JP4157767B2 - 退行性脳神経系疾患の予防および治療効果を有するハンゲショウ抽出物 - Google Patents

Description

【０００１】
技術分野
本発明は退行性脳神経系疾患の予防および治療効果を有するハンゲショウ抽出物（Saururus chinensis extract）および該抽出物を活性成分として含有する薬学的製剤に関する。
【０００２】
さらに、本発明は、退行性脳神経系疾患の予防および治療効果を有する次の一般式（Ｉ）で示される化合物の用途に関する。
【０００３】

【０００４】
式中、
Ｒ_１およびＲ_２はそれぞれ水素原子、炭素数１〜４の低級アルキル基または
【０００５】

【０００６】
（式中、
Ｒ_５は水素原子または炭素数１〜４の低級アルキル基でり、Ｒ_６は水素原子、水酸基または炭素数１〜４の低級アルキル基である。）であって、Ｒ_３は水素原子または炭素数１〜４の低級アルキルである。
【０００７】
（背景技術）
最近、高齢者の増加につれ退行性脳神経系疾患の患者が急増している。代表的に退行性脳神経系疾患による老人性痴呆が挙げられる。老人性痴呆は記憶力の喪失、学習能力の低下が主な症状の疾患で患者は無論その家族にも大きな苦労を与え社会的な問題に発展し、その予防および治療に対する関心は高まる一方である。さらに、生命科学と科学技術の急速な発達で人々の生活は質的に向上したが、これによる成人病の発病率もまた高くなり二次的な症状による退行性脳神経系疾患、たとえば脳卒中の発病率もまた高まりつつある。このように退行性脳神経系疾患の発病は様々な原因によって継続的に増加しているものの、未だこれら疾患の効果的な予防および治療可能な医薬品は開発されていないと言っても過言ではない。
【０００８】
退行性脳神経系疾患は脳震盪や老化による脳神経系の構造的な退化、循環器障害など他の成人病に起因する二次的症状、あるいは交通事故、労働災害、一酸化炭素中毒など多様な物理的、機械的要因によって脳が損傷を受けると起り得る疾患である。（Rothman SM.（1984）Sybaptic release of excitatory amino acid neurotransmitter mediates anoxic neuronal death. J. Neurosci. 4: 1884-1891; およびWeiloch, T. （1985）Hypoglycemia-induced neuronal damage prevented by an NMDA antagonists. Science 230: 681-683）.
【０００９】
前記の理由によって脳への血流量が減少するか、脳への血液の供給が遮断され脳組織が低酸素、低ブドウ糖状態になると、脳は正常代謝ができなくなり結局は回復不可能な損傷を受けるが、かかるケースは脳卒中、トラウマ、虚血性損傷及び退行性脳神経系疾患でよく見られる。（Benveniste, H., Drejer, J., Schousboe, A. および Diemer, N. H. (1984) Elevation of the extracellular concentrations of glutamate and aspartate in rat hippocampus during transient cerebral ischemia monitored by intracerebral microdialysis. J. Neurochem. 43: 1369-1374; およびHagberg, H., Lehmann, A., Saucberg, M., Nystrom, B., Jacobson, I. およびHamberger, A. (1985) Ischemia-induced shift of inhibitory and excitatory amino acids from intra- to extracellular compartments. J. Cereb. Blood Flow & Metab. 5: 413-419）。
【００１０】
脳組織の損傷は大きく２種類のメカニズムに大別できる。一つは細胞膜の電圧の変化による興奮性アミノ酸遊離の増加によるものと、二つは直接的な酸化的ストレスによるものである。（Choi, D. W. (1988) Glutamate neurotoxicity and disease of the nervous system. Neuron 1: 623-634; およびCoyle, J. T. およびPurrfarcken, P. (1993). Oxidative stress, glutamate and neurodegenerative disorders. Science 262: 689-695）最近の研究によると、グルタミン酸塩は筋収縮性の受容体を活性化することによって酸化的ストレスを引き起こす主な原因物質として考えられ、グルタミン酸塩は発作、外傷および虚血性損傷の発病原因として考えられている。（Halliwell, B およびGutteridge J. M. (1985a) Oxygen radicals and the nervous system. Trends Neurosci. 5: 22-26; およびHalliwell, B およびGutteridge J. M. (1985b) .The importance of free radicals and catalytic metal ions in human diseases. Mol. Aspects Med. 8: 89-193）。脳の血流量が減少すると、神経接合部でグルタミン酸塩の遊離が増加し、神経細胞内への流入が減少して細胞外のグルタミン酸塩の濃度が急速に増加しながら毒性を誘発し結局は神経細胞は死滅する。（Benveniste, H., Drejer, J., Schousboe, A. およびDiemer, N. H. (1984) Elevation of the extracellular concentrations of glutamate and aspartate in rat hippocampus during transient cerebral ischemia monitored by intracerebral microdialysis. J. Neurochem. 43: 1369-1374; およびHagberg, H., Lehmann, A., Saucberg, M., Nystrom, B., Jacobson, I. およびHamberger, A. (1985) Ischemia-induced shift of inhibitory and excitatory amino acids from intra- to extracellular compartments. J. Cereb. Blood Flow & Metab. 5: 413-419）。かかるグルタミン酸塩による神経毒性は極めて協力且つ迅速に発現する“急性毒性”と低濃度のグルタミン酸塩に露出したか、高濃度のグルタミン酸塩に短時間に露出した場合に発現する“慢性毒性”に分かれる。（Choi, D. W. (1988) Glutamate neurotoxicity and disease of the nervous system. Neuron 1: 623-634）。急性毒性は細胞外に存在するCa2+が細胞内に過量に流入して始まり、細胞の浸透圧維持のために続けてＮa^＋、K ^＋ およびＣｌ⁻などのイオンが流入することによって細胞は膨張し結局死に至る形態に示される。（Kauppisen, R. A., McMahonm, H. T.およびNicholls, D. G. (1988) Ca^２＋-dependent and Ca^２＋-independent glutamate release, energy status and cytosolic free Ca^２＋ concentration in isolated nerve terminals following metabolic inhibition: Possible relevance to hypoglycemia and anoxia, Neurosci. 27: 175-182;およびGarthwaite, G. およびGarthwaite, J. (1988) In vitro neurotoxicity of excitatory acid analogues during cerebellar development, J. Neurosci. 17: 755-767）。
