120T2
Application number: DE60128120T
Authority: DE
Inventors: Young-Joong Gwangjin-gu KIM; Sang-Hyun Sung; So-Ra Gwanak-gu KIM
Original assignee: Elcom Bio Technology Co Ltd
Current assignee: Elcom Bio Technology Co Ltd
Priority date: 2000-10-19
Filing date: 2001-10-19
Publication date: 2008-01-10
Anticipated expiration: 2021-10-20
Also published as: WO2002032443A1; EP1326623B1; AU2002212774A1; EP1326623A1; US20030045564A1; JP4157767B2; CN1394143A; DE60128120D1; ATE360431T1; EP1326623A4; JP2004511525A; CN1245983C

Description

Technisches Gebiet
Die Erfindung betrifft die Verwendung einer Verbindung der folgenden Formel (I) zur Herstellung von Arzneimitteln zur Vorbeugung und Behandlung von Schlaganfall oder Alzheimer-Krankheit
wobei R₁ H, C_1-4-Alkyl oder die Gruppe
ist (in der R₅ H oder C_1-4-Alkyl ist, R₆ H, OH oder C_1-4-Alkyl ist),
R₂ C_1-4-Alkyl ist und
R₃ C_1-4-Alkyl ist.
Hintergrund der Technologie
In jüngerer Zeit steigt die Zahl der Patienten, die an neurodegenerativen Krankheiten leiden, parallel zur Zunahme alter Personen rasch. Eine typische neurodegenerative Erkrankung ist die Alzheimer-Krankheit. Die Hauptsymptome de Alzheimer-Krankheit sind Gedächtnisverlust und die Abnahme der Lernfähigkeit. Neben den Patienten leiden die Familien. Sie wird daher zu einem sozialen Problem. Das Interesse an der Vorbeugung und Behandlung von Alzheimer-Krankheit wächst täglich. Obwohl die Lebensqualität der Menschen entsprechend der raschen Entwicklung von Biotechnologie und Wissenschaft & Technologie zugenommen hat, nimmt darüber hinaus auch der Krankheitsausbruch bei alten Personen zu. Der Ausbruch neurodegenerativer Krankheiten wie Schlaganfall durch die zweiten Symptome nimmt ebenfalls zu. Obwohl ein solcher Ausbruch neurogenerativer Krankheiten auf Basis unterschiedlichen Ursprungs zunimmt, wurde bis jetzt kein Wirkstoff entwickelt, der solche Krankheiten wirksam verhindern und behandeln kann. Neurodegenerative Krankheiten können durch Neurodegeneration als Folge von Gehirnerschütterung und Altern, sekundären Phänomenen wie Kreislauferkrankungen und neurodegenerativen Krankheiten als Folge verschiedener physikalischer oder mechanischer Faktoren wie Verkehrsunfällen, Arbeitsunfällen und CO-Vergiftungen auftreten. (Rothman, S. M. (1984) Synaptic release of excitatory amino acid neurotransmitter mediates anoxic neuronal death, J. Neurosci. 4: 1884–1891 und Weiloch, T. (1985) Hypoglycemiainduced neuronal damage prevented by an NMDA antagonists, Science 230: 681–683).
Aus obigen Gründen wird das Hirngewebe hypoxisch oder hypoglykämisch, wenn der Blutzustrom zum Gehirn abnimmt oder unterbrochen wird. Dann kann das Hirn keinen normalen Stoffwechsel durchführen und wird irreversibel geschädigt. Solche Fälle sind häufig bei Schlaganfall, Trauma, ischämischer Schädigung und neurodegenerativen Krankheiten zu beobachten. (Benveniste, H., Drejer, J., Schousboe, A. und Diemer, N. H. (1984) Elevation of the extracellular concentrations of glutamate and aspartate in rat hippocampus during transient cerebral ischemia monitored by intracerebral microdialysis, J. Neurochem. 43:1369–1374, und Hagberg, H., Lehmann, A., Saucberg, M., Nystrom, B., Jacobson, I. und Hamberger, A. (1985) Ischemia-induced shift of inhibitory and excitatory amino acids from intra- to extracellular compartments, J. Cereb. Blond Flow & Metab. 5:413–419).
Die Schädigung von Hirngewebe kann grob in zwei Arten von Mechanismen unterteilt werden. Der eine hat seinen Ursprung in einer Zunahme freier exzitatorischer Aminosäuren, die auf Spannungsänderungen der Zellmembran basiert. Der andere hat seinen Ursprung in unmittelbarem oxidativem Stress. (Choi, D. W. (1988) Glutamate neurotoxicity and disease of the nervous system, Neuron 1:623–634, und Coyle, J. T. und Purrfarcken, P. (1993) Oxidative stress, glutamate and neurodegenerative disorders, Science 262:689–695). Nach jüngeren Untersuchungen wird Glutamat als ursächliche Substanz angesehen, die durch Aktivierung des inotropen Rezeptors oxidativen Stress hervorruft. Daher wird Glutamat als Ursache von Schlaganfall, Trauma und ischämischer Verletzung angesehen. (Halliwell, B. und Gutteridge, J. M. (1985a) Oxygen radicals and the nervous system, Trends Neurosci. 5:22–26, und Halliwell, B. und Gutteridge, J. M. (1985b) The Importance of free radicals and catalytic metal ions in human diseases, Mol. Aspects Med. 8:89–193). Falls der Blutzustrom zum Gehirn abnimmt, steigt die Freisetzunjg von Glutamat an den Synapsen und der Zufluss von Glutamat in die Neuronen nimmt ab. Dementsprechend nimmt die Glutamatkonzentration außerhalb der Zellen rasch zu. Zuletzt sterben die Neuronen ab. (Benveniste, H., Drejer, J., Schousboe, A. und Diemer, N. H. (1984) Elevation of the extracellular concentrations of glutamate and asparate in rat hippocampus during transient cerebral ischemia monitored by intracerebral microdialysis, J. Neurochem. 43:1369–1374 und Hagberg, H., Lehmann, A., Saucberg, M., Nystrom, B., Jacobson, I. und Hamberger, A. (1985) Ischemia-induced shift of inhibitory and excitatory amino acids from intra- to extracellular compartments, J. Cereb. Blond Flow & Metab. 5:413–419). Eine solche auf Glutamat basierende Neurotoxizität wird unterteilt in "akute Toxizität", bei der sich die Toxizität stark und rasch zeigt, und "chronische Toxizität", bei der Neuronen geringen Glutamatkonzentrationen ausgesetzt sind oder über einen kurzen Zeitraum hohen Glutamatkonzentrationen ausgesetzt sind. (Choi, D. W. (1988) Glutamate neurotoxicity and disease of the nervous system, Neuron 1:623–634). Akute Toxizität beginnt, wenn Ca²⁺ außerhalb der Zellen in zu hohem Maße in die Zellen strömt, und zur Aufrechterhaltung des osmotischen Drucks Ionen wie Na⁺, K⁺ und Cl^– in die Zellen strömen und die Zellen platzen und absterben. (Kauppisen, R. A., McMahonm, H. T. und Nicholls, D. G. (1988) Ca²⁺-dependent and Ca²⁺-independent glutamate release, energy status and cytosolic free Ca²⁺ concentration in isolated nerve terminals following metabolic inhibition: Possible relevance to hypoglycemia and anoxia, Neurosci. 27:175–182, und Garthwaite, G. und Garthwaite, J. (1988) In vitro neurotoxicity of excitatory acid analogues during cerebellar development, J. Neurosci. 17:755–767).
Chronische Toxizität beginnt, wenn N-Methyl-D-aspartat (NMDA) der Glutamatrezeptor, und non-NMDA aktiviert werden und Ca²⁺ in die Zellen strömt und dadurch Ca²⁺-abhängige Enzyme aktiviert werden und die Zellen zuletzt absterben. (Coyle, J. T. und Purrfarcken, P. (1993) Oxidative stress, glutamate and neurodegenerative disorders, Science 262:689–695). Das heißt, wenn NMDA und non-NMDA durch Glutamat aktiviert werden, strömt Ca²⁺ in die Zellen und Phospholipase A2, das Ca²⁺-abhängige Enzym, wird anomal aktiviert, die Bildung vieler freier Fettsäuren nimmt zu und daher steigen freie Radikale wie aktiver Sauerstoff und/oder aktives Wasserstoffperoxid anomal an und beschleunigen die Peroxidation von Zellen und die Zellen sterben schließlich ab. (Coyle, J. T. und Purrfarcken, P. (1993) Oxidative stress, glutamate and neurodegenerative disorders, Science 262:689–695, Halliwell, B. und Gutteridge, J. M. (1985a) Oxygen radicals and the nervous system, Trends Neurosci. 5:22–26, Halliwell, B. und Gutteridge, J. M. (1985b) The importance of free radicals and catalytic metal ions in human diseases, Mol. Aspects Med. 8:89–193, Siesjo, B. K. und Wieloch, J. (1985) Cerebral metabolism in ischaemia: Neurochemical basis for therapy, Br. J. Anaesth. 47:47–62, Sladeczek, F., Pin, J. P., Recasens, M., Bokaerk, J. und Weiss, S. (1985) Glutamate stimulates inositol phosphate formation in striatal neurones, Nature 317:717–719 und Choi, D. W. und Koh, J. (1987) Ionic dependence of glutamate neurotoxicity, J. Neurosci. 7:369–379). Wenn der NMDA-Rezeptor aktiviert wird, nimmt die Aktivierung von Stickoxid synthetisierenden Enzymen zu und Stickoxid wird überproduziert. Das so gebildete Stickoxid beschleunigt ebenfalls die Peroxidation der Zellen. (Strijbos, P. J. L. M., Lesch, M. J. und Garthwaite, J. (1996) Vicious cycle involving Na⁺ channels, glutamate release and NMDA receptors mediates delayed neurodegeneration through nitric Oxide formation, J. Neurosci. 16:5004–5013). Die Neurotoxizität kann durch Glutamatantagonisten, Natrium- oder Calciumkanalblocker, Antioxidanzien, Blocker von freien Radikalen und Anti-Proteinenzyme, die die Umwandlung von Xanthindehydrogenase in Xanthinoxidase supprimieren, verhindert werden. Besonders wirksam sind Antagonisten gegen den NMDA-Rezeptor. (Choi, D. W., Koh, J. und Peters, S. (1988) Pharmacology of glutamate neurotoxicity in cortical cell culture: Attenuation by NMDA antagonists, J. Neurosci. 8:185–196, und Olney, J. W. und Sharpe, I. G. (1969) Brain lesions in an infant rhesus monkey treated with monosodium glutamate, Science 166:368–388).
