KR20110036040A

KR20110036040A - 인지 장해 개선제

Info

Publication number: KR20110036040A
Application number: KR1020117001007A
Authority: KR
Inventors: 기쿠지 야마구치; 야스시 오이즈미; 도루 야마쿠니; 아키라 나카지마; 요시하루 이와부치; 마사토시 시부야
Original assignee: 재팬 로얄 젤리 가부시키가이샤; 도호쿠 다이가쿠
Priority date: 2008-06-17
Filing date: 2009-06-16
Publication date: 2011-04-06
Also published as: EP2311472A4; EP2311472B1; US20130129832A1; US20110287106A1; JP5676881B2; CN101801398A; WO2009154197A1; JPWO2009154197A1; KR101627001B1; EP2311472A1

Abstract

본 발명은, 인지 장해, 특히 바람직하게는 알츠하이머병의 예방 또는 치료에 유용한 인지 장해 개선제를 제공한다. 본 발명의 인지 장해 개선제는 로열 젤리를 유효 성분으로서 포함한다.

Description

인지 장해 개선제{COGNITIVE DISORDER-AMELIORATING AGENT}

본 발명은, 노빌레틴 또는 그의 유사체 또는 감귤류 진액(extract) 및 로열 젤리를 유효 성분으로서 포함하는 인지 장해 개선제에 관한 것이다.

고령화 사회가 되고 있는 일본에서 고령에 기인한 집중력, 기억력, 정리 능력, 계획 능력, 문제 해결 능력 등의 인지 장해, 특히 그의 대표적인 질환인 알츠하이머병의 예방 및 치료가 중대한 문제가 되고 있다.

대부분의 감귤류에 포함되는 폴리메톡시플라보노이드 중 하나인 노빌레틴은 기억을 담당하는 정보 전달 촉진 작용이 있고, 학습 장해의 항진을 억제한다는 것이 보고되어 있으며, 알츠하이머병 등의 인지 장해 개선제로서 유용하다고 알려져 있다(특허문헌 1 및 2).

로열 젤리(Royal jelly)는 꿀벌 중 젊은 일벌의 인두선으로부터의 분비물이며, 여왕벌이 되는 유충이나 성충이 된 여왕벌의 음식물로서 급이(給餌)된다. 일벌의 40배나 장수하는 여왕벌의 생애에서 유일한 에너지원이다. 또한, 벌꿀과는 비교가 되지 않을 정도로 많은 비타민류, 미네랄, 아미노산이 포함되어 있으며, 고단백질일 뿐만 아니라 다양한 영양소를 포함하고 있다는 것이 알려져 있다. 그러나, 로열 젤리의 인지 장해에 대한 효과는 아직 알려져 있지 않다.

일본 특허 공개 제2002-60340호 공보 국제 공개 WO2005-082351호 공보

본 발명의 과제는 인지 장해, 특히 바람직하게는 알츠하이머병의 예방 또는 치료에 유용한 인지 장해 개선제를 제공하는 것에 있다.

본 발명자들은 예의 검토를 거듭한 결과, 노빌레틴 또는 그의 유사체 또는 감귤류 진액, 및 로열 젤리를 유효 성분으로서 포함하는 조성물이 학습 장해 모델에 대하여 매우 우수한 효과를 나타낸다는 것을 최초로 발견하여, 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명은,

[1] 로열 젤리를 유효 성분으로서 포함하는 인지 장해 개선제,

[2] 노빌레틴 또는 그의 유사체 또는 감귤류 진액, 및 로열 젤리를 유효 성분으로서 포함하는 인지 장해 개선제,

[3] 노빌레틴 또는 그의 유사체 및 로열 젤리, 및 홍경천(紅景天, Rhodiola sacra) 진액, 은행나무잎 진액 및 페룰산을 유효 성분으로서 포함하는 인지 장해 개선제,

[4] 2'-히드록시-3',4',5',6'-테트라메톡시아세토페논을 4-벤질옥시-3-메톡시벤즈알데히드와 반응시켜 3-(4-벤질옥시-3-메톡시페닐)-1-(2-히드록시-3,4,5,6-테트라메톡시페닐)-프로페논을 얻는 공정,

얻어진 3-(4-벤질옥시-3-메톡시페닐)-1-(2-히드록시-3,4,5,6-테트라메톡시페닐)-프로페논을 요오드의 존재하에 반응시켜 3-(4-벤질옥시-3-메톡시페닐)-1-(2-히드록시-3,4,5,6-테트라메톡시페닐)-프로페논을 얻는 공정, 및

얻어진 3-(4-벤질옥시-3-메톡시페닐)-1-(2-히드록시-3,4,5,6-테트라메톡시페닐)-프로페논을 수소 및 팔라듐탄소의 존재하에 반응시켜 2-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-5,6,7,8-테트라메톡시크로멘-4-온을 얻는 공정을 포함하는 4-탈메틸화 노빌레틴의 제조 방법

에 관한 것이다.