【００１１】
グルタミン酸塩による慢性毒性はグルタミン酸受容体のN-メチル-D-アスパラギン酸（NMDA）受容体と非NMDA受容体が活性化しＣa^２＋が細胞内に流入することによって始まり、これによってＣa^２＋依存性酵素が活性化し結局は細胞が死滅する。（Coyle, J. T. およびPurrfarcken, P. (1993) Oxidative stress, glutamate and neurodegenerative disorders. Science 262: 689-695.）。すなわち、グルタミン酸塩によってNMDAおよび非−ＮＭＤＡ受容体が活性化しＣa^２＋が細胞内に流入して細胞内カルシウム依存性酵素のホスホリパーゼＡ２が非正常的に活性化すると多重の不飽和遊離脂肪酸の生成が増加し、活性酸素基および活性過酸化水素基のような遊離基が過多に生成し、細胞の過酸化を促進し結局は細胞が死滅する慢性毒性が起こる。（Coyle, J. T. およびPurrfarcken, P. (1993) Oxidative stress, glutamate and neurodegenerative disorders. Science 262: 689-695; Halliwell, B および Gutteridge J. M. (1985a) Oxygen radicals and the nervous system. Trends Neurosci. 5: 22-26; Halliwell, B および Gutteridge J. M. (1985b) The importance of free radicals and catalytic metal ions in human diseases. Mol. Aspects Med. 8: 89-193; Siesjo, B. K. および Wieloch, J. (1985) Cerebral metabolism in ischaemia: neurochemical basis for therapy. Br. J. Anaesth. 47: 47-62; Sladeczek, F., Pin, J. P., Recasens, M., Bokaerk, J. and Weiss, S. (1985) Glutamate stimulates inositol phosphate formation in striatal neurones. Nature 317: 717-719; および Choi, D. W. および Koh, J. (1987) Ionic dependence of glutamate neurotoxicity. J. Neurosci. 7: 369-379）。NMDA受容体が活性化すると、一酸化窒素合成酵素の活性度もさらに増大して一酸化窒素が過大に生成し細胞の過酸化を促進する（Strijbos, P. J. L. M. Leach, M. J. および Garthwaite, J. (1996) Vicious cycle involving Na+ channels, glutamate release and NMDA receptors mediates delayed neurodegeneration through nitric oxide formation. J. Neurosci. 16: 5004-5013）。グルタミン酸塩による神経毒性はグルタミン酸塩の拮抗物質、ナトリウム−またはカルシウム−チャンネル遮断剤、抗酸化剤、遊離基遮断剤およびザンチン脱水素酵素よりザンチン酸化酵素への転換を抑制する酵素の抗蛋白質酵素などによって防ぐことができるが、特にNMDA受容体に対する拮抗物質が効果的である。（Choi, D. W., Koh, J. および Peters, S. (1988) Pharmacology of glutamate neurotoxicity in cortical cell culture: attenuation by NMDA antagonists. J. Neurosci. 8: 185-196; and Olney, J. W. および Sharpe, I. G. (1969) Brain lesions in an infant rhesus monkey treated with monosodium glutamate. Science 166: 368-388）
【００１２】
一方、老人性痴呆を引き起こす主原因の疾患であるアルツハイマーの治療剤を開発するための研究の相反する二つの方向から進められている。グルタミン酸性神経の研究においては、その機能を亢進する面（効能剤の利用）と抑制する面（拮抗剤の利用）が共に進められている。すなわち、グルタミン酸性神経が損傷しグルタミン酸塩の量が減少すると記憶力と学習能力が低下する。退行性脳神経系疾患のアルツハイマー患者の場合はグルタミン酸受容体のＮＭＤＡ受容体数が７５−８７％、非−ＮＭＤＡ受容体数が４５−６９％と減少する。（Cowburn, R., Hardy, J., Roberts, P. および Briggs, R. (1988) Regional distribution of pre- and postsynaptic glutamatergic function in Alzheimer's disease. Brain Res. 452: 403-407; Greenamyre, J. T., Penney, J. B., D'Amato, C. J. および Young A. B. (1987) Dementia of the Alzheimer's type: Changes in hippocampal L-[3H] glutamate binding,. J. Neurochem. 48: 543-551; および Chalmers, D. T., Dewar, D., Graham, D. I., Brooks, D. N. および McCulloch, J. (1990) Differential alternations of cortical glutamatergic binding sites in senile dementia of the Alzheimer type. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1352-1356）。さらに、グルタミン酸受容体は記憶力と学習能力に関与すると知られている脳の部位に集中的に分布し、アルツハイマー病での記憶力喪失と学習能力低下はグルタミン酸受容体の異常によって大きく影響を受けるものと考えられる。（Izquierdo, I. (1991) Role of NMDA receptors in memory. Trends Pharm. Sci. 12: 260- 265）。