Bei der Entwicklung von Arzneimitteln gegen die Alzheimer-Krankheit, die bedeutsame Krankheit, die zu Bewusstseinsverlust führt, richten sich die Untersuchungen auf beides. Das heißt, im Fall von Glutamatneuronen wird die Funktion verstärkt (Verwendung effektiver Wirkstoffe) oder die Funktion wird supprimiert (Verwendung von Antagonisten). Das heißt, wenn der Glutamatgehalt durch Schädigung von Glutamatneuronen sinkt, nehmen Gedächtnis und Lernfähigkeit ab. Bei Patienten mit Alzheimer-Krankheit ist die Zahl der NMDA-Rezeptoren, der Glutamatrezeptoren, auf 75–87 % der NMDA-Rezeptoren und auf 45–69 % der non-NMDA-Rezeptoren reduziert (Cowburn, R., Hardy, J., Roberts, P. und Briggs, R. (1988) Regional distribution of pre-and postsynaptic glutamatergic function in Alzheimer's disease, Brain Res. 452:403–407, Greenamyre, J. T., Penney, J. B., D'Amato, C. J. und Young, A. B. (1987) Dementis of the Alzheimer's type: Changes in hippocampal L-[3H] glutamate binding, J. Neurochem. 48:543–551 und Chalmers, D. T., Dewar, D., Graham, D. I., Brooks, D. N. und McCulloch, J. (1990) Differential alternations of cortical glutamatergic binding sites in senile dementia of the Alzheimer type, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1352–1356), und die Glutamatrezeptoren sind in dem Hirnbereich konzentriert, von dem bekannt ist, dass er für Gedächtnis und Lernfähigkeit wichtig ist. Man nimmt daher an, dass Gedächtnisverlust und Abnahme der Lernfähigkeit eine Folge der Anomalie des Glutamatrezeptors sind. (Izquierdo, I. (1991) Role of NMDA receptors in memory, Trends Pharm. Sci. 12:260–265). Zum Zeitpunkt des Memorierens und Lernens, wenn die Calciumionen erhöht sind und das proteinlysierende Enzym aktiviert ist, sind die Glutamatrezeptoren erhöht. In der Folge kommt es zu strukturellen und chemischen Veränderungen an der Synapse und der Mensch kann memorieren und lernen. Dies ist die wahrscheinlichste Hypothese. (Thompson, R. F. (1986) The neurobiology of learning and memory, Science 233:941–947). Das Hauptsymptom der Alzheimer-Krankheit ist der Gedächtnisverlust. Es ist bekannt, dass ein Wirkstoffe für Glutamat eine wichtige Rolle beim Gedächtnis und der Lernfähigkeit spielt. Man beobachtet, dass Wirkstoffe bei Verabreichung des Wirkstoffs für Glutamat zur Behandlung von Gedächtnisverlust verwendet werden können. Manche Wirkstoffe zeigen Wirkung. (Willetts, J., Balster, R. L., Leander, J. D. (1990) The behavioral pharmacology of NMDA receptor antagonists, Trends Pharmacol. Sci. 11:423–428). Bei Patienten mit Alzheimer-Krankheit kann die Readsorption von Glutamat am präsynaptischen Teil der Nerven der Großhirnrinde und des Hippocampus nicht harmonisch erfolgen. Der Gehalt an Decarboxylase, die Glutamat metabolisiert und GABA synthetisiert, ist erniedrigt und als Folge nimmt der Glutamatgehalt an den Synapsen zu. (Willetts, J., Balster, R. L., Leander, J. D. (1990) The behavioral pharmacology of NMDA receptor antagonists, Trends Pharmacol. Sci. 11:423–428).
Die Erfinder verglichen den Einfluss chinesischer Arzneimittel oder roher Wirkstoffe, von denen bekannt war, dass sie eine Wirkung gegen neurodegenerative Erkrankungen wie Schlaganfall oder Gedächtnisverlust haben, bei Primärkulturen von Rattenkortexzellen basierend auf der obigen Literatur und den obigen Überlegungen. Primärkulturen von Rattenkortexzellen wurde Gesamtmethanolextrakt appliziert, und es wurde eine große Menge Glutamat appliziert und versucht, die Wirkung des Extrakts auf den Neuronentod zu kennenzulernen. Als Ergebnis wurde gefunden, dass Gesamtmethanolextrakt aus Saururus chinensis eine signifikante Wirkung auf die neuroprotektive Wirkung besaß. Außerdem besaßen Alkaloide von Aristolactamderivaten, die aus Saururus chinensis isoliert wurden, signifikante neuroprotektive Wirkung.
Saururus chinensis ist ein Staudengewächs, das zu den Saururaceae gehört. Die ganze Pflanze, Wurzeln oder Blätter wurden von den Menschen als Arzneimittel gegen Diurese, Ödem, Gonorrhö, Hepatitis, Pneumonie und Hypertonie verwendet.
Die Untersuchung von Bestandteilen von Saururus chinensis wurde hauptsächlich an Flavonoiden, Alkaloiden, Aminosäuren, Fettsäuren, Chinonen und etherischem Öl von Stamm und Blättern durchgeführt. Als etherisches Öl der ganzen Pflanze wurde Methyl-n-nonyl-keton beschrieben. Daneben wurden α-Pinen, Camphen, Safrol, β-Carophyllen, Linalool und Humulen beschrieben. (Choe, K. H., Yoon, C. H. und Kwon, S. J. (1988b) Chemical composition of Saururaceae growing in Korea – on volatile constituents of Saururus chinensis by GC/MS, Punsok kwahak 1:259–262, und Choe, K. H., Kwon, S. J. und Lee, K. C. (1989) Chemical composition of Saururaceae growing in Korea – on fatty acids and amino acids of Houttuynia cordata and Saururus chinensis, Punsok kwahak 2:285–288). Als Flavonoide, den Hauptbestandteilen von Stamm und Blättern, wurden Hyperin, Quercetin, Isoquercitrin und Quercitrin beschrieben. (Choe, K. H., Yoon, C. H. und Kwon, S. J. (1994) A study of chemical constituents of Saururaceae growing in Korea – on flavonoid constituents of Saururus chinensis, Anal. Sci. Technol. 7:11–15, Sung, S. H., Kwon, S. H., Cho, N. J. und Kim, Y. C. (1997) Hepatoprotective flavonolglycosides of Saururus chinensis Herbs, Phytotherapy Res. 11:500–503 und Wang, E. C., Shih, M. H., Liu, M. C., Chef, M. T. und Lee, G. H. (1996) Studies an constituents of Saururus chinensis, Heterocycles 43:969–972). Bestandteile der Chinonreihe wie Emodin, Physcion und Lignan, wie Carpanon, wurden beschrieben. (Crohare, R., Priestap, H. A., Farins, M., Cedola, M. und Ruveda, E. A. (1962) Aristolactams of Aristolochia argentina, Phytochemistry 13:1957–1960). Daneben wurde Saurolactam, das Alkaloid der Aristolactamreihe, als zelltoxischer Bestandteile isoliert. (Priestap, H. A. (1989) ¹³C-NMR spectroscopy of aristolochic acid and aristolactams, Magn. Reson. Chem. 27:460–465).
Aristolactam, ein Alkaloid der gleichen Reihe, wurde ebenfalls beschrieben. (Crohare, R., Priestap, H. A., Farins, M., Cedola, M. und Ruveda, E. A. (1962) Aristolactams of Aristolochia argentina, Phytochemistry 13:1957–1960).
Darüber hinaus wurden auch Fettsäuren, wie Cuprinsäure, Linolsäure und Laurinsäure, Aminosäuren wie Alanin, Valin, Glutaminsäure, Asparaginsäure, Leucin, Isoleucin und Prolin beschrieben (Priestap, H. A. (1985a) Seven aristolactams from Aristolochia argentina, Phytochemistry 24:849–852).
Aufgabe der Erfindung
Die Erfinder haben Extrakte von Saururus chinensis untersucht und Stoffe aus den Extrakten isoliert.
Dementsprechend ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die Verwendung einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) zur Herstellung von Arzneimitteln zur Vorbeugung und Behandlung von Schlaganfall oder Alzheimer-Krankheit bereitzustellen.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
1 ist eine grafische Darstellung, die die Wirkung von Saurolactam-3-O-(E)-p-methoxycinnamat auf den Peroxidgehalt bei glutamatbehandelten Rattenkortexzellen bei Vor- oder Nachbehandlung zeigt.
Art der Erfindung
Art und Wirkung der vorliegenden Erfindung werden ausführlich beschrieben.
Die Extraktion von S. chinensis erfolgte mit niederen Alkanolen wie Methanol, Ethanol oder Propanol, chlorierten Kohlenwasserstoffen wie Methylenchlorid oder Chloroform, Kohlenwasserstoffen wie Hexan oder Heptan, und aromatischen Kohlenwasserstoffen wie Benzol oder Toluol, oder Mischungen davon.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele und Versuchsbeispiele näher erläutert.
Beispiel 1
Getrockneter S. chinensis (10 kg) wurde dreimal mit CHCl₃-MeOH (1:1) in einer Rückflussapparatur extrahiert, was nach Entfernung des Lösungsmittels unter Vakuum einen Gesamtextrakt von S. chinensis lieferte (1,8 kg). Dieser Extrakt wurde in Wasser suspendiert und mit CH₂Cl₂ extrahiert. Der CH₂Cl₂-Extrakt wurde unter Vakuum zur Trockne eingedampft. Die resultierende CH₂Cl₂-Fraktion wurde in 90 %igem MeOH suspendiert und mit n-Hexan extrahiert. Der n-Hexanextrakt und die restliche Suspension in 90 %igem MeOH wurden unter Vakuum getrocknet, was 60 g n-Hexanfraktion bzw. 120,0 g 90 %-MeOH-Fraktion lieferte.
Beispiel 2
Isolierung und Identifizierung von Verbindung 1
Die n-Hexanfraktion (60 g) wurde an einer Silicagelsäule chromatografiert und mit einem Stufengradienten von n-Hexan-EtOAc (100:1) eluiert, was 20 Subfraktionen ergab. Subfraktion 6 (600 mg) wurde an einer Sephadex LH-20-Säule chromatografiert, was eine Fraktion mit rohem Alkaloidf lieferte (200 mg). Verbindung 1 (Rt 14,15 min) wurde durch Reverse Phase HPLC isoliert. Verbindung 1 wurde mit MeOH umkristallisiert, was Verbindung 1 (100 mg) lieferte.
Identifizierung von Verbindung 1
Gelbliches Pulver

