KR102661884B1 - 해방풍 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 경도인지장애 개선용 조성물 - Google Patents
해방풍 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 경도인지장애 개선용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 해방풍 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 경도인지장애 개선용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 해방풍 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 경도인지장애의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서는 해방풍 추출물 및 이의 에틸아세테이트 분획물의 신경염증 억제 효능이 우수한 것을 확인하였으며, 해방풍 추출물의 주성분 중의 하나인 루틴(rutin) 농도 의존적으로 신경염증 억제 효능이 증가하는 것을 확인하였다.
또한, 본 발명의 해방풍 추출물 및 이의 에틸아세테이트 분획물은 기억력 손상이 유도된 마우스의 기억력 개선 효과를 나타내는 것을 확인하였으므로, 경도인지장애 예방 또는 치료용 조성물로 유용하게 활용할 수 있다.
본 발명에서는 해방풍 추출물 및 이의 에틸아세테이트 분획물의 신경염증 억제 효능이 우수한 것을 확인하였으며, 해방풍 추출물의 주성분 중의 하나인 루틴(rutin) 농도 의존적으로 신경염증 억제 효능이 증가하는 것을 확인하였다.
또한, 본 발명의 해방풍 추출물 및 이의 에틸아세테이트 분획물은 기억력 손상이 유도된 마우스의 기억력 개선 효과를 나타내는 것을 확인하였으므로, 경도인지장애 예방 또는 치료용 조성물로 유용하게 활용할 수 있다.
Description
본 발명은 해방풍 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 경도인지장애 개선용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 해방풍 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 경도인지장애의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
치매의 가장 흔한 원인은 알츠하이머병으로, 진행성 기억 및 학습 장애, 판단력 저하, 행동 장애를 특징으로 하는 일반적인 신경 퇴행성 장애이다. 현재 전 세계적으로 4,700만 명의 알츠하이머병 피해자가 있는 것으로 추정되며, 2050년까지 1억 3,000만 명 이상으로 증가할 것으로 예상된다 (Unzeta, M. et. al., Frontiers in neuroscience, 10:205, 2016).
병리학적 특징은 산화 스트레스, 미토콘드리아 이상, 아밀로이드-베타(Aβ) 침착, 비정상적인 타우 인산화, 뇌의 신경망 기능 장애 및 신경 세포 손실이다. 알츠하이머병의 다양한 특징 중에서 산화 스트레스와 신경 염증(neuroinflammation)은 알츠하이머병을 유발하고 가속화할 수 있으며, 또한, 활성산소종(ROS), 산화질소(NO) 및 인터루킨 6(IL-6) 및 종양 괴사 인자-α(TNF-α)와 같은 전염증성 사이토카인을 생성하는 활성화된 미세아교세포의 수가 증가하게 된다 (Scheltens, P. et. al., Lancet (London, England), 388(10043):505-517, 2016; Solito, E. and Sastre, M., Frontiers in pharmacology, 3:14, 2012).
경도인지장애(Mild Cognitive Impairment: MCI or mild neurocognitive disoreders)는 다양한 요인에 의해 인지능력이 감퇴하여 동일 연령대에 비해 인지기능, 특히 기억력이 저하되어 있는 것을 지칭한다. 경도인지장애가 나타나는 사람의 경우 알츠하이머병으로의 진행 가능성이 매우 높은 고위험군으로 지목되고 있다. 경도인지장애 환자의 약 ~17%가 매년 알츠하이머병으로 진행되며, 약 ~80%는 6년 안에 치매 증상을 보인다는 보고가 있다 (R C Petersen et. al., Arch Neurol., 56(3):303-8, 1999; Annapaola Prestia et. al., Neurology, 80(11):1048-56, 2013). 따라서 경도인지장애는 알츠하이머병을 가장 조기에 치료할 수 있는 단계로써 이에 대한 적절한 치료 및 예방용 조성물을 개발하는 것은 중요하다.
신경염증은 중추신경계(CNS)의 모든 유형의 손상 및 장애를 매개하는 병태생리학적 과정에서 중요한 특징으로, 신경 염증의 주요 세포 요소인 미세아교세포는 뇌 발달, 신경 환경 유지, 손상 및 복구에 대한 반응에 영향을 미치는 조직 상주 대식세포 역할을 한다. 염증 상태에서 미세아교세포가 활성화되고 TNF-α, IL-1β, IL-6을 포함한 전염증 인자의 방출과 유해한 유도성 산화질소 합성효소(iNOS)의 상향 조절에 대한 반응이 나타나고, 뉴런에 영향을 미쳐 조직 염증과 손상을 더욱 악화시킨다.
TLR4/NF-κB를 포함한 다수의 신호전달 분자는 미세아교세포 활성화 및 신경염증의 조절에 중요하다. TLR4는 주로 뇌의 미세아교세포에서 발현되며 지질다당류(LPS)를 포함한 적절한 리간드에 의해 자극된다. TLR4의 자극은 미세아교세포의 활성화에 중요한 역할을 하고 IL-1β, IL-6 및 TNF-α를 포함한 전염증성 사이토카인의 전사를 유도하는 NF-κB경로를 추가로 활성화한다.
전뇌 콜린성 뉴런은 중추 신경계 조절 인지 기능을 제어하는 데 중요한 역할을 한다. 콜린성 저하가 인지 기능에 영향을 미치고 항염증 경로를 방해하며, 콜린성 신호는 항염증 메커니즘을 통해 말초 사이토카인 생산을 조절하는 것으로 보고되었다 (Hoover, D.B., Pharmacol. Ther., 2017, 179:1-16). 스코폴라민(Scopolamine)은 해마와 전전두엽 피질의 콜린성 신경전달을 손상시켜 알츠하이머병의 분자적, 행동적 특징과 유사한 인지기능과 학습기억을 손상시키는 항콜린성 약물로, 다양한 뇌 영역에서 염증유발 사이토카인 및 인플라마좀 성분이 상향조절된다 (Cheon, S.Y. et. al., Sci. Rep., 2021, 11:8376).
한편, 해방풍(Glehnia Littoralis)은 산형과(Umbelliferae)에 속하는 갯방풍(Glehnia)속의 다년생 식물로, 한국, 중국, 일본에 분포하며 한방에서 발한제, 해열제, 진통제, 거담제로 사용되어 왔다 (Yuan, Z., et. al., Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 50(1):73-77, 2002).
해방풍은 퀘르세틴(quercetin), 이소퀘르세틴(isoquercetin), 루틴(rutin), 클로로겐산(chlorogenic acid), 카페산(caffeic acid)과 같은 항산화 성분을 가지고있으며, 최근 연구에서는 해방풍이 일과성 뇌허혈증(transient global cerebral ischemia) 에 대해 치료효능을 가지는 것으로 확인되었다. 또한, 해방풍은 성체 생쥐의 해마에서 세포 증식, 신경아세포 분화 및 신경 성숙을 촉진한다고 최근 보고되었으나(Park, J.H., et. al., Chinese Medical Journal, 131(06):689-695, 2018), 해방풍이 인지 기능 및 신경 염증에 미치는 영향은 연구된 바 없다.
이에, 본 발명에서는 해방풍 추출물의 인지능력 개선 또는 신경염증 개선 효능을 확인하기 위해 예의 노력한 결과, 해방풍 에탄올 추출물 또는 이의 에틸아세테이트 분획물이 신경염증을 효과적으로 억제시킬 수 있으며, 스코폴라민으로 유도된 공간기억 장애를 효과적으로 완화시키는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 해방풍 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 신경염증질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 해방풍 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 기억력 및 인지기능 장애 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.
