KR20120026010A - 미나리 추출물을 유효성분으로 함유하는 학습능력 또는 기억력 장애 예방 또는 치료용 조성물 및 그 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 미나리 추출물을 유효성분으로 함유하는 학습장애 또는 기억력 장애 예방 또는 치료용 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 식용으로 사용되는 향신채소 중 하나인 미나리에서 아세틸콜린에스터라제(AChE)의 활성을 억제하거나, 학습능력 또는 기억력 장애를 예방 또는 치료할 수 있는 유효성분을 추출하여 약학 조성물 또는 건강기능식품으로 활용하는 것이다.

Description

미나리 추출물을 유효성분으로 함유하는 학습능력 또는 기억력 장애 예방 또는 치료용 조성물 및 그 제조방법{Composition for treatment or prevention of learning or memory malfunctions comprising minari extract as a effective component and preparation method thereof}

본 발명은 미나리 추출물을 유효성분으로 함유하는 학습능력 또는 기억력 장애 예방 또는 치료용 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 식용으로 사용되는 향신채소 중 하나인 미나리, 특히 밭미나리에서 아세틸콜린에스터라제(AChE)의 활성을 억제하거나, 학습능력 또는 기억력 장애를 예방 또는 치료할 수 있는 유효성분을 추출하여 약학 조성물 또는 건강기능식품으로 활용하는 것이다.

미나리는 근채(芹菜), 수근(水芹), 수영(水英)이라고 불리고, 우리나라 전역에 자생하고 있으며 사할린섬, 중국대륙, 일본, 동남아시아, 오세아니아 등 아한대, 온대로부터 열대까지 널리 분포하는 향신채소이다.

미나리는 재배방식에 따라 논 미나리와 밭 미나리로 구분하는데, 논 미나리는 처음부터 수확시까지 논에 물을 가두어 재배한 미나리로 줄기를 잘라보면 안이 비어 있는 것으로 조직이 유연하며 물 미나리라고도 하고, 밭 미나리는 처음에는 논 미나리와 유사하게 수경재배하다가 나중에 물을 빼고 재배하는 것으로, 밭 상태로 관리하여 재배한다고 하여 밭 미나리라고 부르며, 줄기 안쪽이 비어 있지 않고 내용물이 꽉 차있는 것이다.

보통 미나리라고 칭하는 것은 논 미나리로서, 미나리는 동의보감에 황달, 부인병, 음주 후의 두통이나 구토에 효과적인 것으로 나오며, 최근의 각종 연구에 따르면 미나리에 플라보노이드(flavonods), 콜린(cholin) 정유가 포함되어 있고, 퀴놀린(quinoline)계의 알칼로이드(alkaloid)로 루타민(rutamin)과 r-파가린(r-pagarin), 쿠마린(cumarin) 등도 함유하고 있고, 이러한 성분들로 인하여 간 보호작용, 항돌연변이 및 항산화작용, 고혈압 치료효과뿐만 아니라 음주 후 숙취제거에 탁월한 효과가 있는 것으로 알려져 있다.

한편, 치매(dementia)란 뇌세포 사멸 및 기억력 감퇴 등 뇌기능의 전반적인 장애가 나타나는 것을 특징으로 하는 퇴행성 질환으로, 65세 이상인 사람들의 약 10%, 80세 이상의 노인들의 약 50% 이상에서 나타나는 것으로 추정된다. 최근 노령화 인구가 증가하게 되면서 그 발병속도는 더욱 급속하게 증가할 것으로 예상되므로, 치매는 현대사회의 심각한 사회적, 경제적 문제로 대두되고 있다.

치매의 원인은 다양해서 알츠하이머성 치매(Alzheimer's disease), 혈관성 치매, 기타 알콜 중독, 외상, 파킨슨병의 후유증으로 오는 치매로 구분된다. 치매 환자의 절반 이상에서 알츠하이머성 치매가 나타나고 있기 때문에, 치매에 대한 연구는 알츠하이머성 치매를 중점으로 하여 진행되고 있다.