UV (CHCl₃) λ max (log ε): 388,10 (3,88), 314,20 (3,94), 287,20 (4,45), 276,50 (4,42), 262,10 (4,42), 235,50 (4,56) nm
IR (KBr) ν max: 3220, 1701, 1648, 1427, 1319, 1257, 1031, 972, 835, 737, 604 cm^–1
EIMS (m/z) (rel. int.): 279 [M⁺] (100), 264 (31), 236 (25), 194 (61)
¹H-NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ 10,32 (OH), 9,10 (1H, dd, J = 8,85, 2,50 Hz, H-5), 7,94 (1H, dd, J = 8,16, 2,25 Hz, H-8), 7,62 (1H, s, H-2), 7,58 (2H, td, J = 7,00, 7,25 Hz, H-6 und H-7), 7,28 (1H, s, H-9), 4,01 (3H, s, OCH₃), 3,38 (3H, s, NCH₃) ppm
¹³C-NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ 166,79 (C-1), 152,17 (C-3), 148,81 (C-4), 136,93 (C-9a), 134,64 (C-4a), 129,01 (C-8), 127,44 (C-6), 126,86 (C-5), 126,30 (C-8a), 125,57 (C-7), 120,96 (C-1a und 1b), 120,14 (C-5a), 113,60 (C-2), 103,48 (C-9), 59,52 (OCH₃), 26,17 (NCH₃) ppm