상술한 목적을 달성하기 위해,
본 발명은 해방풍 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 신경염증질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 해방풍 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 신경염증질환 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 해방풍 추출물은 에탄올, 바람직하게는 50%(v/v) 에탄올을 용매로 하여 추출할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 있어서, 상기 분획물은 해방풍 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물일 수 있으며, 바람직하게는 (a) 해방풍 에탄올 추출물에서 헥산 용매를 첨가한 다음, 수상(aqueous phase)을 수득하는 단계;
(b) 상기 수상에 클로로포름 용매를 첨가한 다음, 수상을 수득하는 단계; 및
(c) 상기 수상에 에틸아세테이트 용매를 첨가한 다음, 에틸아세테이트 분획물을 수득하는 단계;를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 해방풍 추출물 또는 이의 분획물에는 페닐알라닌(Phenylalanine), 트립토판(Tryptophan), 클로로겐산(Chlorogenic acid), 루틴(Rutin), 이소퀘르세틴(isoquercetin), 또는 루테올린-7-루티노사이드(Luteolin-7-rutinoside) 성분이 포함될 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 해방풍 추출물 또는 이의 분획물은 ⅰ) NO, iNOS 및 COX-2를 포함하는 염증반응 매개인자(inflammatory mediators) 생성 억제;
ⅱ) ERK, p38 또는 JNK의 인산화 억제를 통한 MAPK 신호경로 억제;
ⅲ) IL-1β, IL-6 및 TNF-α를 포함하는 염증성 사이토카인(cytokines) 생성 억제; 및
ⅳ) IκB-α 인산화 억제 및 p65 전위 억제를 통한 NF-κB활성 억제를 통해 신경염증을 조절할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 신경염증 질환은 다발성 경화증, 신경모세포종, 허혈성 뇌졸중, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 루게릭 질환, 헌팅턴 질환, 크로이츠펠트야콥병, 외상 후 스트레스 장애, 우울증, 정신분열증, 근위축성측색경화증 또는 경도 인지장애로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
다른 목적을 달성하기 위해,
본 발명은 해방풍 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 기억력 및 인지기능 장애 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 해방풍 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 기억력 및 인지기능 장애 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 해방풍 추출물은 에탄올, 바람직하게는 50%(v/v) 에탄올을 용매로 하여 추출할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 있어서, 상기 분획물은 해방풍 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물일 수 있으며, 바람직하게는 (a) 해방풍 에탄올 추출물에서 헥산 용매를 첨가한 다음, 수상(aqueous phase)을 수득하는 단계;
(b) 상기 수상에 클로로포름 용매를 첨가한 다음, 수상을 수득하는단계; 및
(c) 상기 수상에 에틸아세테이트 용매를 첨가한 다음, 에틸아세테이트 분획물을 수득하는 단계;를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 해방풍 추출물 또는 이의 분획물에는 페닐알라닌(Phenylalanine), 트립토판(Tryptophan), 클로로겐산(Chlorogenic acid), 루틴(Rutin), 이소퀘르세틴(isoquercetin), 또는 루테올린-7-루티노사이드(Luteolin-7-rutinoside) 성분이 포함될 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 콜린성 신경 기능 저하를 개선시킬 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 해마 또는 대뇌 피질에서 ⅰ) 아세틸콜린에스터레이즈(acetylcholinesterase; AChE) 저해 활성 억제;
ⅱ) 산화적 손상 억제;
ⅲ) iNOS 또는 COX-2를 포함하는 염증성 인자의 발현 억제; 또는
ⅳ) BDNF 또는 pCREB를 포함하는 인지기능성 인자의 발현 증가를 통해 기억력 및 인지기능을 개선시킬 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시에에 있어서, 상기 기억력 또는 인지 기능 장애는 경도인지장애, 주의력 결핍장애(ADHD), 우울증, 알츠하이머병, 뇌혈관성 치매, 노인성 치매, 픽(pick)병 및 크루츠펠트-야곱(Creutzfeldt-jakob)병으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.
본 발명에서는 해방풍 추출물 및 이의 에틸아세테이트 분획물의 신경염증 억제 효능이 우수한 것을 확인하였으며, 해방풍 추출물의 주성분 중의 하나인 루틴(rutin) 농도 의존적으로 신경염증 억제 효능이 증가하는 것을 확인하였다.
또한, 본 발명의 해방풍 추출물 및 이의 에틸아세테이트 분획물은 기억력 손상이 유도된 마우스의 기억력 개선 효과를 나타내는 것을 확인하였으므로, 경도인지장애 예방 또는 치료용 조성물로 유용하게 활용할 수 있다.
도 1a는 LPS-자극된 BV-2 세포에서 해방풍 추출물의 추출 용매에 따른 NO 생성억제 및 세포 생존율을, 도 1b는 해방풍 50% 에탄올 추출물의 농도의존적 NO 생성억제 및 세포 생존율을 확인한 데이터이다. 도면에서 GLW는 해방풍 열수 추출물, GLE-30은 해방풍 30% 에탄올 추출물, GLE-50은 해방풍 50% 에탄올 추출물을 의미한다.
도 2a는 LPS-자극된 BV-2 세포에 해방풍 50% 에탄올 추출물 처리에 따른 iNOS 및 COX-2 단백질 발현 억제 정도를, 도 2b는 MAPK 경로 관련 인자들의 인산화 억제 정도를 나타낸 데이터이다.
도 3a는 LPS-자극된 BV-2 세포에 해방풍 50% 에탄올 추출물 처리에 따른 NF-κB(p65) 및 IκB-α의 인산화 억제 정도를, 도 3b는 세포내 NF-κB(p65) 위치를 형광 현미경으로 관찰한 이미지이다.
도 4는 LPS-자극된 BV-2 세포에 해방풍 50% 에탄올 추출물 처리에 따른 (a) IL-6 및 (b) TNF-α 생성 억제정도를 확인한 데이터이다.
도 5는 해방풍 50% 에탄올 추출물 유래 분획물 제조방법을 나타낸 모식도이다.
도 6은 LPS-자극된 BV-2 세포에 해방풍 50% 에탄올 추출물 유래 분획물을 각각 처리하였을 때, (a) NO 생성 및 (b) 세포 생존율을 확인한 데이터이다. 도면에서, GLE-50은 해방풍 50% 에탄올 추출물, HF는 헥산 분획물, CF는 클로로포름 분획물, EF는 에틸아세테이트 분획물, BF는 n-부탄올 분획물, WF는 물 분획물을 의미한다.
도 7a는 LPS-자극된 BV-2 세포에서 해방풍 50% 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물 처리에 따른 iNOS 및 COX-2 단백질 발현 억제 정도를, 도 7b는 MAPK 경로 관련 인자들의 인산화 억제 정도를 나타낸 데이터이다.
도 8a는 LPS-자극된 BV-2 세포에서 해방풍 50% 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물 처리에 따른 NF-κB(p65) 및 IκB-α의 인산화 억제 정도를, 도 8b는 세포내 NF-κB(p65) 위치를 형광 현미경으로 관찰한 이미지이다.
도 9는 LPS-자극된 BV-2 세포에서 해방풍 50% 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물 처리에 따른 (a) IL-6 및 (b) TNF-α 생성 억제정도를 확인한 데이터이다.
도 10은 해방풍 50% 에탄올 추출물을 UHPLC-MS(Ultra high-performance liquid chromatography-mass spectrometry) 크로마토크래피로 분석하였을 때, (a) 총 이온 크로마토크래피 및 (b) 총 이온 크로마토그램에서 3.23, 4.5, 5.24, 7.21, 7.49 및 7.86분 피크의 MS 및 MS2 스펙트럼를 나타낸 데이터이다.
도 11a는 LPS-자극된 BV-2 세포에서 루틴 처리에 따른 NO 생성 및 세포 생존율을, 도 11b는 iNOS 및 COX-2 단백질 발현 억제 정도를 나타낸 데이터이다.
도 12는 스코폴라민 유발 기억상실 동물 모델 실험 방법을 나타낸 모식도이다. 도면에서 DNZ(donepezil)는 양성대조군을 의미한다.
도 13은 스코폴라민 유발 기억상실 동물 모델에 해방풍 50% 에탄올 추출물을 투여하였을 때, Y-미로실험 결과를 나타낸 데이터이다.
도 14a는 스코폴라민 유발 기억상실 동물 모델에 해방풍 50% 에탄올 추출물을 투여하였을 때, 모리스 물 미로 테스트(Morris Water Maze Test; MWM)에서 훈련 및 데이터 중에 마우스의 궤적맵을, 도 14b 및 도 14c는 MWM에서 숨겨진 플랫폼을 찾기 위해 이동한 거리(travelled distance) 및 탈출 대기 시간(mean escape latency)을 나타낸 데이터이다.
도 15는 스코폴라민 유발 기억상실 동물 모델에 해방풍 50% 에탄올 추출물을 투여하였을 때, 마우스 (a) 해마(Hippocampus) 및 (b) 대뇌피질(cortex)에서 아세틸콜린에스터레이즈(acetylcholinesterase; AChE) 저해 활성을 확인한 데이터이다.
도 16은 스코폴라민 유발 기억상실 동물 모델에 해방풍 50% 에탄올 추출물을 투여하였을 때, (a, c, e) 해마 및 (b, d, f) 대뇌피질에서 Nrf-2 및 HO-1 단백질 생성 억제 정도를 확인한 데이터이다. 도 16c ~ 도 16f는 각 단백질 발현정도를 정량화한 데이터이다.
도 17은 스코폴라민 유발 기억상실 동물 모델에 해방풍 50% 에탄올 추출물을 투여하였을 때, (a, c, e) 해마 및 (b, d, f) 대뇌피질에서 p-CREB/BDNF 단백질 생성 억제 정도를 확인한 데이터이다. 도 17c ~ 도 17f는 각 단백질 발현정도를 정량화한 데이터이다.
도 18은 스코폴라민 유발 기억상실 동물 모델에 해방풍 50% 에탄올 추출물을 투여하였을 때, (a, c, e) 해마 및 (b, d, f) 대뇌피질에서 iNOS 및 COX-2단백질 생성 억제 정도를 확인한 데이터이다. 도 18c ~ 도 18f는 각 단백질 발현정도를 정량화한 데이터이다.
도 19는 스코폴라민 유발 기억상실 동물 모델에 해방풍 50% 에탄올 추출물을 투여하였을 때, (a, c, e) 해마 및 (b, d, f) 대뇌피질에서 NF-κB(p65) 및 IκB-α의 인산화 억제 정도를 확인한 데이터이다. 도 19c ~ 도 19f는 각 단백질 발현정도를 정량화한 데이터이다.