記憶と学習の際、細胞内カルシウムイオンが増加して蛋白質分解酵素が活性化し、グルタミン酸受容体が増加し結果的にシナプシスで長時間にわたって構造および化学的な変化が起こることによって記憶と学習ができるようになるのが最も可能性の高い仮説となっている。（Thompson, R. F. (1986) The neurobiology of learning and memory. Science 233: 941- 947）。アルツハイマーは記憶力喪失が代表的に認知されている疾患でグルタミン酸効能剤もまた学習力と記憶力に重大な役割を行うものと知られているため、効能剤を投与して記憶力喪失の治療剤として用いる可能性について研究しつつ、数々の効能剤が効果を示すものと知られている。（Willetts, J., Balster, R. L., Leander, J. D. (1990) The behavioral pharmacology of NMDA receptor antagonists. Trends Pharmacol Sci 11: 423-428）。しかしながら、アルツハイマー患者では大脳皮質と海馬のグルタミン性神経のシナプシス前末端（pre-end of synapsis）でのグルタミン酸塩の再吸収に異常が起こり、グルタミン酸塩を代謝してＧＡＢＡを合成する酵素のグルタミン酸脱炭酸酵素の量が減少し結果的にはシナプシスでのグルタミン酸の量が増加する結果を招くものとなった。（Willetts, J., Balster, R. L., Leander, J. D. (1990) The behavioral pharmacology of NMDA receptor antagonists. Trends Pharmacol Sci 11: 423-428）
【００１３】
本発明者らは前記の文献的考察に基づき古くから健忘や脳卒中などの退行性神経系疾患に有効と知られ、民間や伝承医薬で用いられてきた漢方薬や生薬を中心に一次培養したマウスの大脳皮質細胞で脳神経系に及ぼす影響を検索した。すなわち、一次培養したマウスの大脳皮質細胞に生薬の総メタノール抽出物を投与した後、多量のグルタミン酸塩を作用し誘発する神経細胞の死滅にどのような影響を及ぼすかを調べた結果、ハンゲショウ（Saururus chinensis）の総メタノール抽出物が顕著な脳神経細胞保護活性を有するものと確認した。さらにハンゲショウより分離したアリストラクタム系アルカロイドが有意的に脳神経系細胞保護活性を有するものと確認した。
【００１４】
ハンゲショウはドクダミ科に属する多年草で民間では草全体または根や葉が利尿、水腫、淋疾、肝炎、肺炎および高血圧などの治療に用いられてきた。
ハンゲショウの化学成分に対する研究は今まで葉や茎（地上部）のフラボノイド、アルカロイド、アミノ酸、脂肪酸、キノンおよび精油成分について進められた。精油成分としてはメチル−ｎ−ノニル-ケトンが主成分として報告され、他にもα−ピネン、カンフェン、サフロール、β−カロフィレン、リナルール、フムレンなどが報告されている。（Choe, K. H., Yoon, C. H. および Kwon, S. J. (1988b) 、Chemical composition of Saururaceae growing in Korea - on volatile constituents of Saururus chinensis by GC/MS. Punsok kwahak 1: 259-262; および Choe, K. H., Kwon, S. J. および Lee K. C. (1989) 、Chemical composition of Saururaceae growing in Korea - on fatty acids and amino acids of Houttuynia cordata and Saururus chinensis. Punsok kwahak 2: 285-288）。ハンゲショウの葉や茎（地上部）の主成分のフラボノイドはヒペリン、ケルセチン、イソケルシトリンおよびケルシトリンなどが報告され、（Choe, K. H., Yoon, C. H. および Kwon, S. J. (1994)、 A study of chemical constituents of Saururaceae growing in Korea - on flavonoid constituents of Saururus chinensis. Anal. Sci. Technol. 7: 11-15; Sung, S. H., Kwon, S. H., Cho, N. J. および Kim, Y. C. (1997),Hepatoprotective flavonolglycosides of Saururus chinensis Herbs. Phytotherapy Res. 11: 500-503; および Wang, E. C., Shih, M. H., Liu, M. C., Chen, M. T. および Lee, G. H. (1996) Studies on constituents of Saururus chinensis. Heterocycles 43: 969-972）。エモジン、フィスシオンなどのキノン系列成分とカルパノン（carpanone）系列のリグナンも報告されている。（Crohare, R., Priestap, H. A., Farina, M., Cedola, M. および Ruveda, E. A. (1962), Aristolactams of Aristolochia Argentina. Phytochemistry 13: 1957-1960）。さらに、アリストラクタム系列のアルカロイドのサウロラクタムがハンゲショウの細胞毒性成分に分けられ、（Priestap, H. A. (1989) 13C-NMR spectroscopy of aristolochic acid and aristolactams. Magn. Reson. Chem. 27: 460-465）、同じ系列のアルカロイドのアリストラクタムも報告されている。(Crohare, R., Priestap, H. A., Farina, M., Cedola, M. および Ruveda, E. A. (1962), Aristolactams of Aristolochia Argentina. Phytochemistry 13: 1957-1960).。
【００１５】
一方、クプリン酸、リノール酸およびラウリン酸の脂肪酸とアラニン、バリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、ロイシン、イソロイシンおよびフロリンのアミノ酸の存在も確認した。(Priestap, H. A. (1985a) Seven aristolactams from Aristolochia Argentina. Phytochemstry 24: 849-852). ）
【００１６】
（発明が解決しようとする課題）
本発明者らはハンゲショウおよびハンゲショウ根の抽出物、ハンゲショウより分離した単一物質を研究し、次のような事実を究明した。
【００１７】
本発明の目的は退行性脳神経系疾患の予防および治療効果を有するハンゲショウエキスを有効成分として含有する薬剤学的製剤を提供することである。
【００１８】
本発明の他の目的はハンゲショウより分離した上記一般式（Ｉ）のアリストラクタム系アルカロイド誘導体の退行性脳神経系疾患の予防および治療剤としての用途を提供することである。
【００１９】