Basierend auf den obigen chemischen und spektrofotometrischen Ergebnissen wurde Verbindung 1 als 10-Aminomethyl-4-methoxy-3-hydroxyphenanthren-1-carbonsäurelactam, Saurolactam, identifiziert (Crohare, R., Priestap, H. A., Farins, M., Cedola, M. und Ruveda, E. A. (1962) Aristolactams of Aristolochia argentina, Phytochemistry 13:1957–1960, Priestap, H. A. (1989) ¹³C-NMR spectroscopy of aristolochic acid and aristolactams. Magn. Reson. Chem. 27:460–465 und Priestap, H. (1985a) Seven aristolactams from Aristolochia argentina, Phytochemistry 24:849–852).
Beispiel 3
Isolierung und Identifizierung von Verbindung 2
Bei der Isolierung von Verbindung 1 wurde ein Peak der semipräparativen HPLC (Rt 15,90 min) aufgefangen und Verbindung 2 (10 mg) wurde auf gleiche Weise wie Verbindung 1 erhalten.
Identifizierung von Verbindung 2
Gelbliches Pulver

UV (CHCl₃) λ max (log ε): 380,00 (3,74), 314,20 (3,78), 285,20 (4,33), 275,00 (4,35), 261,20 (4,27), 230,00 (4,41) nm
IR (KBr) ν max: 3220, 1701, 1648, 1427, 1319, 1257, 1031, 972, 835, 737, 604 cm^–1
EIMS (m/z) (rel. int.): 279 [M⁺] (100), 264 (59), 236 (66)
¹H-NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ 10,85 (NH), 9,12 (1H, dd, J = 8,32, 2,01 Hz, H-5), 7,94 (1H, dd, J = 8,32, 2,01 Hz, H-8), 7,85 (1H, d, J = 2,01 Hz, H-3), 7,57 (2H, m, H-6 und H-7), 7,14 (1H, s, H-9), 4,10 (3H, s, OCH₃), 4,01 (3H, s, OCH₃) ppm
¹³C-NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ 168,85 (C-1), 154,71 (C-3), 150,86 (C-4), 135,80 (C-9a), 135,30 (C-4a), 129,51 (C-8), 127,95 (C-6), 127,30 (C-5), 126,38 (C-8a), 125,96 (C-7), 123,78 (C-1a), 122,60 (C-1b), 120,75 (C-5a), 110,37 (C-2), 105,07 (C-9), 60,39 (OCH₃), 57,40 (OCH₃) ppm

Basierend auf den obigen chemischen und spektrofotometrischen Ergebnissen wurde Verbindung 2 als 10-Amino-3,4-methoxy-3-hydroxyphenanthren-1-carbonsäurelactam, Aristolactam BII, identifiziert. (Crohare, R., Priestap, H. A., Farins, M., Cedola, M. und Ruveda, E. A. (1962) Aristolactams of Aristolochia argentina, Phytochemistry 13:1957–1960, Priestap, H. A. (1989) ¹³C-NMR spectroscopy of aristolochic acid and aristolactams, Magn. Reson. Chem. 27:460–465 und Priestap, H. A. (1985a) Seven aristolactams from Aristolochia argentina, Phytochemistry 24:849–852).
Beispiel 4
Synthese und Identifizierung von Verbindung 3
Verbindung 3 wurde durch Veresterung von Saurolactam und E-p-Methoxyzimtsäure hergestellt. Saurolactam (10 mg) und E-p-Methoxyzimtsäure wurden in wasserfreiem Toluol gelöst und es wurden Dicyclohexylcarbodiimid und 4-Dimethylaminopyridin zugegeben. Diese wurden im Ölbad bei 70 °C unter Ar-Gas gerührt. Nach 18-stündiger Umsetzung wurde die Lösung filtriert, um das Nebenprodukt, Harnstoff abzutrennen. Die filtrierte Lösung wurde unter Vakuum eingedampft und an einer Silicagelsäule mit einem Stufengradienten aus n-Hexan:CH₂Cl₂:MeOH chromatografiert, was Verbindung 3 lieferte.
Identifizierung von Verbindung 3
Gelbes Pulver

EIMS (m/z) (rel. int.): 409 (17) [M⁺], 293 (16), 279 (14)[M⁺-Zimtsäure], 224 (9), 178 (100), 164 (72), 131 (56)
¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃): 9,10 (1H, d, J = 8,32 Hz, H-5), 8,00 (1H, d, J = 15,90 Hz, H-7'), 7, 92 (1H, s, H-2), 7,87 (1H, m, H-8), 7,69-7,55 (4 H, m, H-2', 3', 5', 6'), 7,45 (2H, m, H-6 und H-7), 7,10 (1H, s, H-9), 6,75 (1H, d, J = 15,90 Hz, H-8'), 4,01 (3H, s, OCH3), 3,50 (3H, s, NCH₃) ppm

Verbindung 3 wurde mittels physikalischer Daten und Spektraldaten als Saurolactam-3-O-E-p-methoxycinnamat identifiziert.

