KR100295739B1 - 안지오텐신ⅰ전환효소저해제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 안지오텐신 Ⅰ전환효소 저해제에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 돌미나리로부터 안지오텐신 Ⅰ전환효소에 대한 저해 활성물질을 용매분획 및 각종 크로마토그래피를 통하여 순수하게 분리정제하고 각종 기기분석에 의해 이 효소의 저해 활성물질이 아데노신임을 확인함으로써 안지오텐신 Ⅰ전환효소에 대한 저해활성 및 고혈압 억제효능을 가지며, 특히 이 물질과 화학적 구조상 동일한 계열의 물질들인 씨티딘, 구아노신, 이노신 및 우리딘과 비교하였을 때 아데노신이 월등히 강력한 안지오텐신 Ⅰ전환효소에 대한 저해 활성물질임을 확인하여 혈관 수축작용을 갖는 안지오텐신 Ⅱ의 생성을 막고 혈관 이완작용을 갖는 브래디키닌의 분해를 억제하는 안지오텐신 Ⅰ전환효소를 저해하여 고혈압 억제제로 유용한 안지오텐신 Ⅰ전환효소 저해제에 관한 것이다.

Description

안지오텐신 Ⅰ전환효소 저해제
본 발명은 안지오텐신 Ⅰ전환효소 저해제에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 돌미나리로부터 안지오텐신 Ⅰ전환효소에 대한 저해 활성물질을 용매분획 및 각종 크로마토그래피를 통하여 순수하게 분리정제하고 각종 기기분석에 의해 이 효소의 저해 활성물질이 아데노신임을 확인함으로써 안지오텐신 Ⅰ전환효소에 대한 저해활성 및 고혈압 억제효능을 가지며, 특히 이 물질과 화학적 구조상 동일한 계열의 물질들인 씨티딘, 구아노신, 이노신 및 우리딘과 비교하였을 때 아데노신이 월등히 강력한 안지오텐신 Ⅰ전환효소에 대한 저해 활성물질임을 확인하여 혈관 수축작용을 갖는 안지오텐신 Ⅱ의 생성을 막고 혈관 이완작용을 갖는 브래디키닌의 분해를 억제하는 안지오텐신 Ⅰ전환효소를 저해하여 고혈압 억제제로 유용한 안지오텐신 Ⅰ전환효소 저해제에 관한 것이다.
고혈압이 발생하는 기작에서 레닌-안지오텐신계(rennin-angiotensin system)는 혈압조절에 매우 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 특히, 안지오텐신 Ⅰ전환효소는 레닌에 의하여 생성된 데카펩타이드(decapeptide)인 안지오텐신 Ⅰ으로부터 C-말단의 디펩타이드(dipiptide)를 가수분해시킴으로써 강력한 혈관 수축작용을 갖는 옥타펩타이드(octapeptide)인 안지오텐신 Ⅱ를 합성하는 마지막 단계에 관여하는 효소이다. 생성된 안지오텐신 Ⅱ는 강력한 혈관 수축작용을 가짐과 동시에 부신피질(adrenal cortex)에서 알도스테론(aldosterone)의 분비를 촉진함으로써 물과 나트륨의 배설을 억제한다. 또한, 안지오텐신 Ⅰ전환효소는 혈관 이완작용을 갖는 노나펩타이드(nonapeptide)인 브래디키닌(bradykinin)을 불활성화시킴으로써 결과적으로 혈압을 상승시키는 역할을 한다[Das, M and Soffer, R.L., J. Biol. Chem., 250(17), 6762, 1975; Soffer, R.L., Ann. Rev. Biochem., 45, 73, 1976; Ondetti, M.A. and Cushman, D.W., Ann. Rev. Biochem., 51, 283, 1982]. 따라서, 혈관 수축작용을 갖는 안지오텐신 Ⅱ의 생성을 막고 혈관 이완작용을 갖는 브래디키닌의 분해를 억제하기 위해서는 안지오텐신 Ⅰ전환효소의 저해가 필수적이라 할 수 있다.