本発明の更なる他の目的はハンゲショウより分離した上記一般式（Ｉ）のアリストラクタム系アルカロイド誘導体を含有する退行性脳神経系疾患の予防および治療用薬剤学的製剤を提供することである。
【００２０】
（発明の構成）
以下、本発明の構成および作用効果を次の通り詳細に説明する。
【００２１】
ハンゲショウの抽出はメタノール、エタノールまたはプロパノールのような低級アルカノール、メチレンクロライドまたはクロロホルムのような塩素化炭化水素、ヘキサンまたはヘプタンのような炭化水素類、ベンゼン、トルエンなどのような芳香族炭化水素、またはこれらの混合溶媒中で行われる。
【００２２】
次に実施例および実験例で本発明をより詳細に説明する。
【００２３】
実施例１
乾燥ハンゲショウ１０ｋｇをクロロホルムとメタノール（１：１）の混合溶媒を用い還流装置内で３回抽出して溶媒を真空で除去し、三百草の総抽出物１．８ｋｇを得た。ハンゲショウエキス（１．８ｋｇ）を蒸留水に懸濁した後、ＣＨ_２Ｃｌ_２で抽出しＣＨ_２Ｃｌ_２−抽出物を真空乾燥して蒸発した。得られたＣＨ_２Ｃｌ_２画分をさらに９０％メタノールに懸濁した後、ｎ−ヘキサンで抽出した。ｎ−ヘキサン抽出物と残留９０％メタノール懸濁液を真空乾燥し、９０％メタノール画分（１２０ｇ）とｎ−ヘキサン画分（６０ｇ）を得た。
【００２４】
実施例２
化合物1の分離および同定
ｎ−ヘキサン画分（６０ｇ）をｎ−ヘキサン：酢酸エチルの混合溶媒（１００：１）で段階的濃度勾配で溶離し、シリカゲルカラム上でクロマトグラフィーして２０個の小画分に分けた。このうち、６番小画分（６００ｍｇ）をセファデックスＬＨ−２０カラムクロマトグラフィーを行い、アルカロイド粗画分（２００ｍｇ）を得た。化合物１（Ｒｔ １４．１５ｍｉｎ）を逆相ＨＰＬＣにより分離した。化合物１をメタノールを用いて再結晶し化合物１（１００ｍｇ）を得た。
【００２５】
化合物１の同定
淡黄色粉末
UV (CHCl_３) λmax (log ε): 388.10 (3.88), 314.20 (3.94), 287.20 (4.45), 276.50 (4.42), 262.10 (4.42), 235.50 (4.56) nm
IR (KBr) νmax: 3220, 1701, 1648, 1427, 1319, 1257, 1031, 972, 835, 737, 604 cm^−１
EIMS (m/z) (rel. int.): 279 [M^＋] (100), 264 (31), 236 (25), 194 (61)
^１H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ 10.32 (OH), 9.10 (1 H, dd, J = 8.85, 2.50 Hz, H-5), 7.94 (1 H, dd, J = 8.16, 2.25 Hz, H-8), 7.62 (1 H, s, H-2), 7.58 (2 H, td, J = 7.00, 7.25 Hz, H-6 and H-7), 7.28 (1 H, s, H-9), 4.01 (3 H, s, OCH_３), 3.38 (3 H, s, NCH_３) ppm
^１３C NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ 166.79 (C-1), 152.17 (C-3), 148.81 (C-4), 136.93 (C-9a), 134.64 (C-4a), 129.01 (C-8), 127.44 (C-6), 126.86 (C-5), 126.30 (C-8a), 125.57 (C-7), 120.96 (C-1a and 1b), 120.14 (C-5a), 113.60 (C-2), 103.48 (C-9), 59.52 (OCH_３), 26.17 (NCH_３) ppm
【００２６】
以上の理化学的および分光学的結果に基づき化合物1を10-アミノメチル-4-メトキシ−３−ヒドロキシ−フェナントレン−１−カルボン酸ラクタムのサウロラクタムと同定した。（Crohare, R., Priestap, H. A., Farina, M., Cedola, M. およびRuveda, E. A. (1962), Aristolactams of Aristolochia Argentina. Phytochemistry 13: 1957-1960; Priestap, H. A. (1989) 13C-NMR spectroscopy of aristolochic acid and aristolactams. Magn. Reson. Chem. 27: 460-465; および Priestap, H. A. (1985a) Seven aristolactams from Aristolochia Argentina. Phytochemstry 24: 849-852）.
【００２７】
実施例３
化合物２の分離および同定
化合物１の分離過程中、未完成分離用ＨＰＬＣでＲｔ １５．９０ｍｉｎのパークを分取し、化合物１と同じ方法で化合物２（１０ｍｇ）を得た。
【００２８】
化合物２の同定
淡黄色の粉末
UV (CHCl_３) λmax (log ε): 380.00 (3.74), 314.20 (3.78), 285.20 (4.33), 275.00 (4.35), 261.20 (4.27), 230.00 (4.41) nm
IR (KBr) νmax: 3220, 1701, 1648, 1427, 1319, 1257, 1031, 972, 835, 737, 604 cm^−１
EIMS (m/z) (rel. int.): 279 [M^＋] (100), 264 (59), 236 (66)
^１H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ 10.85 (NH), 9.12 (1 H, dd, J = 8.32, 2.01 Hz, H-5), 7.94 (1 H, dd, J = 8.32, 2.01 Hz, H-8), 7.85 (1 H, d, J = 2.01 Hz, H-3), 7.57 (2 H, m, H-6 and H-7), 7.14 (1 H, s, H-9), 4.10 (3 H, s, OCH_３), 4.01 (3 H, s, OCH_３) ppm
^１３C NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ 168.85 (C-1), 154.71 (C-3), 150.86 (C-4), 135.80 (C-9a), 135.30 (C-4a), 129.51 (C-8), 127.95 (C-6), 127.30 (C-5), 126.38 (C-8a), 125.96 (C-7), 123.78 (C-1a), 122.60 (C-1b), 120.75 (C-5a), 110.37 (C-2), 105.07 (C-9), 60.39 (OCH_３), 57.40 (OCH_３) ppm
【００２９】
以上の理化学的および分光学的結果に基づき化合物１を１０−アミノ−３、４−メトキシ−３−ヒドロキシ−フェナントレン−１−カルボン酸ラクタムのアリストラクタムＢIIと同定した。（Crohare, R., Priestap, H. A., Farina, M., Cedola, M. および Ruveda, E. A. (1962), Aristolactams of Aristolochia Argentina. Phytochemistry 13: 1957-1960; Priestap, H. A. (1989), 13C-NMR spectroscopy of aristolochic acid and aristolactams. Magn. Reson. Chem. 27: 460-465; および Priestap, H. A. (1985a), Seven aristolactams from Aristolochia argentina. Phytochemstry 24: 849-852）