알츠하이머성 치매의 발병기전은 명확하게 밝혀져 있지 않으나, 현재까지는 중추신경계에서 아세틸콜린 기능의 감소, 아밀로이드 베타(amyloid beta, Aβ) 단백질을 주성분으로 하는 노인반(senile plaque)의 뇌세포 내 침착, 또는 세포 외부의 과인산화된 타우 단백질을 주성분으로 하는 신경섬유덩어리(Neurofibrillary tangle)의 출현 등과 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있다.

기존에는 상기 원인 중 콜린성 신경계의 기능 저하와 기억력 저하 사이의 상관관계를 밝혀주는 연구결과가 많이 보고되었으므로, 콜린 신경계를 보충하고 개선함으로써 치매를 치료하고자 하는 노력이 계속되어 왔다.

따라서 기존의 치매 치료제는 뇌에서 아세틸콜린의 분해효소인 아세틸콜린 에스터라제(AchE)의 활성을 억제할 수 있는 아세틸콜린분해 억제제, 또는 아세틸콜린의 농도를 일정수준으로 유지해 줄 수 있는 아세틸콜린 합성전구체 및 아세틸콜린 수용체 활성제(Receptor agonist) 등의 물질들이 대부분이다.

그 예로, 아세틸콜린분해 억제제로는 FDA의 승인을 받아 국내에서도 시판사용중인 타크린(tacrine), 아리셉트(aricept) 및 갈란타민(galantamine), 아세틸콜린 합성전구체로는 레시틴(lecitin), 그리고 아세틸콜린 수용체 활성제로는 RS-86, 니코틴(nicotine) 등이 있다.

그러나 치매가 진행되면서 아세틸콜린성 신경세포 뿐 아니라 신경세포의 대다수를 차지하는 글루탐산성 신경세포들도 퇴화하기 때문에, 아세틸콜린의 활성 증진에 중점을 둔 상기 방법은 일시적이고 미약한 치매 예방 및 치료효과만을 거둘 뿐이다. 또한 타크린을 비롯한 대부분의 약물들은 심각한 간독성, 구토, 오심 또는 설사 등의 부작용 때문에 아직까지 그 사용 여부에 대해 논란의 여지가 많은 상태이다.

또한 현대사회는 복잡하고 전문화되는 추세이며 그에 따라 많은 정보량과 학습량이 요구되므로 효과적인 두뇌활동이 필요하게 되고 있다. 그러나 많은 사람들이 노화, 질병, 약물이나 스트레스에 의한 기억력의 감퇴로 고통받고 있으며 이러한 인간의 수명이 연장되어 감에 따라 고도의 정신활동이 요구되고 있다. 이러한 상황을 적절히 대처하기 위하여 두뇌를 맑게 하고 기억력을 증진시켜 정신활동을 필요로 하는 등의 노력이 다양하게 시도되고 있고 이러한 기능을 효과적으로 증진시킬 수 있는 의약품, 기능성 식품등의 개발이 당업계에 요구되고 있다.

따라서 민간이나 한방에서 널리 이용되어 별도의 부작용이 적은 천연물을 대상으로 효과적으로 학습능력 및 기억력을 증진시킬 수 있고, 학습장애 또는 기억력 장애를 예방하거나 치료하며, 아세틸콜린에스터라제(AChE)의 활성을 억제하는 활성을 가진 천연물을 검색하던 중 미나리 추출물, 특히 밭 미나리 추출물이 경구 투여시 상기 활성을 매우 현저히 나타냄을 확인하게 되어 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 천연물로부터 얻어지는 것으로 독성과 부작용이 거의 없고 강력한 항콜린에스터라제 효과를 가지며 학습능력이나 기억력 장애를 예방 또는 치료하는 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 미나리로부터 가장 높은 항콜리에스터라제 효과를 가지는 추출물의 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

또한 본 발명은 천연물로부터 얻어지는 것으로 독성과 부작용이 거의 없고 강력한 항콜린에스터라제 효과를 가지며 학습능력이나 기억력을 증진시키는 건강기능식품을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 미나리 추출물을 유효성분으로 하는 학습장애 또는 기억력 장애 예방 또는 치료용 약학 조성물을 특징으로 한다.