EIMS (m/z) (rel. int.): 409 (17) [M⁺], 293 (16), 279 (14) [M⁺-Zimtsäure], 224 (9), 178 (100), 164 (72), 131 (56)
¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃): 9,10 (1H, d, J = 8, 32 Hz, H-5), 8,00 (1H, d, J = 15,90 Hz, H-7'), 7,92 (1H, s, H-2), 7,87 (1H, m, H-8), 7,69-7,55 (4 H, m, H-2', 3', 5', 6'), 7,45 (2H, m, H-6 und H-7), 7,10 (1H, s, H-9), 6,75 (1H, d, J = 15,90 Hz, H-8'), 4,01 (3H, s, OCH₃), 3,50 (3H, s, NCH₃) ppm

Versuchsbeispiele
Experimentelle Verfahren
1. Tiere
Die aus der Zucht der Seoul National University erhaltenen Sprague-Dawley-Ratten wurden in der Zucht des College of Pharmacy, Seoul National University, vermehrt. Die Zuchtstätte wurde bei 22 ± 5 °C gehalten. Die Beleuchtung erfolgte von 7 bis 19 Uhr. Es wurde Festfutter mit 23,2 % Rohprotein, 4,0 % Rohfett, 6,0 % Rohfaser, 10,0 % Rohasche, 0,6 % Rohcalcium und 0,4 % Roh-P (Seoul, Samyangsa) verwendet.
2. Kultivierung von Kortexzellen
Primärkulturen gemischter Kortexzellen, die sowohl Neuronen als auch Glia enthielten, wurden wie beschrieben aus fötalen Ratten präpariert (Kim, Y.C., Kim, S.R., Markelonis, G.J. und Oh, T.H. (1988) Ginsenosides Rb1 and Rg3 protect cultured rat cortical cells from glutamate-induced neurodegeneration, J. Neurosci. Res. 53:426–432).
Die Kortexzellen wurden mit einer Dichte von 1 × 10⁶ Zellen/ml auf kollagenbeschichteten Platten ausplattiert. Die kultivierten Zellen wurden in einer Feuchtatmosphäre von 95 % Luft/5 % CO₂ bei 37 °C in DMEM wachsen gelassen, das mit 10 % hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum, 1 mM Natriumpyruvat, 100 IU/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin supplementiert war.
3. Applikation von S. chinensis-Extrakt
Gesamtextrakt von S. chinensis, Fraktionen und isolierte Substanzen wurden in DMSO gelöst (Endkonzentration in der Kultur 0,1 %) und mit destilliertem Wasser verdünnt, und die Lösung wurde durch eine Millipore-Membran (0,22 μm, Millex-GV, USA) sterilfiltriert. Die Lösung wurde in unterschiedlichen Konzentrationen kultiviert und zu Neuronenzellen dosiert.
1) MTT-Messungen
Zu einer Kulturlösung der Kortexzellen wurde während der Kultivierung in einer Menge von 10 % der Kulturlösung MTT (5 mg/ml) gegeben. Die Nährlösung wurde weitere 3 Stunden kultiviert. Das gebildete Formazan wurde mit DMSO gelöst und durch Absorption bei 540 nm getestet. (Mosmann, T. (1983) Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays, J. Immuno. Methods 65:55–61).
2) Stickoxidmessung
Der Gehalt an isoliertem Nitrit in der Kulturlösung von Primärkulturen von Kortexzellen wurde mit dem Verfahren nach Dawson mit Griess-Reagens getestet (Dawson, V.L., Brahbhatt, H.P., Mong, J.A. und Dawson, T.M. (1994) Expression of inducible nitric Oxide synthase causes delayed neurotoxicity in primary neuronal-glial cortical cultures, Neuropharmacology 33:1425–1430).
3) Messung der Ca²⁺-Konzentration in den Zellen
Die Ca²⁺-Konzentration der Primärkulturen der Kortexzellen wurde durch Aufteilen der zu testenden Proben getestet und nach einer Stunde wurde die Neurotoxizität durch Glutamat induziert und mit Fura-2 AM getestet. (Grynkiewicz, G., Poenie, M. und Tsien, R.Y. (1985) A new generation of calcium indicators with greatly improved fluorescence properties, J. Biol. Chem. 260:3440–3450).
4) Ergebnisse und Diskussion
Wir verwendeten Primärkulturen von Rattenkortexzellen als in vitro-Testsystem, um neuroprotektive Verbindungen aus natürlichen Produkten zu isolieren, die gegen glutamatinduzierte Neurotoxizität schützen (Kim et al., 1998). Beim Screening natürlicher Quellen mit schützender Wirkung gegen glutamatinduzierte Schädigung in unserer Kultur entdeckten wird, dass ein CHCl₃/MeOH-Extrakt aus den Wurzeln von Saururus chinensis Ball (Saururaceae) eine signifikante neuroprotektive Wirkung zeigte (Tabelle 1). Die Verbindungen 1 und 2 wurden isoliert und durch Säulenchromatografie an Sephadex LH-20 und semipräparative HPLC als Saurolactam und Aristolactam der folgenden Formeln identifiziert.
Fig. 1. Struktur der Verbindungen 1–3
Eine Bioassay-gestützte Fraktionierung eines Gesamtextrakts von S. chinensis ergab, dass die n-Hexanfraktion am aktivsten war (50,6 % Schutz gegen glutamatinduzierte Toxizität bei 10 g/ml, p < 0,001) (Tabelle 1). Weitere Fraktionierung und Auftrennung der n-Hexanfraktion mit verschiedenen chromatografischen Verfahren lieferte die beiden Verbindungen 1 und 2. Die Verbindungen 1 und 2 wurden durch Vergleich der physikalischen Daten und der Spektraldaten mit den publizierten Daten (Crohare et al., 1962, Pristap et al., 1985a, Priestap, 1989) als 10-Aminomethyl-4-methoxy-3-hydroxyphenanthren-1-carbonsäurelactam, Saurolactam, und 10-Amino-3,4-methoxy-3-hydroxyphenanthren-1-carbonsäurelactam, Aristolactam BII, identifiziert. Die neuroprotektive Wirkung von Saurolactam und Aristolactam BII wurde in unserem Kultursystem genauer bestimmt. Nach 24 h Inkubation in DMEM in Gegenwart von Alkaloiden wurde das Ausmaß der Neuronenschädigung in den Kulturen festgestellt (Durchgehende Behandlung). Saurolactam und Aristolactam BII zeigten bei durchgehender Behandlung bei Konzentrationen von 1,0 bis 10,0 M eine signifikante neuroprotektive Wirkung (Tabelle 2).
Die neuroprotektive Wirkung dieser beiden Aristolactam-Alkaloide gegen glutamatinduzierte Toxizität wurde anfangs durch eine zeitliche Exposition mit den Alkaloiden vor oder nach exzitotoxischer Provokation bestimmt. Einige Kulturen wurden vor einer kurzen Exposition (30 min) mit Glutamat 1 Sunde mit Alkaloiden vorbehandelt, gewaschen und ohne Alkaloide 24 h in DMEM gehalten (Vorbehandlung) (Tabelle 3). Andere Kulturen wurden zuerst einer 30-minütigen Glutamatexposition ausgesetzt, gewaschen und in Gegenwart von Alkaloiden 24 h in DMEM gehalten (Nachbehandlung) (Tabelle 4).