【００３０】
実施例４
化合物３の合成および同定
ハンゲショウより分離したサウロラクタムとＥ−ｐ−ケイ皮酸メトキシをエステル化して化合物３を合成した。サウロラクタム（１０ｍｇ）およびＥ−ｐ−ケイ皮酸メトキシを無水トルエン内に溶かした後、ジシクロヘキシルカルボジイミドおよび４−ジメチルアミノピリジンを加えアルゴン気流下、油槽内で７０℃まで加温し攪拌した。１８時間反応した後、溶液を濾過して反応中に生成された尿素を除去した。濾液を濃縮しｎ−ヘキサン：塩素化炭化水素：メタノール濃度勾配でシリカゲルカラム上でクロマトグラフィーを行い、化合物３を分離した。
【００３１】
化合物３の同定
黄色の粉末
EIMS (m/z) (rel. int.): 409 (17) [M^＋], 293 (16), 279 (14) [M^＋-cinnamic acid], 224 (9) 178 (100), 164 (72), 131(56)
^１H NMR (300 MHz, CDCl_３): δ 9.10 (1 H, d, J = 8.32 Hz, H-5), 8.00 (1 H, d, J = 15.90 Hz, H-7'), 7.92 (1H, s, H-2), 7.87 (1 H, m, H-8), 7.69 - 7.55 (4 H, m, H-2', 3', 5', 6'), 7.45 (2 H, m, H-6 and H-7), 7.10 (1 H, s, H-9), 6.75(1H, d, J = 15.90 Hz, H-8'), 4.01 (3 H, s, OCH_３), 3.50 (3 H, s, NCH_３) ppm
【００３２】
以上の理化学的および分光学的結果に基づき化合物３をサウロラクタム−３−Ｏ−Ｅ−ｐ−ケイ皮酸メトキシと同定した。
EIMS (m/z) (rel. int.): 409 (17) [M^＋], 293 (16), 279 (14) [M^＋-cinnamic acid], 224 (9) 178 (100), 164 (72), 131(56)
^１H NMR (300 MHz, CDCl３): δ 9.10 (1 H, d, J = 8.32 Hz, H-5), 8.00 (1 H, d, J = 15.90 Hz, H-7'), 7.92 (1H, s, H-2), 7.87 (1 H, m, H-8), 7.69 - 7.55 (4 H, m, H-2', 3', 5', 6'), 7.45 (2 H, m, H-6 and H-7), 7.10 (1 H, s, H-9), 6.75(1H, d, J = 15.90 Hz, H-8'), 4.01 (3 H, s, OCH_３), 3.50 (3 H, s, NCH_３) ppm
【００３３】
実験例
実験方法
１．実験動物
大韓民国ソウル大学校動物飼育場から供与されたスピローグ-ドーリー（Sprague-Dawley）系マウスをソウル大学薬学大実験動物室で飼育した。飼育場の環境は室内温度を２２±５℃に維持して照明時間を朝７時〜夜７時に固定し、飼料は粗蛋白２３．２％、粗脂肪４．０％、粗繊維６．０％、粗灰分１０．０％、粗カルシウム０．６％、粗リン０．４％などを含有した固形飼料（ソウル、三養社）を用いた。
【００３４】
２．皮質細胞の培養
ニューロンおよびグリアを共に含有する混合大脳皮質細胞の一次培養物を先行技術文献に開示のラット胎児より製造した。( Kim YC, Kim SR, Markelonis GJおよびOh TH (1998), Ginsenosides Rb1 and Rg3 protect cultured rat cortical cells from glutamate-induced neurodegeneration. J. Neurosci. Res. 53: 426-432).
分離した大脳皮質細胞を１．０×１０^６ ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるようコラーゲンで塗布した培養容器に移植した。培養液は熱不活性化された１０％仔牛胎児血清を含有するＤＭＥＭに１ｍＭピルビン酸ナトリウム、ペニシリン１００ ＩＵ／ｍｌおよびストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを加え、３７℃で湿度を保った空気９５％／ＣＯ_２５％の雰囲気下にて用いた。実験に用いる前２週間培養した。
【００３５】
３．ハンゲショウ抽出物の投与
ハンゲショウの総抽出物、画分および分離した化合物はＤＭＳＯ（最終培養濃度０．１％以内）に溶解した後、蒸留水で希釈しミリポアメンブレイン（０．２２μｍ， Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ， Ｕ．Ｓ．Ａ．）を通過させて無菌状態とした。該溶液を濃度を異にし培養し、ニューロン細胞に投与した。
【００３６】
１）ＭＴＴ検定法
培養中の大脳皮質細胞の培養液にＭＴＴ（５ｍｇ／ｍｌ）を培養液の１０％になるよう加え、続けてさらに３時間培養し生成されたホルマザンをＤＭＳＯで溶解した後、５４０ｎｍで吸光度を測定した。（Mosmann T (1983) Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immuno. Methods 65: 55-61）
【００３７】
２）一酸化窒素の定量
一次培養した大脳皮質細胞より培養液中に遊離される一酸化窒素の量はグリース試薬を用いてドーソンらの方法で測定した。（Dawson VL, Brahbhatt HP, Mong JA and Dawson TM (1994) Expression of inducible nitric oxide synthase causes delayed neurotoxicity in primary neuronal-glial cortical cultures. Neuropharmacology 33: 1425-1430）
【００３８】
３）細胞内Ｃａ^２＋濃度測定
一次培養した大脳皮質細胞内のＣａ^２＋濃度は活性を測定しようとする化合物を投与し１時間後にグルタミン酸塩で神経毒性を誘導した後、Ｆｕｒａ−２ ＡＭを用いて測定した。（Grynkiewicz G, Poenie MおよびTsien RY (1985) A new generation of calcium indicators with greatly improved fluorescence properties. J. Biol. Chem. 260: 3440-3450）
【００３９】
４）結果および考察
本発明者らはインビトロ検定システムでラットの大脳皮質細胞の一次培養液を用いグルタミン酸−誘導された神経毒性に対抗する神経保護化合物を天然物より分離した（Ｋｉｍ など、１９９８）。本培養液でグルタミン酸−誘導された損傷に対し、保護効果を有する天然供給源をスクリーニングする過程で本発明者らはハンゲショウの根よりのＣＨＣｌ_３／ＭｅＯＨ抽出物が有意的な神経保護活性を示すものと明らかになった（表１）。化合物１および２をセファデックスＬＨ−２０カラムクロマトグラフィーと未完成分離用ＨＰＬＣによって分離し、次の構造式を有するサウロラクタムおよびアリストラクタムで同定した。
【００４０】