도 20은 스코폴라민 유발 기억상실 동물 모델에 해방풍 50% 에탄올 추출물을 투여하였을 때, (a, c, e, g) 해마 및 (b, d, f, h) 대뇌피질에서 MAPK 경로 관련 인자들의 인산화 억제 정도를 확인한 데이터이다. 도 19c ~ 도 19h는 각 단백질 발현정도를 정량화한 데이터이다.
도 2a는 LPS-자극된 BV-2 세포에 해방풍 50% 에탄올 추출물 처리에 따른 iNOS 및 COX-2 단백질 발현 억제 정도를, 도 2b는 MAPK 경로 관련 인자들의 인산화 억제 정도를 나타낸 데이터이다.
도 3a는 LPS-자극된 BV-2 세포에 해방풍 50% 에탄올 추출물 처리에 따른 NF-κB(p65) 및 IκB-α의 인산화 억제 정도를, 도 3b는 세포내 NF-κB(p65) 위치를 형광 현미경으로 관찰한 이미지이다.
도 4는 LPS-자극된 BV-2 세포에 해방풍 50% 에탄올 추출물 처리에 따른 (a) IL-6 및 (b) TNF-α 생성 억제정도를 확인한 데이터이다.
도 5는 해방풍 50% 에탄올 추출물 유래 분획물 제조방법을 나타낸 모식도이다.
도 6은 LPS-자극된 BV-2 세포에 해방풍 50% 에탄올 추출물 유래 분획물을 각각 처리하였을 때, (a) NO 생성 및 (b) 세포 생존율을 확인한 데이터이다. 도면에서, GLE-50은 해방풍 50% 에탄올 추출물, HF는 헥산 분획물, CF는 클로로포름 분획물, EF는 에틸아세테이트 분획물, BF는 n-부탄올 분획물, WF는 물 분획물을 의미한다.
도 7a는 LPS-자극된 BV-2 세포에서 해방풍 50% 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물 처리에 따른 iNOS 및 COX-2 단백질 발현 억제 정도를, 도 7b는 MAPK 경로 관련 인자들의 인산화 억제 정도를 나타낸 데이터이다.
도 8a는 LPS-자극된 BV-2 세포에서 해방풍 50% 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물 처리에 따른 NF-κB(p65) 및 IκB-α의 인산화 억제 정도를, 도 8b는 세포내 NF-κB(p65) 위치를 형광 현미경으로 관찰한 이미지이다.
도 9는 LPS-자극된 BV-2 세포에서 해방풍 50% 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물 처리에 따른 (a) IL-6 및 (b) TNF-α 생성 억제정도를 확인한 데이터이다.
도 10은 해방풍 50% 에탄올 추출물을 UHPLC-MS(Ultra high-performance liquid chromatography-mass spectrometry) 크로마토크래피로 분석하였을 때, (a) 총 이온 크로마토크래피 및 (b) 총 이온 크로마토그램에서 3.23, 4.5, 5.24, 7.21, 7.49 및 7.86분 피크의 MS 및 MS2 스펙트럼를 나타낸 데이터이다.
도 11a는 LPS-자극된 BV-2 세포에서 루틴 처리에 따른 NO 생성 및 세포 생존율을, 도 11b는 iNOS 및 COX-2 단백질 발현 억제 정도를 나타낸 데이터이다.
도 12는 스코폴라민 유발 기억상실 동물 모델 실험 방법을 나타낸 모식도이다. 도면에서 DNZ(donepezil)는 양성대조군을 의미한다.
도 13은 스코폴라민 유발 기억상실 동물 모델에 해방풍 50% 에탄올 추출물을 투여하였을 때, Y-미로실험 결과를 나타낸 데이터이다.
도 14a는 스코폴라민 유발 기억상실 동물 모델에 해방풍 50% 에탄올 추출물을 투여하였을 때, 모리스 물 미로 테스트(Morris Water Maze Test; MWM)에서 훈련 및 데이터 중에 마우스의 궤적맵을, 도 14b 및 도 14c는 MWM에서 숨겨진 플랫폼을 찾기 위해 이동한 거리(travelled distance) 및 탈출 대기 시간(mean escape latency)을 나타낸 데이터이다.
도 15는 스코폴라민 유발 기억상실 동물 모델에 해방풍 50% 에탄올 추출물을 투여하였을 때, 마우스 (a) 해마(Hippocampus) 및 (b) 대뇌피질(cortex)에서 아세틸콜린에스터레이즈(acetylcholinesterase; AChE) 저해 활성을 확인한 데이터이다.
도 16은 스코폴라민 유발 기억상실 동물 모델에 해방풍 50% 에탄올 추출물을 투여하였을 때, (a, c, e) 해마 및 (b, d, f) 대뇌피질에서 Nrf-2 및 HO-1 단백질 생성 억제 정도를 확인한 데이터이다. 도 16c ~ 도 16f는 각 단백질 발현정도를 정량화한 데이터이다.
도 17은 스코폴라민 유발 기억상실 동물 모델에 해방풍 50% 에탄올 추출물을 투여하였을 때, (a, c, e) 해마 및 (b, d, f) 대뇌피질에서 p-CREB/BDNF 단백질 생성 억제 정도를 확인한 데이터이다. 도 17c ~ 도 17f는 각 단백질 발현정도를 정량화한 데이터이다.
도 18은 스코폴라민 유발 기억상실 동물 모델에 해방풍 50% 에탄올 추출물을 투여하였을 때, (a, c, e) 해마 및 (b, d, f) 대뇌피질에서 iNOS 및 COX-2단백질 생성 억제 정도를 확인한 데이터이다. 도 18c ~ 도 18f는 각 단백질 발현정도를 정량화한 데이터이다.
도 19는 스코폴라민 유발 기억상실 동물 모델에 해방풍 50% 에탄올 추출물을 투여하였을 때, (a, c, e) 해마 및 (b, d, f) 대뇌피질에서 NF-κB(p65) 및 IκB-α의 인산화 억제 정도를 확인한 데이터이다. 도 19c ~ 도 19f는 각 단백질 발현정도를 정량화한 데이터이다.
도 20은 스코폴라민 유발 기억상실 동물 모델에 해방풍 50% 에탄올 추출물을 투여하였을 때, (a, c, e, g) 해마 및 (b, d, f, h) 대뇌피질에서 MAPK 경로 관련 인자들의 인산화 억제 정도를 확인한 데이터이다. 도 19c ~ 도 19h는 각 단백질 발현정도를 정량화한 데이터이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
신경염증질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물
본 발명은 일관점에서, 본 발명은 해방풍 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 신경염증질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 다른 일관점에서, 해방풍 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 신경염증질환 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 해방풍 추출물은 에탄올, 바람직하게는 50%(v/v) 에탄올을 용매로 하여 추출한 것을 특징으로 할 수 있으나, 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라, 즉, 통상적인 온도와 압력의 조건 하에서, 통상적인 용매를 사용하여 제조될 수 있으며, 바람직하게는 정제수(또는 물), 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 글리세린, 에틸아세테이트, 아세톤, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디클로로메탄, 클로로포름, 에틸에테르, 부틸렌글라이콜, 헥산 및 이들의 혼합용매으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 용매를 사용하여 추출할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 해방풍 추출물 또는 이의 분획물은 전체 조성물에 10 ~ 500 ㎍/㎖ 농도로, 바람직하게는 50 ~ 450 ㎍/㎖ 농도로 포함될 수 있다. 상기 농도 범위 미만의 농도로 추출물이 포함되는 경우, 효과가 미미할 수 있으며, 상기 농도 범위를 초과하면 세포 독성이 나타날 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 분획물은 해방풍 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물일 수 있으며, 바람직하게는 (a) 해방풍 에탄올 추출물에서 헥산 용매를 첨가한 다음, 수상(aqueous phase)을 수득하는 단계;
(b) 상기 수상에 클로로포름 용매를 첨가한 다음, 수상을 수득하는단계; 및
(c) 상기 수상에 에틸아세테이트 용매를 첨가한 다음, 에틸아세테이트 분획물을 수득하는 단계;를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 해방풍 추출물 또는 이의 분획물에는 페닐알라닌(Phenylalanine), 트립토판(Tryptophan), 클로로겐산(Chlorogenic acid), 루틴(Rutin), 이소퀘르세틴(isoquercetin), 또는 루테올린-7-루티노사이드(Luteolin-7-rutinoside) 성분이 포함될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 해방풍 추출물 또는 이의 분획물은 ⅰ) NO, iNOS 및 COX-2를 포함하는 염증반응 매개인자(inflammatory mediators) 생성 억제;
ⅱ) ERK, p38 또는 JNK의 인산화 억제를 통한 MAPK 신호경로 억제;
ⅲ) IL-6 및 TNF-α를 포함하는 염증성 사이토카인(cytokines) 생성 억제; 및
ⅳ) IκB-α 인산화 억제 및 p65 전위 억제를 통한 NF-κB 활성 억제;를 통해 신경염증을 조절할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일구현예에서는, 해방풍 열수 추출물, 30% 에탄올 추출물 및 50% 에탄올 추출물을 제조한 다음, 이들의 효능을 비교한 결과, 해방풍을 50% 에탄올 추출물로 추출하였을 때, 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량이 가장 높았으며(표 1), 세포 독성 없이 효과적으로 신경염증을 억제하는 것을 확인하였다 (도 1a). 또한, 해방풍 50% 에탄올 추출물 농도 의존적으로, LPS-자극된 BV-2 세포에서 NO 발생 억제(도 1b), iNOS 및 COX-2 생성 억제(도 2a), MAPK 경로 관련 인자들의 인산화 억제(도 2b), NF-κB(p65) 및 IκB-α의 인산화 억제(도 3a), 인산화된 NF-κB(p-p65)의 핵으로의 전위 억제(도 3b), IL-6 및 TNF-α를 포함하는 염증성 사이토카인 생성억제(도 4) 효능을 보이는 것을 확인하였다.