본 발명의 학습장애 또는 기억력 장애 예방 또는 치료용 약학 조성물에서, 상기 미나리는 밭미나리인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 학습장애 또는 기억력 장애 예방 또는 치료용 약학 조성물은, 경구 투여용인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 학습장애 또는 기억력 장애 예방 또는 치료용 약학 조성물에서, 상기 추출물은 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 또는 상기 저급 알코올의 수용액으로로부터 선택된 용매에 가용한 추출물인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 학습장애 또는 기억력 장애 예방 또는 치료용 약학 조성물에서, 상기 알코올 수용액은 저급 알코올의 혼합비가 10 내지 95(v/v)%인 알코올 수용액임을 특징으로 한다.

또한 본 발명의 학습장애 또는 기억력 장애 예방 또는 치료용 미나리 추출물의 제조방법은, 건조 미나리 중량의 20 내지 200배의 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 수용액을 혼합하여 50 내지 90 ℃에서 4 내지 20 시간 추출하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 학습장애 또는 기억력 장애 예방 또는 치료용 미나리 추출물의 제조방법에서, 상기 저급 알코올 수용액은 50 내지 80(v/v)%의 에탄올 수용액이고, 상기 에탄올 수용액으로 추출한 후, 그 추출물을 에틸아세테이트 또는 부탄올로 추출하는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 미나리 추출물을 유효성분으로 하는 학습능력 또는 기억력 증진용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 학습능력 또는 기억력 증진용 건강기능식품에서, 상기 미나리는 밭 미나리인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 학습능력 또는 기억력 증진용 건강기능식품에서, 상기 건강기능식품의 형태는 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료 형태인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 미나리 추출물은 부작용이나 독성이 거의 없는 천연물 유래 추출물로서 아세틸콜린에스터라제(AChE)의 활성을 현저히 억제하며, 치매 또는 기억력 감퇴를 유도하는 약물인 스코폴라민 투여에 의한 기억력 손상을 예방하는 효과를 가지며, 알코올 또는 스트레스에 의한 기억력 장애를 치료하는 효과를 나타낸다.

도 1은 미나리를 비롯한 각종 천연물의 아세틸콜린에스터라제(AChE)의 활성 억제율을 비교한 그래프이다.
도 2는 미나리의 알코올 추출물을 다양한 용매로 다시 추출한 재분획 추출물의 아세틸콜린에스터라제 활성 억제율을 비교한 그래프이다.
도 3은 논 미나리 추출물과 밭 미나리 추출물의 아세틸콜린에스터라제 활성 억제율을 비교한 그래프이다.

본 발명은 미나리에서 아세틸콜린에스터라제(AChE)의 활성 억제 및 학습능력 또는 기억력 증진에 효과가 있는 조성물을, 학습장애 또는 기억력 장애 예방 또는 치료용 약학 조성물이나 학습능력 또는 기억력 증진용 건강기능식품으로 활용하는 것이다.

본 발명에서 미나리는 미나리과 학명 움벨리퍼라세아에(Umbelliferaceae)에 속하는 오스테리쿰 코레아눔(Ostericum coreanum), 오에난테 스토니리페라(Oenanthe stonilifera), 오에난테 자바니카 (Oenanthe javanica) 등에 속하는 것으로, 바람직하게는 한국산 미나리이다.

미나리는 통상 논에서 수경재배하는 물 미나리라고 불리우는 논 미나리와, 밭에서 재배하는 불 미나리라고 불리우는 밭 미나리 모두 사용될 수 있으나, 밭 미나리가 논 미나리에 비하여 아세틸콜린에스터라제(AChE)의 억제 활성이 뛰어나고, 약물에 의한 기억력 손상 예방 효과가 뛰어나다는 점에서 더욱 바람직하다.

본 발명의 미나리 추출물 제조를 위한 용매로 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 또는 상기 저급 알코올의 수용액이 사용될 수 있다. 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올로는 예를 들어 메탄올, 에탄올, 부탄올, 프로판올, 이소프로판올 등이 사용될 수 있고, 바람직하게는 에탄올을 사용한다.