도 1은, PC12D 세포에서의 ERK 인산화에 대한 로열 젤리 및 노빌레틴의 영향을 나타낸다. 데이터는 평균±표준 오차(n=3)이다. *는 용매에 대하여 p<0.05이고, ***는 p<0.001이다(n=3). 횡축의 Veh는 용매이고, Nb30은 30 μM 노빌레틴이고, RJ1/200 및 RJ1/100은 각각 200배 및 100배 희석한 로열 젤리이고, RJ1/200+Nb30 및 RJ1/100+Nb30은 각각 200배 및 100배 희석한 로열 젤리+30 μM 노빌레틴이다. 종축은 전체 ERK에 대한 인산화 ERK의 상대값이다.
도 2는, PC12D 세포에서의 ERK 인산화의 로열 젤리 유도 자극에 대한 노빌레틴의 증강 효과를 나타낸다. 적어도 3회의 독립된 시험으로부터 얻어진 대표적인 결과를 나타낸다(상부). 종축의 수치는, PC12D 세포에서의 ERK 인산화에 대한 농도 측정치이고, 대상군(0.1 ％ DMSO)의 수치에 대한 상대값으로 나타내었다. *는 용매에 대하여 p<0.05이고, **는 p<0.01이고, ***는 p<0.005이다. ##는 30 μM 노빌레틴에 대하여 p<0.01이고, ###는 p<0.005이다. +는 400배 희석 로열 젤리에 대하여 p<0.05이고, +++는 p<0.01이다. 수치는 평균±표준 오차(n=3)이다. Veh는 용매이고, Nb30은 30 μM 노빌레틴이고, RJ1/400, RJ1/200 및 RJ1/100은 각각 400배, 200배 및 100배 희석한 로열 젤리이고, RJ1/400+Nb30, RJ1/200+Nb30 및 RJ1/100+Nb30은 각각 400배, 200배 및 100배 희석한 로열 젤리+30 μM 노빌레틴이다.
도 3은 PC12D 세포에서의 CRE 의존적 전사에 미치는 로열 젤리(RJ)와 노빌레틴(nobiletin)의 병용 효과를 나타낸다. 데이터는 평균±S.E.M(n=4)이다. *는 RJ에 대하여 p<0.05이고, **는 RJ에 대하여 p<0.001이다.
도 4는 PC12D 세포에서의 CRE 의존적 전사에 미치는 로열 젤리 및 감귤류 진액의 병용 효과를 나타낸다. 데이터는 평균±S.E.M(n=4)이다. *는 대조군에 대하여 p<0.05이고, **는 감귤류 진액에 대하여 p<0.001이다.
도 5는, 배양 래트 해마 신경 세포에서의 CRE 의존적 전사에 대한 노빌레틴의 농도 의존 효과를 나타낸다. 세포를 8×10⁴/48 웰 플레이트의 밀도로 파종하고, 플레이트를 10-14일간 유지하였다. 이어서, 세포를 CRE 의존적 전사를 나타내는 루시페라아제 리포터 컨스트럭트(luciferase reporter construct)를 사용하여 16 시간 동안 형질감염하였다. 형질감염 후, 세포를 상이한 농도의 4-탈메틸화 노빌레틴으로 8 시간 동안 처리하였다. 데이터는 평균±S.E.M(n=6)이다. *는 대조군에 대하여 p<0.05이고, **는 대조군에 대하여 p<0.001이다.
도 6은 배양 래트 해마 신경 세포에서의 CRE 의존적 전사에 대한 4-탈메틸노빌레틴의 농도 의존 효과를 나타낸다. 세포를 8×10⁴/48 웰 플레이트의 밀도로 파종하고, 플레이트를 10-14일간 유지하였다. 이어서, 세포를 CRE 의존적 전사를 나타내는 루시페라아제 리포터 컨스트럭트를 사용하여 16 시간 동안 형질감염하였다. 형질감염 후, 세포를 상이한 농도의 4-탈메틸화 노빌레틴으로 8 시간 동안 처리하였다. 데이터는 평균±S.E.M(n=6)이다. *는 대조군에 대하여 p<0.05이고, **는 대조군에 대하여 p<0.001이다.

본 발명에 사용할 수 있는 노빌레틴에는, 5,6,7,8,3',4'-헥사메톡시플라본, 그의 약학적으로 허용될 수 있는 염, 이들의 수화물 또는 용매화물이 포함된다.

본 발명의 노빌레틴은, 당업자에게 주지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 또한, 귤과 식물로부터 추출할 수도 있다. 본 발명에서는, 노빌레틴을 포함하는 귤과 식물의 추출물을 사용할 수도 있다. 예를 들면, 노빌레틴의 유사체인 4'-히드록시-5,6,7,8,3'-펜타메톡시플라본(4-탈메틸화 노빌레틴), 그의 약학적으로 허용될 수 있는 염, 이들의 수화물 또는 용매화물이 포함된다.

귤과 식물로서는 히라미 레몬(Citrus depressa), 온주 밀감(Citrus unshiu), 탄제린(Citrus tangerina), 동정귤(Citrus erythrosa), 등자(Citrus aurantium), 지중해 만다린(Citrus deliciosa), 자몽(Citrus grandis), 기주 밀감(Citrus kinokuni), 뽕깡(Citrus reticulata), 홍귤(Citrus tachibana), 진귤(Citrus sunki) 등을 들 수 있다.

본 발명에 사용되는 귤과 식물의 추출물은, 채취 후 미처리된 상태 또는 건조된 상태 중 어느 한 상태로부터 추출된 것일 수도 있다. 부위로서는, 성숙 또는 미성숙 과실, 과피, 종자, 잎, 잎자루, 가지, 뿌리, 꽃 등을 들 수 있다. 바람직하게는 과실, 과피이다.

