KR20240073178A - 부채마 추출물 또는 디오신을 포함하는 기억력 개선, 신경염증 억제, 신경세포 사멸 억제, 또는 자가포식작용 촉진용 조성물 - Google Patents
부채마 추출물 또는 디오신을 포함하는 기억력 개선, 신경염증 억제, 신경세포 사멸 억제, 또는 자가포식작용 촉진용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 부채마 추출물 또는 디오신을 포함하는 기억력 개선, 신경염증 억제, 신경세포 사멸 억제, 또는 자가포식작용 촉진용 조성물에 관한 것으로, 부채마 추출물 또는 디오신을 유효성분으로 포함하는 기억력 또는 인지기능 장애 예방 또는 개선용 조성물, 신경염증질환의 예방 또는 치료용 조성물, 신경세포 사멸 억제용 조성물, 및 자가포식작용 촉진용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서는 부채마 뿌리줄기 추출물 또는 디오신이 기억력 및 인지기능 개선 효능을 가지고 있을 뿐만 아니라, 신경염증을 억제하는 것을 확인하였다. 또한, 디오신은 파킨슨병 모델에서 자가포식 활성을 유도하여 뇌신경세포의 사멸을 억제하고, 신경 보호 효과를 가지고 있는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 부채마 뿌리줄기 추출물 또는 디오신은 기억력 개선, 신경염증 억제, 신경세포 사멸 억제, 또는 자가포식작용 촉진용 조성물로 활용될 수 있다.
본 발명에서는 부채마 뿌리줄기 추출물 또는 디오신이 기억력 및 인지기능 개선 효능을 가지고 있을 뿐만 아니라, 신경염증을 억제하는 것을 확인하였다. 또한, 디오신은 파킨슨병 모델에서 자가포식 활성을 유도하여 뇌신경세포의 사멸을 억제하고, 신경 보호 효과를 가지고 있는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 부채마 뿌리줄기 추출물 또는 디오신은 기억력 개선, 신경염증 억제, 신경세포 사멸 억제, 또는 자가포식작용 촉진용 조성물로 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 부채마 추출물 또는 디오신을 포함하는 기억력 개선, 신경염증 억제, 신경세포 사멸 억제, 또는 자가포식작용 촉진용 조성물에 관한 것으로, 부채마 추출물 또는 디오신을 유효성분으로 포함하는 기억력 또는 인지기능 장애 예방 또는 개선용 조성물, 신경염증질환의 예방 또는 치료용 조성물, 신경세포 사멸 억제용 조성물, 및 자가포식작용 촉진용 조성물에 관한 것이다.
신경 염증은 알츠하이머 병을 포함한 퇴행성 신경 질환 진행의 중요한 병리학적 특징이다. 뇌의대식세포인 미세아교세포는 LPS와 같은 외인성 신경독을 감지할 수 있다. LPS는 미세아교세포의 TLR4(toll-like receptor 4)에 결합하여 면역 반응을 자극한다. TLR4 신호 활성화 후, 다운스트림 신호 전달 캐스케이드는 NF-κB를 활성화하고, 이는 TNF-α, 인터루킨-1β(IL-1β) 및 인터루킨-6(IL-6)을 포함하는 염증성 사이토카인의 방출을 유발시킨다. 산화질소 합성효소(iNOS)와 사이클로옥시게나아제-2(COX-2)의 유도성 전염증 매개체도 이과정에서 상향 조절되어 산화질소(NO)와 프로스타글란딘 E2(PGE2)의 생성을 증가시켜 신경염증을 더욱 악화시킨다.
전뇌 콜리성 뉴런은 중추 신경계 조절 인지 기능을 제어하는 데 중요한 역할을 한다. 콜린성 저하가 인지 기능에 영향을 미치고 항염증 경로를 방해하며, 콜린성 신호는 항염증 메커니즘을 통해 말초 사이토카인 생산을 조절하는 것으로 보고되었다 (Hoover, D.B., Pharmacol. Ther., 2017, 179:1-16). 스코폴라민(Scopolamine)은 해마와 전전두엽 피질의 콜린성 신경전달을 손상시켜 알츠하이머병의 분자적, 행동적 특징과 유사한 인지기능과 학습기억을 손상시키는 항콜린성 약물로, 다양한 뇌 영역에서 염증유발 사이토카인 및 인플라마좀 성분이 상향조절된다 (Cheon, S.Y. et. al., Sci. Rep., 2021, 11:8376).
신경 염증 질환 중에 하나인 파킨슨병(PD)은 SNpc(substantia nigra pars compacta)에서 도파민성(DAergic) 뉴런의 손실, 뉴런 내 단백질 봉입체 및 루이 소체의 형성을 특징으로 하는 가장 널리 퍼진 연령 관련 신경퇴행성 질환 중 하나이다. 자가포식은 손상된 소기관, 잘못 접히거나 응집된 단백질, 세포내 병원균을 포함한 세포내 구성요소가 세포의 세포질로 분해되는 세포 항상성 과정이다. 자가포식 과정에서 이중막 소포인 자가포식소체(autophagosome)는 표적 세포 구성요소를 리소좀으로 전달하고 그 내부에서 융합하여 자가용해소체를 형성하여 세포의 오작동 내용물을 분해하고 재활용할 수 있다. 반대로 자가포식 기능 장애는 세포 사멸을 촉진하여 신경 퇴행성 질환, 암 및 노화 관련 질병을 유발할 수 있다. 이전의 연구에서 산발성 또는 돌연변이 α-시누클레인의 제거와 같은 자가포식 기능 장애가 파킨슨병의 발병기전에 관여하는 것이 확인된 바 있다 (Liu, J. et. al., Cell Death Dis., 2017, 8:e3056).
한편, 부채마(Dioscorea nipponica; DN)는 마과(Dioscoreaceae)과에 속하는 디오스코리아(Dioscorea) 속의 종으로, 마른기침, 기관지염, 류머티즘, 진통과 같은 호흡기 질환을 치료하고 혈액순환을 촉진하며 소화와 이뇨작용을 증진시키는 효과가 있다. 부채마에서 발견되는 주요 화합물은 디오신(dioscin)과 같은 스테로이드성 사포닌과 diosniponol C 및 diosniposide A와 같은 스틸벤 유도체이다. 최근 연구 결과에 따르면 부채마의 생리활성 화합물과 스테로이드성 사포닌은 심혈관 질환을 약화시키고 면역 기능을 개선하며 암 진행을 예방하는 효능이 있다 (Ou-Yang, S.H. et. al., Chem. Cent. J., 2018, 12:57).
이에, 본 발명에서는 효과적인 신경염증 억제 효과를 가지는 물질을 선별하기 위해 예의 노력한 결과, 부채마 뿌리줄기 추출물 또는 디오신이 신경염증을 억제할 뿐만 아니라, 기억력 개선 효능을 가지고 있는 것을 확인하였다. 또한, 디오신은 파킨슨병 모델에서 자가포식 유동 손상을 개선하여 신경세포의 사멸을 억제하고, 신경 보호 효과를 가지고 있는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 부채마 뿌리줄기 추출물 또는 디오신을 유효성분으로포함하는 기억력 및 인지 기능 장애 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 부채마 뿌리줄기 추출물 또는 디오신을 유효성분으로 포함하는 신경염증질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 부채마 뿌리줄기 추출물 또는 디오신을 유효성분으로 포함하는 신경세포 사멸 억제용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 부채마 뿌리줄기 추출물 또는 디오신을 유효성분으로 포함하는 자가포식작용 촉진용 조성물을 제공하는 데 있다.
상술한 목적을 달성하기 위해,
본 발명은 부채마(Dioscorea nipponica Makino) 뿌리줄기 추출물 또는 디오신(dioscin)을 유효성분으로 포함하는 기억력 및 인지 기능 장애 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 부채마 뿌리줄기 추출물 또는 디오신을 유효성분으로 포함하는 기억력 및 인지 기능 장애 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 부채마 뿌리줄기 추출물은 에탄올을 용매로 하여 추출할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 콜린성 신경 기능 저하를 개선시킬 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 해마 또는 대뇌 피질에서 ⅰ) iNOS 또는 COX-2를 포함하는 염증성 인자의 발현 억제; 또는 ⅱ) BDNF 또는 pCREB를 포함하는 인지기능성 인자의 발현 증가를 유도할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시에에 있어서, 상기 기억력 또는 인지 기능 장애는 경도인지장애, 주의력 결핍장애(ADHD), 우울증, 알츠하이머병, 뇌혈관성 치매, 노인성 치매, 픽(pick)병 및 크루츠펠트-야곱(Creutzfeldt-jakob)병으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.
다른 목적을 달성하기 위해,
본 발명은 부채마(Dioscorea nipponica Makino) 뿌리줄기 추출물 또는 디오신(dioscin)을 유효성분으로 포함하는 신경염증질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 부채마 뿌리줄기 추출물 또는 디오신을 유효성분으로 포함하는 신경염증질환의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 부채마 뿌리줄기 추출물은 에탄올을 용매로 하여 추출할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 있어서, 상기 부채마 뿌리줄기 추출물 또는 디오신은
ⅰ) NO, iNOS 및 COX-2를 포함하는 염증반응 매개인자(inflammatory mediators) 생성 억제;
ⅱ) IL-1β, IL-6 및 TNF-α를 포함하는 염증성 사이토카인(cytokines) 생성 억제; 및
ⅲ) IκB-α 인산화 억제 및 p65 전위 억제를 통한 NF-κB 활성 억제;를 통해 신경염증을 조절할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 부채마 뿌리줄기 추출물 또는 디오신은 자가포식 활성 유도, Bax(Bcl-2 associated X protein) 발현 감소 또는 caspase-3 활성 감소를 통해 뇌 신경세포 사멸(apoptosis)을 억제하거나, BDNF, pCREB 및 티로신 수산화효소(Tyrosine hydroxylase) 발현 증가를 통해 신경세포를 보호할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 신경염증 질환은 다발성 경화증, 신경모세포종, 허혈성 뇌졸중, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 루게릭 질환, 헌팅턴 질환, 크로이츠펠트야콥병, 외상 후 스트레스 장애, 우울증, 정신분열증 또는 근위축성측색경화증으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
또 다른 목적을 달성하기 위해,
본 발명은 부채마 뿌리줄기 추출물 또는 디오신을 유효성분으로 포함하는 신경세포 사멸 억제용 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 자가포식 활성 유도, Bax(Bcl-2 associated X protein) 발현 감소 또는 caspase-3 활성 감소를 통해 신경세포 사멸(apoptosis)을 억제할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 신경세포 사멸 억제용 시약 조성물, 신경세포 사멸에 의한 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 또는 신경세포 사멸에 의한 질병의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물일 수 있다.