또한 미나리 추출물 제조를 위한 용매로 알코올 수용액이 사용될 경우 물과 알코올이 혼합된 알코올 수용액에서 알코올의 혼합비율이 10 내지 95 (v/v)%인 알코올 수용액, 바람직하게는 20 내지 90 (v/v)%인 알코올 수용액, 보다 바람직하게는 50 내지 80(v/v)% 를 갖는 알코올 수용액이 사용된다.

가장 바람직하게는 50 내지 80(v/v)% 를 갖는 에탄올 수용액으로 추출한 후, 그 추출액을 에틸아세테이트 또는 부탄올로 추출한 분획을 추출물로 사용하는 것이 아세틸콜린에스터라제(AChE)의 억제 활성이 뛰어나다는 점에서 유리하다.

본 발명의 미나리 추출물은 상기 용매를 사용하여 교반추출, 환류 냉각 추출, 냉침 추출, 초음파 추출 또는 초임계 추출 등의 추출방법으로 제조될 수 있고,

특히 미나리에서 유효성분을 고농도로 효율적으로 추출하기 위해서는 건조 미나리 중량의 20 내지 200배, 바람직하게는 50 내지 150배의 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 수용액을 혼합하여 50 내지 90 ℃에서 4 내지 20 시간 추출하는 것이 바람직하다.

본 발명의 미나리 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 알츠하이머성 치매, 혈관성 치매, 기타 알콜 중독, 외상, 파킨슨병의 후유증으로 오는 치매나 인지 기능 장애의 예방 및 치료를 위해 사용될 수 있으며, 특히 알츠하이머성 치매의 치료에 적합하다.

본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 미나리 추출물을 고형분 기준으로 0.1 내지 50% 중량으로 포함한다.

그러나 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 질환의 종류 및 진행 정도에 따라 변할 수 있다.

본 발명의 미나리 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 미나리 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물은 미나리 추출물의 고형분을 기준으로 1일 0.01 mg/kg 내지 10 g/kg으로, 바람직하게는 1 mg/kg 내지 1 g/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다. 특히 바람직하게는 본 발명의 미나리 추출물은 경구 투여시 복강 투여에 비하여 기억력 손상 예방 효과가 뛰어나다.

본 발명은 학습능력 또는 기억력 증진 효과를 나타내는 미나리 추출물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 미나리 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.

본 발명의 미나리 추출물 자체는 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.

본 발명의 상기 미나리 추출물은 학습능력 또는 기억력 증진 효과를 위하여 건강기능식품에 첨가될 때, 상기 추출물의 양은 고형분을 기준으로 일반적으로 본 발명의 분말, 과립, 정제, 캡슐 등의 형태의 건강기능식품인 경우 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 음료 형태의 건강기능식품인 경우 음료 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 음료 형태의 건강기능식품은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이에 한정되는 것은 아니다.

실험예 1 : 각종 천연물의 아세틸콜린에스터라제(AChE)의 억제활성 비교 ( Ellman's method )

백년초 열매, 석류, 유자, 무화과, 신선초, 대추 및 논 미나리 70 (v/v)%의 에탄올 수용액 추출물을 제조하여 아세틸콜린에스터라제 억제활성을 비교하였다.

각각의 에탄올 수용액 추출물은 건조 시료 10 g에 주정(에탄올 함량 70 (v/v)%) 600 ㎖를 넣고 60 ℃에서 8시간 환류시키지 않고 추출하고, 여과하여 잔사를 제거한 후 50 내지 60 mmHg 및 30 내지 40 ℃의 조건하에서 증발농축하였고, 그 결과로 얻어진 농축액을 열풍건조하여 에탄올 추출물 분말을 얻었다.