【００４１】
ハンゲショウの総抽出物のバイオ検定による分画の結果、ｎ−ヘキサン分画が最も活性のものと明らかになった。（１０ｇ／ｍｌ、ｐ＜０．００１でグルタミン酸−誘導された毒性に対し、５０．６％保護率）（表１）。数回のクロマトグラフィーによってｎ−ヘキサン画分をさらに分画および分離し、二つの化合物１および２を得た。化合物１および２は１０−アミノメチル−４−メトキシ−３−ヒドロキシ−フェナントレン−１−カルボン酸ラクタムのサウロラクタムおよび１０−アミノ−３，４−メトキシ−３−ヒドロキシ−フェナントレン−１−カルボン酸ラクタムのアリストラクタムＢIIで同定した（Crohareなど、1962、Priestapなど、1985a Priestap、1985）。分離したアリストラクタム系アルカロイドの脳神経細胞保護活性を本培養システムで検索した。アルカロイド存在下、ＤＭＥＭ内で２４時間インキュベーションした後、培養液を神経損傷程度に対し検索した（全体処理）。サウロラクタムおよびアリストラクタムＢIIを１．０Ｍ〜１０．０Ｍの濃度範囲で全体処理で顕著な脳神経細胞保護活性を示した（表２）。
【００４２】
グルタミン酸塩−誘導された毒性に対するこれら二つのアリストラクタムアルカロイドの脳神経保護活性は興奮毒性の前後に一定時間の間隔で露出し、初期に評価した。一部培養液はグルタミン酸塩に（３０分間）曝す１時間前からアルカロイドで前処理し、洗浄してＤＭＥＭ内で２４時間にわたってアルカロイド不在下で維持した（前処理群）（表３）。さらに、培養液を３０分間グルタミン酸に最初曝し、洗浄してアルカロイド存在下で２４時間にわたってＤＭＥＭ内で維持した（後処理群）（表４）。
【００４３】
表４に示したよう、これらアルカロイドは１．０Ｍ〜１０．０Ｍの濃度範囲で後処理群でグルタミン酸塩によって誘導された神経毒性を顕著に抑制した。しかし、サウロラクタムおよびアリストラクタムＢIIは前処理群ではグルタミン酸−誘導された神経毒性培養の皮質細胞をあまり顕著に保護することができなかった（表３）。これらの結果よりアリストラクタムアルカロイドはグルタミン酸の受容体結合またはグルタミン酸受容体−媒介された細胞反応に初期段階で直接的に拮抗作用するものではなくグルタミン酸受容体の過剰活性後に起こる一連の反応過程中に作用して発現するものとまずは推定することができた。サウロラクタムおよびアリストラクタムＢIIが過量のグルタミン酸による毒性誘発の初期段階で細胞内へ多量に流入されるＣａ^２＋の量をあまり顕著には減少し得ないという実験結果がかかる推定を裏付けると言えよう（実験結果未提示）。過多な細胞内ニューロン性Ｃａ^２＋濃度は一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）、プロテインキナーゼＣ、ホスホリパーゼおよびプロテアーゼを含む一連の酵素を活性化することができる。ＮＯＳが活性化されると過度なＮＯが生成される。ＮＯはグルタミン酸神経毒性に伴うものと知られている（Ｍａｓａｎｏｒｉなど、１９９８）。ＮＯは超酸化物アニオンと反応してペルオキシ亜硝酸ラジカルを形成し、これは用量−依存的神経損傷を誘発する（Ａｌｍｅｉｄａなど、１９９８）。したがって、さらに強力な脳保護活性アルカロイドのアリストラクタムＢIIの培養液内のＮＯ含量に対する効果を測定した（表５）。
【００４４】
グルタミン酸のみで処理した皮質細胞培養液はＮＯ形成が増加する反面、グルタミン酸およびアリストラクタムＢIIで処理した培養液内の含量はわずかの増加と示された（表５）。この結果はアリストラクタムＢIIがペルオキシ亜硝酸ラジカルの過多生産またはＮＯＳの過度生産を阻害することを示す。
【００４５】