현재까지 안지오텐신 Ⅱ의 생성을 막고, 브래디키닌의 분해를 억제하기 위하여 에날라프릴(enalapril), 포시노프릴(fosinopril), 퀴나프릴(quinapril) 등의 합성약제가 개발되어 시판되고 있으나, 이는 기침, 두통, 미각장애, 발진, 간효소치 상승 등 부작용을 동반하는 단점이 있다. 따라서, 안지오텐신 Ⅰ전환효소의 저해제를 식품 등 천연소재에서 찾고자 하는 연구가 왕성히 수행되어 오고 있으나, 지금까지 안지오텐신 Ⅰ전환효소 저해제에 대한 연구는 펩타이드가 주류를 이루고 있다. 즉, 우유, 콩, 어류 등 식품 단백질을 펩신(pepsin), 트립신(trypsin) 등 단백질 분해효소로 분해한 후 추출, 정제하여 특성을 파악하는 연구가 주로 행하여지고 있다[Miyoshi, S., et al., Agric. Biol. Chem., 55(5), 1407, 1991; Matsui, T., et al., Biosci. Biotech. Biochem., 57(6), 922, 1993]. 그러나, 이러한 식품 단백질로부터 활성 펩타이드를 생산하는 방법은 분리 정제시 수율이 매우 낮을 뿐만 아니라 높은 제조경비가 드는 문제가 있어 아직 산업적 생산단계까지는 이르지 못하고 있는 실정이다.
따라서, 본 발명자들은 돌미나리 추출물로부터 아데노신을 분리정제하고, 이물질을 이와 화학적으로 유사한 물질들과 비교하였을 때 안지오텐신 Ⅰ전환효소에 대하여 현저히 높은 저해활성의 효과가 있음을 알게됨으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명에서는 안지오텐신 Ⅰ전환효소를 저해하여 혈관 수축작용을 갖는 안지오텐신 Ⅱ의 생성을 막고 혈관 이완작용을 갖는 브래디키닌의 분해를 억제하는 고혈압 억제제로 유용한 안지오텐신 Ⅰ전환효소 저해제 및 그 용도를 제공하는데 그 목적이 있다.
제1도는 본 발명에 따른 실시예 5에서 제조한 활성분획물 Ⅲ중 P-1, P-2, P-3 및 P-4의 고속액체크로마토그램을 나타낸 것이고,
제2도는 본 발명에 따른 실시예 6에서 제조한 저해 활성물질의 자외선 흡광스캐닝 결과를 나타낸 것이고,
제3도는 본 발명에 따른 실시예 6에서 제조한 저해 활성물질의 질량분석 결과를 나타낸 것이고,
제4도는 본 발명에 따른 실시예 6에서 제조한 저해 활성물질의1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이고,
제5도는 본 발명에 따른 실시예 6에서 제조한 저해 활성물질의13C-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이고,
제6도는 본 발명에 따른 실시예 6에서 제조한 저해 활성물질의 HMQC 스펙트럼을 나타낸 것이고,
제7도는 본 발명에 따른 실시예 6에서 제조한 저해 활성물질의 HMBC 스펙트럼을 나타낸 것이다.
본 발명은 돌미나리로부터 추출된 아데노신이 유효성분으로 함유된 안지오텐신 Ⅰ전환효소 저해제를 그 특징으로 한다.
이와 같은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 돌미나리에서 추출한 다음 화학식 1로 표시되는 아데노신이 유효성분으로 함유된 안지오텐신 Ⅰ전환효소 저해제에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 저해제는 혈관 수축작용을 갖는 안지오텐신 Ⅱ의 생성을 막고 혈관 이완작용을 갖는 브래디키닌의 분해를 억제하기 위하여 안지오텐신 Ⅰ전환효소를 저해함으로써 고혈압 억제제로 사용할 수 있는데 특징이 있다.