상기 각각의 에탄올 추출물 분말을 디메틸술폭사이드(DMSO)에 용해시킨 후 100 mM 인산염(pH 8.0, "완충액 I"이라 함)에 1000 ㎍/㎖ 농도로 희석하였다(DMSO의 경우 최종농도 10%로 희석). 상기 완충액 I에 희석된 추출물 분말 1.5 ㎖, 100 mM 인산염(pH 7.0, "완충액 Ⅱ"라 함) 1.5 ㎖, 75 mM 아세틸티오콜린요오드 용액 20 ㎕ 및 완충엘만시약[Buffered Ellman's reagent; 5,5'-디티오-비스(2-니트로벤조산)10 mM, NaHCO₃ 17.85 mM] 100 ㎕를 혼합하고 25 ℃에서 10 분간 정체시켰다. 그리고, AChE 효소(20 ㎕)를 넣고 흔들어 섞어준 다음 30초 간격으로 5 분동안 흡광도를 측정하므로써 선형반응(linear reaction)임을 확인하였다.

블랭크(blank)에는 효소 대신 식염수(saline)를 넣어주었다. 또한, 아세틸티오콜린요오드 용액을 넣지 않고 흡광도를 측정하여 에탄올 추출물 분말과 효소활성측정시 약간의 비특이적 반응이 나타나지 않음도 확인하였다.

또한, 추출물을 넣지 않았을 때를 음성대조군으로 하고 이때의 AChE 활성도를 100%로 하였을 때, 각 식물의 에탄올 추출물(500 ㎍/㎖)에 대한 AChE 억제활성도를 '%억제'로 도 1에 나타내었다. AChE 활성실험은 5회 반복하여 결과의 유의성을 one-way ANOVA 테스트로 검정하였다.

도 1에 따르면, 백년초 열매, 석류 및 유자 추출물에서 8 내지 11 %의 아세틸콜린에스터라제 활성 억제율을 나타내었으나, 논 미나리 추출물에서는 2 배 이상인 23.5 %의 활성 억제율을 나타내었고, 무화과, 신선초 및 대추 추출물의 효소 활성 억제율은 5 % 미만으로 미미하였다.

실험예 2 : 미나리 추출방법에 따른 아세틸콜린에스터라제(AChE)의 억제활성 비교

건조 논 미나리 10 g에 정제수 600 ㎖를 넣고 100 ℃에서 8시간 열수추출하고, 여과하여 잔사를 제거한 후 50 내지 60 mmHg 및 30 내지 40 ℃의 조건하에서 증발농축하였고, 그 결과로 얻어진 농축액을 열풍건조하여 열수추출물 분말을 얻었다.

또한 건조 논 미나리 10 g에 주정(에탄올 함량 75 (v/v)%) 600 ㎖를 넣고 60 ℃에서 8시간 환류시키지 않고 추출하고, 여과하여 잔사를 제거한 후 50 내지 60 mmHg 및 30 내지 40 ℃의 조건하에서 증발농축하였고, 그 결과로 얻어진 농축액을 열풍건조하여 알코올 추출물 분말을 얻었다.

상기 논 미나리 열수추출물 분말과 알코올 추출물 분말의 아세틸콜린에스터라제 활성 억제율을 실험예 1의 방법으로 측정하였고, 양성대조군으로 DHED를 37.8 μM이 되도록 첨가하여 비교하였으며, 그 결과를 표 1에 나타내었다. AChE 활성실험은 5회 반복하여 결과의 유의성을 one-way ANOVA 테스트로 검정하였다.

구분	농도	AChE 억제활성도(%)
양성대조군(DHED)	37.8 μM	45.2±5.2
열수추출물 분말	500㎍/㎖	2.4±0.4
알코올추출물 분말	500㎍/㎖	31.5±9.6

실험예 3 : 미나리 추출물의 분획방법에 따른 아세틸콜린에스터라제(AChE)의 억제활성 비교

실험예 2의 건조 논 미나리 10 g에 주정(에탄올 함량 75 (v/v)%) 600 ㎖를 넣고 60 ℃에서 8시간 환류시키지 않고 추출하고, 여과하여 잔사를 제거한 후, 각각 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물로 추출하여 각각의 분획 추출물을 얻고, 이들 각각을 50 내지 60 mmHg 및 30 내지 40 ℃의 조건하에서 증발농축하였고, 그 결과로 얻어진 농축액을 열풍건조하여 추출물 분말을 얻었다.