본 발명에 사용할 수 있는 로열 젤리는 특별히 한정되지 않고, 시판되어 있는 로열 젤리를 사용할 수 있다. 바람직하게는, 재팬 로얄 젤리사의 제품을 들 수 있다. 본 발명에서 특별히 기재하지 않는 경우에는, 로열 젤리 동결 건조 분말(FD 분말)로 한다.

본 발명에서 노빌레틴의 함유량은 0.0025 중량％ 내지 2.00 중량％, 바람직하게는 0.005 중량％ 내지 1.50 중량％, 보다 바람직하게는 0.01 중량％ 내지 1.00 중량％이다. 한편, 노빌레틴을 10 ％ 포함하는 진액을 사용한 경우에는 0.025 중량％ 내지 20.0 중량％, 바람직하게는 0.05 중량％ 내지 15.0 중량％, 보다 바람직하게는 0.1 중량％ 내지 10.0 중량％이다. 또한, 로열 젤리의 함유량은, 로열 젤리 FD 분말로서 3 중량％ 내지 60 중량％, 바람직하게는 5 중량％ 내지 45 중량％, 보다 바람직하게는 10 중량％ 내지 30 중량％이다.

본 발명에서 노빌레틴 함유량과 로열 젤리 함유량의 비율은 2:3 내지 1:24000, 바람직하게는 3:10 내지 1:9000, 보다 바람직하게는 1:10 내지 1:600이다. 한편, 노빌레틴을 10 ％ 포함하는 진액을 사용한 경우에는 20:3 내지 1:2400, 바람직하게는 3:1 내지 1:900, 보다 바람직하게는 1:1 내지 1:60이다.

본 발명의 인지 장해 개선제는 의약품, 의약 부외품 또는 식품 등에 배합할 수 있다. 또한, 본 발명의 신경 돌기 신장제는 경구 투여 또는 비경구 투여 모두에 사용할 수 있다.

의약품의 형태로서는 정제, 캡슐제, 과립제, 시럽제 등을 들 수 있다. 이들 의약품은, 통상적인 의약 제조에서의 첨가제를 사용하여 제조할 수 있다.

본 발명의 인지 장해 개선제의 투여량은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 경구 투여의 경우에는 1일당 10 내지 60 mg/kg체중, 바람직하게는 1일당 20 mg/kg체중이고, 비경구 투여의 경우에는 1일당 2 내지 6 mg/kg체중, 바람직하게는 2 내지 3 mg/kg체중이다. 상기 투여량은 1일 1회 또는 2 내지 3회로 나누어 투여할 수 있으며, 연령, 병태, 증상에 따라 적절하게 증감할 수도 있다.

첨가제의 구체예로서는 락토오스, 덱스트린, 수크로오스, 만니톨, 옥수수 전분, 소르비톨, 결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈 등을 들 수 있으며, 이들을 단독으로 또는 적절하게 조합하여 사용할 수 있다. 이들 의약품은, 일본 약전의 기재에 따라 각각의 의약품의 형태에 적합한 방법으로 제조할 수 있다. 또한, 향미료, 착색료, 감미료 등을 적절하게 사용할 수도 있다. 이들 첨가제의 함유량은 당업자가 적절히 선택할 수 있다.

의약 부외품의 형태로서는, 정제, 캡슐제, 과립제, 젤리제, 드링크제 등을 들 수 있다. 이들 의약 부외품은, 통상적인 의약 부외품 제조에서의 첨가제를 사용하여 제조할 수 있다. 또한, 이들 의약 부외품은, 예를 들면 비타민류 등의 다른 유효 성분을 함유할 수도 있다. 또한, 감미료, 향미료, 착색료, 산화 방지제 등의 첨가제를 단독으로 또는 적절하게 조합하여 사용할 수도 있다. 이들 의약 부외품은, 당업자에게 주지된 방법으로 제조할 수 있다.

식품의 형태로서는, 면, 파스타, 과립, 정제, 젤리, 액체(음료) 등을 들 수 있다. 이들 식품은 다양한 식품 재료를 적절하게 사용하여 제조할 수 있다. 식품 재료의 구체예는, 쌀, 소맥, 옥수수, 감자, 고구마, 대두 분말, 해초 분말, 물엿, 젖당, 글루코오스, 과당, 수크로오스, 만니톨 등이며, 이들을 단독으로 또는 적절하게 조합하여 사용할 수 있다. 필요에 따라 물 등의 사용에 의해 원하는 형상으로 할 수 있다. 또한, 향미료, 착색료, 감미료, 식용유, 비타민류 등을 적절하게 첨가할 수도 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명하지만, 이것은 그의 대표예를 나타내는 것이며, 본 발명은 이 실시예로 한정되지 않는다.

[실시예]

cAMP/PKA/ERK/CREB 의존적 시그널 전달 경로는, 뇌의 기억ㆍ학습 능력과 밀접한 관련이 있다는 것이 증명되어 있다. 최근, 뇌 내에서의 아밀로이드 β 단백질(Aβ)의 축적에 기인한 신경의 변성ㆍ탈락뿐만 아니라 가용성 Aβ에 의한 신경 세포사를 동반하지 않는 시냅스 가소성 장해는, 알츠하이머병(AD)에서의 기억 장해의 원인 중 하나로 이해되고 있다. 예를 들면, 학습 및 기억 형성의 세포 기구 중 하나라고 생각되고 있는 해마 글루탐산 시냅스에서의 신경 전달의 장기간 증강(LTP)은, 시냅스 가소성의 대표적인 예이다. Aβ는 PKA/CREB 시그널 전달을 저해하여, 이 LTP의 발생을 억제한다고 알려져 있다. 즉, 이러한 Aβ에 의한 시그널 전달 저해를 개선 또는 억제하는 생리 활성 물질을 함유하는 식품은 AD의 개선ㆍ예방에 유용하다고 생각된다.

