WO2005082351A1

WO2005082351A1 - 神経変性疾患治療剤

Info

Publication number: WO2005082351A1
Application number: PCT/JP2005/004013
Authority: WO
Inventors: Yasushi Ohizumi; Tohru Yamakuni; Tatsuo Ido; Takeshi Tadano; Yoshihiro Mimaki; Yutaka Sashida
Original assignee: Eisai R & D Management Co., Ltd.
Priority date: 2004-03-02
Filing date: 2005-03-02
Publication date: 2005-09-09
Also published as: JP4505555B2; JPWO2005082351A1

Abstract

本発明は、フラボン誘導体もしくはその光学異性体、その薬学的に許容される塩、またはそれらの水和物もしくはそれらの溶媒和物を有効成分として含有する医薬組成物を提供する。

Description

明細書神経変性疾患治療剤 ' 技術分野

本発明は、フラボン誘導体もしくはその光学異性体、その酸付加塩またはそれらの水和物もしくは溶媒和物を有効成分として含む学習障害治療剤およぴ神経変性疾患治療剤等に関する。背景技術

高齢化社会となりつつある我が国において高齢に起因する学習障害や神経変性疾患、特にその代表的な疾患であるアルツハイマー病の予防および治療は重大な問題である。当該疾患の治療薬の代表的なものとして現在コリンエステラーゼ阻害を主作用に持つドネぺジル等が上市されている力 s (S. L. Rongers et al.; NEUROLOGY 50:136-145 (1998)) 、本化合物は記憶学習機能に関連するコリン作動性神経を賦活することにより一過的に症状を緩和するいわば対処療法的な位置づけにあり、神経の変性の進行抑制ないしは神経再生を誘導する機序やアルツハイマー病発症原因自体を取り除く原因療法的治療薬は未だ存在していない。

アルツハイマー病の発症機序として現在最も有力な説は、アミロイドべ一ター蛋白が脳内に異常沈着することにより神経変性が誘導され、その結果痴呆症状が発症するというものである。即ちアミロイドベータ一蛋白の脳内での異常沈着を抑制することによりアルツハイマー病の発症おょぴ進行を抑制することが可能と考えられている。現在多くの研究者により当該蛋白の沈着を抑制する治療法が研究されているが、臨床上有効なものは未だ見出されていない。現在アルツハイマー病治療薬として臨床で最も利用されている化合物は上述したドネぺジルであるが、当該治療薬との併用によってより効果的な記憶障害改善作用を有する化合物が存在すれば臨床応用上大変有益な治療法となりうる。現在のところこのような作用を明確に示す治療薬は存在しない。

フラボン誘導体はフラボノィドの 1種である。フラボノィドは植物を起源とする物だけでも四千種類以上が報告されている。ほとんど全ての植物の全器官に存在し、特に、緑葉や白色野菜、柑橘類の皮の中に多く存在し、それらの多くは配糖体の形で存在している。

フラボノイドの生理作用として、毛細血管を保護し、その吸収力を調整する作用がある事が知られている。更に、フラボノィドの生理機能に関する研究の進展によって、抗酸化作用の他様々な作用が報告されている。またアルツハイマー病による記憶障害の防止に効果があること等も報告されてレヽる (RW. Stackman et al.; Exp Neurol. Nov;i84(l): 510-20 (2003))。

フラボン誘導体の一つである 5 , 6, 7， 8 , 3 ' , 4，一へキサメトキシフラボンは抗炎症作用を有することや（N. Lin et al.; Biochem Pharmacol. Jun 15;65(12) : 2065-71 (2003))、抗癌作用を有することが報告されている (A. Minagawa et al.; Jpn J Cancer Res. Dec;92(12) : 1322-8 (2001)) 。

しかしながら 5, 6， 7, 8, 3 ' ， 4 ' 一へキサメトキシフラボンが学書障害、神経変性疾患等の治療に有効であるとの報告はない。発明の開示

本発明の課題は、学習障害または神経変性疾患、特に好ましくはァルツハイマー病を改善するために有用な医薬を提供することにある。

本発明者らは、学習障害等に対する有用な薬剤を開発すべく鋭意検討を重ねた結果、フラボン誘導体が学習障害モデルに効果を示すことを初めて見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、

(1) 一般式（ I )

[式中、 R1は C1〜C6アルキル基、 H2、 R3、 R4はそれぞれ無関係に C1 〜C6アルキル基または（C1〜C6)アルコキシ基を示す。 ]

で表される化合物もしくはその光学異性体、その薬学的に許容される塩、またはそれらの水和物もしくはそれらの溶媒和物を有効成分として含有する医薬組成物。

(2) 学習障害の予防および/または治療薬である、（ 1 ) 記載の医薬組成物。

(3) 神経変性疾患の予防および/または治療薬である、（ 1 ) 記載の医薬組成物。

(4) 一般式（ I ) で表される化合物が、 5， 6， 7, 8， 3， , 4， —へキサメトキシフラボンである、（ 1 ) 〜（3) のいずれか 1項に記載の医薬組成物。