일반적으로 식물체로부터 추출된 아데노신의 안지오텐신 Ⅰ전환효소 저해에 관한 연구는 지금까지 수행된 바 없었으나, 아데노신의 혈관 확장작용에 관해서는 표준품을 이용한 연구결과가 보고되어 있다[Noll, G., et al., Circulation, 95(9), 2286, 1997; Zanzinger, J. and Bassenge, E., Eur. Heart J., 14(1), 164, 1993; Zanzinger, J., Zeng, X. and Bassenge, E., Cardiovas. Res., 28(2), 209, 1994]. 이들 보고에 따르면 아데노신은 혈관확장제로서 심장혈관 등 내복조직에 의존적인 혈관 확장을 유도하며, 브래디키닌(bradykinin)과 함께 L-아르기닌(arginine)/니트릭옥사이드(nitric oxide) 경로에 독립적으로 작용함은 물론 아세틸콜린(acetylcholine)이 급격히 안지오텐신 Ⅰ전환효소를 저해하는 작용을 돕는 것으로 알려져 있다.
또한, 아데노신의 혈관 확장반응은 혈압 강하제로 사용되고 있는 씰라자프릴(cilazapril), 로사르탄(losartan) 및 캡토프릴(captopril) 등에 의해 촉진된다는 연구결과도 보고된 바가 있다[Clozel, J.P., et al., Hypertension, 18(4), 118, 1991; Nishimura, N., Takase, H. and Morita, T., Nippon Yakurigaku Zasshi, 105(6), 479, 1995]. 그러나, 아데노신이 안지오텐신 Ⅰ전환효소의 활성을 저해한다는 연구 결과는 본 발명에 의해 최초로 확인되었으며, 따라서 본 발명에 따른 저해제는 안지오텐신 Ⅰ전환효소 활성을 저해함으로써 고혈압을 억제할 수 있는 용도로 제공될 수 있다.
본 발명에 따른 안지오텐신 Ⅰ전환효소 저해제는 돌미나리로부터 추출된 상기 화학식 1로 표시되는 아데노신을 유효성분으로 포함하는 바, 아데노신의 추출과정을 상세히 설명하면 다음과 같다.
우선, 돌미나리의 이물질을 제거하고 세절하여 40℃정도에서 열풍건조시킨 다음, 이를 분쇄기로 분새한 후 그 분말을 사용한다. 추출용 용매로는 60% 아세톤 수용액, 부탄올, 증류수, 50% 메탄올 수용액 및 메탄올 중에서 선택한 하나 또는 그 이상의 혼합용매를 사용한다. 그 중에서 60% 아세톤 수용액을 사용한 것을 예로 들어 추출과정을 설명하면 다음과 같다.
상기에서 제조된 돌미나리 분말 100g에 60% 아세톤 수용액 2ℓ를 넣고 50∼70℃에서 5시간동안 교반 추출한다. 이것을 여과지로 여과하고 남은 잔사에 동량의 60% 아세톤 수용액을 넣고 동일한 추출과정을 2회 반복한다. 이와 같은 방법으로 얻은 추출물을 감압농축기로 농축하고 진공하에서 건조함으로써 60% 아세톤 수용액 추출물을 얻을 수 있다.
상기와 같이 돌미나리에서 추출한 추출물이 안지오텐신 Ⅰ전환효소의 활성을 억제할 수 있는 저해 활성물질임을 확인하기 위하여 첨부도면 도 1 내지 도 7에 나타낸 분석결과로 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.