Wie in Tabelle 4 gezeigt, supprimierten diese Alkaloide die glutamatinduzierte Neurotoxizität bei Nachbehandlung in Konzentrationen von 0,1 bis 10 M signifikant. Bei Vorbehandlung schützten Saurolactam und Aristolactam BII die kultivierten Kortexzellen jedoch nicht signifikant vor glutamatinduzierter Neurotoxizität (Tabelle 3). Aus diesen Ergebnissen ergibt sich, dass Aristolactamalkaloide im frühen Stadium möglicherweise nicht unmittelbar antagonistisch auf glutamaterge Rezeptorbindung oder glutamaterge rezeptorvermittelte Zellreaktionen wirken. Von diesen Alkaloiden wurde angenommen, dass sie nach Überaktivierung des glutamatergen Rezeptors auf Zellreaktionen downstream einwirken könnten. Dies wurde durch unsere Ergebnisse weiter bestätigt, die zeigen, dass Aristolactamalkaloide im frühen Stadium glutamatinduzierter Neurotoxizität keine signifikante Wirkung auf den Anstieg von intrazellulärem Ca²⁺ zeigen (Daten nicht gezeigt). Eine übermäßige intrazelluläre neuronale Ca²⁺-Konzentration kann eine Reihe von Enzymen aktivieren, einschließlich Stickoxidsynthase (NOS), Proteinkinase C, Phospholipasen und Proteasen. Wenn NOS aktiviert ist, wird NO im Überschuss gebildet. Von NO ist bekannt, dass es an der Glutamatneurotoxizität beteiligt ist (Masanori et al.. 1998). NO reagiert mit dem Superoxidanion unter Bildung von Peroxynitritradikalen, die zu einer dosisabhängigen neuronalen Schädigung führen (Almeids et al., 1998). Daher untersuchten wir die Wirkung von Aristolactam BII, einem stärkeren neuroprotektiven Alkaloid, auf den NO-Gehalt in der Kultur (Tabelle 5). Die mit Glutamat allein behandelten Kortexkulturen zeigten eine erhöhte Bildung von NO, während der NO-Gehalt bei Kulturen, die mit Glutamat und Aristolactam BII behandelt worden waren, nur leicht zunahm (Tabelle 5). Dieses Ergebnis lässt vermuten, dass Aristolactam BII die Überproduktion von Peroxynitritradikalen oder die Überaktivierung von NOS hemmen kann.
Die Aktivierung des Glutamatrezeptors stimuliert auch Phospholipase A2 (Lipton und Rosenberg, 1994). Die Aktivierung von Phospholipase A2 führt zur Bildung seines Metaboliten, Arachidonsäure. Arachidonsäure potenziert die von NMDA hervorgerufenen Ströme und inhibiert die Wiederaufnahme von Glutamat in die Astrozyten und Neuronen, was die Situation weiter verschärft (Miller et al., 1992). Beim Metabolismus von Arachidonsäure sauerstofffreie Radikale gebildet werden, was zu weiterer Phospholipase A2-Akivierung führt (Lafon-Cazal et al., 1993). Ein anderer allgemein bekannter Mechanismus für glutamatinduzierte neuronale Degeneration ist oxidativer Stress (Choi, 1988, Coyle und Puttfarcken, 1993). CNS-Neuronen sind aufgrund ihrer hohen Sauerstoffverbrauchsrate und wegen des hohen Gehalts an mehrfach ungesättigten Fettsäuren in den Zellen des Nervensystems gegenüber oxidativem Stress ungewöhnlich empfindlich (Guckmann et al., 1993). Dennoch hat das Hirn ein zelluläres Abwehrsystem, das große Mengen verschiedener Antioxidanzien (z. B. GSH) und verschiedener antioxidativer Enzyme (z. B. Katalase, SOD, GSH-px und GSSG-R) umfasst. Daher bestimmten wir die Wirkung von Aristolactam BII auf die Aktivität der antioxidativen Enzyme. Dieses Alkaloid zeigte jedoch keine signifikante Schutzwirkung auf die Aktivität von Katalase, SOD und GSH-px (Daten nicht gezeigt). Daher könnte Aristolactam BII kultivierte Kortexneuronen durch unmittelbare Einwirkung auf NOS vor glutamatinduzierter Neurotoxizität schützen. Es werden jedoch weitere Experimente durchgeführt werden, um diesen postulierten Mechanismus zu bestätigen.
Auf der anderen Seite haben wir bereits (E)-p-Methoxyzimtsäure als Neuroprotektivum patentiert. Daher modifizierten wir die chemische Struktur des Aristolactamalkaloids, um die neuroprotektive Wirkung des echten Aristolactamalkaloids zu verbessern. Wir synthetisierten Saurolactam-3-O-(E)-p-methoxycinnamat (S-MCA), indem wir Saurolactam und E-p-MCA chemisch modifizierten. Die neuroprotektive Wirkung von S-MCA wurde mit unserem in vitro-Kultursystem bestimmt (Tabellen 6 und 7). S-MCA zeigte signifikante neuroprotektive Wirkung auf glutamatinduzierte Neurotoxizität sowohl bei Vorbehandlung als auch bei Nachbehandlung. Das heißt, S-MCA besitzt eine verbesserte neuroprotektive Wirkung im Vergleich mit dem Aristolactamalkaloid, das nur bei Nachbehandlung signifikante Schutzwirkung zeigt, und E-p-MCA, das nur beim Vorbehandlung signifikante Schutzwirkung zeigt. Daher ist S-MCA ein äußerst fähiger Kandidat zur Behandlung und Vorbeugung von neurodegenerativen Erkrankungen.
Diese verbesserte neuroprotektive Wirkung von S-MCA wurde durch unsere fortgeführten experimentellen Untersuchungen weiter bestätigt. S-MCA konnte den durch einen Überschuss von Glutamat induzierten Anstieg von intrazellulärem Ca²⁺ erfolgreich hemmen. Außerdem konnte S-MCA als Folge der erfolgreichen Hemmung des Anstiegs von intrazellulärem Ca²⁺ die NO-Synthese sowohl bei Vorbehandlung als auch dem Nachbehandlung erfolgreich blockieren (Tabelle 9). S-MCA reduzierte außerdem die zelluläre Peroxidmenge bei glutamatgeschädigten Kortexneuronen.
5) Induktion von Neurotoxizität durch Glutamat
Direkt aus fötalen Ratten isolierte Kortexzellen wurden 14 Tage lang kultiviert. Die zu testenden Proben wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen für die kultivierten Zellen behandelt. Nach einer Stunde wurde die Neurotoxizität durch Behandlung mit 100 μM Glutamat induziert. Nach 24 Stunden wurde die Überlebensrate der Zellen mittels MTT-Assay gemessen, um die neuroprotektive Wirkung auf die Proben festzustellen.
6) Statistische Analyse

Die Untersuchung auf statistische Signifikanz erfolgte mit einer Anzahl von 3 (n = 3) für jede Testgruppe. Die Daten wurden mittels Varianzanalyse auf statistische Signifikanz untersucht (ANOVA-Test). Das Vertrauensniveau für die statistische Signifikant wurde auf einen Wahrscheinlichkeitswert von 5 % gesetzt. Tabelle 1. Neuroprotektive Wirkung jeder S. chinensis-Fraktion auf die Zellviabilität von glutamatprovozierten Rattenkortexzellen bei durchgehender Behandlung^a.