(5) 神経変性疾患がアルツハイマー病である（3) または（4) に記載の医薬組成物。

(6) 一般式（ I )

[式中、 Rlは C1〜C6アルキル基、 R2、 R3、 R4はそれぞれ無関係に CI 〜C6アルキル基または（C1〜C6)アルコキシ基を示す。 ]

で表される化合物もしくはその光学異性体、その薬学的に許容される塩、またはそれらの水和物もしくはそれらの溶媒和物、およぴコリンェステラーゼ阻害作用を有する化合物もしくはその光学異性体、その薬学的に許容される塩、またはそれらの水和物もしくはそれらの溶媒和物を有効成分として含有する医薬組成物。

(7) 学習障害の予防および Zまたは治療薬である、（6) 記載の医薬組成物。

(8) 神経変性疾患の予防および/または治療薬である、（6) 記載の医薬組成物。

(9) 一般式（ I ) で表される化合物が、 5, 6, 7， 8, 3' , 4' —へキサメトキシフラボンである、（6) 〜（8) のいずれか 1項に記載の医薬組成物。

( 1 0) コリンエステラーゼ阻害作用を有する化合物がドネぺジルである (6) 〜（9) のいずれか 1項に記載の医薬組成物。

( 1 1 ) 神経変性疾患がアルツハイマー病である（8) 〜（ 1 0) のいずれか 1項に記載の医薬組成物。

( 1 2) —般式（ I )

[式中、： R1は C1〜C6アルキル基、 R2、 R3、 R4はそれぞれ無関係に CI 〜C6アルキル基または（C1〜C6)アルコキシ基を示す。 ]

で表される化合物もしくはその光学異性体、その薬学的に許容される塩、またはそれらの水和物もしくはそれらの溶媒和物を有効成分として含有する薬剤、およぴコリンエステラーゼ阻害作用を有する化合物もしくはその光学異性体、その薬学的に許容される塩、またはそれらの水和物もしくはそれらの溶媒和物を有効成分として含有する薬剤を併用することを特徴とする学習障害の予防および/または治療方法。

( 1 3) —般式（ I ) で表される化合物が、 5, 6， 7, 8, 3' , 4' —へキサメトキシフラボンである、（ 1 2) 記載の学習障害の予防および Zまたは治療方法。

( 1 4) コリンエステラーゼ阻害作用を有する化合物がドネぺジルである ( 1 2) または（ 1 3 ) に記載の学習障害の予防および Zまたは治療方法。

( 1 5) 一般式（ I )

[式中、 R1は C1〜C6アルキル基、 R2、 R3、 R4はそれぞれ無関係に CI 〜C6アルキル基または（C1〜C6)アルコキシ基を示す。 ]

で表される化合物もしくはその光学異性体、その薬学的に許容される塩、またはそれらの水和物もしくはそれらの溶媒和物を有効成分として含有する薬剤、およぴコリンエステラーゼ阻害作用を有する化合物もしくはその光学異性体、その薬学的に許容される塩、またはそれらの水和物もしくはそれらの溶媒和物を有効成分として含有する薬剤を併用することを特徴とする神経変性疾患の予防および Zまたは治療方法。

( 1 6 ) 一般式（ I ) で表される化合物が、 5， 6, 7, 8, 3，， 4，一へキサメトキシフラボンである、（ 1 5) 記載の神経変性疾患の予防おょぴ /または治療方法。

( 1 7) コリンエステラーゼ阻害作用を有する化合物がドネぺジルである ( 1 5) または（ 1 6) に記載の神経変性疾患の予防および/または治療方法。

( 1 8) 神経変性疾患がアルツハイマー病である ( 1 5) 〜 ( 1 7) のいずれか 1項に記載の予防および/または治療方法。図面の簡単な説明

' 図 1は、 E-1単独 2回投与による学習障害への影響を示す図である。

図 2は、 E-1 と 0.5 mg/kg ドネぺジル併用投与による学習障害への影響を示す図である。

図 3は、薬物投与 11 日後の学習障害への影響を示す図である。

図 4は、 IBOおよび Aj3で処理したラットにおける E-1前投与による 3H-NANA発現量の変化を示す図である。

図 5は、 IBOおよびで処理したラットにおける 3H-NANA発現量に対する E-1前投与の効果を示す図である。

図 6は、 IBOおよび Ai3で処理したラットにおける E-1前投与および後投与による ³H-NANA発現量の変化を示す図である。

図 7は、 IBOおよぴで処理したラットにおける 3H-NANA発現量に対する E-1前投与および後投与の効果を示す図である。発明を実施するための最良の形態

以下に本発明を詳細に説明する。

なお、本明細書において引用した文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。

本発明の医薬組成物は、本明細書に定義する一般式（ I ) で示されるフラボン誘導体若しくはその光学異性体、その薬学的に許容される塩、またはそれらの水和物もしくはそれらの溶媒和物を有効成分として含む。また、本発明の医薬組成物は、上記一般式（ I ) で示されるフラボン誘導体もしくはその光学異性体、その薬学的に許容される塩、またはそれらの水和物もしくはそれらの溶媒和物、およびコリンエステラーゼ阻害作用を有する化合物もしくはその光学異性体、その薬学的に許容される塩、またはそれらの水和物もしくはそれらの溶媒和物を、有効成分として含む。本発明において、コリンエステラーゼ阻害作用を有する化合物は、好ましくはドネぺジノレである。