또 다른 목적을 달성하기 위해,
본 발명은 부채마 뿌리줄기 추출물 또는 디오신을 유효성분으로 포함하는 자가포식작용 촉진용 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 자가포식소체 형성을 촉진하여 자가포식작용을 촉진할 수 잇다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 심혈관질환, 유방암, 폐암, 비염, 중이염, 관절염, 관절통, 비만, 안과질환, 천식, 대장염, 크론병, 아토피, 알러지, 건선 또는 부상으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 심혈관질환, 유방암, 폐암, 비염, 중이염, 관절염, 관절통, 비만, 안과질환, 천식, 대장염, 크론병, 아토피, 알러지, 건선 또는 부상으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 질병의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물일 수 있다.
본 발명에서는 부채마 뿌리줄기 추출물 또는 디오신이 기억력 및 인지기능 개선 효능을 가지고 있을 뿐만 아니라, 신경염증을 억제하는 것을 확인하였다. 또한, 디오신은 파킨슨병 모델에서 자가포식 활성을 유도하여 뇌신경세포의 사멸을 억제하고, 신경 보호 효과를 가지고 있는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 부채마 뿌리줄기 추출물 또는 디오신은 기억력 개선, 신경염증, 또는 자가포식작용 촉진용 조성물로 활용될 수 있다.
도 1은 부채마 뿌리줄기 추출물(DNRE) 처리에 의한 미세아교세포 보호 효과를 나타낸 데이터이다. 도면에서 각 모양(원, 삼각형, 사각형 등)은 특정 그룹의 반복 횟수를 나타낸다 (ns - DNRE 처리되지 않은 것과 비교하여 유의하지 않음; ### p < 0.001 비처리와 비교; ** p < 0.01, *** p < 0.001 LPS 대 LPS + DNRE 비교; ### p < 0.001 비처리와 비교; ** p < 0.01, *** p < 0.001 LPS 대 LPS + DNRE 비교; $$$ p< 0.001 저농도 DNRE(10 ~ 20 ㎍/㎖) 대 중간농도 DNRE(50 ~ 400 ㎍/㎖), @@@ p < 0.001 중간농도 DNRE 비교(50 ~ 100 ㎍/㎖) 대 고농도 DNRE(200 ~ 400 ㎍/㎖) 비교).
도 1a는 LPS-자극된 BV-2 세포에서 DNRE 처리에 따른 세포 생존율(IC50 = 152.2997 ㎍/㎖) 및 NO 방출 정도를 분석한 데이터이다.
도 1b는 DPPH 자유 라디칼 소거에 대한 DNRE의 IC50 값 결정을 위한 S자형 플롯으로, IC50은 S자 곡선에서 얻은 식(y = mx-c)으로 계산하였다. 'y'의 값을 50으로 변경하고 IC50 값인 'x'의 값을 결정하였다.
도 1c는 LPS-자극된 BV-2 세포에서 DNRE 처리에 따른 DCFDA 형광 현미경 사진 및 이미지 J(Image J) 소프트웨어를 사용한 형광 강도 측정 결과이다.
도 2는 DNRE의 염증 억제 활성을 확인한 데이터이다. 도면에서 각 모양(원, 삼각형, 사각형 등)은 특정 그룹의 반복 횟수를 나타낸다 (ns - DNRE 처리되지 않은 것과 비교하여 유의하지 않음; ### p < 0.001 비처리와 비교; ** p < 0.01, *** p < 0.001 LPS 대 LPS + DNRE 비교).
도 2a 및 도 2b는 LPS-자극된 BV-2 세포에서 DNRE 처리에 따른 염증 유발 효소의 mRNA 발현 정도 및 단백질 발현정도를 확인한 데이터이고, 도 2c는 LPS-자극된 BV-2 세포에서 DNRE 처리에 따른 전염증성 사이토카인의 mRNA 발현 정도를 확인한 데이터이다.
도 3은 DNRE의 핵 인자에 대한 효과를 나타낸 데이터이다. 도면에서 각 모양(원, 삼각형, 사각형 등)은 특정 그룹의 반복 횟수를 나타낸다 (ns - DNRE 처리되지 않은 것과 비교하여 유의하지 않음; ## p < 0.01 미처리와 비교; ** p < 0.01 LPS 대 LPS + DNRE 비교).
도 3a는 LPS-자극된 BV-2 세포에서 DNRE 처리에 따른 MPAK 신호전달체계 억제 정도를 확인한 데이터이다.
도 3b는 LPS-자극된 BV-2 세포에서 DNRE 처리에 따른 IκB의 단백질 발현 및 밀도계 계산을 나타낸 데이터이고, 도 3c는 LPS-자극된 BV-2 세포에서 DNRE 처리에 따른의 핵 및 세포질 분획의 인산화된 NF-κB의 단백질 발현 정도를 확인한 데이터이다.
도 3d는 LPS-자극된 BV-2 세포에서 DNRE 처리에 따라 인산화된 NF-κB(p-p65) 위치를 형광 현미경으로 관찰한 이미지이다.
도 4는 DNRE에서 디오신 검출 및 정량화를 위한 HPLC 스크리닝 데이터이다.
도 4a는 표준 스테로이드 사포닌 디오신(상단) 및 DNRE 내 디오신(하단)의 머무름 시간 및 면적을 보여주는 크로마토그램 데이터이다.
도 4b는 디오신의 항산화능을 ABTS 어세이를 이용하여 측정한 데이터로, 등몰량의 DNRE 및 디오신이 사용되었으며, 분광광도 측정은 DNRE 또는 디오신 mg당 Trolox의 μM으로 표시하였다.
도 4c는 LPS-자극된 BV-2 세포에서 디오신 처리에 따른 핵 및 세포질 분획 내 NF-κB 인산화 정도를 확인한 데이터이다.
도 5는 스코폴라민 유발 기억상실 동물 모델에 대한 디오신 효과를 확인한 데이터이다.
도 5a는 스코폴라민 유발 기억상식 동물 모델 실험 방법을 나타낸 모식도이다.
도 5b는 모리스 물 미로 테스트(Morris Water Maze Test; MWM)에서 훈련 및 데이터 중에 마우스의 궤적맵으로 B는 시작점, E는 숨겨진 플랫폼을 의미한다.
도 5c는 MWM에서 숨겨진 플랫폼을 찾기 위해 이동한 거리(Distance travelled) 및 대기 시간(latency)을 나타낸 데이터이다 (ns - 스코폴라민 대 디오신 + 스코폴라민 비교시 유의하지 않음, ** p < 0.01 스코폴라민 대 디오신 + 스코폴라민 비교).
도 5d는 디오신 투여에 따른 Y-미로 분석에서 팔 진입 및 변경에 대한 마우스 강도(Mice intensity)를 나타낸 데이터이다.
도 6은 스코폴라민 자극 염증 반응에 대한 디오신 효과를 나타낸 데이터이다. 도면에서, Control은 무처리군, Sco는 스코폴라민 투여군, Dio는 디오신 투여군, Dio + Sco는 디오신 및 스코폴라민 투여군을 의미한다. 각 모양(원, 삼각형, 사각형 등)은 특정 그룹의 반복 횟수를 의미한다 (* p < 0.05, ** p < 0.01, 및 *** p < 0.001 스코폴라민 대 디오신 + 스코폴라민 비교).
도 6a는 디오신 투여에 따른 대뇌 피질 및 해마에서의 염증 유발 인자(iNOS 및 COX-2)의 발현정도를 확인한 데이터이고, 도 6b는 디오신 투여에 따른 대뇌 피질 및 해마에서의 신경영양 인자(pCREB 및 BDNF) 발현 정도를 확인한 데이터이다.
도 7은 MPP+ 처리된 SH-SY5Y 세포에서 디오신 처리에 따른 세포 생존율을 확인한 데이터이다.
도 7a는 디오신 농도 의존적 세포 생존율을 확인한 데이터이고, 도 7b는 DAPI 염색으로 SH-SY5Y 세포를 관찰한 형광 현미경 이미지이다. 도면에서 흰색 화살포는 염색질 응집을 나타내며, 형광 이미지는 광시야 형광 현미경(Nikon)(스케일 바 20μm)으로 촬영하였다. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 전체 염색된 세포에서 핵 농축(pyknosis)이 있는 세포의 백분율을 점수화하여 계산을 수행하였다. 값은 평균 ± SEM(n = 3/그룹)으로 나타내였다 (# p < 0.05, ## p < 0.01 및 ### p < 0.001, 비처리군과 비교; * p < 0.05, ** p < 0.01 및 *** p < 0.001, MPP+ 및 디오신 처리군과 비교).
도 8은 디오신에 의한 항-세포 사멸 활성을 확인한 데이터이다.
도 8a는 MPP+ 처리된 SH-SY5Y 세포에서 디오신 농도에 따른 Bcl-2 및 Bax 발현 정도를 확인한 데이터이고, 도 8b는 MPP+ 처리된 SH-SY5Y 세포에서 디오신 농도에 따른 Cas3 및 절단된 카스파제-3(clvCas3) 발현 정도(도 8b)를 확인한 데이터이다.
Bax/Bcl-2의 발현 비율은 Bcl-2에 대한 Bax의 배수 변화로 표시하였으며, Cas3에서 clvCas3의 절단은 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 측정된 배수 변화로 표시하였다. 그래프는 대조군(비처리) 또는 MPP+ 처리된 세포에 대해 정규화된 각 단백질/β-액틴의 비율을 나타내며 3번 반복 실험(n = 3)을 수행하여 평균 ± SEM으로 표시하였다 (# p < 0.05, ## p < 0.01 및 ### p < 0.001, 비처리군과 비교; * p < 0.05, ** p < 0.01 및 *** p < 0.001, MPP+ 및 디오신 처리군과 비교).
도 9는 디오신에 의한 신경영양인자(neurotrophic factor) 및 도파민 생성 효소(tyrosine hydroxylase, TH) 발현 정도를 확인한 데이터이다.
도 9a는 MPP+ 처리된 SH-SY5Y 세포에서 디오신 농도에 따른 BDNF, CREB 및 pCREB 발현 정도를 확인한 데이터이고, 도 9b는 MPP+ 처리된 SH-SY5Y 세포에서 디오신 농도에 따른 TH 발현 정도(도 9b)를 확인한 데이터이다.
웨스턴블랏 밴드는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 광학 밀도를 측정하였다. 그래프는 대조군(비처리) 또는 MPP+ 처리된 세포에 대해 정규화된 각 단백질/β-액틴 또는 pCREB/CREB의 비율을 나타내며 3번 반복 실험(n = 3)을 수행하여 평균 ± SEM으로 표시하였다 (# p < 0.05, ## p < 0.01 및 ### p < 0.001, 비처리군과 비교; * p < 0.05, ** p < 0.01 및 *** p < 0.001, MPP+ 및 디오신 처리군과 비교).
도 10은 디오신 농도에 따른 자가포식(autophagy) 활성 정도를 확인한 데이터이다.
도 10a는 MPP+ 처리된 SH-SY5Y 세포에서 디오신 농도에 따른 ATG5 및 p62 발현 정도를 확인한 데이터이며, 도 10b는 자가포식 저해제인 CQ(40μM) 및 MPP+ 처리된 SH-SY5Y 세포에서 디오신 농도에 따른 ATG5 및 p62 발현 정도를 확인한 데이터이다.