따라서, 신경 세포의 모델 세포로 생각되고 있는 PC12D 세포에서의 로열 젤리의 ERK의 활성에 대한 효과, 및 로열 젤리와 노빌레틴 병용의 ERK의 활성에 대한 효과를 "로열 젤리 FD 분말"의 수용성 성분의 ERK의 인산화에 대한 영향을 지표로 하여 웨스턴 블로팅(western blotting)법으로 검토하였다.

1. 실험 방법

PC12D 세포의 배양

PC12D 세포(아이치현 콜로니 연구소)는, 비동화(56 ℃, 30분)한 5 ％ 말 혈청(HS: Gibco), 10 ％ 소 태아 혈청(FCS: CELLect), 페니실린(50 단위/mL) 및 스트렙토마이신(50 μg/mL)을 첨가한 둘베코 개변 이글 배지(DMEM: Dulbecco's Modified Eagle Medium)를 사용하여 계대 배양하였다. 세포는 37 ℃로 보온한 95 ％ air-5 ％ CO₂를 포함하는 인큐베이터 중에서 배양하였다. 또한, 본 실험에서는 HS가 2 ％, FCS가 1 ％가 되도록 조정한 배지를 약물의 희석에 사용하였다.

"로열 젤리 FD 분말" 모액(stock solution)(25 ％(w/v))의 제조

멸균한 주걱을 사용하여 멸균된 2 ml 튜브에 0.25 g의 "로열 젤리 FD 분말"(재팬 로얄 젤리 가부시끼가이샤)을 칭량투입하였다. 그 후, 무균 실험대 내에서, 멸균된 PBS(-)를 첨가하여 용량을 1 ml로 하였다. 교반 후, 냉장고로 옮겨서 1 시간마다 교반을 반복하고, 밤새 냉장고 내에 정치시켰다. 다음날, 교반한 후 12000×g, 4 ℃에서 10분간 원심하였다. 그 상청을 필터 멸균하고, 분주한 후 -20 ℃에서 동결 보존하였다.

웨스턴 블로팅

35 mm 디쉬에 PC12D 세포를 1×10⁶ 세포/디쉬로 파종하고, CO₂ 인큐베이터 내에서 24 시간 동안 배양한 후, 약물로 처리하였다. 약물 처리한 세포를 90 μl의 세포 가용화액(1 mM EDTA, 1 ％ SDS, 10 mM NaF, 10 nM 칼리쿨린(calyculin), 320 nM 오카다산, 1 mM 오르토바나듐산나트륨, 1 mM p-APMSF, 10 μg/ml 펩스타틴, 10 μg/ml 안티팬, 10 μg/ml 류펩틴, 10 μg/ml 키모스타틴, 10 μg/ml 포스포라미돈, 10 mM HEPES(pH 7.5))으로 가용화한 후, 1.5 ml 튜브에 회수하고, 95 ℃에서 5분간 가열하였다. 또한, 빙수 중에서 5분간 초음파 처리한 후, 14,000 rpm으로 20분간 원심하고, 상청을 회수하여 단백질을 정량하였다. 그 후, SDS-PAGE 샘플 버퍼를 첨가하였다. SDS-PAGE 후, 웨스턴 블로팅법에 의해 PVDF 멤브레인에 단백질을 전사하고, 블록킹 버퍼(10 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 0.05 ％ 트윈(Tween) 20, 5 ％ 탈지유; pH 7.4)를 사용하여 2 시간 동안 블록킹하였다. 그 후, 멤브레인을 TBST로 세정하고, 블록킹 버퍼로 희석한 일차 항체와 4 ℃에서 밤새 인큐베이트하였다. 또한, 멤브레인을 TBST로 세정하고, 블록킹 버퍼로 희석한 HRP 표지 IgG 항체와 실온에서 2 시간 동안 인큐베이트하고, 재차 TBST로 세정하였다. 밴드의 검출에는 ECL법을 이용하였다. 리프로빙(reprobing)은 스트리핑 버퍼(stripping buffer)(62.5 mM 트리스-HCl, 2 ％ SDS, 100 mM β-머캅토 에탄올; pH 7.4)를 사용하여 항체를 제거하고, 그 후 내부 표준 단백질을 검출하였다.

데이터 해석

실험값을 평균값±표준 오차로 표시하였다. 통계 처리는 스튜던트(Student) t 검정, 분산 분석 및 던네트(Dunnett) 검정을 이용하고, 위험률 5 ％ 미만인 경우를 유의차가 있는 것으로 판정하였다.

2. 결과

PC12D 세포에서의 ERK 인산화에 대한 로열 젤리 및 노빌레틴의 효과

PC12D 세포를 1×10⁶ 세포/3.5 cm 디쉬의 세포 밀도로 파종하고, 밤새 배양하고, 다양한 약물을 포함하는 저혈청 배지로 15분간 처리하고, 세포 가용화액으로 세포를 용해시켜 세포 추출액을 얻었다. 웨스턴 블로팅법을 이용하여 이 세포 추출액 중의 p-ERK 및 전체 ERK의 발현량을 분석하였다. 또한, 로열 젤리 용액은 25 ％ 용액을 제조한 후, 저혈청 배지로 희석하여 실험에 사용하였다.