본 발명의 구체적인 다른 일구현예에서, 해방풍 50% 에탄올 추출물로 부터 분획물을 추출한 결과, 에틸아세테이트 분획물에 의한 NO 생성 억제 효능이 가장 우수한 것을 확인하였다 (도 6). 또한, 에틸아세테이트 분획물 농도 의존적으로, LPS-자극된 BV-2 세포에서 iNOS 및 COX-2 생성 억제(도 7a), MAPK 경로 관련 인자들의 인산화 억제(도 7b), NF-κB(p65) 및 IκB-α의 인산화 억제(도 8a), 인산화된 NF-κB(p65)의 핵으로의 전위 억제(도 8b), IL-6 및 TNF-α를 포함하는 염증성 사이토카인 생성억제(도 9) 효능을 보이는 것을 확인하였다.
본 발명의 구체적인 또 다른 일구현예에서, 해방풍 50% 에탄올 추출물 성분을 분석한 결과, 페닐알라닌(Phenylalanine), 트립토판(Tryptophan), 클로로겐산(Chlorogenic acid), 루틴(Rutin), 이소퀘르세틴(isoquercetin), 또는 루테올린-7-루티노사이드(Luteolin-7-rutinoside) 성분이 포함된 것을 확인하였으며, 그 중 루틴 및 클로로겐산이 주요 화합물임을 확인하였다 (표 2). 또한, 루틴 농도 의존적으로 LPS-자극된 BV-2 세포에서 세포 독성 없이 NO 생성(도 11a) 및 iNOS 및 COX-2 단백질 발현을 억제(도 11b)하는 것을 확인하였다.
즉, 본 발명의 해방풍 추출물 및 이의 분획물의 신경염증억제 활성은 루틴과 연관이 있는 것으로 판단된다.
본 발명에 있어서, 상기 신경염증 질환은 다발성 경화증, 신경모세포종, 허혈성 뇌졸중, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 루게릭 질환, 헌팅턴 질환, 크로이츠펠트야콥병, 외상 후 스트레스 장애, 우울증, 정신분열증, 근위축성측색경화증 또는 경도 인지장애로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
기억력 및 인지기능 장애 예방, 개선 또는 치료용 조성물
본 발명은 또 다른 일관점에서, 해방풍 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 기억력 및 인지기능 장애 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 일관점에서, 해방풍 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 기억력 및 인지기능 장애 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 해방풍 추출물은 에탄올, 바람직하게는 50%(v/v) 에탄올을 용매로 하여 추출한 것을 특징으로 할 수 있으나, 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라, 즉, 통상적인 온도와 압력의 조건 하에서, 통상적인 용매를 사용하여 제조될 수 있으며, 바람직하게는 정제수(또는 물), 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 글리세린, 에틸아세테이트, 아세톤, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디클로로메탄, 클로로포름, 에틸에테르, 부틸렌글라이콜, 헥산 및 이들의 혼합용매으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 용매를 사용하여 추출할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 해방풍 추출물 또는 이의 분획물은 전체 조성물에 10 ~ 500 ㎍/㎖ 농도로, 바람직하게는 50 ~ 450 ㎍/㎖ 농도로 포함될 수 있다. 상기 농도 범위 미만의 농도로 추출물이 포함되는 경우, 효과가 미미할 수 있으며, 상기 농도 범위를 초과하면 세포 독성이 나타날 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 분획물은 해방풍 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물일 수 있으며, 바람직하게는 (a) 해방풍 에탄올 추출물에서 헥산 용매를 첨가한 다음, 수상(aqueous phase)을 수득하는 단계;
(b) 상기 수상에 클로로포름 용매를 첨가한 다음, 수상을 수득하는단계; 및
(c) 상기 수상에 에틸아세테이트 용매를 첨가한 다음, 에틸아세테이트 분획물을 수득하는 단계;를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 해방풍 추출물 또는 이의 분획물에는 페닐알라닌(Phenylalanine), 트립토판(Tryptophan), 클로로겐산(Chlorogenic acid), 루틴(Rutin), 이소퀘르세틴(isoquercetin), 또는 루테올린-7-루티노사이드(Luteolin-7-rutinoside) 성분이 포함될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 콜린성 신경 기능 저하를 개선시킬 수 있으며, 상기 조성물은 해마 또는 대뇌 피질에서 ⅰ) 아세틸콜린에스터레이즈(acetylcholinesterase; AChE) 저해 활성 억제;
ⅱ) 산화적 손상 억제;
ⅲ) iNOS 또는 COX-2를 포함하는 염증성 인자의 발현 억제; 또는
ⅳ) BDNF 또는 pCREB를 포함하는 인지기능성 인자의 발현 증가;를 통해 기억력 및 인지기능을 개선시킬 수 있다.
본 발명의 구체적인 일구현예에서, 스코폴라민 유발 기억상실 마우스 모델에 해방풍 50% 에탄올 추출물을 투여한 결과, 스코폴라민에 의해 유도되었던 기억력 및 인지 기능 장애가 개선되는 것을 확인하였다 (도 13, 도 14a ~ 도 14c). 또한, 대뇌 피질 및 해마에서 해방풍 50% 에탄올 추출물 농도 의존적으로 아세틸콜린에스터레이즈 활성 억제(도 15), Nrf-2 및 HO-1 생성 억제를 통한 산화적 손상 억제(도 16), BDNF- pCREB 경로 활성화를 통한 인지 기능 개선(도 17), iNOS 및 COX-2 생성 억제(도 18), NF-κB(p65) 및 IκB-α의 인산화 억제(도 19), MAPK 경로 관련 인자들의 인산화 억제(도 20) 효능이 나타나는 것을 확인하였다.
즉, 본 발명의 해방풍 추출물 또는 이의 분획물은 알츠하이머 유발 동물 모델의 기억력 및 인지 기능 장애가 개선되는 것을 확인하였으므로, 기억력 및 인지 기능 장애 예방, 개선 또는 치료용 조성물로 활용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 기억력 또는 인지 기능 장애는 콜린성 신경계 저하로 유발되는 질병일 수 있으며, 구체적으로 경도인지장애, 주의력 결핍장애(ADHD), 우울증, 알츠하이머병, 치매, 노인성 치매, 픽(pick)병 및 크루츠펠트-야곱(Creutzfeldt-jakob)병으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 다양한 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 예컨대, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 경구형 제형으로 제형화할 수 있고, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 각각의 제형에 따라 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 외용제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유 등이 있다. 상기 약학 조성물을 제제화나 제형화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로오스(sucrose), 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 본 발명의 약학 조성물을 제공하는 것을의미한다. 본 발명은 약학 조성물은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양, 즉 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양인 치료상 유효량으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에 대한 치료상 유효 투여량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여시간, 투여 경로 및 조성물의분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자 등에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 예를 들어, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 구강, 심장내, 골수내, 경막내, 경피, 장관, 피하, 설하 또는 국소 투여할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 약학 조성물은 1 ~ 10,000㎎/㎏/일의 양으로 투여할 수 있으며, 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수 회에 나누어 투여할 수도 있다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 건강기능식품, 식품 첨가제 또는 식이보조제로 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물을 식품 첨가제로 사용할 경우, 그대로 첨가하거나, 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 혼합하여 사용되는 등 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.
또한 상기 건강기능식품 조성물의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 변경될 수 있다. 구체적인 예로, 식품 또는 음료의 제조 시에는 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15중량% 이하, 바람직하게는 10중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하여 장기간 섭취할 경우에는 상기 범위 이하의 양으로 첨가될 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없으나, 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료, 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
본 발명의 건강기능식품 조성물이 음료로 제조될 경우 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등의 추가 성분을 포함할 수 있다. 상기 천연 탄수화물로는 포도당, 과당 등의 모노사카라이드; 말토오스, 수크로오스 등의 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린 등의 천연 감미제; 사카린, 아스파르탐 등의 합성 감미제 등이 사용될 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 본 발명의 식품 조성물 총 중량에 대하여 0.01 ~ 10중량%, 바람직하 게는 0.01 ~ 0.1중량%로 포함된다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있으며, 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 상기의 첨가제 비율은 크게 제한되지는 않으나, 본 발명의 식품 조성물 총 중량에 대하여 0.01 ~ 0.1중량% 범위내로 포함되는 것이 바람직하다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.
이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
해방풍 추출물 제조 및 총 폴리페놀/총플라보노이드 함량 측정
1-1 : 추출물 제조
해방풍은 울진(한국)에서 구매하였으며, 해방풍 추출물은 열수 추출물(GLW), 30% 에탄올 추출물(GLE-30) 및 50% 에탄올 추출물(GLE-50)로 준비하였다.