웨스턴블랏 밴드는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 광학 밀도를 측정하였다. 그래프는 대조군(비처리), MPP+ 또는 MPP+/CQ 처리된 세포에 대해 정규화된 각 단백질/β-액틴 비율을 나타내며 3번 반복 실험(n = 3)을 수행하여 평균 ± SEM으로 표시하였다 (# p < 0.05, ## p < 0.01 및 ### p < 0.001, 비처리군과 비교; * p < 0.05, ** p < 0.01 및 *** p < 0.001, MPP+ 및 디오신 처리군과 비교).
도 11은 디오신 농도에 따른 자가포식소체(autophagosome) 활성을 확인한 데이터이다.
도 11a는 MPP+ 처리된 SH-SY5Y 세포에서 디오신 농도에 따른 LC3I 및 LC3Ⅱ 발현정도를 확인한 데이터이고, 도 6b는 자가포식 저해제인 CQ(40μM) 및 MPP+ 처리된 SH-SY5Y 세포에서 디오신 농도에 따른 LC3I 및 LC3Ⅱ 발현정도를 확인한 데이터이다.
LC3I의 LC3Ⅱ로의 전환은 Image J 소프트웨어를 사용하여 측정된 배수 변화로 표시하였다. 그래프는 대조군(비처리), MPP+ 또는 MPP+/CQ 처리된 세포에 대해 정규화된 각 단백질/β-액틴 비율 또는 LC3I 비율을 나타내며 3번 반복 실험(n = 3)을 수행하여 평균 ± SEM으로 표시하였다 # p < 0.05, ## p < 0.01 및 ### p < 0.001, 비처리군과 비교; * p < 0.05, ** p < 0.01 및 *** p < 0.001, MPP+ 및 디오신 처리군과 비교).
도 11c는 CQ(40μM) 및/또는 MPP+ 처리된 SH-SY5Y 세포에서 디오신 처리에 따른 자가포식 마커인 LC3를 면역세포화학 방법으로 관찰한 이미지이다.
형광 이미지는 Nikon 현미경(광시야 형광 현미경, 눈금 막대 20μm)으로 촬영했으며, LC3 점(puncta)의 평균 크기와 수는 ImageJ 소프트웨어로 측정였다 (≥25개 세포에서 정량화 수행).
도 1a는 LPS-자극된 BV-2 세포에서 DNRE 처리에 따른 세포 생존율(IC50 = 152.2997 ㎍/㎖) 및 NO 방출 정도를 분석한 데이터이다.
도 1b는 DPPH 자유 라디칼 소거에 대한 DNRE의 IC50 값 결정을 위한 S자형 플롯으로, IC50은 S자 곡선에서 얻은 식(y = mx-c)으로 계산하였다. 'y'의 값을 50으로 변경하고 IC50 값인 'x'의 값을 결정하였다.
도 1c는 LPS-자극된 BV-2 세포에서 DNRE 처리에 따른 DCFDA 형광 현미경 사진 및 이미지 J(Image J) 소프트웨어를 사용한 형광 강도 측정 결과이다.
도 2는 DNRE의 염증 억제 활성을 확인한 데이터이다. 도면에서 각 모양(원, 삼각형, 사각형 등)은 특정 그룹의 반복 횟수를 나타낸다 (ns - DNRE 처리되지 않은 것과 비교하여 유의하지 않음; ### p < 0.001 비처리와 비교; ** p < 0.01, *** p < 0.001 LPS 대 LPS + DNRE 비교).
도 2a 및 도 2b는 LPS-자극된 BV-2 세포에서 DNRE 처리에 따른 염증 유발 효소의 mRNA 발현 정도 및 단백질 발현정도를 확인한 데이터이고, 도 2c는 LPS-자극된 BV-2 세포에서 DNRE 처리에 따른 전염증성 사이토카인의 mRNA 발현 정도를 확인한 데이터이다.
도 3은 DNRE의 핵 인자에 대한 효과를 나타낸 데이터이다. 도면에서 각 모양(원, 삼각형, 사각형 등)은 특정 그룹의 반복 횟수를 나타낸다 (ns - DNRE 처리되지 않은 것과 비교하여 유의하지 않음; ## p < 0.01 미처리와 비교; ** p < 0.01 LPS 대 LPS + DNRE 비교).
도 3a는 LPS-자극된 BV-2 세포에서 DNRE 처리에 따른 MPAK 신호전달체계 억제 정도를 확인한 데이터이다.
도 3b는 LPS-자극된 BV-2 세포에서 DNRE 처리에 따른 IκB의 단백질 발현 및 밀도계 계산을 나타낸 데이터이고, 도 3c는 LPS-자극된 BV-2 세포에서 DNRE 처리에 따른의 핵 및 세포질 분획의 인산화된 NF-κB의 단백질 발현 정도를 확인한 데이터이다.
도 3d는 LPS-자극된 BV-2 세포에서 DNRE 처리에 따라 인산화된 NF-κB(p-p65) 위치를 형광 현미경으로 관찰한 이미지이다.
도 4는 DNRE에서 디오신 검출 및 정량화를 위한 HPLC 스크리닝 데이터이다.
도 4a는 표준 스테로이드 사포닌 디오신(상단) 및 DNRE 내 디오신(하단)의 머무름 시간 및 면적을 보여주는 크로마토그램 데이터이다.
도 4b는 디오신의 항산화능을 ABTS 어세이를 이용하여 측정한 데이터로, 등몰량의 DNRE 및 디오신이 사용되었으며, 분광광도 측정은 DNRE 또는 디오신 mg당 Trolox의 μM으로 표시하였다.
도 4c는 LPS-자극된 BV-2 세포에서 디오신 처리에 따른 핵 및 세포질 분획 내 NF-κB 인산화 정도를 확인한 데이터이다.
도 5는 스코폴라민 유발 기억상실 동물 모델에 대한 디오신 효과를 확인한 데이터이다.
도 5a는 스코폴라민 유발 기억상식 동물 모델 실험 방법을 나타낸 모식도이다.
도 5b는 모리스 물 미로 테스트(Morris Water Maze Test; MWM)에서 훈련 및 데이터 중에 마우스의 궤적맵으로 B는 시작점, E는 숨겨진 플랫폼을 의미한다.
도 5c는 MWM에서 숨겨진 플랫폼을 찾기 위해 이동한 거리(Distance travelled) 및 대기 시간(latency)을 나타낸 데이터이다 (ns - 스코폴라민 대 디오신 + 스코폴라민 비교시 유의하지 않음, ** p < 0.01 스코폴라민 대 디오신 + 스코폴라민 비교).
도 5d는 디오신 투여에 따른 Y-미로 분석에서 팔 진입 및 변경에 대한 마우스 강도(Mice intensity)를 나타낸 데이터이다.
도 6은 스코폴라민 자극 염증 반응에 대한 디오신 효과를 나타낸 데이터이다. 도면에서, Control은 무처리군, Sco는 스코폴라민 투여군, Dio는 디오신 투여군, Dio + Sco는 디오신 및 스코폴라민 투여군을 의미한다. 각 모양(원, 삼각형, 사각형 등)은 특정 그룹의 반복 횟수를 의미한다 (* p < 0.05, ** p < 0.01, 및 *** p < 0.001 스코폴라민 대 디오신 + 스코폴라민 비교).
도 6a는 디오신 투여에 따른 대뇌 피질 및 해마에서의 염증 유발 인자(iNOS 및 COX-2)의 발현정도를 확인한 데이터이고, 도 6b는 디오신 투여에 따른 대뇌 피질 및 해마에서의 신경영양 인자(pCREB 및 BDNF) 발현 정도를 확인한 데이터이다.
도 7은 MPP+ 처리된 SH-SY5Y 세포에서 디오신 처리에 따른 세포 생존율을 확인한 데이터이다.
도 7a는 디오신 농도 의존적 세포 생존율을 확인한 데이터이고, 도 7b는 DAPI 염색으로 SH-SY5Y 세포를 관찰한 형광 현미경 이미지이다. 도면에서 흰색 화살포는 염색질 응집을 나타내며, 형광 이미지는 광시야 형광 현미경(Nikon)(스케일 바 20μm)으로 촬영하였다. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 전체 염색된 세포에서 핵 농축(pyknosis)이 있는 세포의 백분율을 점수화하여 계산을 수행하였다. 값은 평균 ± SEM(n = 3/그룹)으로 나타내였다 (# p < 0.05, ## p < 0.01 및 ### p < 0.001, 비처리군과 비교; * p < 0.05, ** p < 0.01 및 *** p < 0.001, MPP+ 및 디오신 처리군과 비교).
도 8은 디오신에 의한 항-세포 사멸 활성을 확인한 데이터이다.
도 8a는 MPP+ 처리된 SH-SY5Y 세포에서 디오신 농도에 따른 Bcl-2 및 Bax 발현 정도를 확인한 데이터이고, 도 8b는 MPP+ 처리된 SH-SY5Y 세포에서 디오신 농도에 따른 Cas3 및 절단된 카스파제-3(clvCas3) 발현 정도(도 8b)를 확인한 데이터이다.
Bax/Bcl-2의 발현 비율은 Bcl-2에 대한 Bax의 배수 변화로 표시하였으며, Cas3에서 clvCas3의 절단은 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 측정된 배수 변화로 표시하였다. 그래프는 대조군(비처리) 또는 MPP+ 처리된 세포에 대해 정규화된 각 단백질/β-액틴의 비율을 나타내며 3번 반복 실험(n = 3)을 수행하여 평균 ± SEM으로 표시하였다 (# p < 0.05, ## p < 0.01 및 ### p < 0.001, 비처리군과 비교; * p < 0.05, ** p < 0.01 및 *** p < 0.001, MPP+ 및 디오신 처리군과 비교).
도 9는 디오신에 의한 신경영양인자(neurotrophic factor) 및 도파민 생성 효소(tyrosine hydroxylase, TH) 발현 정도를 확인한 데이터이다.
도 9a는 MPP+ 처리된 SH-SY5Y 세포에서 디오신 농도에 따른 BDNF, CREB 및 pCREB 발현 정도를 확인한 데이터이고, 도 9b는 MPP+ 처리된 SH-SY5Y 세포에서 디오신 농도에 따른 TH 발현 정도(도 9b)를 확인한 데이터이다.
웨스턴블랏 밴드는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 광학 밀도를 측정하였다. 그래프는 대조군(비처리) 또는 MPP+ 처리된 세포에 대해 정규화된 각 단백질/β-액틴 또는 pCREB/CREB의 비율을 나타내며 3번 반복 실험(n = 3)을 수행하여 평균 ± SEM으로 표시하였다 (# p < 0.05, ## p < 0.01 및 ### p < 0.001, 비처리군과 비교; * p < 0.05, ** p < 0.01 및 *** p < 0.001, MPP+ 및 디오신 처리군과 비교).
도 10은 디오신 농도에 따른 자가포식(autophagy) 활성 정도를 확인한 데이터이다.