도 1은 상기와 같이 추출된 추출물을 용매에 용해시키고 박층크로마토그래피를 사용하여 수득한 분획물의 고속액체크로마토그램을 나타낸 것으로서, 추출물을 고속액체크로마토그래피를 이용하여 P-1, P-2, P-3 및 P-4의 물질로 분리한 결과를 나타내었고, 분리된 것 중에서 P-4로 표시되는 물질에 대하여 자외선 분광계를 사용하여 자외선 흡광도를 측정하고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
그리고, 도 3에는 상기 저해 활성물질 P-4를 질량분석기를 사용하여 질량분석결과를 나타내었고, 도 4 및 도 5에는 핵자기공명(NMR) 스펙트럼을 측정한 결과를 나타내었다. 도 4는 저해 활성물질 P-4의1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것으로, 이 스펙트럼상에서 δ3.55∼5.87ppm에 나타난 6개의 프로톤 시그널(proton signal)은 이 물질이 배당체임을 시사하였다. 또한, δ8.12ppm(1H, s) 및 δ8.33ppm(1H, s)의 시그널은 방향환(aromatic ring)의 존재를 나타냈으며, 이들이 주위의 프로톤과는 전혀 커플링(coupling)하고 있지 않았으므로 오르토(ortho), 메타(meta) 위치의 프로톤들은 치환된 것으로 확인되었다.
도 5는 저해 활성물질 P-4의13C-NMR 스펙트럼을 나타낸 것으로, 이 스펙트럼 상에서 δ119.3∼156.1 ppm에 나타난 시그널은 방향환중에 모두 5개의 탄소가 존재하며, δ61.7∼87.9 ppm에 나타난 당류(sugar moiety)의 시그널이 5개인 것으로 미루어 이 물질은 오탄당(furanoside)인 것으로 추정되었다.
도 6은 저해 활성물질 P-4의 헤테로뉴클리어 멀티플 퀀텀 코릴레이션(HMQC, heteronuclear multiple quantum correlation) 스펙트럼을 나타낸 것으로, 이 스펙트럼상에서 δ139.9ppm의 탄소와 δ152.4ppm의 탄소는 각각 δ8.33ppm의 프로톤(1H, s) 및 δ8.12ppm의 프로톤(1H, s)과 서로 상관관계에 있어 이들이 서로 결합하고 있으며, 또한 δ 7.30ppm(2H, s)의 시그널은 어떤 탄소와도 상관관계를 보이지 않아 아미노(-NH2)기의 존재가 강력히 시사되었다. 따라서, 아미노기의 결합위치를 확인하기 위하여 헤테로뉴클리어 멀티플 본드 코릴레이션(HMBC, heteronuclear multiple bond correlation) 스펙트럼을 측정하고, 그 결과를 도 7에 나타내었는데, δ119.3ppm의 탄소시그널과 아미노기의 프로톤 시그널이 강한 상관관계를 나타내었으므로, 이들이 서로 결합하고 있는 것으로 확인되었다.
상기와 같은 방법으로 돌미나리에서 분리한 안지오텐신 Ⅰ전환효소의 저해활성물질 P-4의 화학적 구조를 분석한 결과, 이 물질은 분자량이 267이며, 리보뉴 클레오사이드의 일종인 6-아미노-9-베타-디-리보퓨라노실-9H-퓨린, 즉 아데노신인 것으로 최종적으로 동정하였다. 또한, 돌미나리로부터 순수하게 정제한 저해 활성물질 P-4는 아데노신의 표준품과 박층크로마토그래피 및 액체고속크로마토그래피상에서 분리거리 및 분리시간이 완전히 일치하였을 뿐만 아니라 자외선 흡광도 스캐닝에 있어서도 동일한 형태를 나타내었고, 아데노신으로 확인된 안지오텐신 Ⅰ전환효소에 대하여 저해 활성물질 P-4는 상기 화학식 1에 나타낸 구조를 갖는다.
상기와 같은 결과로부터, 돌미나리에서 추출하고 각종 용매분획 및 크로마토그래피를 통해 저해 활성물질을 순수정제하였으며, 각종 기기분석에 의하여 추출물은 상기 화학식 1로 표시되는 아데노신임을 확인하였고, 이 아데노신은 화학적 구조상 동일한 계열의 물질들에 비해 안지오텐신 Ⅰ전환효소를 효과적으로 저해함을 알 수 있다. 또한, 식용채소에서 분리된 아데노신은 인체에 대한 부작용이 전혀 없는 것으로 이미 밝혀져 있는 바, 본 발명의 돌미나리로부터 추출된 아데노신은 안지오텐신 Ⅰ전환효소에 대한 우수한 저해활성물질로서 고혈압 억제기능의 용도를 제공한다.