	Konzentration (μg/ml)	Viabilität (%)
Kontrolle		100,0 ± 4,2
glutamatbehandelt^b		0,0 ± 1,3
Gesamtextrakt	1	8,0 ± 0,5
	10	24,1 ± 1,2*
	100	45,1 ± 1,5**
CH₂Cl₂-Fr	1	1,0 ± 3,0
	10	27,6 ± 3,6*
	100	52,6 ± 2,9**
n-Hexan-Fr.	1	60,4 ± 1,8***
	10	50,6 ± 0,7**
	100	34,3 ± 2,0*
90 % MeOH-Fr.	1	7,5 ± 0,8
	10	14,6 ± 1,7
	100	0,9 ± 2,2
wässrige Fr.	1	keine Wirkung
	10	keine Wirkung
	100	keine Wirkung
n-BuOH-Fr.	1	keine Wirkung
	10	keine Wirkung
	100	keine Wirkung

^a durchgehende Behandlung: kombinierte Behandlung aus lediglich Vorbehandlung und Wiedergewinnung.
^b Glutamatbehandelt unterscheidet sich signifikant von der Kontrolle bei einem Niveau von p < 0,001.

Die Kontrolle ist der Wert für die Primärkulturen von Rattenkortexzellen. Der Kontrollwert für MTT war eine optische Dichte (OD) von 1,03 ± 0,08. Glutamatbehandelt ist der Wert für die Primärkulturen von Rattenkortexzellen bei 30 min Glutamatexposition. Der MTT-Wert bei Glutamatbehandlung war 0,58 ± 0,02 OD.
Die Viabilität wird berechnet als: 100 × (OD behandelte Probe – OD glutamatbehandelt)/(OD Kontrolle – OD glutamatbehandelt).

Die Ergebnisse unterscheiden sich bei einem Niveau von *: p < 0,05, **: p < 0,01, ***: p < 0,001 signifikant von glutamatbehandelt. Tabelle 2. Wirkung von Saurolactam oder Aristolactam BII auf die Zellviabilität von glutamatprovozierten Rattenkortexzellen bei durchgehender Behandlung^a.

	Konzentration (μM)	Viabilität (%)
Kontrolle		100,0 ± 4,2
glutamatbehandelt^b		0,0 ± 1,3
Saurolactam	0,1	keine Wirkung
	1,0	39,0 ± 1,8*
	10,0	46,6 ± 2,1**
Aristolactam BII	0,1	keine Wirkung
	1,0	60,8 ± 2,1***
	10,0	52,2 ± 3,2**

^a Versuchsprotokoll, Nomenklatur und Fußnoten für Tabelle 2 sind genau wie unter der Legende für Tabelle 1.

^a

	Konzentration (μM)	Viabilität (%)
Kontrolle		100,0 ± 4,2
glutamatbehandelt^b		0,0 ± 1,3
Saurolactam	0,1	0,0 ± 4,5
	1,0	0,0 ± 2,1
	10,0	toxischer Effekt
Aristolactam BII	0,1	0,0 ± 7,8
	1,0	0,0 ± 3,2
	10,0	32,2 ± 0,8*

^a Vorbehandlung: Die Probenbehandlung erfolgte 1 h vor Glutamatprovokation.
^b Glutamatbehandelt unterscheidet sich signifikant von der Kontrolle bei einem Niveau von p < 0,001

Nomenklatur und Fußnoten für Tabelle 3 sind genau wie unter der Legende für Tabelle 1. Tabelle 4. Neuroprotektive Wirkung von Saurolactam oder Aristolactam BII auf die Zellviabilität von glutamatprovozierten Rattenkortexzellen bei Nachbehandlung^a.

	Konzentration (μM)	Viabilität (%)
Kontrolle		100,0 ± 4,2
glutamatbehandelt^b		0,0 ± 1,3
Saurolactam	0,1	0,0 ± 2,9
	1,0	66,3 ± 2,1**
	10,0	32,1 ± 1,9*
Aristolactam BII	0,1	58,5 ± 5,8**
	1,0	68,4 ± 3,5***
	10,0	47,8 ± 2,9**

^a Nachbehandlung: Die Probenbehandlung erfolgte unmittelbar nach der 30-minütigen Glutamatprovokation.
^b Glutamatbehandelt unterscheidet sich signifikant von der Kontrolle bei einem Niveau von p < 0,001.

Nomenklatur und Fußnoten für Tabelle 4 sind genau wie unter der Legende für Tabelle 1. Tabelle 5. Wirkung von Aristolactam BII auf den aus glutamatprovozierten Kortexzellen freigesetzten NO-Gehalt bei Nachbehandlung^a.

	Konzentration (μM)	Nitrit (nM)
Kontrolle		75,5 ± 2,7
glutamatbehandelt^b		145,7 ± 5,2
Aristolactam BII	0,1	87,0 ± 0,8**
	1,0	86,8 ± 2,2**
	10,0	103,2 ± 1,2*
N-Nitro-L-arginin^c	0,1	103,9 ± 3,5*
	1,0	88,5 ± 4,1**
	100,0	109,7 ± 1,9*

^a Versuchsprotokoll, Nomenklatur und Fußnoten für Tabelle 5 sind genau wie unter der Legende für Tabelle 4.
^b Glutamatbehandelt unterscheidet sich signifikant von der Kontrolle bei einem Niveau von p < 0,01.
^c N-Nitro-L-arginin: Stickoxidsynthaseinhibitor

^a

	Konzentration (μM)	Viabilität (%)
Kontrolle		100,0 ± 4,2
glutamatbehandelt^b		0,0 ± 1,3
Saurolactam-3-O-(E)-p-Methoxycinnamat	0,1	29,8 ± 8,2*
	1,0	67,2 ± 9,6***
	10,0	80,6 ± 9,5***

^a Vorbehandlung: Die Probenbehandlung erfolgte 1 h vor Glutamatprovokation.
^b Glutamatbehandelt unterscheidet sich signifikant von der Kontrolle bei einem Niveau von p < 0,001.

Nomenklatur und die Fußnoten für Tabelle 6 sind genau wie unter der Legende für Tabelle 1 beschrieben. Tabelle 7. Neuroprotektive Wirkung von Saurolactam-3-O-(E)-p-methoxycinnamat auf die Zellviabilität von glutamatbehandelten Rattenkortexzellen bei Nachbehandlung^a.