각각의 분획 추출물(500 ㎍/㎖)의 아세틸콜린에스터라제 활성 억제율을 실험예 1의 방법으로 측정하여 도 2에 나타내었다. 각각의 분획 추출물 중, 에틸아세테이트와 부탄올 추출물의 효소 활성 억제율이 가장 크게 나타나, E알코올 추출에 의한 미나리 추출물의 아세틸콜린에스터라제 활성을 억제하는 유효성분은 에틸아세테이트층 또는 부탄올층에 있을 것으로 판단되었다.

실험예 4 : 논 미나리와 밭 미나리의 아세틸콜린에스터라제(AChE)의 억제활성 비교

실험예 2의 논 미나리 대신에 건조 밭 미나리 10 g에 주정(에탄올 함량 75 (v/v)%) 600 ㎖를 넣고 60 ℃에서 8시간 환류시키지 않고 추출하고, 여과하여 잔사를 제거한 후, 50 내지 60 mmHg 및 30 내지 40 ℃의 조건하에서 증발농축하였고, 그 결과로 얻어진 농축액을 열풍건조하여 추출물 분말을 얻었다.

논 미나리 추출물 분말 및 밭 미나리 추출물 분말은 500 ㎍/㎖ 농도로, 양성대조군으로 DHED는 100 μM 농도로 첨가하여 실험예 1의 방법으로 아세틸콜린에스터라제 활성 억제율을 측정하여 도 3에 나타내었다.

밭 미나리 추출물은 동일한 추출 방법으로 제조되고, 동일 농도가 사용되었음에도 논 미나리 추출물의 효소 활성 억제율에 비해 2 배 이상 높아진 것을 확인할 수 있었고, 50 μM 농도의 DHED와 동등한 수준의 효소 활성 억제율을 나타내었다.

실험예 5 : 수동회피반응에 의한 학습장애 및 기억력 장애 예방 효과 확인

실험기구로는 Shuttle box (50×15×40 cm)로 바닥은 electric grid floor이다. 상자는 칸막이문으로 나누어져 25×15 cm의 방을 이루고 있다. 이 실험은 소음이 60dB 이하이고, 조명을 어둡게 한 방에서, 랫트의 스코폴라민(scopolamine)에 의해 손상된 학습과 기억력 손상이 실험예 4의 논 미나리 추출물 및 밭 미나리 추출물 투여를 통해 치료될 수 있는지 살펴보았다.

실험 첫날 실험대상이 되는 모든 동물들에 대해 다음과 같은 실험을 동일하게 실시하였다. 칸막이로 나누어진 방 2개 중 밝은 방에 랫트를 넣고 1500 lux의 조명을 켜면서 칸막이를 열어준다. 랫트는 방안을 여기저기 살피다가 조명이 없는 건너편 어두운 방으로 들어가게 되는데, 이때 자동적으로 칸막이가 닫히게 된다. 불을 켜면서 칸막이가 열릴 때부터 칸막이가 닫힐 때까지 latency를 측정하는데, 이러한 trial을 3-4 회 반복하면 4회째는 거의 예외 없이 20초 안에 밝은 방에서 어두운 방으로 넘어간다.

실험 둘째날 체중 200 내지 250 g 랫트에 실험예 4의 논 미나리 추출물 분말 및 밭 미나리 추출물 분말을 각각 10 mg/kg 씩 경구 투여하고, 양성대조군인 Tacrine은 1 mg/kg로 경구 투여하였다.

추출물 및 Tacrine 투여 1시간 후, 생리식염수에 녹인 scopolamine을 4.5 mg/kg로 복강내로 투여하고, 다시 1시간 후 shuttle box에서 다음과 같이 foot-shock을 주었다. 랫트가 밝은 방에서 어두운 방으로 넘어가면 불이 꺼진 상태에서 0.3 mA의 전류를 방밑의 stainless grid를 통해 3초 동안 흘려 랫트에게 foot-shock을 주었다. 랫트는 어두운 방과 foot-shock과의 관계를 기억하게 되며, 20시간 후 밝은 방에 넣어주면, 조명이 들어와도 어두운 방에 들어가기를 망설이게 된다. 이 때의 latency를 각 그룹별로 비교하여 표 2에 나타내었다.