구체적으로, 열수 추출물은 해방풍을 씻어 건조한 후 분쇄하여 사용하였으며, 건조된 해방풍 50g에 물 1 ℓ를 넣고 100℃에서 2시간 동안 추출하였다.
에탄올 추출물은 30%(v/v) 에탄올 또는 50%(v/v) 에탄올을 첨가하고 초음파로 각각 1시간씩 2회 추출하였다.
그 다음, 열수 추출물 및 에탄올 추출물은 각각 여과지(Whatman No.41, Whatman International Limited, 영국)로 여과하고 회전식 진공 증발기(N-1000, EYELA Co., 일본)를 사용하여 농축한 다음, 진공 동결 건조기(일신연구소, 양주, 한국)를 사용하여 동결건조하여 해방풍 추출물을 제조하였다.
1-2 : 총 폴리페놀 함량 측정
해방풍 추출물의 총 폴리페놀 함량은 폴린-시오칼테우(Folin-Ciocalteu) 방법을 사용하여 측정하였다.
간략하게, 깨끗한 시험관에서 0.2 ㎖의 용매 추출물 및 0.8 ㎖의 증류수를 혼합한 다음, 50% Folin-Ciocalteu 시약 0.6 ㎖를 첨가하고 5분 동안 반응시켰다. 반응 혼합물에 0.5 M 탄산나트륨(1 ㎖)을 첨가하고 730 nm에서 발색을 관찰하였다. 총 페놀 함량은 추출물 그램당 갈산 당량 밀리그램으로 표시하였다 (㎎ GAE/g 추출물).
1-3 : 총 플라보노이드 함량 측정
해방풍 추출물의 총 플라보노이드 함량은 다음과 같은 방법으로 측정하였다.
먼저, 식물 시료의 일부를 메탄올에 녹이고 용액의 부피를 3 ㎖이 되도록 한 다음, 0.1 ㎖ AlCl3(100 ㎎/㎖), 0.1 ㎖ 나트륨 칼륨(100 ㎎/㎖) 및 2.8 ㎖ 증류수를 순차적으로 첨가하였다. 혼합용액을 격렬하게 흔들어 준 다음, 30분 반응시킨 후 415 nm에서 흡광도를 측정하였다.
각 추출물의 플라보노이드 함량은 칼리브레이션 플랏(calibration plot)으로 계산되었으며, 시료 그램당 카테킨 당량 ㎎(㎎ CE/g 추출물)으로 표시하였다.
| Samples | Extraction yields (%, w/w) | Total polyphenol content (㎎ GAE/g extract) | Total flavonoid content (㎎ CE/g extract) |
| GLW | 33.54 | 35.245±0.969 | 12.103±0.362 |
| GLE-30 | 32.73 | 38.042±0.210 | 10.308±0.628 |
| GLE-50 | 30.98 | 49.907±0.704 | 19.026±2.538 |
그 결과, 건조 해방풍을 열수, 30% 에탄올 및 50% 에탄올로 추출하였을 때, 각각 33.54%, 32.73%, 30.98%의 수율로 시료를 획득하였다. 또한, 표 1에 나타난 바와 같이, 각 추출물의 총폴리페놀과 총플라보노이드함량을 측정한 결과 50% 에탄올로 추출하였을 때 총폴리페놀과 총플라보노이드함량이 가장 높은 것으로 나타났다.
LPS-자극된 미세아교세포에서 해방풍 추출물에 의한 NO 생성 억제 효능 확인
BV-2 미세아교세포는 5%(v/v) FBS 및 1%(v/v) 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 DMEM 배지에서 37℃, 5% CO2 조건으로 배양하였다. 70 ~ 80% 컨플루언스(confluence)로 자란 세포를 트립신(0.05% trypsin-EDTA) 처리하여 계대배양하였으며, 2일 간격으로 배지를 교환하였다. 각 실험은 통계적 분석을 위해 3번 반복 실험하였다. 각 실험에는 최소 3번의 계대배양된 세포가 사용되었다.
세포 생존율 및 산화질소(NO) 방출을 평가하기 위해, BV-2 세포를 24웰 플레이트에 8×104 개/웰이 되도록 500 ㎕의 DMEM에서 배양하였다. 세포가 부착된 후, 다양한 농도(12.5 ~ 500 ㎍/㎖)의 해방풍 추출물을 1시간 동안 전처리 한 다음, LPS(200 ng/㎖)를 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 그 후, Griess 시약을 사용한 비색 NO 방출 분석을 위해 배양 배지를 수득한 다음, 마이크로플레이트 리더(SunriseTM, Tecan Trading AG, 스위스)를 사용하여 UV 스펙트럼에서 550 nm에서 흡광도를 측정하였다.
세포 생존을 위해 MTT(5 ㎎/㎖)를 첨가하고 1시간 동안 배양한 다음, 배양액을 제거하고 400 ㎕의 DMSO를 첨가하여 포르마잔 결정을 용해시켰다. 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
해방풍 열수 추출물, 30% 에탄올 추출물 및 50% 에탄올 추출물을 이용하여 BV2세포에서 NO 생성량 및 세포생존율을 측정한 결과, 도 1a에 나타난 바와 같이, 해방풍 열수 추출물은 LPS로 유도된 NO 생성을 억제하지 못한 반면, 해방풍 30%에탄올 및 50% 에탄올 추출물을 세포 독성 없이 NO 생성이 억제되는 것을 확인하였다.
특히, 해방풍 50% 에탄올 추출물의 NO 생성 억제 효능이 가장 우수한 것을 확인하였으며, 도 1b에 나타난 바와 같이, 해방풍 50% 에탄올 추출물을 50 ~ 500 ㎍/㎖ 농도로 처리한 결과, 400 ㎍/㎖, 450 ㎍/㎖, 500 ㎍/㎖의 농도에서 NO 생성 억제 효능이 유사한 것으로 확인되었다. 이에, 이후 실험에서는 400, 200, 100 ㎍/㎖ 농도의 해방풍 50% 에탄올 추출물을 사용하였다.
LPS-자극된 미세아교세포에서 해방풍 추출물에 의한 염증매개인자 및 MAPK 신호경로 억제 효능
3-1 : 염증매개인자 발현 억제 효능 확인
상기 실시예 2와 동일하게 BV-2 세포를 배양한 다음, 해방풍 50% 에탄올 추출물(100, 200, 400 ㎍/㎖)을 1시간 동안 전처리한 후, LPS(200 ng/㎖)를 처리하고 24시간 동안 BV-2 세포를 자극시킨 다음, 단백질을 분리하였다.
세포를 차가운 PBS로 2회 세척하고 용해 완충액(프로테아제 및 포스파타제 억제제(1:1) 칵테일을 함유하는 1x RIPA 용해 완충액)을 사용하여 용해시켰다. 동일한 단백질(20㎍/10㎕)을 8 ~ 15% SDS-PAGE(sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide electrophoresis) 겔에서 전기영동 한 다음, PVDF(polyvinylidene-difluoride) 막(Millipore, 미국)으로 트랜스퍼시켰다.
비특이적 결합을 방지하기 위해, 5% 탈지유(skim milk)로 상온에서 1시간 반응시킨 다음, 1차 항체인, 항-iNOS 항체(#A0312, ABclonal), 항-COX-2 항체(M-19 #sc1747, Santa Cruz biotechnology), 및 항-β-actin 항체(#C4; Santa Cruz Biotechnology)를 첨가하여 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 그 다음, 2차 항체인 항-마우스 항체 또는 항-래빗 항체(1:10,000)를 첨가하고 상온에서 반응시켰다. 멤브레인은 화학발광 검출 시스템(enhanced chemiluminescence detection system (LAS 500; GE Healthcare Bio-Sciences AB, 스웨덴)의 프로토콜에 따라 시각화하였다.
그 결과, 도 2a에 나타난 바와 같이, 해방풍 50% 에탄올 추출물 농도 의존적으로, LPS에 의해 발현이 유도된 iNOS 및 COX-2 발현이 억제되는 것을 확인하였다.
3-2 : MAPK 신호경로 억제 효능
MAPK 신호경로 억제 효능을 확인하기 위해, ERK, p38 및 JNK의 단백질 발현정도 및 인산화 정도를 측정하였다. 상기 3-1에서 분리한 단백질을 이용하여 웨스턴 블랏을 수행하였으며, 1차 항체로 항-p38 항체(#9212S, cell signaling), 항-p-p38 항체(#9201S, cell signaling), 항-JNK 항체(#9253S, cell signaling), 항-p-JNK 항체(#9251S, cell signaling), 항-ERK 항체(#91012S cell signaling), 항-p-ERK 항체(#9101S, cell signaling) 및 항-β-actin 항체(#C4; Santa Cruz Biotechnology)를 이용하였다.
그 결과, 도 2b에 나타난 바와 같이, 해방풍 50% 에탄올 추출물 농도 의존적으로 MAPK 신호전달인자인 ERK, JNK 및 p38의 인산화를 감소시키는 것을 확인하였다.