本発明の医薬組成物は、学習障害の予防および/または治療薬として、あるいは、神経変性疾患の予防および/または治療薬として有用である。本発明において、神経変性疾患は、例えばアルツハイマー病である。

本発明の医薬組成物に含まれるフラボン誘導体は、以下の一般式（ I ) で示される。

一般式（ I )

一般式（ I ) において、 R1は C1〜C6アルキル基を示す。

一般式（ I ) において、 R2、 R3、 R4 はそれぞれ無関係に独立して C1 〜C6アルキル基または（C1〜C6)アルコキシ基を示す。

本発明で使用される Rl、 R2、 R3および R4における C1〜C6アルキル基としては、好ましくはメチル、ェチル、 n—プロピル、イソプロピル、 n —ブチノレ、 sec—プチル、 tert—ブチル、イソブチル等の Cl〜 C4のァノレキル基が挙げられるが、これらに限定されるものではない。 R2、 R3および R4 における（C1〜C6)アルコキシ基としては、好ましくはメトキシ、エトキシ、プロボキシ、ブトキシ等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

本発明において、一般式（ I )で表される化合物の中で好ましいものは、 5, 6, 7， 8, 3 ' ， 4' —へキサメトキシフラボンである（式（ I I ) ) 。

上記一般式（ I )で表される化合物は、光学異性体を有する場合があり、それらもまた本発明の有効成分である化合物に包含される。

本発明において一般式（ I ) で表される化合物の酸付加塩での酸としては、例えば、塩酸、臭化水素酸、ョゥ化水素酸、硫酸、リン酸等の無機酸、シユウ酸、マレイン酸、フマル酸、乳酸、リンゴ酸、クェン酸、酒石酸、安息香酸、メタンスルホン酸、カンファースルホン酸等の有機酸が挙げられる。一般式（ I ) で表される化合物と上記酸とで形成する、投与される酸付加塩は薬学的に許容されるものである。

上記一般式（ I ) で表される化合物およびその酸付加塩などの薬学的に許容される塩は、水和物または溶媒和物の形で存在することもあるので、これらの水和物およぴ溶媒和物も本発明の医薬組成物の有効成分である化合物に含まれる。

本発明の薬剤、医薬組成物に有効成分として含まれる一般式（ I ) 等の化合物の製法は、特に限定されないが、当該化合物は当業者であれば公知の方法により合成することができるし、あるいは、実施例 1に記載の方法に従い植物から精製することができる。本発明の医薬組成物は、学習障害の予防およびノまたは治療に、あるいは、神経変性疾患の予防および/または治療に用いることができる。したがって、本発明の医薬組成物に有効成分として含まれる上記化合物、あるいは、上記化合物とコリンエステラーゼ阻害作用を有する化合物との併用は、学習障害の治療等に、あるいは神経変性疾患の治療等に有効である。上記化合物が学習障害等の治療に有効であるかを in vivoで証明するためには、学習障害の動物モデルに上記化合物を投与することにより、当該モデルの学習障害が改善されることを示せば良い。

学習障害の動物モデルとしては例えば嗅球摘出モデルがある。嗅球摘出モデルにおいては神経変性疾患症状として学習障害の亢進が認められる。この動物に上記化合物を投与することにより、学習障害の亢進が抑制されれば、当該化合物が神経変性疾患の治療において有効であることを示すことが出来る。

上記化合物が既存のコリンエステラ ^ゼ阻害薬と併用した場合に学習障害等の治療に有効であることを in vivoで証明するためには、学習障害の動物モデルに上記化合物およびコリンエステラーゼ阻害薬を投与することにより、当該モデルの学習障害が改善されることを示せば良い。

ここで、コリンエステラーゼ阻害作用を有する化合物としては、例えばドネぺジルを挙げることができる。ドネぺジルの塩酸塩は、商品名ァリセブト（エーザィ株式会社）を購入して入手することができる。

神経変性疾患の一つである、アルツハイマー病の原因の一つとしてアミロイドベータ一の脳における蓄積が考えられている。従って、上記化合物あるいは、上記化合物とコリンエステラーゼ阻害作用を有する化合物の併用がアルツハイマー病の治療に有効であるかを in vivoで証明するためには、上記化合物の投与、あるいは、上記化合物とコリンエステラーゼ阻害作用を有する化合物との投与により、脳におけるアミロイドベータ一の層状沈着形成が改善されることを示せば良い。