도 10a는 MPP+ 처리된 SH-SY5Y 세포에서 디오신 농도에 따른 ATG5 및 p62 발현 정도를 확인한 데이터이며, 도 10b는 자가포식 저해제인 CQ(40μM) 및 MPP+ 처리된 SH-SY5Y 세포에서 디오신 농도에 따른 ATG5 및 p62 발현 정도를 확인한 데이터이다.
웨스턴블랏 밴드는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 광학 밀도를 측정하였다. 그래프는 대조군(비처리), MPP+ 또는 MPP+/CQ 처리된 세포에 대해 정규화된 각 단백질/β-액틴 비율을 나타내며 3번 반복 실험(n = 3)을 수행하여 평균 ± SEM으로 표시하였다 (# p < 0.05, ## p < 0.01 및 ### p < 0.001, 비처리군과 비교; * p < 0.05, ** p < 0.01 및 *** p < 0.001, MPP+ 및 디오신 처리군과 비교).
도 11은 디오신 농도에 따른 자가포식소체(autophagosome) 활성을 확인한 데이터이다.
도 11a는 MPP+ 처리된 SH-SY5Y 세포에서 디오신 농도에 따른 LC3I 및 LC3Ⅱ 발현정도를 확인한 데이터이고, 도 6b는 자가포식 저해제인 CQ(40μM) 및 MPP+ 처리된 SH-SY5Y 세포에서 디오신 농도에 따른 LC3I 및 LC3Ⅱ 발현정도를 확인한 데이터이다.
LC3I의 LC3Ⅱ로의 전환은 Image J 소프트웨어를 사용하여 측정된 배수 변화로 표시하였다. 그래프는 대조군(비처리), MPP+ 또는 MPP+/CQ 처리된 세포에 대해 정규화된 각 단백질/β-액틴 비율 또는 LC3I 비율을 나타내며 3번 반복 실험(n = 3)을 수행하여 평균 ± SEM으로 표시하였다 # p < 0.05, ## p < 0.01 및 ### p < 0.001, 비처리군과 비교; * p < 0.05, ** p < 0.01 및 *** p < 0.001, MPP+ 및 디오신 처리군과 비교).
도 11c는 CQ(40μM) 및/또는 MPP+ 처리된 SH-SY5Y 세포에서 디오신 처리에 따른 자가포식 마커인 LC3를 면역세포화학 방법으로 관찰한 이미지이다.
형광 이미지는 Nikon 현미경(광시야 형광 현미경, 눈금 막대 20μm)으로 촬영했으며, LC3 점(puncta)의 평균 크기와 수는 ImageJ 소프트웨어로 측정였다 (≥25개 세포에서 정량화 수행).
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
기억력 및 인지 기능 장애 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 일관점에 있어서, 부채마(Dioscorea nipponica Makino) 뿌리줄기(rhizome) 추출물 또는 디오신(dioscin)을 유효성분으로 포함하는 기억력 및 인지 기능 장애 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 다른 일관점에서, 부채마 뿌리줄기 추출물 또는 디오신을 유효성분으로 포함하는 기억력 및 인지 기능 장애 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 부채마 뿌리줄기 추출물은 에탄올을 용매로 하여 추출한 것을 특징으로 할 수 있으나, 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라, 즉, 통상적인 온도와 압력의 조건 하에서, 통상적인 용매를 사용하여 제조될 수 있으며, 바람직하게는 정제수(또는 물), 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 글리세린, 에틸아세테이트, 아세톤, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디클로로메탄, 클로로포름, 에틸에테르, 부틸렌글라이콜, 헥산 및 이들의 혼합용매으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 용매를 사용하여 추출할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 부채마 뿌리줄기 추출물은 전체 조성물에 10 ~ 150 ㎍/㎖ 농도로, 바람직하게는 10 ~ 100 ㎍/㎖ 농도로 포함될 수 있다. 또한, 디오신은 전체 조성물에 100 ~ 600 ng/㎖ 농도로, 바람직하게는 100 ~ 400 ng/㎖ 농도로 포함될 수 있다. 상기 농도 범위 미만의 농도로 부채마 뿌리줄기 추출물이 포함되는 경우, 효과가 미미할 수 있으며, 상기 농도 범위를 초과하면 세포 독성이 나타날 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 콜린성 신경 기능 저하를 개선시킬 수 있으며, 해마 또는 대뇌 피질에서 ⅰ) iNOS 또는 COX-2를 포함하는 염증성 인자의 발현 억제; 또는 ⅱ) BDNF 또는 pCREB를 포함하는 인지기능성 인자의 발현 증가를 유도할 수 있다.
본 발명에서는, 스코폴라민 유발 기억상실 마우스 모델에 디오신을 투여한 결과, 스코폴라민에 의해 유도되었던 기억력 및 인지 기능 장애가 개선되었으며(도 5), 대뇌 피질 및 해마에서 디오신 투여에 따라 염증 유발 인자(iNOS 및 COX-2)의 발현이 감소하고 신경영양 인자(pCREB 및 BDNF)의 발현이 증가하는 것을 확인하였다 (도 6).
즉, 본 발명의 부채마 뿌리줄기 추출물 또는 부채마 뿌리줄기 추출물의 유효성분인 디오신에 의해 알츠하이머 유발 동물 모델의 기억력 및 인지 기능 장애가 개선되는 것을 확인하였으므로, 기억력 및 인지 기능 장애 예방, 개선 또는 치료용 조성물로 활용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 기억력 또는 인지 기능 장애는 콜린성 신경계 저하로 유발되는 질병일 수 있으며, 구체적으로 경도인지장애, 주의력 결핍장애(ADHD), 우울증, 알츠하이머병, 치매, 노인성 치매, 픽(pick)병 및 크루츠펠트-야곱(Creutzfeldt-jakob)병으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.
신경염증 질환의 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 또 다른 일관점에서, 부채마(Dioscorea nipponica Makino) 뿌리줄기 추출물 또는 디오신(dioscin)을 유효성분으로 포함하는 신경염증질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 일관점에서, 부채마 뿌리줄기 추출물 또는 디오신을 유효성분으로 포함하는 신경염증질환의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 부채마 뿌리줄기 추출물은 에탄올을 용매로 하여 추출한 것을 특징으로 할 수 있으나, 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라, 즉, 통상적인 온도와 압력의 조건 하에서, 통상적인 용매를 사용하여 제조될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 부채마 뿌리줄기 추출물은 전체 조성물에 10 ~ 150 ㎍/㎖ 농도로, 바람직하게는 10 ~ 100 ㎍/㎖ 농도로 포함될 수 있다. 또한, 디오신은 전체 조성물에 100 ~ 600 ng/㎖ 농도로, 바람직하게는 100 ~ 400 ng/㎖ 농도로 포함될 수 있다. 상기 농도 범위 미만의 농도로 부채마 뿌리줄기 추출물이 포함되는 경우, 효과가 미미할 수 있으며, 상기 농도 범위를 초과하면 세포 독성이 나타날 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 부채마 뿌리줄기 추출물 또는 디오신은
ⅰ) NO, iNOS 및 COX-2를 포함하는 염증반응 매개인자(inflammatory mediators) 생성 억제;
ⅱ) IL-1β, IL-6 및 TNF-α를 포함하는 염증성 사이토카인(cytokines) 생성 억제; 및
ⅲ) IκB-α 인산화 억제 및 p65 전위 억제를 통한 NF-κB 활성 억제;를 통해 신경염증을 조절할 수 있다.
본 발명에서는, 부채마 뿌리줄기 추출물(DNRE)이 NO 방출억제, 염증반응 매개인자 및 염증성 사이토카인 발현 또는 생성 억제, 및 NF-κB 활성 억제를 통해 세포 독성 없이 신경염증을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다 (도 1 내지 도 4)
본 발명에 있어서, 상기 부채마 뿌리줄기 추출물 또는 디오신은 자가포식 활성 유도, Bax(Bcl-2 associated X protein) 발현 감소 또는 caspase-3 활성 감소를 통해 뇌 세포사멸(apoptosis)을 억제하거나, BDNF, pCREB 및 티로신 수산화효소(Tyrosine hydroxylase) 발현 증가를 통해 신경세포를 보호할 수 있다.
본 발명에서는, MPP+ 처리로 자가포식 유동(autophagic flux)을 손상시킨 신경모세포종 세포주에 디오신을 처리하였을 때, MPP+ 매개 자가포식 유동 손상이 방지되어 자가포식이 활성화되고, 세포자멸사가 억제되는 것을 확인하였다 (도 7, 도 8, 도 10, 및 도 11). 또한, 디오신에 의해 신경영양인자(neurotrophic factor) 및 도파민 생성 효소(tyrosine hydroxylase, TH) 발현이 증가된 것을 확인하였다 (도 9).
즉, 본 발명의 부채마 뿌리줄기 추출물 또는 디오신은 신경염증을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였으므로, 신경염증 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물로 활용할 수 있다.
나아가, 디오신은 자가포식 활성을 촉진시킬 수 있으므로, 자가포식작용 촉진용 조성물로 활용될 수 있으며, 바람직하게는 자가포식 기능이 저하된 질환, 더 바람직하게는 자가포식 기능이 저하된 파킨슨병의 치료에 유용하게 활용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 신경염증 질환은 다발성 경화증, 신경모세포종, 허혈성 뇌졸중, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 루게릭 질환, 헌팅턴 질환, 크로이츠펠트야콥병, 외상 후 스트레스 장애, 우울증, 정신분열증 또는 근위축성측색경화증으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
신경세포 사멸 억제 또는 자가포식작용 촉진용 조성물
본 발명은 또 다른 일관점에서, 부채마 뿌리줄기 추출물 또는 디오신을 유효성분으로 포함하는 신경세포 사멸 억제용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 자가포식 활성 유도, Bax(Bcl-2 associated X protein) 발현 감소 또는 caspase-3 활성 감소를 통해 신경세포 사멸(apoptosis)을 억제할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 신경세포 사멸 억제용 시약 조성물, 신경세포 사멸에 의한 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 또는 신경세포 사멸에 의한 질병의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물일 수 있다.
본 발명은 또 다른 일관점에서, 부채마 뿌리줄기 추출물 또는 디오신을 유효성분으로 포함하는 자가포식작용 촉진용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 자가포식소체 형성을 촉진하여 자가포식작용을 촉진할 수 잇다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 심혈관질환, 유방암, 폐암, 비염, 중이염, 관절염, 관절통, 비만, 안과질환, 천식, 대장염, 크론병, 아토피, 알러지, 건선 또는 부상으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 심혈관질환, 유방암, 폐암, 비염, 중이염, 관절염, 관절통, 비만, 안과질환, 천식, 대장염, 크론병, 아토피, 알러지, 건선 또는 부상으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 질병의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 다양한 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 예컨대, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 경구형 제형으로 제형화할 수 있고, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 각각의 제형에 따라 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 외용제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유 등이 있다. 상기 약학 조성물을 제제화나 제형화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로오스(sucrose), 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 본 발명의 약학 조성물을 제공하는 것을의미한다. 본 발명은 약학 조성물은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양, 즉 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양인 치료상 유효량으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에 대한 치료상 유효 투여량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여시간, 투여 경로 및 조성물의분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자 등에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 예를 들어, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 구강, 심장내, 골수내, 경막내, 경피, 장관, 피하, 설하 또는 국소 투여할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 약학 조성물은 1 ~ 10,000㎎/㎏/일의 양으로 투여할 수 있으며, 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수 회에 나누어 투여할 수도 있다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 건강기능식품, 식품 첨가제 또는 식이보조제로 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물을 식품 첨가제로 사용할 경우, 그대로 첨가하거나, 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 혼합하여 사용되는 등 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.