LPS-자극된 미세아교세포에서 해방풍 추출물에 의한 NF-κB 활성 억제 효능 확인
본 발명에서는 해방풍 추출물에 의해 전사 인자 NF-κB의 핵 전위가 억제되는지 확인하였다. 상기 3-1에서 분리한 단백질을 이용하여 웨스턴 블랏을 수행하였으며, 1차 항체로 항-NF-κB/p65 항체(F-6 #sc-8008, Santa Cruz biotechnology), 항-p-NF-κB/pp65 항체(#3033S, cell signaling), 항-IκB-α 항체(#4812S, cell signaling), anti-p-IκB 항체(#2859S, cell signaling) 및 항-β-actin 항체(#C4; Santa Cruz Biotechnology)를 이용하였다.
그 결과, 도 3a에 나타난 바와 같이, LPS를 처리한 세포에서는 인산화된 NF-κB(p65)의 발현이 증가한 반면, 해방풍 50% 에탄올 추출물 농도의존적으로 인산화된 p65의 발현이 감소되었다. 또한, 인산화된 IκB-α는 LPS 처리시 단백질 발현이 증가한 반면, 해방풍 50% 에탄올 추출물 농도의존적으로 감소되는 것을 확인하였다.
세포 상에서 NF-κB의 핵 전위 정도를 관찰하기 위해, 면역형광염색을 수행하였으며, 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 세포를 배양한 다음, 차가운 PBS로 1회 세척하고, 차가운 4% PFA로 고정하였다. 그 다음 세포를 상온에서 10분 동안 0.1%(v/v) Triton X-100으로 투과시킨 후 2번 세척하고, 2 ㎍/㎖의 1차 항체(항-pNF-κB 항체)를 첨가하고 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 다음날, 세포를 상온에서 1시간 동안 2차 항체(chicken anti-rabbit secondary antibody; CAR-594;A21201 Invitrogen)로 대조염색한 다음, DAPI(2 ㎍/㎖)로 세포를 염색하였다. 형광 현미경을 사용하여 이미지를 캡처하고 NIS-Elements 소프트웨어(BR-2.01.00, NY 11747-3064, 미국)으로 분석하였다.
그 결과, 도 3b에 나타난 바와 같이, LPS를 처리하지 않은 BV2 세포(대조군)에서는 NF-κB의 발현은 대부분 세포질에서 나타났지만, LPS 처리군에서 NF-κB p65 서브유닛(subunit)의 발현이 세포질 내에서 현저히 감소하였으며, 핵 내에서의 발현이 증가되어 LPS 처리에 의하여 NF-κB가 핵 내로 이동되었음을 확인하였다.
반면, 해방풍 50% 에탄올 추출물 처리에 의해 LPS에 의한 NF-κB의 핵으로의 전위가 현저하게 억제되었다. 상기 결과는 해방풍 50% 에탄올 추출물에 의해 LPS에 의한 NF-κB 단백질의 핵 내 이동이 억제되고, LPS에 의해 유도되는 주요 염증신호 전달경로인 NF-κB 경로가 억제됨을 의미한다.
LPS-자극된 미세아교세포에서 해방풍 추출물에 의한 염증성사이토카인 생성 억제
염증성 사이토카인인 IL-6 및 TNF-α 방출 수준은 Cytokine ELISA 키트(BD OptEIA, BD Biosciences, 미국)을 이용하여 매뉴얼에 따라 측정하였다.
상기 실시예 2와 동일하게 BV-2 세포를 배양한 다음, 해방풍 50% 에탄올 추출물(100, 200, 400 ㎍/㎖)을 1시간 동안 전처리한 후, LPS(200 ng/㎖)를 처리하고 18시간(IL-6) 또는 6시간(TNF-α) 동안 BV-2 세포를 자극시킨 다음, 방출된 IL-6 및 TNF-α 농도를 측정하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 해방풍 50% 에탄올 추출물 농도 의존적으로 IL-6 및 TNF-α 생성량이 유의하게 감소되는 것을 확인하였다.
해방풍 에탄올 추출물 유래 분획물 제조 및 효능 확인
6-1 : 분획물 제조
도 1에 나타난 모식도와 같은 방법으로, 해방풍 50% 에탄올 추출물로부터 헥산 분획물, 클로로포름 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물, 및 물 분획물을 수득하였다.
구체적으로, 해방풍 50% 에탄올 추출물 20 g에 각각의 분획용매를 200 ㎖씩 혼합한 다음, 혼합물을 강하게 섞은 후 정치시켜 층별 분리를 3번씩 하였다. 용매별 분획물은 감압농축한 후 동결건조하여 시료로 사용하였다.
6-2 : NO 생성 및 세포 생존율 확인
상기 실시예 2와 동일하게 BV-2 세포를 배양한 다음, 해방풍 50% 에탄올 추출물, 핵산 분획물, 클로로포름 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물 및 물 분획물이 각각 12.5, 25, 50 ㎍/㎖ 농도가 되도록 1시간 동안 전처리한 후, LPS(200 ng/㎖)를 처리하고 24시간 동안 BV-2 세포를 자극시킨 다음, 실시예 2와 동일한 방법으로 NO 생성 및 세포생존율을 측정하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 헥산 분획물, 클로로포름 분획물 및 에틸아세테이트 분획물에서 NO 생성량이 감소하였으나, 헥산 분획물 및 클로로포름 분획물은 세포 생존율이 현저히 낮았기 때문에 세포독성으로 인하여 NO 생성이 낮은 것으로 확인되었다. 따라서, 에틸아세테이트 분획물이 세포 독성이 없으면서 NO 생성 억제 효능이 가장 우수한 것으로 확인되었으며, 12.5 ~ 50 ㎍/㎖ 저농도에서는 해방풍 50% 에탄올 추출물보다 NO 생성 억제 효능이 더 우수한 것으로 확인되었다.
6-3 : iNOS 및 COX-2 생성 억제 및 MAPK 경로 관련 인자들의 인산화 억제 효능 확인
상기 실시예 2와 동일하게 BV-2 세포를 배양한 다음, 해방풍 에틸아세테이트 분획물 (12.5 ~ 50 ㎍/㎖)을 1시간 동안 전처리한 후, LPS(200 ng/㎖)를 처리하고 18시간(iNOS 및 COX-2) 또는 30분(MAPK) 동안 BV-2 세포를 자극시킨 다음, 단백질을 분리하였다. 그 후, 상기 실시예 3-1 및 실시예 3-2와 동일한 방법으로 웨스턴 블랏을 수행하였다.
그 결과, 도 7a 및 도 7b에 나타난 바와 같이, 에틸아세테이트 분획물이 농도 의존적으로, LPS-자극된 BV-2 세포에서 iNOS 및 COX-2 생성을 억제하고, MAPK 경로 관련 인자들의 인산화를 억제하는 것을 확인하였다.
6-4 : NF-κB 활성 억제 효능 확인
상기 실시예 2와 동일하게 BV-2 세포를 배양한 다음, 해방풍 에틸아세테이트 분획물(12.5 ~ 50 ㎍/㎖)을 1시간 동안 전처리한 후, LPS(200 ng/㎖)를 처리하고 15분 동안 BV-2 세포를 자극시킨 다음, 단백질을 분리하였다. 그 후, 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 NF-κB 활성 억제 정도를 확인하였다.
그 결과, 도 8a 및 도 8b에 나타난 바와 같이, 해방풍 에틸아세테이트 분획물 농도 의존적으로, NF-κB(p65) 및 IκB-α의 인산화가 억제되었으며, LPS로 유도된 BV2 세포의 세포질에서 인산화된 형태인 p-IκB-α와 세포핵 내에서의 NF-κB p65 단백질의 발현이 유의하게 억제된 것을 확인하였다.
6-5 : 염증성 사이토카인 발현 억제 효능 확인
상기 실시예 2와 동일하게 BV-2 세포를 배양한 다음, 해방풍 에틸아세테이트 분획물 (12.5 ~ 50 ㎍/㎖)을 1시간 동안 전처리한 후, LPS(200 ng/㎖)를 처리하고 18시간(IL-6) 또는 6시간(TNF-α) 동안 BV-2 세포를 자극시킨 다음, 상기 실시예 5와 동일한 방법으로 방출된 IL-6 및 TNF-α 농도를 측정하였다.
그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, 해방풍 에틸아세테이트 분획물 농도 의존적으로 IL-6 및 TNF-α를 포함하는 염증성 사이토카인 생성이 억제되는 것을 확인하였다.
해방풍 에탄올 추출물 성분 분석
본 발명에서는 해방풍 50% 에탄올 추출물의 성분을 분석하기 위해, 초고성능 액체 크로마토그래피-질량 분석법(Ultra High-Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry, UHPLC-MS)을 사용하여 주요 화합물을 측정하였다. LC/MS 분석은 Accelar 초고압 액체 크로마토그래피 시스템(Thermo Fisher Scientific)에 연결된 LTQ Orbitrap XL(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 수행하였다.
대사 산물의 크로마토그래피 분리는 ACQUITY UPLC®BEH C18 컬럼(2.1 × 150 mm, 1.7 ㎛)을 사용하고 40℃에서 작동하고 이동상 A(0.1% 포름산이 포함된 물) 및 B(0.1% 포름산이 포함된 아세토니트릴)를 사용하여 수행하였다. 용매 구배 조건은 다음과 같다: 0 ~ 1 분에서 5% B, 1 ~ 20 분에서 5 ~ 70% B, 20 ~ 24 분에서 70 ~ 100% B, 24 ~ 27 분에서 100% B.