グルタミン酸受容体活性化はホスホリパーゼＡ２も刺激する（LiptonおよびRosenberg、1994 ）。ホスホリパーゼＡ２の活性化はその代謝物のアラキドン酸の生成を誘発する。アラキドン酸はＮＭＤＡ−誘導された電流を強化しグルタミン酸塩が星状細胞およびニューロン内へ再吸収されることを阻害する（Millerなど、1992）。酸素遊離ラジカルはアラキドン酸代謝中に生成することがあって、追加のホスホリパーゼＡ２活性化を誘発する（Lafon-Cazalなど、1993）。ＣＮＳニューロンは高い酸素消費速度および神経システムの細胞内ポリ不飽和脂肪酸の高い含量により酸化的ストレスに非常に鋭敏である（Choi, 1988 CoyleおよびPuttfarcken, 1993）。それにもかかわらず、脳は高い水準のいくつかの抗酸化化合物（たとえばＧＳＨ）およびいくつかの抗酸化酵素（たとえばカタラーゼ、ＳＯＤ、ＧＳＨ−ｐｘおよびＧＳＳＧ−Ｒ）を含む細胞防御システムを有する（Buckmannなど、1993）。本発明者らはアリストラクタムＢIIが抗酸化酵素の活性に効果があるとみなした。しかし、アリストラクタムＢIIはカタラーゼ、ＳＯＤおよびＧＳＨ−ｐｘの活性にはあまり顕著な保護効果を示していない（データ未提示）。したがって、アリストラクタムＢIIはＮＯＳに直接作用することによってグルタミン酸塩−誘導された神経毒性培養の皮質ニューロンを保護する。しかしこの仮説的メカニズムを確立するためには更なる実験を行わなければならない。
【００４６】
一方、本研究室では１次培養したマウスの大脳皮質細胞を用い（Ｅ）−ｐ−ケイ皮酸メトキシの脳神経細胞保護活性を確認し、これを特許出願した（韓国特許出願番号第９８−２８１８９号）。これに本研究ではアリストラクタムアルカロイドの脳神経細胞保護活性増大を目的にサウロラクタムの酸化水素基に（Ｅ）−ｐ−ケイ皮酸メトキシを結合したサウロラクタム−３−Ｏ−（Ｅ）−ｐ−ケイ皮酸メトキシ（Ｓ−ＭＣＡ）を合成した。Ｓ−ＭＣＡの脳神経細胞保護活性はインビトロ培養システムを用い評価した（表６および７）。Ｓ−ＭＣＡは前処理した場合も後処理した場合も、両方とも顕著な脳神経細胞保護活性を示した。すなわち、かかるＳ−ＭＣＡの脳神経細胞保護活性は（Ｅ）−ｐ−ケイ皮酸メトキシを後処理した場合に脳神経保護活性が減少することと、アリストラクタムアルカロイドを前処理した場合に脳神経細胞保護活性が弱くなることを共に改善した結果と言えよう。すなわち、Ｓ−ＭＣＡは（Ｅ）−ｐ−ケイ皮酸メトキシの神経細胞死滅遮断効果とアリストラクタムアルカロイドの神経毒性誘発後の生存率改善効果の二つの長所を有するため、退行性脳神経系疾患の予防や治療剤として開発できる可能性が一層高まったと考えられる。
【００４７】
かかるＳ−ＭＣＡの脳神経細胞保護活性は一次培養したマウスの大脳皮質細胞を用いる様々な実験を通じて立証することができる。Ｓ−ＭＣＡは過度なグルタミン酸によって誘導された細胞内Ｃａ^２＋増加をうまく遮断した。（表８）さらに、Ｓ−ＭＣＡは前処理または後処理共に細胞内Ｃａ^２＋増加を首尾良く遮断した結果としてＮＯ合成を顕著に減少させた（表９）。Ｓ−ＭＣＡはさらにグルタミン酸によって損傷された皮質ニューロンで細胞内ペルオキシドの量を減少した。
【００４８】
５）グルタミン酸塩による神経毒性誘導
ラット胎児より直接分離した皮質細胞を１４日間培養した。テストサンプルを相異する濃度で培養細胞に処理した。１時間後、１００μＭグルタミン酸塩で処理し、神経毒性を誘導した。２４時間後に生存細胞率をＭＴＴ検定法で測定し、サンプルの脳保護活性を決定した。
【００４９】
６．統計分析
統計的有意性研究は各テスト群に対し、３個（ｎ＝３）で行われた。データは分析偏差を用い統計的有意性に対して評価した（ＡＮＯＶＡテスト）。統計的有意性に対する信頼水準は５％の確立で設定された。
【００５０】