구분	Latency time(초)
대조군(스코폴라민 비투여군)	260±39.6
스코폴라민 투여군	17±5.4
타크린 투여후 스코폴라민 투여군	32±13.4
논 미나리 투여후 스코폴라민 투여군	17±5.1
밭 미나리 투여후 스코폴라민 투여군	44±7.2

대조군에 비해 스코폴라민 투여군의 기억력 저하가 뚜렷하게 보였다. 이렇게 스코폴라민에 의해 저하된 기억력은 항콜린에스터라아제이면서 기존에 치매약물로 사용되었던 tacrine에 의해 회복되었다. 또한 스코폴라민에 의해 저하된 기억력의 회복은 논 미나리보다 밭 미나리에서 효과가 더 크게 나타났으며, 밭 미나리의 기억력 회복 효과는 타크린에 비하여 더 우수하였다.

이러한 밭 미나리의 기억력 회복 효과가 경구 투여는 물론 복강 투여에서도 동일하게 나타나는지를 확인하기 위하여, 동일 용량의 밭 미나리 추출물 분말을 동일 농도로 희석하여 상기 방법에서 투여 경로만 변경하여 다시 실험하여 그 결과를 표 3에 나타내었다.

구분	Latency time(초)
스코폴라민 투여군	17±5.4
밭 미나리 경구 투여후 스코폴라민 투여군	44±7.2
밭 미나리 복강 투여후 스코폴라민 투여군	14±3.6

스코폴라민 투여로 인한 기억력 저하의 회복에 대하여 밭 미나리 추출물을 경구 투여했을 때에는 스코폴라민 투여군에 비하여 Latency time이 2.6 배 증진되었으나, 복강 투여에서는 기억력 저하의 회복 효과를 확인할 수 없었다.

실험예 6 : 알코올에 의한 기억력 저하의 치료 효과 확인

알코올에 의한 기억력 저하의 치료 효과를 4 주간 실시하였다. 알코올은 2.5 g/kg 용량으로 매일 복강 투여하였다. 밭 미나리 추출물의 투여용량은 10 mg/kg 및 양성대조군인 linoleic acid은 10 mg/kg로 4주간 경구투여하였다. 4주간 투여 후에 Y-미로 테스트를 수행하였다.

Y-미로 테스트는 공간지각을 검증하는 테스트 방법으로, 크기가 동일한 세개의 arms으로 구성되며 검정색 plastic 미로이다. 각각의 arm은 80×35×15 cm로 구성되며 각 arm은 동일한 각도를 유지한다. 랫트는 arm의 끝에 놓고 자유롭게 10 분간 이동할 수 있게 한다. 랫트가 각 arm에 들어가는 순서를 기록한다. 각기 다른 세 개의 arms을 연속적으로 선택할 때 점수를 준다. 이들 점수 (% of alternation)를 그룹별로 비교하여 표 4에 나타내었다.

구분	% of alteration
대조군	66.8±3.5
대조군에 밭 미나리 추출물 경구투여	62.0±5.7
알코올 복강투여	42.9±5.2
알코올 복강투여 및 리놀레산 경구투여	62.3±2.8
알코올 복강투여 및 밭 미나리 추출물 경구투여	62.2±4.6

대조군에 알코올을 4주 동안 복강투여 함으로써 기억력 저하가 대조군에 비하여 기억력 저하가 뚜렷하게 나타났다. 이렇게 알코올에 의해 저하된 기억력은 종래 기억력 개선 효과가 알려진 리놀레산의 투여에 의하여 회복되었고, 본 발명의 밭 미나리 추출물을 경구 투여했을 때에도 리놀레산과 동등한 수준의 알코올에 의한 기억력 손상 회복 효과를 나타내었다.

실험예 7 : 스트레스에 의한 기억력 손상의 치료 효과 확인

스트레스에 의한 기억력 저하의 치료 효과를 4 주간 실시하였다. 스트레스 실험을 위해 랫트를 매일 6시간 동안 plastic box에서 움직이지 못하게 하는 고정스트레스를 주었다. 밭 미나리 추출물의 투여용량은 10 mg/kg 및 양성대조군인 linoleic acid은 10 mg/kg로 4주간 경구투여하였다. 4주간 투여 후에 실험예 6과 동일한 방법으로 Y-미로 테스트를 수행하여 그 결과를 표 5에 나타내었다.