각 화합물은 200 ~ 500 nm에서 포토다이오드 어레이로 검출하였다. LC-MS 시스템은 이온화 소스로 가열된 전자분무 이온화 프로브(HESI-II)로 구성되었다. HESI는 5.0kV의 분무 전압으로 300℃에서 작동되었으며, 분무기 덮개 및 보조 가스 유량은 각각 50 및 5 arb로 설정되었다. MS 분석은 극성 전환 및 MS/MS 스캔에 대한 다음 매개변수로 수행되었다: 100 ~ 1,500의 m/z 범위; 45%의 충돌 유도 해리 에너지(collision-induced dissociation energy of 45%); 데이터 종속 스캔 모드(data-dependent scan mode).
분석기는 30,000 FWHM의 질량 분해능으로 고해상도 질량 스펙트럼 데이터 수집에 사용되었으며, Xcalibur 시스템(Thermo Fisher Scientific)과 함께 제공되는 메뉴 구동 소프트웨어를 사용하여 데이터 의존적 직렬 질량 분석(MS/MS) 실험을 제어하였다.
| RT (min) | m/z ([M+H]+) | Calculated Formula ([M+H]+) | Δppm | Identification compounds |
| 3.23 | 166.0860 | C9H12O2N | -1.657 | Phenylalanine |
| 4.5 | 205.0969 | C11H13O2N2 | -1.142 | Tryptophan |
| 5.24 | 355.1026 | C16H19O9 | 0.680 | Chlorogenic acid |
| 7.21 | 611.1601 | C27H31O16 | -0.984 | Rutin |
| 7.49 | 465.1023 | C21H21O12 | -0.994 | Hyperoside or isoquercetin |
| 7.86 | 595.1654 | C27H31O15 | -0.565 | Luteolin-7-rutinoside or Kaempferol-3-rutinoside |
상기 표 2에 나타난 바와 같이, 해방풍 50% 에탄올 추출물을 LC-MS를 이용하여 주성분을 분석한 결과, 페닐알라닌(Phenylalanine), 트립토판(Tryptophan), 클로로겐산(Chlorogenic acid), 루틴(Rutin), 이소퀘르세틴(isoquercetin), 및 루테올린-7-루티노사이드(Luteolin-7-rutinoside)과 같이 6개의 물질을 분석하였으며 그 중 루틴(rutin)과 클로로겐산(Chlorigenic acid)이 주요 물질인 것을 확인하였다. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 루틴을 정량하였으며, 해방풍 50% 에탄올 추출물 및 에틸아세테이트 분획물에 포함된 루틴 함량을 자외선(UV) 검출이 가능한 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 수행하였다. 이동상은 용매 A(DW 중 0.5% 인산) 및 용매 B(메탄올)로 구성되어 있으며 다음과 같은 용출 프로파일을 가지고 있다: 0-5분, 30% B; 5-10분, 30-35% B; 10-15분, 35-40%; 15-18분, 40-50% B; 18-25분, 55-30%. 유속은 1.0 ㎖/min이고 파장은 254 nm으로 수행하였다.
루틴 함량을 분석한 결과, 해방풍 50% 에탄올 추출물에는 2.46±0.14%, 에틸아세테이트분획물에는 26.5±2.26%의 루틴이 포함된 것을 확인하였다.
LPS-자극된 미세아교세포에서 루틴에 의한 신경염증 억제 효능 확인
본 발명에서는 해방풍 추출물의 주성분 중에 하나인 루틴을 이용하여 BV 세포에서 NO 생성 정도 및 세포생존율을 측정하였다.
상기 실시예 2와 동일하게 BV-2 세포를 배양한 다음, 루틴(12.5μM ~ 500μM)을 1시간 동안 전처리한 후, LPS(200 ng/㎖)를 처리하고 24시간 동안 BV-2 세포를 자극시킨 다음, 실시예 2와 동일한 방법으로 NO 생성 및 세포생존율을 측정하였다.
그 결과, 도 11a 및 도 11b에 나타난 바와 같이, 루틴 농도 의존적으로 LPS-자극된 BV-2 세포에서 세포 독성 없이 NO 생성 및 iNOS 및 COX-2 단백질 발현을 억제하는 것을 확인하였으며, 이는 해방풍 추출물 및 에틸아세테이트 분획물의 염증억제 활성은 루틴과 연관이 있는 것으로 판단된다.
스코폴라민에 의해 유발된 인지 장애 질환 동물모델에서 해방풍 추출물의 기억력 증진 및 인지기능 개선 효능 확인
9-1 : 동물 준비 및 약물 투여
수컷 C57BL/6 마우스(8주령, 체중 20 ~ 25g, n=6)는 대한민국 대한바이오링크에서 구입하였으며, 모든 실험은 건국대학교의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았다.
모든 동물을 7일 동안 순응시켰으며, 동물은 통제된 환경과 조명(12/12 암/광 주기)에 수용되었고 동물은 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있었다.
하기 그룹당 6마리씩 되도록 무작위로 마우스를 나누었으며, 해방풍 에탄올 추출물(GLME)은 14일 동안 경구 투여하였다. 스코폴라민(Scopolamine; 1 ㎎/kg)은 연속 7일 동안 복강 내 투여하였다.
그룹 1) 대조군(무처리군)
그룹 2) 스코폴라민 1 ㎎/kg 투여군
그룹 3) 해방풍 에탄올 추출물 50 ㎎/kg + 스코폴라민 1 ㎎/kg 투여군
그룹 4) 해방풍 에탄올 추출물 100 ㎎/kg + 스코폴라민 1 ㎎/kg 투여군
그룹 5) 해방풍 에탄올 추출물 200 ㎎/kg + 스코폴라민 1 ㎎/kg 투여군
그룹 6) DNZ(donepezil) 5 ㎎/kg + 스코폴라민 1 ㎎/kg 투여군 (양성대조군)
9-2 : Y-미로 테스트
각 팔이 120°각도로 분리된 3개의 동일한 팔이 있는 'Y'자 모양의 미로를 사용하였으며, 마우스를 미로의 중앙에 배치하고, 이동 대기 시간 및 다른 팔로의 변경된 진입을 5분 동안 기록하였다. 기억력이 손상되지 않은 마우스는 최근에 입력한 팔을 다시 방문하는 데 덜 관심을 보여야 하지만 기억력이 손상된 마우스는 다시 방문하는 데 높은 관심을 보여야 한다.
그 결과, 도 13에 나타난 바와 같이, Y-미로에서의 각 가지를 방문한 총 횟수 (total entry)를 비교하였을 때는 유의성의 차이를 보이지 않았으나, 해방풍 추출물 투여군에서 변경 행동력의 유의적인 변화가 관찰되었으며 양성 대조군인 도네페질(donepezil) 투여군과 유사한 결과가 관찰되었다. 이러한 마우스의 변경 행동력 증가는 스코폴라민에 의해 손상된 기억력이 해방풍 추출물 투여로 회복되었음을 의미한다.
9-3 : 모리스 물 미로 테스트
마우스의 공간 기억을 평가하기 위해, 모리스 물 미로 테스트(Morris water maze; MWM)를 수행하였으며, 마우스는 탐색기술에 의존하여 물에 잠긴 탈출 플랫폼을 찾게된다. 이 테스트는 플랫폼이 숨겨진 원형 풀(122 cm)을 사용하였으며, 마우스가 시작 위치에서 숨겨진 플랫폼으로 가는 짧고 직접적인 경로를 찾도록, 약물 투여전 2일 동안 2시간 간격으로 2회의 연속 훈련을 수행하였다. 약물 투여 후, 미로 테스트를 수행한 다음, SMART 3.0 소프트웨어(Ver. 3.0, Harvard Apparatus, Holliston, MA 01746, 미국)를 사용하여 공간 획득을 측정하고 데이터를 분석하였다.
그 결과, 도 14a ~ 도 14c에 나타난 바와 같이, 스코폴라민을 투여하였을 때, 찾는 시간과 거리가 현저하게 증가한 반면, 해방풍추출물 투여군에서는 플랫폼 찾는 시간과 거리가 현저하게 감소되는 것을 확인하였다.
스코폴라민에 의해 유발된 인지 장애 질환 동물모델에서 해방풍 추출물의 아세틸콜린에스터레이즈 활성 억제 효능 확인
본 발명에서는 상기 실시예 9-1의 마우스 뇌에서 추출한 해마(Hippocampus)와 대뇌피질(Cerebral cortex) 조직에서 아세틸콜린에스터레이즈(acetylcholinesterase; AChE) 활성을 확인하였다. 해마 및 대뇌피질 조직을 분리한 다음, 분광광도법으로 AChE 활성을 측정하였다. 각각 기질로서 아세틸콜린 요오드화합물이 포함되었으며, 티오콜린(thiocholin) 생성 속도는 DTNB(5,5-dithiobis-2-nitrobenzoate) 이온과 티올의 연속 반응에 의해 결정되어 5-티오-2-니트로벤조산(5-thio-2-nitrobenzoic acid)의 황색 음이온을 생성하였다. 혼합물의 흡광도를 412 nm에서 5분 동안 30초 간격으로 판독한 후 즉시 기질을 첨가하고 억제율을 계산하였다.