그 결과, PC12D 세포에서 로열 젤리는, 400배 내지 100배 희석(0.0625-0.25％(w/v))의 농도에서 기억ㆍ학습의 세포 기구 중 하나인 시냅스 전달의 장기간 증강에 중요한 역할을 한다고 알려져 있는 cAMP/PKA/ERK/CREB 의존적 시그널 전달 경로의 중요한 구성 분자인 ERK의 인산화를 현저히 촉진시켰다(도 1 및 도 2). 한편, 30 μM 노빌레틴 처리군에서는, ERK의 인산화의 약한 촉진 작용이 관찰되었다(도 2).

PC12D 세포에서의 로열 젤리 유도성의 ERK 인산화의 촉진에 대한 노빌레틴의 효과

또한, 매우 흥미로운 결과가 얻어졌다. 즉, 단독으로는 ERK의 인산화의 약한 촉진 작용만 나타내었던 30 μM 노빌레틴은, 로열 젤리의 현저한 ERK의 인산화촉진 활성을 더욱 증강시킨다는 것이 판명되었다. 이것은, 로열 젤리와 노빌레틴의 병용이 기억ㆍ학습과 밀접히 관련된 cAMP/PKA/ERK/CREB 의존적 시그널 전달을 현저히 촉진시킬 가능성이 있다는 것을 강하게 나타내는 것이다(도 2).

C12D 세포에서의 로열 젤리 단독, 또는 로열 젤리와 노빌레틴 병용의 cAMP/PKA/ERK/CREB 의존적 시그널 전달에 대한 작용의 검토를 행하였다. PC12D 세포의 배양, "로열 젤리 FD 분말" 모액(25 ％(w/v))의 제조는 상기에 기재된 방법으로 행하였다.

1. 실험 방법

래트 해마 신경 세포 초대 배양

임신 SD 래트(E18)를 에테르 마취한 후, 경추 탈구시켰다. 그 후, 복부를 70 ％ EtOH로 소독한 후, 복부 정중 절개에 의해 태아를 적출하였다. 또한, 래트 태아로부터 뇌를 적출하고, 실태 현미경하에 해마를 분리하였다. 해마 신경 세포의 배양은, 스미또모 베이크라이트사 제조의 스미토모 너브 셀 컬쳐 시스템을 사용하여 행하였다. 파파인 효소를 포함하는 분산액(SUMILON)으로 해마 조직을 분산시키고, 1,000 rpm으로 4분간 원심한 후, 상청을 제거하였다. 펠릿을 분산액(SUMILON) 중에서 분산시키고, 피펫팅에 의해 충분히 분산시킨 세포에 제거액(SUMILON)을 첨가하여 800 rpm으로 5분간 원심한 후, 상청을 제거하였다. 펠릿을 뉴로버살(Neurobasal) 배지(페놀 레드를 포함하지 않는 뉴로버살 배지 500 ml, 50×B-27 서플리먼트 10 m1, 0.5 mM L-글루타민, 0.005 ％ 페니실린-스트렙토마이신)를 사용하여 현탁하고, 폴리리신 코팅한 48 웰 플레이트에 8×10⁴ 세포/웰로 파종하고, 배양 1일 후에 PBS로 세정한 후 새로운 배지로 교환하고, 그 후에는 2-3일 간격으로 배지 반량 교환에 의해 10 μMAraC 함유 배지로 배양하였다.

형질감염 및 리포터 유전자 분석

PC12D 세포를 48 웰 플레이트에 8×10⁴ 세포/웰로 파종하고, 증식 배지에서 24 시간 동안 배양한 후, pCRE의 리포터 유전자 플라스미드(반딧불이ㆍ루시페라아제)를 0.1 μg/웰, 내부 표준용의 pRG-TK 플라스미드(레닐라ㆍ머시룸 루시페라아제)를 0.01 μg/웰의 농도로 리포펙타민(상표) 2000 시약(인비트로젠(Invitrogen)사)을 사용하여 공-형질감염하였다. 형질감염 16 시간 후에 다양한 약물을 첨가한 배지로 교환하였다. 다양한 농도의 약물을 포함하는 배지로 5 시간 동안 처리한 후, 배지를 흡인하고, 패시브 라이시스 버퍼(passive lysis buffer)(듀얼-루시페라아제 리포터 분석 시스템 카탈로그 # E1960(프로메가(Promega)사))를 세포에 첨가하여 용해시켜 회수하였다. 또한, 반딧불이 및 레닐라 머시룸 루시페라아제의 활성은 듀얼-루시페라아제 리포터 분석 시스템(프로메가사)을 사용하여 광도계(Mini Lumat LB9506(베르톨트(BERTHOLD)사))로 측정하였다.

한편, 상기한 방법으로 제조한 해마 신경 세포를 뉴로버살 배지로 10-14일간 배양한 후, 리포터 플라스미드(0.1 μg/웰), 레닐라 머시룸 pRG-TK 플라스미드(0.01 μg/웰)를 리포펙션법으로 형질변환하고, 일정 시간 약물 처치하였다. 전사 활성의 측정은 프로메가사 제조의 듀얼-루시페라아제(등록 상표) 리포터 분석 시스템을 사용하여 행하였다.