【００５１】
コントロールは一次培養したラットの大脳皮質細胞のＭＴＴ数値で１．０３±０．０８の光学密度（ＯＤ）を有する。グルタミン酸処理群はグルタミン酸塩で３０分間毒性を受けたラットの大脳皮質細胞のＭＴＴ数値で０．５８±０．０２の光学密度（ＯＤ）を有する。
【００５２】
生存率は次のよう計算した。１００×（試料処理群の吸光度値−グルタミン酸塩処理群の光学密度）／（正常対照群の光学密度−グルタミン酸塩処理群の光学密度）試料処理群の結果はグルタミン酸塩処理群の差は統計的に有意性がある；
*：p<0.05、**： p<0.01、**：p<0.001。
【００５３】

【００５４】

【００５５】

【００５６】

【００５７】

【００５８】

【００５９】

【００６０】

【００６１】
本発明の一般式（Ｉ）の化合物は１日１ｍｇ〜２００ｍｇを１〜３回投与することができる。本発明のハンゲショウエキスおよび化合物は患者の体重、性別、年齢および疾病の程度によってその使用量を増減することができる。
【００６２】
本発明のハンゲショウエキスおよび化合物は通常薬剤学的に許容される賦形剤と共に薬剤学的に通常的に許容される薬学的製剤、たとえば注射剤、液剤、シロップ剤、錠剤、カプセル剤などに製剤化して薬学的製剤を製造することができる。
【００６３】
次の製剤実施例より本発明をさらに詳細に説明する。
【００６４】
製剤実施例１
ハンゲショウエキス １００ｍｇ
注射用滅菌蒸留水 適量
ｐＨ調節剤 適量
ハンゲショウエキスを注射用蒸留水に溶解し、ｐＨ調節剤でｐＨ約７．６に調節した後、全体を２ｍｌにした後、２ｍｌ用量のアンプルに充填して滅菌し注射剤を製造する。
【００６５】
製剤実施例２
化合物１ ２ｍｇ
注射用滅菌蒸留水 適量
ｐＨ調節剤 適量
化合物１を注射用蒸留水に溶解し、ｐＨ調節剤でｐＨ約７．２に調節して全体を２ｍｌにした後、２ｍｌ用量のアンプルに充填して滅菌し注射剤を製造する。
【００６６】
製剤実施例３
ハンゲショウエキス １００ｍｇ
乳糖 １００ｍｇ
澱粉 １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム 適量
前記の成分を混合し、通常錠剤の製造方法に従って打錠し錠剤を製造する。
【００６７】
製剤実施例４
化合物２ １０ｍｇ
乳糖 １００ｍｇ
澱粉 ５０ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム 適量
前記の成分を混合し、通常錠剤の製造方法に従って打錠し錠剤を製造する。
【００６８】
製剤実施例５
ハンゲショウエキス ５ｍｇ
乳糖 ５０ｍｇ
澱粉 ５０ｍｇ
タルク ２ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム 適量
前記の成分を混合し、通常カプセル剤の製造方法に従ってゼラチンカプセルに充填しカプセル剤を製造する。
【００６９】
製剤実施例６
化合物１ ５ｍｇ
乳糖 １００ｍｇ
澱粉 ９３ｍｇ
タルク ２ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム 適量
前記の成分を混合し、通常カプセル剤の製造方法に従ってゼラチンカプセルに充填しカプセル剤を製造する。
【００７０】
製剤実施例７
ハンゲショウエキス ５０ｍｇ
砂糖 ２０ｇ
異性化糖 ２０ｇ
レモン香 適量
精製水 全体 １００ｍｌ
前記の成分を通常液剤の製造方法に従って混合し、１００ｍｌの褐色ボトルに充填して滅菌し液剤を製造する。
【００７１】
製剤実施例８
化合物３ ５０ｍｇ
砂糖 ２０ｇ
異性化糖 ２０ｇ
レモン香 適量
精製水 全体 １００ｍｌ
前記の成分を通常液剤の製造方法に従って混合し、１００ｍｌの褐色ボトルに充填して滅菌し液剤を製造する。
【００７２】
（産業上の利用可能性）
上記の実験結果でハンゲショウの総抽出物、塩素化炭化水素画分、ｎ−ヘキサン画分およびアリストラクタム系列アルカロイドとこれのケイ皮酸誘導体は脳卒中および痴呆のような退行性脳神経系疾患の予防や治療剤として用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 前処理および後処理でグルタミン酸塩を投与したマウス大脳皮質細胞のペルオキシド含量に対するＳ−ＭＣＡの効果を示したグラフである。

Claims (1)

1. 下記式で示されるサウロラクタム−３−Ｏ−Ｅ−ｐケイ皮酸メトキシ及び薬学的に許容される担体とを含む、退行性脳神経系疾患の予防及び／又は治療用医薬製剤。
   

   

Images