또한 상기 건강기능식품 조성물의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 변경될 수 있다. 구체적인 예로, 식품 또는 음료의 제조 시에는 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15중량% 이하, 바람직하게는 10중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하여 장기간 섭취할 경우에는 상기 범위 이하의 양으로 첨가될 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없으나, 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료, 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
본 발명의 건강기능식품 조성물이 음료로 제조될 경우 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등의 추가 성분을 포함할 수 있다. 상기 천연 탄수화물로는 포도당, 과당 등의 모노사카라이드; 말토오스, 수크로오스 등의 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린 등의 천연 감미제; 사카린, 아스파르탐 등의 합성 감미제 등이 사용될 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 본 발명의 식품 조성물 총 중량에 대하여 0.01 ~ 10중량%, 바람직하 게는 0.01 ~ 0.1중량%로 포함된다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있으며, 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 상기의 첨가제 비율은 크게 제한되지는 않으나, 본 발명의 식품 조성물 총 중량에 대하여 0.01 ~ 0.1중량% 범위내로 포함되는 것이 바람직하다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.
이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
부채마 뿌리줄기 추출물의 미세아교세포 보호 효과 확인
부채마 뿌리줄기 추출물(DNRE)은 DNRE는 한국식물추출은행(ID: PBC-464AS)에서 구입하여 사용하였으며, BV-2 미세아교세포는 경북대학교로부터 입수하였다. 세포는 5%(v/v) FBS 및 1%(v/v) 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 DMEM 배지에서 37 ℃, 5% CO2 조건으로 배양하였다. 80 ~ 90% 컨플루언스(confluence)로 자란 세포를 트립신(0.05% trypsin-EDTA) 처리하여 계대배양하였으며, 2일 간격으로 배지를 교환하였다. 각 실험은 통계적 분석을 위해 3번 반복 실험하였다. 각 실험에는 최소 3번의 계대배양된 세포가 사용되었다.
1-1 : 세포 생존율 및 산화질소(NO) 방출 평가
세포 생존율 및 산화질소(NO) 방출을 평가하기 위해 BV-2 세포를 96웰 플레이트에 5 x 103 개세포/웰로 분주하였다. 세포가 약 80% 컨플루언스에 도달하면, 다양한 농도의 DNRE(10 ~ 400 ㎍/㎖)를 2시간 동안 전처리한 다음, LPS(200 ng/㎖)를 처리하고 24시간 동안 배양하였다.
그 후, Griess 시약을 사용한 비색 NO 방출 분석을 위해 배양 배지를 수득한 다음, 마이크로플레이트 리더(SunriseTM, Tecan Trading AG, 스위스)를 사용하여 UV 스펙트럼에서 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
세포 생존을 위해 20 ㎕의 MTT(5 mg/㎖)를 첨가하고 45분 동안 배양한 다음, 배양액을 제거하고 200 ㎕의 DMSO를 첨가하여 포르마잔 결정을 용해시켰다. 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 552 nm에서 흡광도를 측정하였다.
본 발명에서 수행된 모든 실험은 GraphPad Prism(version-8.0.1; La Jolla, 미국) 소프트웨어를 사용하여 통계 분석을 수행하였다. 데이터는 3번 반복하여 평균 ± SEM(표준 오차 평균)으로 표시하였으며, 모든 데이터는 일원 ANOVA 및 Sidak의 다중 비교로 분석하여 유의성을 결정하였다. p-값은 <0.05에서 유의미한 것으로 간주되었다.
1-2 : DPPH 자유 라디칼 소거 분석
DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl, 95%; Thermo Fisher Scientific, 미국) 200μM/L을 99% 에탄올에 준비한 다음, 96-웰 플레이트에 300 ㎕/웰이 되도록 다양한 농도의 DNRE와 DPPH를 함께 첨가하였다. 대조군은 DPPH + 에탄올을 첨가하였으며, 음성 대조군은 에탄올만 첨가하였다. 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 520nm에서 흡광도를 측정하였으며, DPPH 라디칼 억제율은 하기 수학식 1을 사용하여 측정하였다.
[수학식 1]
1-3 : DCFDA 분석
LPS 처리 후 세포 내 ROS 방출을 측정하기 위해, 본 발명에서는 ROS에 민감한 형광염료인 DCFDA(2',7'-dichlorofluorescein diacetate; Sigma-Aldrich, 미국) 사용하였다.
BV-2 세포(2.5 x 105 개/㎖)를 6-웰 플레이트에서 일반배지로 배양한 다음, 약 60% ~ 70% 컨플루언스에 도달하면, LPS(200 ng/㎖)에 이어 DNRE(10 ~ 100 ㎍/㎖)를 무혈청 배지에서 2시간 동안 처리하였다. 그 다음, 10μM DCFDA를 처리한 후, 37℃에서 30분 동안 추가로 배양한 다음, 차가운 PBS로 두번 세척하였다. 형광 현미경 시스템(Nikon Eclipse Ts2R)을 사용하여 이미지를 즉시 캡처한 다음, ImageJ(Java 1.8.0_172, NIH)를 사용하여 형광 강도를 계산하였다.
그 결과, DNRE는 농도 의존적으로 NO 방출을 감소시켰으나, 고농도의 DNRE(200 ~ 400 ㎍/㎖)에서는 세포독성이 관찰되었다 (도 1a). MTT 결과 및 IC50(152.2997 ㎍/㎖)을 고려할 때 50 ~ 100 ㎍/㎖ 농도의 DNRE가 세포 독성 없이 신경염증을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다. 따라서, 이후의 연구에서는 10 ~ 100 ㎍/㎖ 농도의 DNRE를 사용하였다. 이는 DPPH 분석 및 DCFDA 분석에서 LPS 유도 ROS 방출에 대한 DNRE(0.01 ~ 1.0 mg/㎖)의 항산화 효과와 관련이 있다 (도 1b 및 도 d).
부채마 뿌리줄기 추출물의 염증매개인자 및 전염증성 사이토카인 억제 효능 확인
BV-2 세포(2.5 x 105 개/㎖)를 6-웰 플레이트에서 일반배지로 배양한 다음, 약 80% 컨플루언스에 도달하면, DNRE 농도가 10 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖ 및 100 ㎍/㎖이 되도록 첨가하였다. 1시간 후에 신경염증 유발 인자인 LPS(200 ng/㎖)를 처리한 다음, 6시간 동안 배양하였다. BV-2 세포를 차가운 PBS로 2회 세척하고, 각 웰에 1 ㎖의 트리졸 시약을 첨가한 후, 상온에서 30초 동안 반응시켰다. 세포를 조심스럽게 에펜도르프(Eppendorf) 튜브에 수집한 후 원심분리하였다. ReverTra Ace-α kit(Toyobo, 일본)를 사용하여 매뉴얼에 따라 cDNA를 합성하였다.
또한, 1 ㎕의 RT-혼합 템플렛은 표 1의 특정 프라이머를 이용하여 증폭하였다. PCR 산물은 GelRed®Nucleic Acid Gel Stain(Biotium Inc., 미국)이 포함된 1.5% 아가로스 겔을 이용하여 전기영동 하였다.
| 프라이머 서열(5'-3') | 서열 번호 |
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| iNOS | 정방향 | GAG GTA CTC AGCGTC CTC CA | 1 |
| 역방향 | AGG GAG GAA AGG GAG AGA GG | 2 | |
| COX-2 | 정방향 | TGA GTG GTA GCC AGC AAA GC | 3 |
| 역방향 | CTG CAG TCC AGG TTC AAT GG | 4 | |
| TNF-α | 정방향 | TTC GAG TGA CAA GCC TGT AGC | 5 |
| 역방향 | AGA TTG ACC TCA GCG CTG AGT | 6 | |
| IL-1β | 정방향 | CAA GGA GAA CCA AGC AAC GA | 7 |
| 역방향 | TTG GCC GAG GAC TAA GGA GT | 8 | |
| IL-6 | 정방향 | GGA GGC TTA ATT ACA CAT GTT | 9 |
| 역방향 | TGA TTT CAA GAT GAA TTG GAT | 10 | |
| GAPDH | 정방향 | ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC | 11 |
| 역방향 | CCA CCA CCC TGT TGC TGT AG | 12 | |
그 결과, 도 2a 및 도 2b에 나타난 바와 같이, DNRE는 농도 의존적으로 염증성 효소 COX-2 및 iNOS mRNA 및 단백질 수준을 감소시켰으며, 이는 DNRE 처리에 의해 NO 방출이 감소되는 것을 의미한다.
또한, 도 2c에 나타난 바와 같이, DNRE 처리에 의해 LPS로 유도된 BV-2 미세아교세포에서 염증성 사이토카인 IL-1β, IL-6 및 TNF-α의 mRNA 수준이 2배 이상 감소하였다.
부채마 뿌리줄기 추출물의 MAPK 경로 억제 효능 확인
BV-2 세포(2.5 x 105 개/㎖)를 6-웰 플레이트에서 일반배지로 배양한 다음, 약 80% 컨플루언스에 도달하면, DNRE 농도가 10 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖ 및 100 ㎍/㎖이 되도록 첨가하였다. 1시간 후에 신경염증 유발 인자인 LPS(200 ng/㎖)를 처리한 다음, 24시간 동안 BV-2 세포를 자극시킨 후, 단백질을 분리하였다.
세포를 차가운 PBS로 2회 세척하고 용해 완충액(프로테아제 및 포스파타제 억제제(1:1) 칵테일을 함유하는 1x RIPA 용해 완충액)을 사용하여 용해시켰다. 동일한 단백질(20㎍/10㎕)을 8 ~ 15% SDS-PAGE(sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide electrophoresis) 겔에서 전기영동 한 다음, PVDF(polyvinylidene-difluoride) 막(Millipore, 미국)으로 트랜스퍼시켰다.
비특이적 결합을 방지하기 위해, 5% 탈지유(skim milk)로 상온에서 1시간 반응시킨 다음, 1차 항체인, 항-p38 항체(#9212S, cell signaling), 항-p-p38 항체 (#9201S, cell signaling), 항-JNK 항체(#9253S, cell signaling), 항-p-JNK 항체(#9251S, cell signaling), 항-ERK 항체(#91012S cell signaling), 항-p-ERK 항체(#9101S, cell signaling)또는 항-β-actin 항체(#C4; Santa Cruz Biotechnology)를 첨가하여 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 그 다음, 2차 항체인 항-마우스 또는 항-래빗(1:10,000)을 첨가하고 상온에서 반응시켰다. 멤브레인은 화학발광 검출 시스템(enhanced chemiluminescence detection system (LAS 500; GE Healthcare Bio-Sciences AB, 스웨덴)의 프로토콜에 따라 시각화하였다.