アミロイドベータ一の層状沈着形成が改善されることを示すには、例えば、実施例 3に記載の細胞膜面ガンダリオシド判定法がある。アミロイドベータ一の層状沈着形成がある場合は、これによりガングリオシドがシァリダーゼ処理により切り出されず、アミロイドベータ一の層状沈着形成がない場合は、ガンダリオシドがシァリダーゼ処理により切り出される。従つて、化合物を投与しガンダリオシドの量を測ることにより、アミロイドベータ一の層状沈着形成が改善されることを示すことができる。本発明は、本発明の医薬組成物を患者に投与する学習障害の予防おょぴノまたは治療方法をも含むものである。また、本発明は、本発明の医薬組成物を患者に投与する神経変性疾患の予防および Zまたは治療方法を含むものである。

本発明の医薬組成物の投与量は特に限定されないが、通常は、有効成分である一般式（ I ) で示される化合物の重量として一般に経口投与の場合には一日あたり 1〜2000 mg/kg体重、好ましくは一日あたり l〜500 mg Zkg体重であり、非経口投与の場合には一日あたり 0.：!〜 100 mgZkg体重、好ましくは 0.1〜50 mgZkg体重である。上記投与量は 1 日 1回または 2〜3 回に分けて投与するのが好ましく、年齢、病態、症状により適宜増減してもよレ、。

本発明の医薬組成物としては、上記一般式（ I ) で表される化合物若しくはその薬学的に許容される塩、またはそれらの水和物若しくは溶媒和物をそのまま投与してもよいが、一般的には、有効成分である上記の物質と薬理学的および製剤学的に許容される添加物を含む医薬組成物を調製して薬剤として投与することが好ましい。

薬理学的および製剤学的に許容しうる添加物としては、例えば、賦形剤、崩壌剤ないし崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、基剤、溶解剤ないし溶解補助剤、等張化剤、 pH 調節剤、安定化剤、噴射剤、および粘着剤等を用いることができる。

経口投与に適する医薬組成物には、添加物として、例えば、ブドウ糖、乳糖、 D—マンニトール、デンプン、または結晶セルロース等の賦形剤；カノレポキシメチノレセノレロース、デンプン、またはカノレボキシメチノレセノレ口ースカルシウム等の崩壊剤または崩壊補助剤；ヒドロキシプロピルセル口ース、ヒドロキシプロピノレメチノレセノレロース、ポリビニノレピロリドン、またはゼラチン等の結合剤；ステアリン酸マグネシウムまたはタルク等の滑沢剤；ヒドロキシプロピルメチルセルロース、白糖、ポリエチレングリコールまたは酸化チタン等のコーティング剤；ワセリン、流動パラフィン、ポリエチレングリコール、ゼラチン、カオリン、グリセリン、精製水、またはハードファット等の基剤を用いることができる。

注射あるいは点滴用に適する医薬組成物には、注射用蒸留水、生理食塩水、プロピレングリコール等の水性あるいは用時溶解型注射剤を構成しうる溶解剖または溶解補助剤；ブドウ糖、塩化ナトリウム、 D—マンニトール、グリセリン等の等張化剤；無機酸、有機酸、無機塩基または有機塩基等の pH調節剤等の添加物を用いることができる。

本発明の医薬組成物の形態は特に限定されず、当業者に利用可能な種々の形態をとることができる。経口投与に適する医薬として、例えば、固体の製剤用添加物を用いて錠剤、散剤、顆粉剤、硬ゼラチンカプセル剤、坐剤、またはトローチ剤などを調製することができ、液状の製剤用添加物を用いてシロップ剤、乳剤、軟ゼラチンカプセル剤などを調製することができる。また、非経口投与に適する医薬として、注射剤、点滴剤、吸入剤、坐剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤などを調製することができる。

本発明の医薬組成物の投与経路は特に限定されず、経口的または非経口的に投与することができる以下に本発明を実施例で具体的に説明するが、これはその代表例を示すものであって、本発明はこの実施例に限定されるものではない。実施例 1 (実験 1 ) 5, 6, 7 , 8 , 3 ' , 4 ' —へキサメトキシフラボン (以下 E- 1 と略する場合がある）の分離、精製方法

シークヮーシャミカン（Citrus depressa)の乾燥果皮（500g)をメタノール (2L)で 2回還流抽出した（各 2時間）。抽出エキスを減圧下濃縮後、メタノ一ルー水混液（3 :7)に懸濁させ、多孔質ポリスチレン樹脂（Diaion HP-20、三菱化学社製）を充填したカラムに通じ、メタノール一水混液（3:2)、メタノ一ルー水混液（4: 1)、メタノール、エタノール、酢酸ェチル（各 2L)で順次溶出させた。酢酸ェチル溶出画分（10 g)をシリカゲルカラムクロマトグラフィ一に付し、クロ口ホルムーメタノ一ル混液（19:1)で溶出させ、 5画分に分画した（フラクシヨン I-V)。フラクション III (1.63g)をシリ力ゲル力ラムクロマトグラフィ一（へキサン一ァセ 1、ン混液、 2:1)で繰り返し精製して、 E- l、 725 m を単離した。実施例 2 (実験 2 ) 嗅球摘出マウスにおける投与による学習障害改善効果