그 결과, 도 15에 나타난 바와 같이, 스코폴라민 투여 마우스의 뇌의 해마(hippocampus) 및 대뇌피질(cortex)에 서 아세틸콜린에스터레이즈의 활성을 확인한 결과, 스코폴라민 투여에 의해 아세틸콜린에스터레이즈의 활성이 증가된 반면, 해방풍추출물 투여에 의해 해마 및 대뇌피질에서 아세틸콜린에스터레이즈의 활성이 현저하게 억제되는 것을 확인하였다.
스코폴라민에 의해 유발된 인지 장애 질환 동물모델에서 해방풍 추출물의 산화적 손상 억제 확인
본 발명에서는 해방풍 에탄올 추출물 의해 스코폴라민에 의해 유발된 인지 장애 질환 동물모델에서 산화적 손상이 억제되는지 확인하였다.
상기 실시예 9-1의 마우스 뇌에서 추출한 해마 및 대뇌피질 조직에서 단백질을 각각 분리한 다음, 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 웨스턴 블랏을 수행하여 Nrf2/HO-1 단백질 발현정도를 측정하였다.
그 결과, 도 16에 나타난 바와 같이, 스코폴라민을 투여한 마우스 뇌의 해마(hippocampus) 및 대뇌피질(cortex)에서 Nrf-2 및 HO-1 단백질 생성이 억제되어 산화적 손상이 유도되었지만, 해방풍 에탄올 추출물 투여에 의해 Nrf-2 및 HO-1 단백질 생성 증가되는 것을 확인하였다. 이는 해방풍 에탄올 추출물이 산화적 손상을 억제하는 것을 의미한다.
스코폴라민에 의해 유발된 인지 장애 질환 동물모델에서 해방풍 추출물의 BDNF - pCREB 경로 활성화 확인
본 발명에서는 해방풍 에탄올 추출물 의해 스코폴라민에 의해 유발된 인지 장애 질환 동물모델에서 BDNF - pCREB 경로가 활성화되는지 확인하였다.
상기 실시예 9-1의 마우스 뇌에서 추출한 해마 및 대뇌피질 조직에서 단백질을 각각 분리한 다음, 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 웨스턴 블랏을 수행하였으며, 1차 항체는 항-pCREB 항체(#87G3; cell signaling technology), 항-BDNF 항체(#ab226843; abcam), 또는 항-β-actin 항체(#C4; Santa Cruz Biotechnology)를 사용하였다.
그 결과, 도 17에 나타난 바와 같이, 스코폴라민을 투여한 마우스 뇌의 해마(hippocampus) 및 대뇌피질(cortex)에서 p-CREB 및 BDNF 발현이 감소된 반면, 해방풍 에탄올 추출물 투여에 의해 p-CREB 및 BDNF 발현이 현저하게 개선되는 것을 확인하였다. 이는 해방풍추출물에 의해 BDNF-CREB 경로가 활성화되어 인지기능이 개선된다는 것을 의미한다.
스코폴라민에 의해 유발된 인지 장애 질환 동물모델에서 해방풍 추출물의 신경염증 억제 효능 확인
본 발명에서는 해방풍 에탄올 추출물 의해 스코폴라민에 의해 유발된 인지 장애 질환 동물모델에서 신경염증이 억제되는지 확인하였다.
13-1 : iNOS 및 COX-2 생성 억제 효능
상기 실시예 9-1의 마우스 뇌에서 추출한 해마 및 대뇌피질 조직에서 단백질을 각각 분리한 다음, 상기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 웨스턴 블랏을 수행하였다.
그 결과, 도 18에 나타난 바와 같이, 스코폴라민을 투여한 마우스 뇌의 해마(hippocampus) 및 대뇌피질(cortex)에서 신경염증마커인 iNOS와 COX-2 단백질 발현이 증가하였지만, 해방풍추출물을 투여한 군에서는 iNOS와 COX-2 단백질 발현이 유의적으로 감소하였다.
13-2 : NF-κB 활성 억제 효능
상기 실시예 9-1의 마우스 뇌에서 추출한 해마 및 대뇌피질 조직에서 단백질을 각각 분리한 다음, 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 웨스턴 블랏을 수행하였다.
그 결과, 도 19에 나타난 바와 같이, 스코폴라민을 투여한 마우스 뇌의 해마(hippocampus) 및 대뇌피질(cortex)에서 IκB-α 인산화가 증가한 반면, 해방풍 에탄올 추출물을 투여한 군에서는 IκB-α 인산화를 억제하여, 신경 염증기전인 NF-κB의 활성을 억제시키는 것을 확인하였다.
13-3 : MAPK 신호경로 억제 효능
상기 실시예 9-1의 마우스 뇌에서 추출한 해마 및 대뇌피질 조직에서 단백질을 각각 분리한 다음, 상기 실시예 3-2와 동일한 방법으로 웨스턴 블랏을 수행하였다.
그 결과, 도 20에 나타난 바와 같이, 스코폴라민을 투여한 마우스 뇌의 해마(hippocampus) 및 대뇌피질(cortex)에서 인산화된 JNK, ERK, p38가 증가하였지만, 해방풍 에탄올 추출물을 투여한 군에서는 JNK, ERK, p38의 인산화를 유의하게 억제하였다. 이는 해방풍추출물이 MAPK 신호전달 경로를 통하여 신경 염증억제 효능을 가지고 있음을 의미한다.
Claims (12)
- 해방풍 추출물 또는 이의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는, 경도인지장애 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 해방풍 추출물은 해방풍 30%(v/v) ~ 50%(v/v) 에탄올 추출물인 것을 특징으로 하는, 경도인지장애 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 에틸아세테이트 분획물은 (a) 해방풍 에탄올 추출물에서 헥산 용매를 첨가한 다음, 수상(aqueous phase)을 수득하는 단계;
(b) 상기 수상에 클로로포름 용매를 첨가한 다음, 수상을 수득하는단계; 및
(c) 상기 수상에 에틸아세테이트 용매를 첨가한 다음, 에틸아세테이트 분획물을 수득하는 단계;를 포함하는 방법으로 제조되는 것을 특징으로 하는, 경도인지장애 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 해방풍 추출물 또는 이의 에틸아세테이트 분획물은 페닐알라닌(Phenylalanine), 트립토판(Tryptophan), 클로로겐산(Chlorogenic acid), 루틴(Rutin), 이소퀘르세틴(isoquercetin), 및 루테올린-7-루티노사이드(Luteolin-7-rutinoside)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는, 경도인지장애 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 해방풍 추출물 또는 이의 에틸아세테이트 분획물은 콜린성 신경 기능 저하를 개선시키는 것을 특징으로 하는, 경도인지장애 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 해방풍 추출물 또는 이의 에틸아세테이트 분획물은 해마 또는 대뇌 피질에서 ⅰ) 아세틸콜린에스터레이즈(acetylcholinesterase; AChE) 저해 활성 억제;
ⅱ) 산화적 손상 억제;
ⅲ) iNOS 또는 COX-2를 포함하는 염증성 인자의 발현 억제; 또는
ⅳ) BDNF 또는 pCREB를 포함하는 인지기능성 인자의 발현 증가를 유도하는 것을을 특징으로 하는, 경도인지장애 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 해방풍 추출물 또는 이의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는, 경도인지장애 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 제7항에 있어서,
상기 해방풍 추출물은 해방풍 30%(v/v) ~ 50%(v/v) 에탄올 추출물인 것을 특징으로 하는, 경도인지장애 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 제7항에 있어서,
상기 에틸아세테이트 분획물은 (a) 해방풍 에탄올 추출물에서 헥산 용매를 첨가한 다음, 수상(aqueous phase)을 수득하는 단계;
(b) 상기 수상에 클로로포름 용매를 첨가한 다음, 수상을 수득하는단계; 및
(c) 상기 수상에 에틸아세테이트 용매를 첨가한 다음, 에틸아세테이트 분획물을 수득하는 단계;를 포함하는 방법으로 제조되는 것을 특징으로 하는, 경도인지장애 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 제7항에 있어서,
상기 해방풍 추출물 또는 이의 에틸아세테이트 분획물은 페닐알라닌(Phenylalanine), 트립토판(Tryptophan), 클로로겐산(Chlorogenic acid), 루틴(Rutin), 이소퀘르세틴(isoquercetin), 및 루테올린-7-루티노사이드(Luteolin-7-rutinoside)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는, 경도인지장애 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 제7항에 있어서,
상기 해방풍 추출물 또는 이의 에틸아세테이트 분획물은 콜린성 신경 기능 저하를 개선시키는 것을 특징으로 하는, 경도인지장애 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 제7항에 있어서,
상기 해방풍 추출물 또는 이의 에틸아세테이트 분획물은 해마 또는 대뇌 피질에서 ⅰ) 아세틸콜린에스터레이즈(acetylcholinesterase; AChE) 저해 활성 억제;
ⅱ) 산화적 손상 억제;
ⅲ) iNOS 또는 COX-2를 포함하는 염증성 인자의 발현 억제; 또는
ⅳ) BDNF 또는 pCREB를 포함하는 인지기능성 인자의 발현 증가를 유도하는 것을을 특징으로 하는, 경도인지장애 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
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