그 결과, 도 3a에 나타난 바와 같이, LPS 처리된 BV-2 세포에서 DNRE는 농도의존적으로 MAPK 신호전달인자인 ERK, JNK 및 p38의 인산화를 감소시켰다.
부채마 뿌리줄기 추출물의 NF-κB 활성 억제 효능 확인
DNRE가 MAPK 신호 전달의 여러 바이오마커의 인산화를 감소시킨다는 것을 확인하고, 본 발명에서는 DNRE에 의해 전사 인자 NF-κB의 핵 전위를 억제하는지 확인하였다.
BV-2 세포를 60mm 세포 배양 페트리 접시에 2.5 x 105 개/㎖ 및 약 80% 컨플루언스로 분주한 다음, 세포에 LPS 또는 LPS + DNRE로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 1시간 후에 신경염증 유발 인자인 LPS(200 ng/㎖)를 처리한 다음, 24시간 동안 BV-2 세포를 자극시킨 후, 단백질을 분리하였다.
차가운 PBS, 핵산 용해 완충액(nucleic acid lysis buffer) 및 10% NP-40으로 두 번 세척한 다음, 4000rpm에서 10분 동안 원심분리하여 세포질 분획을 수득하였다. 펠렛을 추출 완충액(20 mM HEPES, 20% glycerol 및 0.2 mM EDTA)에 용해시키고 얼음 위에서 30분 동안 반응시키는 동안 가끔 두드려서 혼합물을 유리시킨 후, 15분 동안 13,000 rpm에서 원심분리하여 핵산 분획을 상등액으로 수득하였다. 상기 두 분획을 정량화하여 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 웨스턴 블랏을 수행하였으며, 1차 항체로는 항-NF-κB 항체(F-6 #sc-8008, Santa Cruz Biotechnology), 항-pNF-κB 항체(#3033S, cell signaling), 항-IκB 항체(#4812S, cell signaling), 항-pIκB 항체(#2859S, cell signaling), 항-nucleolin 항체(#14574; cell signaling) 또는 항-β-actin 항체(#C4; Santa Cruz Biotechnology)를 사용하였다.
세포 상에서 NF-κB의 핵 전위 정도를 관찰하기 위해, 면역형광염색을 수행하였으며, 상기와 동일한 방법으로 세포를 배양한 다음, 차가운 PBS로 1회 세척하고, 차가운 4% PFA로 고정하였다. 그 다음 세포를 상온에서 10분 동안 0.1%(v/v) Triton X-100으로 투과시킨 후 2번 세척하고, 2 ㎍/㎖의 1차 항체(항-pNF-κB)를 첨가하고 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 다음날, 세포를 상온에서 1시간 동안 2차 항체(chicken anti-rabbit secondary antibody; CAR-594;A21201 Invitrogen)로 대조염색한 다음, DAPI(2 ㎍/㎖)로 세포를 염색하였다. 형광 현미경을 사용하여 이미지를 캡처하고 NIS-Elements 소프트웨어(BR-2.01.00, NY 11747-3064, 미국)으로 분석하였다.
그 결과, 도 3b 및 도 3c에 나타난 바와 같이, DNRE(100 ㎍/㎖)는 IκB 인산화를 억제하고, 핵으로의 p65 전위를 감소시키는 것으로 확인되었다. 또한, 도 3d에 나타난 바와 같이, 세포 상에서 NF-κB(p65)의 핵 전위 정도를 관찰한 결과, DNRE 처리에 의해 웨스턴 블랏 결과와 동일하게 핵으로의 p65 전위가 감소된 것을 확인하였다.
부채마 뿌리줄기 추출물 내 주요 화합물 분리 및 효능 확인
5-1 : 화합물 분리
본 발명에서는 DNRE 주요 화합물을 분리 및 정량화 하기 위해, HPLC(high-performance liquid chromatography)를 수행하였다.
UV 검출기와 20 ㎕ 주입 루프가 장착된 Thermo Scientific(Ultimate 3000) HPLC 시스템(Thermo Scientific)을 사용하였으며, (A) 0.1% 아세트산, (B) 100% 아세토니트릴로 구성된 구배 시스템을 사용하고 Diamonsil(C18; 250 × 4.6 mm; 5 μm) 컬럼을 사용하여 분리하였다. 기울기 비율(gradient ratio)은 1.0 ㎖/min의 유속에서 30분 동안 45:55(A:B)로 설정되었고 UV 검출은 210 nm로 설정하여, 부채마 뿌리줄기 화합물에서 하기 화학식 1로 표시되는 디오신을 검출 및 정량화 하였다.
[화학식 1]
도 4a에 나타난 바와 같이, 표준 디오신(도 4a 상단)과 체류 시간을 비교하여 DNRE에서 디오신의 정체를 확인하였다(도 4b 하단). 그 후 피크 면적을 사용하여 디오신의 농도를 계산한 결과 DNRE 밀리그램당 7.07 ± 2.95 ㎍의 디오신이 존재한다는 것을 확인하였다. DNRE 크로마토그램에서 디오신 피크 전의 머무름 시간 5 ~ 10분 사이에 흥미로운 알 수 없는 피크가 관찰되었으며, DNRE의 다른 사포닌 성분인 것으로 추측된다.
DNRE 매개 신경 보호는 잠재적인 항산화 효과에 부분적으로 의존하기 때문에 우리는 디오신이 항산화 효과를 가지고 있는지 여부를 확인하였다.
5-2: ABTS 라디칼 소거
DNRE와 디오신의 총 항산화 활성은 ABTS + 라디칼 양이온 탈색 분석을 사용하여 측정하였다.
먼저, 7.4 mM의 ABTS를 2.6mM의 과황산칼륨과 동일한 부피로 혼합한 다음, 혼합물을 사용하기 전에 12 ~ 14시간 동안 실온(RT)의 암실에 보관하였다. 라디칼 생성 후, ABTS 라디칼 용액은 734 nm에서 흡광도가 0.70 ± 0.02가 될 때까지 탈이온수로 희석하였다. 그 다음 0.9 ㎖의 ABTS 라디칼 용액과 0.1㎖의 샘플을 혼합하여 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. DNRE와 디오신의 항산화 활성은 TEAC(Trolox equivalents antioxidant capacity) 추출물 mg당 Trolox 등가의 mM(mM Trolox eq./mg 추출물)로 표시하였다.
그 결과, 도 4b에 나타난 바와 같이, ABTS 분석에서 디오신은 DNRE보다 자유 라디칼 소거 효율이 더 높은 것으로 나타났다.
5-3 : NF-κB(p65) 활성 억제
상기 실시예 4와 동일한 방법으로 디오신에 의한 NF-κB(p65) 소단위의 인산화 및 핵 전위 억제 효능을 확인하였다.
그 결과, 도 4c에 나타난 바와 같이, 디오신에 의해 핵으로의 p65 전위를 감소되는 것을 확인하였다. p65 인산화 및 핵 국소화는 여러 염증성 사이토카인을 전사할 수 있기 때문에 치료 전략 중 하나는 p65 핵 전위를 억제하는 것이다. 본 발명에서는 DNRE 및 이의 주요 화합물인 디오신이 p65 인산화 및 전위를 억제하는 것을 확인하였으므로, 이는 디오신이 신경염증을 예방할 수 있는 것을 의미한다.
스코폴라민에 의해 유발된 인지 장애 질환 동물모델에서 디오신의 인지기능 개선 효능 확인
6-1 : 동물 준비 및 약물 투여
8주령 수컷 C57BL/6(20 ~ 25 g) 마우스는 대한바이오링크(대한민국)에서 구입하였으며, 모든 실험은 건국대학교의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았다 (IACUC no-KUB201101).
스코폴라민(scopolamine hydrochloride; Sigma-Aldrich, 미국)은 콜린성 수용체를 길항하고 학습 습득을 결손시키는 해마 및 전전두엽 피질 전달을 손상시키는 항콜린성 약물로, 스코폴라민의 마우스 복강내 주사는 또한 C57BL/6 마우스에서 전신 및 결과적인 신경염증을 자극한다.
하기 그룹당 5마리의 동물을 실험 전에 다른 케이지에서 1주일 동안 적응시켰다(도 5a). 스코폴라민(2 mg/kg)을 복강 내 투여하고, 디오스신(60 mg/kg)과 식염수(대조군)를 연속 7일 동안 경구 투여하였다.
1) 대조군(cotrol; 무처리군)
2) 스코폴라민(Scopolamine) 2 mg/kg 처리군
3) 스코폴라민(Scopolamine) 2 mg/kg + 디오신 60 mg/kg 처리군
6-2 : Y-미로 테스트
본 발명은 디오신에 의한 공간 및 참조 기억 평가를 위해 Y-미로 분석을 수행하였다.
각 팔이 120° 각도로 분리된 3개의 동일한 팔이 있는 'Y'자 모양의 미로를 사용하였으며, 마우스를 미로의 중앙에 배치하고, 이동 대기 시간 및 다른 팔로의 변경된 진입을 5분 동안 기록하였다. 기억력이 손상되지 않은 마우스는 최근에 입력한 팔을 다시 방문하는 데 덜 관심을 보여야 하지만 기억력이 손상된 마우스는 다시 방문하는 데 높은 관심을 보여야 한다.
6-3 : 모리스 물 미로 테스트
마우스의 공간 기억을 평가하기 위해, 모리스 물 미로 테스트(Morris water maze; MWM)를 수행하였으며, 마우스는 탐색기술에 의존하여 물에 잠긴 탈출 플랫폼을 찾게된다. 이 테스트는 플랫폼이 숨겨진 원형 풀(122 cm)을 사용하였으며, 마우스가 시작 위치에서 숨겨진 플랫폼으로 가는 짧고 직접적인 경로를 찾도록, 약물 투여전 2일 동안 2시간 간격으로 2회의 연속 훈련을 수행하였다. 약물 투여 후, 미로 테스트를 수행한 다음, SMART 3.0 소프트웨어(Ver. 3.0, Harvard Apparatus, Holliston, MA 01746, 미국)를 사용하여 공간 획득을 측정하고 데이터를 분석하였다.
그 결과, 도 5b, 도 5c 및 도 5d에 나타난 바와 같이, 마우스의 공간 학습 기억에서 디오신 투여에 의해 스코폴라민 유도 인지 장애가 개선되는 것을 확인하였다.
스코폴라민에 의해 유발된 인지 장애 질환 동물모델에서 디오신의 신경염증 개선 효능 확인
본 발명에서는 디오신에 의해 스코폴라민에 의해 유발된 인지 장애 질환 동물모델의 신경 염증이 개선되는지 확인하였다.