(嗅球摘出手術）

23 g〜26 gの ddy系雄マゥスにペントバルピタール（50 mgZkg)を腹腔内注射し、麻酔後、歯科用ドリルで両側の嗅球上部の頭蓋骨に穴をあけ、ァスピレーターを用いて嗅球を吸引した。止血後縫合し、傷口を外科用ァロンアルファで塗り固めた。その後 14 日間ケージ内で飼育した。嗅球を吸引せずに同様の操作を行ったマウスを sham群とし、これをコントロールとして用いた。

(薬物の投与）

E- 1を乳鉢ですりつぶし、 tween-80液で懸濁させて嗅球摘出後 14 日目のマウスに腹腔内投与した。 E- 1単独 2回投与の場合は、 1回目投与の翌々日に 2回目の投与を行った。また、代表的なアルツハイマー病治療薬であるドネべジルと E- 1との併用実験では、ドネぺジルを生理食塩水に溶かし、 E- 1投与の翌日に経口投与した。

(学習障害の測定方法）

Step -through passive avoidance task ィ丁つ 7こ。球 ¾：摘出すな刖に、明室と、電流を流すことのできる暗室との 2部屋が連結された passive装置の明室側にマウスを入れ、暗室にマウスが入ると同時に、 2秒間隔で 1.0 mA の電流を流して電撃ショックを与え、これを記憶させた。すぐに嗅球を摘出し、 14日間飼育後、薬物を投与し、再びマウスを明室側に入れ、喑室に入るまでの秒数を測定し、平均値を latency time とした。測定時聞は最大 300秒までとし、薬物投与後 11 日目まで数回測定を行った。なお、嗅球摘出後の測定ではマウスが暗室に入っても電流は流さなかった。

この測定法では、学習障害が起こっていないマウスは電撃ショックの記憶を保持しているため明室側に長く留まるが、学習障害の起こっているマウスは電撃ショックの記憶を保持しておらず、すぐに暗室側に入る。この違いを利用して、 latency timeを学習障害の指標とした。

(E- 1単独 2回投与の学習障害への影響）

嗅球を摘出して 14 日目のマウスを測定し、学習障害が誘発されているかの確認を行なった。その後直ちに E- 1を腹腔内投与し、 2 日後に再ぴ E- 1 を腹腔内投与した。 1回目の E- 1を投与してから 3 日後、 5 日後、 Ί 日後、 11 日後に再び測定を行い、 E- 1の学習障害への影響を検討した。時間の経過と共に latency timeが上昇し、濃度依存的に学習障害が改善される傾向が認められた。また、 E- 1投与量 200 mg/kgでは学習障害の改善効果が確認された（図 1) 。

したがって、 E- l、すなわち、 5, 6, 7, 8， 3，， 4，一へキサメトキシフラボンが学習障害の治療に有効であることが、 in vivoのレベルで初めて示された。

(E- 1と 0.5 mgZkg ドネぺジルとの併用投与による学習障害への影響）嗅球摘出 14 日目のマウスに E- 1または生理食塩水を腹腔内投与し、翌日にドネぺジル 0.5 mg/kg を経口投与した。コリンエステラーゼ阻害薬であるドネぺジルは、投与 1時間後に脳内ァセチルコリン濃度がピークを迎えるため、投与の 1時間後に測定を行った。さらに E- 1投与から 3 日後、 5 日後、 7 日後、 11 日後に再び測定を行い、 E- 1 と 0.5 mgZkgのドネべジルとの併用による学習障害への影響を検討した。ドネぺジル単独投与では学習障害改善作用は認められなかったが、 200 mg/kg E- 1 との併用投与では顕著な学習障害改善作用が確認された（図 2) 。

(E- 1単独投与、ドネぺジルとの併用投与それぞれの 11 日後の学習障害の様子）

E- 1の投与量を上げると latency timeが上昇することから、 E- 1は濃度依存的に学習障害を改善することが確認された。 E- 1 単独、ドネぺジル単独投与の場合に比べて、 E- 1 とドネぺジルの併用投与では学習障害改善作用が増強した（図 3) 。

これらの結果により、 E- l、すなわち、 5, 6, 7, 8, 3 ' ， 4 ' —へキサメトキシフラボンと、コリンエステラーゼ阻害作用を有する化合物、すなわち、ドネぺジルとの併用が、学習障害の治療に有効であることが、 in vivo のレベルで初めて示された。実施例 3 (実験 3) 細胞膜面ガンダリオシドに対する E- l のアミロイドベータ一（以下 A j3と略する場合がある）沈着抑制効果の検討

細胞膜面ガングリオシド判定法は、 IDOS法と呼ばれる。 ³Hラベルされた mannosamine (以下 3H-NA-Man と略する場合がある）をラットの脳内に直接投与すると、約 2日後には mannosamineの量はほとんどなくなり、 4 日後には約 93%の 3Hラベルされた neuraminic acid (以下 ³H-NANAと略する場合がある）がガングリオシドの de novo合成に使われ、細胞膜面に