통계학적 해석

리포터 유전자 분석에서 얻어진 결과를 일원분산분석(one-way ANOVA(Tukey))을 사용하여 평가하였다. 유의 수준을 양측 5 ％로 하여 검정하고, p<0.05를 유의로 하였다.

PC12D 세포에서의 CRE 의존적 전사에 미치는 로열 젤리(RJ)와 노빌레틴의 병용 효과를 검토하였다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 로열 젤리 단독으로도 PC12D 세포에서의 CRE 의존적 전사에 미치는 영향을 나타내지만, 15 μM 노빌레틴 또는 30 μM 노빌레틴을 병용하면 그 효과는 보다 높아지고, 15 μM 노빌레틴보다 첨가량을 늘린 30 μM 노빌레틴을 병용한 시험구가 CRE 의존적 전사에 미치는 영향이 높아진다는 것을 알 수 있었다.

이어서, PC12D 세포에서의 CRE 의존적 전사에 미치는 로열 젤리 및 감귤류 진액의 병용 효과를 검토하였다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 로열 젤리 단독으로도 PC12D 세포에서의 CRE 의존적 전사에 미치는 영향을 나타내지만, 노빌레틴을 포함하는 감귤류 진액을 병용한 경우, CRE 의존적 전사에 미치는 영향이 보다 높아진다는 것을 알 수 있었다.

또한, 초대 배양 래트 해마 신경 세포에서의 CRE 의존적 전사에 미치는 노빌레틴의 효과를 검토하였다.

CRE 의존적인 전사에 미치는 노빌레틴의 효과에 대하여 리포터 유전자 분석법을 이용하여 검토한 결과, 해마 신경 세포에서 노빌레틴은 농도 의존적으로 CRE 의존적인 전사를 촉진하였다.

도 5에 나타낸 바와 같이, CRE 의존적인 전사에 미치는 노빌레틴의 효과에 대하여 리포터 유전자 분석법을 이용하여 검토한 결과, 해마 신경 세포에서 노빌레틴은 농도 의존적으로 CRE 의존적인 전사를 촉진하였다. 또한, 도 6에 나타낸 바와 같이, 4-탈메틸노빌레틴도 노빌레틴과 같이 농도 의존적으로 CRE 의존적인 전사를 촉진하였다.

이하에 4-탈메틸노빌레틴의 제조 방법의 예를 나타낸다. 단, 4-탈메틸노빌레틴의 제조 방법은 기재된 방법으로 한정되지 않는다.

4-탈메틸화 노빌레틴의 유기 합성 반응식을 하기에 나타내었다.

3,4,5-트리메톡시페놀(2)

3,4,5-트리메톡시벤즈알데히드(2.0 g, 10.2 mmol)의 MeOH(20.4 ml, 0.5 M) 용액에 빙냉하에 농황산(0.54 ml, 10.2 mmol)을 첨가한 후, 30 ％ 과산화수소 수용액(3.5 ml, 30.6 mmol)을 천천히 첨가하였다. 실온에서 15분간 교반한 후, 빙냉하에 10 ％ 수산화나트륨 수용액과 아황산나트륨을 첨가하여 반응을 정지시켰다. AcOEt로 추출한 유기층을 브라인으로 세정한 후, MgSO₄로 건조하고, 감압하에 용매를 증류 제거하였다. 잔사를 실리카 겔 크로마토그래피에 첨가하고, AcOEt/헥산(5:6 v/v) 용출부로부터 3,4,5-트리메톡시페놀(1.08 g, 7.0 mmol, 58 ％)을 무색 고체로서 얻었다.

1,2,3,4,5-펜타메톡시벤젠(3)

3,4,5-트리메톡시페놀(0.10 g, 0.54 mmol)의 DMF(3.6 ml, 0.15 M) 용액에 실온하에 2-요오독시벤조산(IBX)(160 mg, 5.7 mmol)을 첨가하고, 30분간 교반하였다. 10 ％ Pd/C(10 mg)를 첨가한 후, 계 내를 수소 분위기로 치환하여 1일간 교반하였다. 계 내를 아르곤 분위기로 되돌린 후, 탄산칼륨(220 mg, 1.6 mmol)과 황산디메틸(0.13 ml, 1.4 mmol)을 첨가하고, 3 시간 동안 실온에서 교반한 후, 반응 용액을 셀라이트 여과하고, 감압하에 용매를 증류 제거하였다. 잔사를 Et₂O로 추출한 유기층을 브라인으로 세정한 후, MgSO₄로 건조하고, 감압하에 용매를 증류 제거하였다. 잔사를 실리카 겔 크로마토그래피에 첨가하고, AcOEt/헥산(5:7 v/v) 용출부로부터 1,2,3,4,5-펜타메톡시벤젠(42 mg, 0.18 mmol, 34 ％)을 무색 고체로서 얻었다.

1,2,3,5-테트라메톡시벤젠(6)

2,6-디메톡시[1,4]벤조퀴논(10 g, 58.8 mmol)을 라니-Ni(3.5 g)의 MeOH(100 ml, 0.59 M) 용액에 첨가하고, 실온, 수소 분위기하에 6 시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 셀라이트 여과하고, 감압하에 용매를 증류 제거함으로써 조(粗) 2,6-디메톡시벤젠-1,4-디올을 얻었다.