상기 실시예 6-1의 마우스 뇌에서 추출한 해마(Hippocampus)와 대뇌피질(Cerebral cortex) 조직을 이용하여 염증 유발 효소(iNOS 및 COX-2) 및 신경영양 인자(BDNF 및 pCREB)의 발현 정도를 확인하였다. 해마 및 대뇌피질 조직에서 단백질을 각각 분리한 다음, 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 웨스턴 블랏을 수행하였으며, 1차 항체는 항-pCREB 항체(#87G3; cell signaling technology), 항-BDNF 항체(#ab226843; abcam), 또는 항-β-actin 항체(#C4; Santa Cruz Biotechnology)를 사용하였다.
도 6a에 나타난 바와 같이, 스코폴라민 투여는 대뇌 피질과 해마에서 염증 유발 효소인 iNOS 및 COX-2 발현을 유의하게 상향 조절했으나, 디오신 투여에 의해 이들의 발현이 유의하게 감소한 것을 확인하였다. 또한, 도 6b에 나타난 바와 같이, 디오신 투여에 의해 신경영양 인자인 BDNF 및 pCREB 발현을 유의하게 증가하였다.
이러한 결과는 디오신이 스코폴라민에 의해 유도된 염증 유발 효소의 발현을 억제하고, 신경영양 인자의 발현을 증가시켜 공간 학습 기억을 개선하는 것을 의미한다. 또한, 디오신이 해마보다 대뇌 피질 영역에 더 나은 영향을 미칠 수 있음을 확인하였다.
MPP+ 처리된 신경모세포종 세포에서 디오신에 의한 신경세포 보호 효과 확인
인간 신경모세포종 SH-SY5Y 세포(Human neuroblastoma SH-SY5Y cell; ATCC 미국)는 100U/㎖ 페니실린/스트렙토마이신 및 10%(v/v) 불활성화 FBS가 첨가된 DMEM/F12(1:1)에서, 37℃, 5% CO2 조건으로 배양하였다. 80 ~ 90% 컨플루언스(confluence)로 자란 세포를 트립신(0.05% trypsin-EDTA) 처리하여 계대배양하였으며, 2일 간격으로 배지를 교환하였다. 각 실험은 통계적 분석을 위해 3번 반복 실험하였다.
SH-SY5Y 세포를 24시간 동안 MPP+(1mM; 1-methyl-4-phenylpyridinium; Sigma-Aldrich, 미국)에 노출시켜 파킨슨병 모델을 확립하였다. 96-웰 플레이트에 SH-SY5Y 세포를 2.5 x 105 개/㎖로 분주한 다음, SH-SY5Y 세포에 다양한 농도의 디오신(100 ~ 400ng/㎖) 및/또는 MPP+(1mM)이 포함된 배지로 교환한 후, 37℃, 5% CO2조건으로 24시간동안 배양하였다.
세포 생존율을 분석하기 위해, 20 ㎕의 MTT(5 mg/㎖)를 각 웰에 첨가하고 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 추가로 3시간 동안 배양하였다. 그 후 배지를 제거한 다음, 각 웰에 200㎕의 DMSO를 첨가하고 30분 동안 교반하여 포르마잔(formazan) 결정을 용해시킨 후, 마이크로플레이트 판독기(SunriseTM, Tecan Trading AG, Switzerland)를 사용하여 552 nm에서 흡광도를 측정하였다.
세포를 형광 현미경으로 관찰하기 위해, 상기와 같이 세포를 배양한 다음, 차가운 PBS로 한 번 세척한 후, 4% 차가운 PFA로 상온에서 15분 동안 반응시켜 세포를 고정하였다. PFA를 제거한 후, 세포를 2회 세척한 다음, 상온에서 10분 동안 0.1% Triton X-100을 투과화(permeabilized) 시킨 후, 세포를 세척한 다음, DAPI(2 ㎍/㎖) 염색을 수행하였다. 이미지는 Nikon Eclipse Ts2R 형광 현미경 시스템을 사용하여 바로 캡처되었고 NIS-Elements BR-2.01.00 소프트웨어로 처리하였다.
그 결과, 도 7a에 나타난 바와 같이, 디오신은 800 ng/㎖를 제외하고는 농도 의존적으로 MPP+ 활성을 감소시키고 세포 생존력을 증가시켰다. 따라서, 이후 실험에서는 디오신을 100 ~ 400 ng/㎖ 농도로 처리하였다.
DAPI 염색 방법을 사용하여 SH-SY5Y에서 MPP+ 유도 세포자멸사에 대한 디오신 매개 보호를 검증한 결과, 도 7b에 나타난 바와 같이, MPP+ 처리는 핵 표현형의 변화 없이 핵 내에서 상당한 염색질 단편화를 보였다. 디오신 200 및 400 ng/㎖의 전처리에서 아폽토시스 세포 사멸이 감소한 것을 확인하였다. 상기 결과는, 디오신이 MPP+로 유도된 미토콘드리아 복합체 I 손상을 감소시켜 신경 세포의 생존성을 향상시킴을 의미한다.
MPP+ 처리된 신경모세포종 세포에서 디오신에 의한 아폽토시스 마커 하향 조절 확인
본 발명에서는 아폽토시스 마커인 Bcl-2(B-cell lymphoma 2), Bax(Bcl-2 associated X protein), 캐스페이스-3(caspase-3) 및 활성화된 캐스페이스-3(activated caspase-3, cleaved caspase-3, clvCas3)에 대한 디오신 처리 효과를 확인하였다.
상기 실시예 8와 동일한 방법으로 세포를 배양한 다음, 단백질을 분리하여 웨스턴 블랏을 수행하였다. 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 웨스턴 블랏을 수행하였으며, 1차 항체로는 항-Caspase3 항체(#H-277; santa cruz biotechnology), 항-clvCaspase3 항체(#9661; cell signaling technology), 항-Bax 항체(#p-19; santa cruz biotechnology), 항-Bcl-2 항체(#N-19; santa cruz biotechnology), 또는 항-β-actin 항체(#C4; Santa Cruz Biotechnology)를 사용하였다.
그 결과, 도 8a 및 도 8b에 나타난 바와 같이, 디오신 농도 의존적으로, Bax 발현이 감소한 반면, Bcl-2 발현은 증가된 것을 확인하였다. 또한, 디오신은 농도 의존적으로 절단된 caspase-3/caspase-3 비율이 감소되었다.
Bax는 MPP+ 매개 아폽토시스에서 중요한 역할을 하며, 증가된 Bax 수치가 항-아폽토시스 Bcl-2를 감소시키고 미토콘드리아 사이토크롬 c의 방출을 증가시킨다. 또한, 시토크롬 c는 Apaf-1과 복합체를 형성하여 caspase-3 매개 세포자멸사를 활성화시킨다. 즉, 본 발명에서는 디오신이 Bax 수치를 감소시키고, MPP+ 유발 독성으로부터 보호하여 caspase-3 활성화를 감소시키는 것을 확인하였다.
MPP+ 처리된 신경모세포종 세포에서 디오신에 의한 TH 세포 및 신경영양 인자 증가 확인
CREB(cAMP response element-binding protein; phosphor/pCREB)은 확장에서 뇌 유래 신경 영양 인자(BDNF) 번역을 조절하는 cFos와 같은 다양한 다른 전사 인자의 발현을 조절할 수 있는 전사 인자이다. MPP+가 파킨슨병 단백질 응집을 유도하고 신경 세포 손실을 일으키기 때문에, 본 발명에서는 디오신 매개 자가포식이 CREB 의존적 BDNF 전사를 촉진하여 신경 세포 손실을 억제할 수 있는지 확인하였다.
먼저, 상기 실시예 8와 동일한 방법으로 세포를 배양한 다음, 단백질을 분리하여 웨스턴 블랏을 수행하였다. 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 웨스턴 블랏을 수행하였으며, 1차 항체로는 항-CREB 항체, 항-pCREB 항체(#87G3; cell signaling technology), 항-BDNF 항체(#ab226843; abcam), 항-TH 항체(#ab112; abcam), 또는 항-β-actin 항체(#C4; Santa Cruz Biotechnology)를 사용하였다.
그 결과, 도 9a 및 도 9b에 나타난 바와 같이, 디오신 농도 의존적으로, BDNF 및 pCREB가 증가하는 것을 확인하였다. 400 ng/㎖ 디오신에 의해 총 CREB 발현은 감소하였으나, pCREB은 현저하게 상향 조절되었다.
즉, 디오신 처리에 의해 CREB/cFos/BDNF 경로가 촉진되어 BDNF 합성이 향상되었으며, 도파민신경세포의 표지인 TH/dopamine 수치가 증가된 것을 확인하였다.
티로신 수산화효소(Tyrosine hydroxylase, TH)는 뇌에서 도파민 합성의 핵심 효소이다. TH 수준의 감소는 파킨슨병에서 운동 기능 장애 증후군의 핵심인 도파민합성의 하향 조절을 유발한다. TH 수준이 도파민 합성 및 신경 발생의 긍정적인 신호이기 때문에 본 발명의 결과는, 디오신이 도파민신경세포 생존을 촉진한다는 가설을 뒷받침할 수 있다.
MPP+ 처리된 신경모세포종 세포에서 디오신에 의한 자가포식 기능 회복 효과 확인
Bax 매개 세포자멸사 외에도 MPP+는 ATG5를 억제하여 자가포식소체 형성(탐식단 단계)을 억제한다. 본 발명에서는 디오신에 의해 MPP+ 매개 ATG5 손상을 개선할 수 있는지 여부를 확인하였다.
먼저, 상기 실시예 8와 동일한 방법으로 세포를 배양한 다음, 단백질을 분리하여 웨스턴 블랏을 수행하였다. 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 웨스턴 블랏을 수행하였으며, 1차 항체로는 항-SQSTM1/p62 항체(#ab109012; abcam), 항-ATG5 항체(#ab108327; abcam), 또는 항-β-actin 항체(#C4; Santa Cruz Biotechnology)를 사용하였다.
p62는 자가포식에 의해 분해되고 자가포식 손상은 p62 단백질의 응집 및 상향 조절을 초래한다. 도 10a에 나타난 바와 같이, 디오신은 MPP+ 처리된 SH-SY5Y 세포에서 ATG5를 농도 의존적으로 증가시켰으나, 400 ng/㎖ 농도에서만 p62를 실직적으로 분해하여 자가포식을 개선시키는 것으로 확인되었다.
디오신이 자가포식 유동(autophagic flux) 형성에 영향을 미친다는 가설을 증명하기 위해 리소좀 억제제인 CQ(chloroquine diphosphate; cat.No C6628, Sigma-Aldrich, 미국)를 SH-SY5Y에서 MPP+ 또는/및 디오신(100 ~ 400 ng/㎖)을 처리하기 1시간 전에 전처리한 결과, 도 10b에 나타난 바와 같이, MPP+ 및 CQ 처리군에서 상당한 자가포식 손상을 나타내었으나, 고동노의 디오신 처리에 의해 p62 분해 증가가 관찰되어, 디오신에 의해 자가포식 활성이 개선된 것을 확인하였다.