3Hラベルされたガングリオシドが発現してくる。これをシァリダーゼ処理により切り出された ³ H-NANAをマイクロダイアリシス法で回収し、放射能を測定することでガングリオシドの de novo合成を指標にできる方法である。

本実験では、この in vitro細胞膜面ガングリオシド判定法（IDOS method) を用いて、 Ibotenic Acid (以下 IBOと略する場合がある）の興奮毒性作用である生合成 b経路ガンダリオシドの de novo合成増加の結果生じると考えられている A i3の層状沈着形成に対する、 E-1 の投与による影響を検討した。

ガイド力-ユーレを嗅球と海馬にそれぞれ固足手術した 2 日後に E-1またはコントロールとして PBS を海馬に投与し、その 2月後、 IBO を嗅球に投与すると同時に ³ H-NA-Manを海馬に投与した。更にその 2 日後、 A /3 40またはコントロールとして PBSを海馬に投与した。その 2 日後、シ了リダ一ゼを海馬に投与し、切り出された 3H-NANAをマイクロダイァリシスによって集め、液体シンチレーン aンカゥンタで測定した。³ H-NA-Man の量は投与 2 日後には、その活性はすでにバックグランドレベルまで顕著に減少し、一方、 3H-NANAは増加して 4 日後に最高値に達しその後徐々に減少した。また、 TLC によって興奮性アミノ酸の IBO の影響を検討した際、特に b経路ガングリオシドは IBO投与 4 日後に増加することが確認されていることから、ガングリオシド de novo合成を評価する実験では、ラットの海馬に ³H-NA-Man投与した 4 日後以降にマイクロダイアリス実験を行った。また、全ての実験においてラットはフリームービングの状態で行った。

(前投与による E-1の効果の検討）

IBO投与より前段階の 2日前に Ε- 1(200 μ M)またはコントロールとして PBSを投与した動物群において、シァリダーゼ投与前 40分間、投与後 140 分間に収集した放射能の経時的変化を図 4示す。 E-1の前投与によって得られた放射能は、コントロール (PBS投与動物群）と比較すると、 E- 1前投与動物群の 3Η-ΝΑΝΑ量は時間経過によって変化はなく一定で、コント口ールょり低いかまたは同量であった。

シァリダーゼ投与後 140分間に収集した放射能の総量を図 5に示す。 E- 1 の前投与によって得られた放射能の総量は、コントロールの放射能の総量より低くまた有意差はなかった。

(前投与および後投与による E-1の効果）

E- 1 の前投与では、神経細胞の軸索進展効果やシナプス樹状突起形成効果およぴ生合成 a経路ガンダリオシドの de novo合成増加効果がみられると証明されている濃度の 2倍の 200 μ Μで実験を行ったために、その効果よりも高濃度の薬物投与による細胞毒性の影響が強かった可能性が考えられた。よって、この実験では、以前の研究で生合成 a経路である GM1の増加が確認できた E- 1の濃度である 100 μ Mを投与量とし、 E-1を ΙΒΟ投与の前後に行うというスケジュールに変更して、研究を進めた。

ΙΒΟ投与の前後の 2回に分けて Ε-1(100 μ Μ)またはコントロールとして PBSを投与し、その 2 日後に Α /3またはコントロールとして PBSを投与し、更にその 2 日後にシァリダーゼを投与した。この動物群におけるシァリダーゼ投与前 40分間および投与後 140分間収集した ³H-NANAの経時的変化を図 6 に示す。 A/3を投与しない動物群においては、 E-1 の前後投与によって得られた動物群 (E-l( + )、 (_))の放射能は、 E-1を投与しない動物群 (Ε-1(— )、 Αβ (一））と比較すると放射能のレベルは常に高く、シァリダーゼ投与 60分後にピークが現れ、その後徐々に減少した。一方、 E-1 を投与しない動物群 (E-l(—）、 Α]3 (—））では、シァリダーゼ投与 40分後にピークが現れ、その後徐々に減少した。 AjSを投与した動物群においては、 E-1の前後投与によって得られた動物群 (E-1( + )、AS ( + ))の放射能は、 E-1 を投与しない動物群 (E-l(—）、 Aj3 (十)）と比較するとは常に高く、シァリダーゼ投与 40 分後にピークが現れ、その後徐々に減少した。しかし、一方の E-1を投与しない動物群（E-l(_)、 A 3 ( + ))では、放射能のレベルは常に低く、ピークは現れなかった。また、 E-1 の前後投与をした動物群で比較すると、 Α]3非投与群 (E-l( + )、 Ai3 (― ))では、投与群 (E-l( + )、 A + )) より常に放射能のレベルは高かった。