구분	% of alteration
대조군	68.24±4.32
대조군에 밭 미나리 추출물 경구투여	72.54±6.21
스트레스군	60.13±5.17
스트레스군에 리놀레산 경구투여	67.53±4.94
스트레스군에 밭 미나리 추출물 경구투여	69.09±4.52

랫트에 스트레스를 줌으로써 기억력 저하가 대조군에 비하여 기억력 저하가 뚜렷하게 나타났다. 이렇게 스트레스에 의해 저하된 기억력은 종래 기억력 개선 효과가 알려진 리놀레산의 투여에 의하여 회복되었고, 본 발명의 밭 미나리 추출물을 경구 투여했을 때에도 리놀레산과 동등한 수준의 알코올에 의한 기억력 손상 회복 효과를 나타내었다.

하기에 본 발명의 추출물을 함유하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

실험예 4에서 얻은 밭 미나리 추출물 분말 20 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

실험예 4에서 얻은 밭 미나리 추출물 분말 10 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

실험예 4에서 얻은 밭 미나리 추출물 분말 10 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

실험예 4에서 얻은 밭 미나리 추출물 분말 10 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na₂HPO_{4 ,}12H₂O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플 당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

실험예 4에서 얻은 밭 미나리 추출물 분말 20 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6. 건강 식품의 제조

실험예 4에서 얻은 밭 미나리 추출물 분말 1,000 ㎎

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 B1 0.13 ㎎

비타민 B2 0.15 ㎎

비타민 B6 0.5 ㎎

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 ㎎

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄산마그네슘 25.3 ㎎

제1인산칼륨 15 ㎎

제2인산칼슘 55 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

염화마그네슘 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7. 건강 음료의 제조

실험예 4에서 얻은 밭 미나리 추출물 분말 1,000 ㎎

구연산 1,000 ㎎

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수를 가하여 전체 900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims (10)

1. 미나리 추출물을 유효성분으로 하는 학습장애 또는 기억력 장애 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 미나리는 밭 미나리인 것을 특징으로 하는 학습장애 또는 기억력 장애 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 경구 투여용인 것을 특징으로 하는 학습장애 또는 기억력 장애 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   
4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 추출물은 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 또는 상기 저급 알코올의 수용액으로로부터 선택된 용매에 가용한 추출물인 것을 특징으로 하는 학습장애 또는 기억력 장애 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   
5. 제 4 항에 있어서, 상기 알코올 수용액은 저급 알코올의 혼합비가 10 내지 95(v/v)%인 알코올 수용액임을 특징으로 하는 학습장애 또는 기억력 장애 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   
6. 건조 미나리 중량의 20 내지 200배의 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 수용액을 혼합하여 50 내지 90 ℃에서 4 내지 20 시간 추출하는 것을 특징으로 하는 학습장애 또는 기억력 장애 예방 또는 치료용 미나리 추출물의 제조방법.
   
7. 제 6 항에 있어서, 상기 저급 알코올 수용액은 50 내지 80(v/v)%의 에탄올 수용액이고, 상기 에탄올 수용액으로 추출한 후, 그 추출물을 에틸아세테이트 또는 부탄올로 추출하는 것을 특징으로 하는 학습장애 또는 기억력 장애 예방 또는 치료용 미나리 추출물의 제조방법.
   
8. 미나리 추출물을 유효성분으로 하는 학습능력 또는 기억력 증진용 건강기능식품.
   
9. 제 8 항에 있어서, 상기 미나리는 밭 미나리인 것을 특징으로 하는 학습능력 또는 기억력 증진용 건강기능식품.
   
10. 제 8 항 또는 제 9 항에 있어서, 상기 건강기능식품의 형태는 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료 형태인 것을 특징으로 하는 학습능력 또는 기억력 증진용 건강기능식품.

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