	Konzentration (μM)	Viabilität (%)
Kontrolle		100,0 ± 4,2
glutamatbehandelt^b		0,0 ± 1,3
Saurolactam-3-O-(E)-p-Methoxycinnamat	0,1	62,1 ± 1,8***
	1,0	70,3 ± 3,2***
	10,0	48,2 ± 1,5**

Nomenklatur und Fußnoten für Tabelle 7 sind genau wie unter der Legende für Tabelle 1. Tabelle 8. Wirkung von Saurolactam-3-O-(E)-p-methoxycinnamat auf [Ca²⁺]i bei glutamatprovozierten Rattenkortexzellen bei Vorbehandlung^a.

	Konzentration (μM)	[Ca²⁺]i (nM)
Kontrolle		75,5 ± 15,0
glutamatbehandelt^b		425,4 ± 20,0
Saurolactam-3-O-(E)-p-methoxycinnamat	0,1	233,3 ± 14,9***
	1,0	145,8 ± 26,3***
	10,0	96,1 ± 4,1***

Nomenklatur und Fußnoten für Tabelle 8 sind genau wie unter der Legende für Tabelle 1. Tabelle 9. Wirkung von Saurolactam-3-O-(E)-p-methoxycinnamat auf den NO-Gehalt bei glutamatprovozierten Rattenkortexzellen bei Vor-^a oder Nachbehandlung^b.

	Konzentration (μM)	Nitrit (nM)
		Vorbehandlung	Nachbehandlung
Kontrolle		70,5 ± 15,0
glutamatbehandelt^c		165,9 ± 10,5
Saurolactam-3-O-(E)-p-methoxycinnamat	0,1	125,0 ± 6,8*	143,6 ± 5,7
	1,0	74,8 ± 6,5**	97,5 ± 26,3**
	10,0	71,4 ± 21,**	118,1 ± 2,1**

^a Vorbehandlung: Die Probenbehandlung erfolgte 1 h vor Glutamatprovokation.
^b Nachbehandlung: Die Probenbehandlung erfolgte unmittelbar nach der 30-minütigen Glutamatprovokation.
^c Glutamatbehandelt unterscheidet sich signifikant von der Kontrolle bei einem Niveau von p < 0,01.

Nomenklatur und Fußnoten für Tabelle 8 sind genau wie unter der Legende für Tabelle 1.
Die vorliegende Verbindung der allgemeinen Formel (I) kann mit 1–200 mg/Tag, 1- bis 3-mal verabreicht werden. Dies kann abhängig von Gewicht, Geschlecht, Alter und Schwere der Erkrankung eines Patienten variieren.
Die Verbindung der allgemeinen Formel (I) der vorliegenden Erfindung kann zur Vorbeugung und Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen verwendet werden. Die Verbindung der vorliegenden Erfindung kann entsprechend üblichen Verfahren mit üblichen Trägern zu pharmazeutischen Präparaten formuliert werden, beispielsweise in Form von Injektionen, Lösungen, Sirup, Tabletten oder Kapseln.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Herstellungsbeispiele genauer erläutert. Herstellungsbeispiel 1

Extrakt von S. chinensis 100 mg

destilliertes Wasser zur Injektion QS

Mittel zur pH-Einstellung QS
Der S. chinensis-Extrakt wird in etwas destilliertem Wasser zur Injektion gelöst, und die Mischung wird mit einem Mittel zur pH-Einstellung auf etwa pH 7,6 eingestellt. Die Mischung wurde durch Zugabe von destilliertem Wasser zur Injektion auf 2 ml gebracht und in eine 2 ml-Ampulle gefüllt. Herstellungsbeispiel 2

Verbindung 1 2 mg

destilliertes Wasser zur Injektion QS

Mittel zur pH-Einstellung QS
Verbindung 1 wird in etwas destilliertem Wasser zur Injektion gelöst und die Mischung wird mit einem Mittel zur pH-Einstellung auf etwa pH 7,6 eingestellt. Die Mischung wurde durch Zugabe von destilliertem Wasser zur Injektion auf 2 ml gebracht und in eine 2 ml-Ampulle gefüllt. Herstellungsbeispiel 3

S. chinensis-Extrakt 10 mg

Laktose 100 mg

Stärke 100 mg

Magnesiumstearat QS
Die obigen Bestandteile werden vermischt und mit einem üblichen Tablettierverfahren zu Tabletten verarbeitet. Herstellungsbeispiel 4

Verbindung 2 10 mg

Laktose 100 mg

Stärke 50 mg

Magnesiumstearat QS
Die obigen Bestandteile werden vermischt und mit einem üblichen Tablettierverfahren zu Tabletten verarbeitet. Herstellungsbeispiel 5

S. chinensis-Extrakt 5 mg

Laktose 50 mg

Stärke 50 mg

Talk 2 mg

Magnesiumstearat QS
Die obigen Bestandteile werden vermischt und mit einem üblichen Verfahren zur Kapselbefüllung in Gelatinekapseln gefüllt. Herstellungsbeispiel 6

Verbindung 1 5 mg

Laktose 100 mg

Stärke 93 mg

Talk 2 mg

Magnesiumstearat QS
Die obigen Bestandteile werden vermischt und mit einem üblichen Verfahren zur Kapselbefüllung in Gelatinekapseln gefüllt. Herstellungsbeispiel 7

S. chinensis-Extrakt 50 mg

Zucker 20 g

Isomeratzucker 20 g

Zitronenessenz QS

destilliertes Wasser auf 100 ml
Die obigen Bestandteile werden vermischt und mit einem üblichen Löseverfahren in eine 100 ml-Flasche gefüllt und sterilisiert. Herstellungsbeispiel 8

Verbindung 3 50 mg

Zucker 20 g

Isomeratzucker 20 g

Zitronenessenz QS

destilliertes Wasser auf 100 ml
Die obigen Bestandteile werden vermischt und mit einem üblichen Löseverfahren in eine 100 ml-Flasche gefüllt und sterilisiert.
Gewerbliche Anwendbarkeit
Entsprechend den obigen Versuchen können der Gesamtextrakt von S. chinensis, die Fraktion mit chloriertem Kohlenwasserstoff, die n-Hexan-Fraktionen und die Alkaloide der Aristolactamreihe und die Zimtsäurederivate zur Vorbeugung und Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen wie Schlaganfall oder Alzheimer-Krankheit verwendet werden.

Claims

Verwendung einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) zur Herstellung von Arzneimitteln zur Vorbeugung und Behandlung von Schlaganfall oder Alzheimer-Krankheit
wobei R₁ H, C_1-4-Alkyl oder die Gruppe
ist (in der R₅ H oder C_1-4-Alkyl ist, R₆ H, OH oder C_1-4-Alkyl ist), R₂ C_1-4-Alkyl ist und R₃ C_1-4-Alkyl ist.