조 2,6-디메톡시벤젠-1,4-디올(<58.8 mmol)의 아세톤(100 ml, <0.59 M) 용액에 탄산칼륨(41 g, 297 mmol)과 황산디메틸(14 ml, 147 mmol)을 첨가하고, 3 시간 동안 가열 환류하여 교반하였다. AcOEt로 추출한 유기층을 브라인으로 세정한 후, MgSO₄로 건조하고, 감압하에 용매를 증류 제거하였다. 잔사를 실리카 겔 크로마토그래피에 첨가하고, AcOEt/헥산(1:2 v/v) 용출부로부터 1,2,3,5-테트라메톡시벤젠(11.5 g, 158.1 mmol, 99 ％)을 무색 유상으로서 얻었다.

2'-히드록시-3',4',6'-트리메톡시아세토페논(7)

1,2,3,5-테트라메톡시벤젠(11.5 g, 58.1 mmol)의 Et₂O(200 ml, 0.29 M) 용액에 AlCl₃(26 g, 192 mmol)을 빙냉하에 첨가하였다. 그 후, AcCl(5.4 ml, 75.5 mmol)을 천천히 첨가하고, 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 빙냉하에 물을 알루미늄이 용해될 때까지 첨가함으로써 반응을 정지시켰다. Et₂O로 추출한 유기층을 브라인으로 세정한 후, MgSO₄로 건조하고, 감압하에 용매를 증류 제거하였다. 잔사를 실리카 겔 크로마토그래피에 첨가하고, AcOEt/헥산(1:1 v/v) 용출부로부터 2'-히드록시-3',4',6'-트리메톡시아세토페논(11.1 g, 49.1 mmol, 85 ％)을 황색 고체로서 얻었다.

2'-히드록시-3',4',5',6'-테트라메톡시아세토페논(9)

2'-히드록시-3',4',6'-트리메톡시아세토페논(10.8 g, 47.7 mmol)의 MeOH(130 ml, 0.37 M) 용액에 빙냉하에 10 ％ 수산화나트륨 수용액(40 ml, 48 mmol)을 첨가한 후, 6 ％ 과산화수소 수용액(82 ml, 143 mmol)을 천천히 첨가하였다. 실온에서 30분간 교반한 후, 빙냉하에 10 ％ 염산과 아황산나트륨을 첨가하여 반응을 정지시켰다. AcOEt로 추출한 유기층을 브라인으로 세정한 후, MgSO₄로 건조하고, 감압하에 용매를 증류 제거함으로써 조 3,4,6-트리메톡시벤젠-1,2-디올을 무색 고체로서 얻었다.

조 3,4,6-트리메톡시벤젠-1,2-디올의 아세톤(150 ml) 용액에 탄산칼륨(170 g, 1.2 mol)과 황산디메틸(22 ml, 239 mmol)을 첨가한 후, 3 시간 동안 가열 환류하였다. AcOEt로 추출한 유기층을 브라인으로 세정한 후, MgSO₄로 건조하고, 감압하에 용매를 증류 제거하였다. 잔사를 실리카 겔 크로마토그래피에 첨가하고, AcOEt/헥산(5:7 v/v) 용출부로부터 1,2,3,4,5-펜타메톡시벤젠(11.5 g, 158.1 mmol, 99 ％)을 디메틸황산과 분리가 불가능한 혼합물로서 얻었다.

조 1,2,3,4,5-펜타메톡시벤젠의 Et₂O(300 ml) 용액에 AlCl₃(42 g, 313 mmol)을 빙냉하에 첨가하였다. 그 후, AcCl(14 ml, 187.5 mmol)을 천천히 첨가하고, 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 빙냉하에 물을 알루미늄이 용해될 때까지 첨가하여 반응을 정지시켰다. Et₂O로 추출한 유기층을 브라인으로 세정한 후, MgSO₄로 건조하고, 감압하에 용매를 증류 제거하였다. 잔사를 실리카 겔 크로마토그래피에 첨가하고, AcOEt/헥산(1:3 v/v) 용출부로부터 2'-히드록시-3',4',5',6'-테트라메톡시아세토페논(4.5 g, 17.6 mmol, 37 ％)을 황색 유상으로서 얻었다.

3-(4-벤질옥시-3-메톡시페닐)-1-(2-히드록시-3,4,5,6-테트라메톡시페닐)-프로페논 (10)

4-벤질옥시-3-메톡시벤즈알데히드(340 mg, 1.41 mmol)와 2'-히드록시-3',4',5',6'-테트라메톡시아세토페논(240 mg, 0.94 mmol)의 EtOH(5.0 ml, 0.19 M) 용액에 실온하에 50 ％ 수산화칼륨 수용액(0.37 ml, 3.3 mmol)을 적하하였다. 24 시간 동안 교반한 후, 빙냉하에 10 ％ 염산을 첨가함으로써 반응을 정지시키고, AcOEt로 추출하였다. 유기층을 브라인으로 세정한 후, MgSO₄로 건조하고, 감압하에 용매를 증류 제거하였다. 잔사를 실리카 겔 크로마토그래피에 첨가하고, AcOEt/헥산(1:2 v/v) 용출부로부터 3-(4-벤질옥시-3-메톡시페닐)-1-(2-히드록시-3,4,5,6-테트라메톡시페닐)-프로페논(0.32 g, 0.66 mmol, 71 ％)을 황색 고체로서 얻었다.