シァリダーゼ投与後 140分間に収集した放射能の総量を図 7に示す。 A βを投与しない動物群においては、 E-1を前後投与した場合 (Ε-1( + )、 Αβ (一））の放射能の総量は、 E-1を投与しない場合 (E-l(— )、 Α/3 (— ))と比較すると有意に約 1.5 倍高かった。一方、 Aj3を投与した動物群においては、 E-1を前後投与した場合 (E-l( + )、 A （ + ))の放射能の総量は、 E-1を投与しない場合 (E-l(— )、（ + ))と比較すると、有意に約 2倍高かった。また、 E-1の前後投与をした動物群で比較すると Αβ非投与群（Ε-1( + )、 Αβ (-)) の放射能の総量は、 Α 投与群 (E-l( + )、 A3 ( + ))の放射能の総量より有意に約 1.7倍高かった。シァリダーゼ投与後 140分間に収集した放射能の総量の高い順に並べると

E-l( + )、 AjS ( -） >Ε-1(_)、 Α （一）≥ Ε·1( + )、 Α （+ ) > Ε'1(_)、 Αβ ( + ) となった。過去の様々な研究から、 Α βが蓄積を開始した脳の不溶性画分の中には種々の画分が存在すると考えられ、そのうちの低密度膜ドメインは神経細胞以外では力べオラと呼ばれており、コレステロール、スフインゴ脂質が多く存在することが知られている。また、神経細胞においてスフインゴ糖脂質であるガンダリオシドは、ほかの細胞に比べてシナプスや軸索にかなり多く存在し、神経栄養因子や神経伝達物質における受容体の活性の調節や神経栄養因子様作用などの様々な機能を有するこという報告がなされている。また、最近ではガンダリオシドとの関連性が注目されており、特に、 A 初期の老人斑形成に先行する変化では、ガンダリオシドが Α β の j3 —シート構造への変化に大きく関与していることが知られている。しかし、正常脳においてガンダリオシドは 1種だけではなく、様々な分子種のガンダリオシドが混合されて細胞膜上で並んでおり、また、脳の発達段階、短期間の刺激、温度順応の過程などにおいて中枢神経系のガンダリオシドは組成や量の特殊な局所的変化を起こすことが知られている。そこで、ガングリオシドの組成と A j3の沈着の関連性を調べたところ、 Α |3の細胞膜沈着にはガンダリオシドの単一組成もしくは生合成 b経路が優勢のガングリオシドを有する膜組成が必要であり、しかも生合成 a経路が優勢なガングリオシド組成では Α β時沈着を起こさないことが証明された。一方、植物由来化合物 E- 1は神経突起や軸索、シナプス形成の指標となるガングリオシドの合成を活性化させる。また、 ΙΒΟ処置による b経路活性状態において E- 1を海馬に投与すると、 IBO とは違った組成のガンダリオシドの合成を活性化させることが分かっている。これらのことから、 E- 1 がガンダリオシド生合成に顕著に影響を与え、 Α βの層状沈着を抑制するような組成に変化させる可能性が考えられた。

本実験では、マイクロダイアリシスによって収集される ³ Η-ΝΑΝΑ量は図 6、 7 で示すようにシァリダーゼ投与後に変化し、 140 分間で集められた全体の放射能は、 Α を投与した場合は E- 1 の前後投与によって有意に約 2倍に増加した。また、 A を投与しない場合は、 E- 1 の前後投与によつて有意に約 1. 5倍高くなった。これは、過去の実験でも同様の結果が得られていることから、実験の手技的問題はないと考えられる。これらのことから次のことが示唆される。シァリダーゼ投与前後で放射能が変化しないかあるいは減少したのは、 ΙΒΟ の投与により海馬膜で b経路ガングリォシドが増加し、ついで A j3が海馬に投与されると、その b経路ガンダリオシドが増加した細胞膜上で Α βが層状沈着を形成する。この沈着体が立体的にシァリダーゼの作用を妨げるためにガンダリオシドの糖鎖の切断がされず、その結果として、マイクロダイアリシスプローブによって収集される放射能が低くなつたと考えられる。一方、放射能がシァリダーゼ投与前と比べて増加したのは、細胞膜のガングリオシド組成は正常のままであり、 A /3の投与によっても細胞膜上で A j3の層状沈着は起こらず、 Α 分子のいくらかは溶液中で凝集するが、それはシァリダーゼの作用を妨げないために細胞膜表面のガンダリオシドの 3Η-ΝΑΝΑは切り出され、マイク口ダイァリシスによって収集された放射能は高くなったということが考えられる。本実験では、 1B0投与により生合成 b経路ガンダリオシドが優勢の異常な膜組成になるが、 E- 1の投与によって a経路ガングリオシドの合成が活性化され、その結果としてガングリオシドの異常組成が正常組成に近くなつたために、 A ;3の沈着が抑制されたと考えられる。