MPP+ 처리된 신경모세포종 세포에서 디오신에 의한 자가포식소체 형성 촉진 효과 확인
자가포식 반응에 대한 디오신의 효과를 확인하기 위해, 자가포식소체(autophagosome) 마커인 LC3의 발현 정도를 확인하였다. 자가포식이 활성화되면 LC3가 절단되어 세포질 LC3I를 형성하고, 나중에 포스파티딜에탄올아민과 접합될 때 LC3Ⅱ로 전환된다.
먼저, 상기 실시예 8와 동일한 방법으로 세포를 배양한 다음, 단백질을 분리하여 웨스턴 블랏을 수행하였다. 웨스턴 블랏은 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 수행하였으며, 1차 항체로는 항-LC3 항체(#ab192890; abcam), 또는 항-β-actin 항체(#C4; Santa Cruz Biotechnology)를 사용하였다.
면역형광염색 분석을 수행하기 위해, 상기와 같이 세포를 배양한 다음, 차가운 PBS로 한 번 세척한 후, 4% 차가운 PFA로 상온에서 15분 동안 반응시켜 세포를 고정하였다. PFA를 제거한 후, 세포를 2회 세척한 다음, 상온에서 10분 동안 0.1% Triton X-100을 투과화(permeabilized) 시킨 후, 5% BSA(0.1% PBS-Tween 20 포함)로 1시간 동안 블로킹 시켰다. 그 후, 세포를 세척한 다음, 2 ㎍/㎖의 1차 항체(항-LC3; #ab192890; abcam)를 처리하고 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. chicken-anti-rabbit(CAR-594; A21201 Invitrogen, 1:400)이 포함된 5% BSA로 상온에서 1시간 동안 반응시킨 다음, DAPI(2 ㎍/㎖) 염색을 수행하였다. 이미지는 Nikon Eclipse Ts2R 형광 현미경 시스템을 사용하여 바로 캡처되었고 NIS-Elements BR-2.01.00 소프트웨어로 처리하였다.
그 결과, 도 11a에 나타난 바와 같이, MPP+에 노출된 세포는 손상된 자가포식소체 형성을 나타내는 LC3Ⅱ 형성이 감소된 반면, 디오신 투여군은 농도 의존적으로 LC3Ⅱ 형성이 증가하였다. 이는 디오신에 의해 자가포식소체 형성이 유의하게 증가된 것을 의미한다.
또한, 세포에서 자가포식 유동에 대한 디오신의 효과를 확인하기 위해, CQ(40μM)로 전처리한 결과, 도 11b에 나타난 바와 같이, CQ 처리에 의해 LC3 농도가 증가되는 것을 확인하였으며, 이는 CQ가 자가용해소체(autolysosome) 분해를 손상시키기 때문이다. 반면, 고농도 디오신 처리군은 MPP+ 단독 처리군에 비해 LC3 발현이 3배 이상 증가한 것으로 확인되었다.
디오신 매개 자가포식소체-리소좀 융합을 형광 현미경으로 관찰한 결과, 도 11c에 나타난 바와 같이, MPP+ 처리에 의해 항-LC3 노출에 대한 형광강도가 낮게 나타났으며, 이는 자가포식소체가 손상되었다는 것을 의미한다.
자가포식소체-리소좀의 억제제로서 CQ 처리는 자가포식 융합 억제를 나타내는 LC3 풍타(LC3 puncta)를 증가시킨 반면, 디오신(400 ng/㎖) 처리는 MPP+ 처리된 SH-SY5Y에서 자가포식 융합을 향상시켰으며, CQ 공동처리된 세포에서 LC3 응집을 감소시킨 것을 확인하였다.
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Claims (23)
- 부채마(Dioscorea nipponica Makino) 뿌리줄기 추출물 또는 디오신(dioscin)을 유효성분으로 포함하는, 기억력 및 인지 기능 장애 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 부채마 뿌리줄기 추출물은 에탄올을 용매로 하여 추출된 것을 특징으로 하는, 기억력 및 인지 기능 장애 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 조성물은 콜린성 신경 기능 저하를 개선시키거나,
해마 또는 대뇌 피질에서 ⅰ) iNOS 또는 COX-2를 포함하는 염증성 인자의 발현 억제; 또는 ⅱ) BDNF 또는 pCREB를 포함하는 인지기능성 인자의 발현 증가를 유도하는 것을 특징으로 하는, 기억력 및 인지 기능 장애 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 기억력 또는 인지 기능 장애는 경도인지장애, 주의력 결핍장애(ADHD), 우울증, 알츠하이머병, 뇌혈관성 치매, 노인성 치매, 픽(pick)병 및 크루츠펠트-야곱(Creutzfeldt-jakob)병으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 기억력 및 인지 기능 장애 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 부채마(Dioscorea nipponica Makino) 뿌리줄기 추출물 또는 디오신(dioscin)을 유효성분으로 포함하는, 기억력 및 인지 기능 장애 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물.
- 제5항에 있어서,
상기 부채마 뿌리줄기 추출물은 에탄올을 용매로 하여 추출된 것을 특징으로 하는, 기억력 및 인지 기능 장애 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물.
- 제5항에 있어서,
상기 조성물은 콜린성 신경 기능 저하를 개선시키거나,
해마 또는 대뇌 피질에서 ⅰ) iNOS 또는 COX-2를 포함하는 염증성 인자의 발현 억제; 또는 ⅱ) BDNF 또는 pCREB를 포함하는 인지기능성 인자의 발현 증가를 유도하는 것을 특징으로 하는, 기억력 및 인지 기능 장애 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물.
- 제5항에 있어서,
상기 기억력 또는 인지 기능 장애는 경도인지장애, 주의력 결핍장애(ADHD), 우울증, 알츠하이머병, 뇌혈관성 치매, 노인성 치매, 픽(pick)병 및 크루츠펠트-야곱(Creutzfeldt-jakob)병으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 기억력 및 인지 기능 장애 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물.
- 부채마(Dioscorea nipponica Makino) 뿌리줄기 추출물 또는 디오신(dioscin)을 유효성분으로 포함하는, 신경염증질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제9항에 있어서,
상기 부채마 뿌리줄기 추출물은 에탄올을 용매로 하여 추출된 것을 특징으로 하는, 신경염증질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제9항에 있어서,
상기 부채마 뿌리줄기 추출물 또는 디오신은
ⅰ) NO, iNOS 및 COX-2를 포함하는 염증반응 매개인자(inflammatory mediators) 생성 억제;
ⅱ) IL-1β, IL-6 및 TNF-α를 포함하는 염증성 사이토카인(cytokines) 생성 억제; 및
ⅲ) IκB-α 인산화 억제 및 p65 전위 억제를 통한 NF-κB 활성 억제;를 통해 신경염증을 조절하는 것을 특징으로 하는, 신경염증질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제9항에 있어서,
상기 부채마 뿌리줄기 추출물 또는 디오신은 자가포식 활성 유도, Bax(Bcl-2 associated X protein) 발현 감소 또는 caspase-3 활성 감소를 통해 뇌 세포사멸(apoptosis)을 억제하거나, BDNF, pCREB 및 티로신 수산화효소(Tyrosine hydroxylase) 발현 증가를 통해 신경세포를 보호하는 것을 특징으로 하는, 신경염증질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제9항에 있어서,
상기 신경염증 질환은 다발성 경화증, 신경모세포종, 허혈성 뇌졸중, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 루게릭 질환, 헌팅턴 질환, 크로이츠펠트야콥병, 외상 후 스트레스 장애, 우울증, 정신분열증 또는 근위축성측색경화증으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 신경염증질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 부채마(Dioscorea nipponica Makino) 뿌리줄기 추출물 또는 디오신(dioscin)을 유효성분으로 포함하는, 신경염증질환의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물.
- 제14항에 있어서,
상기 부채마 뿌리줄기 추출물은 에탄올을 용매로 하여 추출된 것을 특징으로 하는, 신경염증질환의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물.
- 제14항에 있어서,
상기 부채마 뿌리줄기 추출물 또는 디오신은
ⅰ) NO, iNOS 및 COX-2를 포함하는 염증반응 매개인자(inflammatory mediators) 생성 억제;
ⅱ) IL-1β, IL-6 및 TNF-α를 포함하는 염증성 사이토카인(cytokines) 생성 억제; 및
ⅲ) IκB-α 인산화 억제 및 p65 전위 억제를 통한 NF-κB 활성 억제;를 통해 신경염증을 조절하는 것을 특징으로 하는, 신경염증질환의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물.
- 제14항에 있어서,
상기 부채마 뿌리줄기 추출물 또는 디오신은 자가포식 활성 유도, Bax(Bcl-2 associated X protein) 발현 감소 또는 caspase-3 활성 감소를 통해 뇌 세포사멸(apoptosis)을 억제하거나, BDNF, pCREB 및 티로신 수산화효소(Tyrosine hydroxylase) 발현 증가를 통해 신경세포를 보호하는 것을 특징으로 하는, 신경염증질환의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물.
- 제14항에 있어서,
상기 신경염증 질환은 다발성 경화증, 신경모세포종, 허혈성 뇌졸중, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 루게릭 질환, 헌팅턴 질환, 크로이츠펠트야콥병, 외상 후 스트레스 장애, 우울증, 정신분열증 또는 근위축성측색경화증으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 신경염증질환의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물.
- 부채마 뿌리줄기 추출물 또는 디오신을 유효성분으로 포함하는, 신경세포 사멸(apoptosis) 억제용 조성물.
- 제19항에 있어서,
상기 조성물은 신경세포 사멸 억제용 시약 조성물, 신경세포 사멸에 의한 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 또는 신경세포 사멸에 의한 질병의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물인 것을 특징으로 하는, 신경세포 사멸 억제용 조성물.
- 부채마 뿌리줄기 추출물 또는 디오신을 유효성분으로 포함하는, 자가포식작용 촉진용 조성물.
- 제21항에 있어서,
상기 조성물은 심혈관질환, 유방암, 폐암, 비염, 중이염, 관절염, 관절통, 비만, 안과질환, 천식, 대장염, 크론병, 아토피, 알러지, 건선 또는 부상으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물인 것을 특징으로 하는, 자가포식작용 촉진용 조성물.
- 제21항에 있어서,
상기 조성물은 심혈관질환, 유방암, 폐암, 비염, 중이염, 관절염, 관절통, 비만, 안과질환, 천식, 대장염, 크론병, 아토피, 알러지, 건선 또는 부상으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 질병의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물인 것을 특징으로 하는, 자가포식작용 촉진용 조성물.
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|---|---|---|---|
| KR1020220151690A KR20240073178A (ko) | 2022-11-14 | 2022-11-14 | 부채마 추출물 또는 디오신을 포함하는 기억력 개선, 신경염증 억제, 신경세포 사멸 억제, 또는 자가포식작용 촉진용 조성물 |
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| KR1020220151690A KR20240073178A (ko) | 2022-11-14 | 2022-11-14 | 부채마 추출물 또는 디오신을 포함하는 기억력 개선, 신경염증 억제, 신경세포 사멸 억제, 또는 자가포식작용 촉진용 조성물 |
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ID=91321316
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-
2022
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