2-(4-벤질옥시-3-메톡시페닐)-5,6,7,8-테트라메톡시크로멘-4-온 (11)

3-(4-벤질옥시-3-메톡시페닐)-1-(2-히드록시-3,4,5,6-테트라메톡시페닐)-프로페논(95 mg, 0.20 mmol)의 DMSO(1.5 ml, 0.13 M) 용액에 실온하에 요오드(3 mg, 0.01 mmol)를 첨가하고, 150 ℃에서 1.5 시간 동안 교반하였다. 빙냉하에 아황산나트륨을 첨가하여 반응을 정지시켰다. Et₂O로 추출한 유기층을 브라인으로 세정한 후, MgSO₄로 건조하고, 감압하에 용매를 증류 제거하였다. 잔사를 실리카 겔 크로마토그래피에 첨가하고, AcOEt/헥산(3:1 v/v) 용출부로부터 2-(4-벤질옥시-3-메톡시페닐)-5,6,7,8-테트라메톡시크로멘-4-온(79 mg, 0.16 mmol, 83 ％)을 황색 고체로서 얻었다.

2-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-5,6,7,8-테트라메톡시크로멘-4-온(12, G010)

2-(4-벤질옥시-3-메톡시페닐)-5,6,7,8-테트라메톡시크로멘-4-온(79 mg, 0.17 mmol)을 Pd/C(8 mg)의 EtOH(2 ml, 0.08 M) 용액에 첨가하고, 실온, 수소 분위기하에 2 시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 셀라이트 여과하고, 감압하에 용매를 증류 제거하였다. 잔사를 실리카 겔 크로마토그래피에 첨가하고, AcOEt 용출부로부터 G010(64 mg, 0.17 mmol, 99 ％)을 황색 고체로서 얻었다.

상기 합성 방법에 대하여, I₂/DMSO를 사용한 2'-히드록시칼콘으로부터 플라본으로의 산화적 환화 반응(플라본 골격 합성)은 문헌 [A.M.S.Silva, D.C.G.A.Pinto, J.A.S.Cavaleiro, Tetrahedron Lett, 1994, 35, 5899-5902]에, 화합물 1로부터 2로의 변환(방향족 알데히드의 페놀로의 산화)에 대해서는 문헌 [M.Matsumoto, H.Kobayashi, Y.Hotta, J.Org.Chem. 1984, 49, 4740]에, 화합물 2로부터 3으로의 변환(페놀로부터의 카테콜의 합성)에 대해서는, 문헌 [D.Magdziak, A.A.Rodriguez, R.W.Van De Water, T.R.R.Pettus, Org.Lett. 2002, 4, 285-288]에, 화합물 3의 별도 합성(반응식 2, 화합물 4로부터의 화합물 3의 합성)에 대해서는 문헌 [M.Tsukayama, Y.Kawamura, T.Ishizuka, S.Hayashi, F.Torii, Heterocycles 2003, 60, 2775-2784]에, 화합물 9의 합성(프리델-크래프츠 아세틸화)에 대해서는, 문헌 [M.Tsukayama, E.Kusunoki, M.M.Hossain, Y.Kawamura, S.Hayashi, Heterocycles 2007, 71, 1589-1600]에 각각 기재되어 있다.

본 발명품을 건강 식품으로서 사용하는 경우 배합하는 성분의 권장량을 나타낸다. 하기에 인지증에 효과가 있는 것으로 알려진 건강 식품 소재의 1일 섭취 권장량을 나타낸다. 단, 건강 식품은 식품의 일부이기 때문에 한정되는 것은 아니다.

본 발명품을 건강 식품으로서 사용하는 경우의 일례를 나타낸다. 로열 젤리와 노빌레틴을 필수로 하지만, DHA(도코사헥산산), 홍경천 진액 분말, 포스파티딜세린, 페룰산 등을 포함하고 있을 수도 있다. 건강 식품의 형태는 상관없지만, 당의정으로서의 예를 하기에 나타낸다.

Claims

로열 젤리를 유효 성분으로서 포함하는 인지 장해 개선제.
노빌레틴 또는 그의 유사체 또는 감귤류 진액, 및 로열 젤리를 유효 성분으로서 포함하는 인지 장해 개선제.
노빌레틴 또는 그의 유사체 및 로열 젤리, 및 홍경천(紅景天, Rhodiola sacra) 진액, 은행나무잎 진액 및 페룰산을 유효 성분으로서 포함하는 인지 장해 개선제.
2'-히드록시-3',4',5',6'-테트라메톡시아세토페논을 4-벤질옥시-3-메톡시벤즈알데히드와 반응시켜 3-(4-벤질옥시-3-메톡시페닐)-1-(2-히드록시-3,4,5,6-테트라메톡시페닐)-프로페논을 얻는 공정,
얻어진 3-(4-벤질옥시-3-메톡시페닐)-1-(2-히드록시-3,4,5,6-테트라메톡시페닐)-프로페논을 요오드의 존재하에 반응시켜 3-(4-벤질옥시-3-메톡시페닐)-1-(2-히드록시-3,4,5,6-테트라메톡시페닐)-프로페논을 얻는 공정, 및
얻어진 3-(4-벤질옥시-3-메톡시페닐)-1-(2-히드록시-3,4,5,6-테트라메톡시페닐)-프로페논을 수소 및 팔라듐탄소의 존재하에 반응시켜 2-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-5,6,7,8-테트라메톡시크로멘-4-온을 얻는 공정을 포함하는 4-탈메틸화 노빌레틴의 제조 방법.