しかし、図 6、 7で示すように、 E- 1投与群の放射能は、 E- 1非投与群の放射能と比較すると有意に増加したが、 A ]3非投与群と比較すると有意に減少している。このことは、 E- 1には IBOによるガンダリオシドの異常組成を、正常組成へと完全には回復させなかったために Α βの沈着が起こつたか、もしくは、本実験のスケジュールでは E- 1を投与してから A ]S投与までの間隔が短かすぎたために、 E- 1 の効果を完全に発揮させるには回復期間が不十分であったという可能性が考えられる。また、 IBOの前段階における E- 1 200 μ Μ濃度の投与では、その E' l投与効果よるガングリオシドの変化は未だ検討されていない。そのため、細胞毒性が起きたかあるいは A j3沈着の予防効果は期待できないか、そのどちらであるかは断言できないためにさらなる検討が必要である。

以上のことから、本実験は脳内では可溶性 Α βが細胞外に沈着するにはガンダリオシドの組成が関与しているという以前の研究結果を支持し、また、 NGF様作用を有する植物由来化合物 E- 1は Α /3沈着抑制効果があり、この化合物がアルツハイマー病等の治療薬になりうることを示す。

Claims

請求の範囲

一般式（ I )

[式中、 Rlは C1〜C6アルキル基、 R2、 R3、 R4はそれぞれ無関係に C1 〜C6アルキル基または（C1〜C6)アルコキシ基を示す。 ]

2. 学習障害の予防および/または治療薬である、請求項 1記載の医薬組成物。

3. 神経変性疾患の予防および Zまたは治療薬である、請求項 1記載の医薬組成物。

4. 一般式（ I ) で表される化合物が、 5， 6, 7, 8， 3，， 4' —へキサメトキシフラボンである、請求項 1〜 3のいずれか 1項に記載の医薬組成物。

5. 神経変性疾患がアルツハイマー病である請求項 3又は 4に記載の医薬組成物。

6. 一般式（ I )

[式中、 R1は C1〜C6アルキル基、 R2、 R3、 R4はそれぞれ無関係に C1 〜C6アルキル基または (C1〜C6)アルコキシ基を示す。 ]

で表される化合物もしくはその光学異性体、その薬学的に許容される塩、またはそれらの水和物もしくはそれらの溶媒和物、およぴコリンェステラーゼ阻害作用を'有する化合物もしくはその光学異性体、その薬学的に許容される塩、またはそれらの水和物もしくはそれらの溶媒和物を有効成分として含有する医薬組成物。

. 学習障害の予防および/または治療薬である、請求項 6記載の医薬組成物。

. 神経変性疾患の予防および/または治療薬である、請求項 6記載の医薬組成物。

. 一般式（ I ) で表される化合物が、 5， 6， 7, 8， 3 ' ， 4' 一へキサメトキシフラボンである、請求項 6〜 8のいずれか 1項に記載の医薬組成物。

0 . コリンエステラーゼ阻害作用を有する化合物がドネぺジルである請求項 6〜 9のいずれか 1項に記載の医薬組成物。

1 . 神経変性疾患がアルツハイマー病である請求項 8〜 1 0のいずれか 1項に記載の医薬組成物。

2 . 一般式（ I )

で表される化合物もしくはその光学異性体、その薬学的に許容される塩、またはそれらの水和物もしくはそれらの溶媒和物を有効成分として含有する薬剤、およぴコリンエステラーゼ阻害作用を有する化合物もしくはその光学異性体、その薬学的に許容される塩、またはそれらの水和物もしくはそれらの溶媒和物を有効成分として含有する薬剤を併用することを特徴とする学習障害の予防および Zまたは治療方法。

3 . —般式（ I ) で表される化合物が、 5， 6, 7, 8, 3 ' , 4' —へキサメトキシフラボンである、請求項 1 2記載の学習障害の予防およびまたは治療方法。

4 . コリンエステラーゼ阻害作用を有する化合物がドネぺジルである請求項 1 2または 1 3に記載の学習障害の予防および/または治療方法。 5 . 一般式（ I )

[式中、 R1は C1〜C6アルキル基、 R2、 R3、 R4はそれぞれ無関係に C1 〜C6アルキル基または（C1〜C6)アルコキシ基を示す。 ]

で表される化合物もしくはその光学異性体、その薬学的に許容される塩、またはそれらの水和物もしくはそれらの溶媒和物を有効成分として含有する薬剤、およびコリンエステラーゼ阻害作用を有する化合物もしくはその光学異性体、その薬学的に許容される塩、またはそれらの水和物もしくはそれらの溶媒和物を有効成分として含有する薬剤を併用することを特徴とする神経変性疾患の予防および/または治療方法。

1 6 . —般式（ I ) で表される化合物が、 5， 6, 7, 8， 3 ' ， 4' —へキサメトキシフラボンである、請求項 1 5記載の神経変性疾患の予防およぴ Zまたは治療方法。

1 7 . コリンエステラーゼ阻害作用を有する化合物がドネぺジルである請求項 1 5または 1 6に記載の神経変性疾患の予防および/または治療方法。

8 . 神経変性疾患がアルツハイマー病である請求項 1 5〜 1 7のいずれか 1項に記載の予防おょぴ Zまたは治療方法。