이와 같은 본 발명을 실시예에 의거하여 상세하게 설명하겠는 바, 본 발명이 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1]
시중에서 구입한 돌미나리의 이물질을 제거하고 세절하여 40℃에서 열풍건조시킨 것을 분쇄기로 분쇄한 후 그 분말을 사용하였다. 추출용 용매로는 증류한 공업용 아세톤을 증류수로 60% 아세톤 수용액이 되도록 제조하여 사용하였다.
잘 건조된 돌미나리 분말 100g에 60% 아세톤 수용액 2ℓ를 넣고 50∼70℃에서 5시간동안 교반 추출하였다. 이것을 여과지로 여고하고 남은 잔사에 동량의 60% 아세톤 수용액을 넣고 동일한 추출과정을 2회 반복하였다. 이와 같은 방법으로 얻은 추출물은 감압농축기로 농축하고 진공하에서 건조하여 60% 아세톤 수용액 추출물을 제조하였다.
상기한 추출물을 시료로하여 안지오텐신 Ⅰ전환효소 저해활성의 측정은 Cuchiman과 cheung의 방법에 따라 실시하였다[Cushman, D.W. and Cheung, H.S., Biochem. Pharmacol., 20, 1637, 1971].
즉, 시료 0.01g에 증류수 2㎖를 가하고 잘 녹여서 50㎕를 취한 후, 여기에 기질로서 hippuryl-his-leu 용액(25㎎/2.33㎖ 붕산나트륨 완충액, pH 8.3) 50㎕ 및 붕산나트륨 완충액(pH 8.3) 100㎕를 첨가하여 37℃에서 10분간 전반응시켰다. 여기에 안지오텐신 Ⅰ전환효소액 50㎕를 가하여 다시 37℃에서 30분간 반응시킨후, 1N 염산 250㎕를 첨가하여 반응을 정지시켰다.
무첨가군은 시료 용액 대신에 증류수 50㎕를 첨가하고, 대조군은 1N 염산을 먼저 가한 다음 효소액 50㎕를 가하였다.
반응이 완료된 후, 에틸아세테이트 1,5㎖를 가하여 15초간 진탕하여 잘 섞고 상등액 1.25㎖를 취했다. 이 상등액을 105℃에서 1시간동안 완전히 건조시킨 후 증류수 1,5㎖에 용해시키고 228㎚에서 흡광도를 측정하여 다음 수학식 1에 의하여 효소 저해율을 구하였다.
상기 수학식 1에서 S는 시료의 흡광도, Sc는 시료 대조군의 흡광도, B는 무첨가군의 흡광도, Bc는 무첨가군의 대조군의 흡광도를 각각 나타낸다.
상기와 같은 방법으로 안지오텐신 Ⅰ전환효소에 대한 저해활성을 측정한 결과, 다음 표 1에 나타낸 바와 같이 저해율은 52.32% 이었다.
[실시예 2]
상기 실시예 1로부터 제조된 돌미나리 추출물에 100㎖의 증류수를 넣어 잘 분산시키고 이를 분액깔대기에 옮긴 후, 여기에 500㎖의 부탄올을 넣고 세차게 흔들어 주었다. 실온에서 정치하여 완전히 물층과 부탄올층으로 분리된 후 부탄올층만을 회수하였다. 남은 물층에 다시 500㎖의 부탄올을 넣고 상기와 동일한 방법으로 3회 추출하여 회수한 부탄올층을 모아 감압농축기로 농축하고 진공하에서 건조하여 부탄올 분획물을 제조하였다.
상기한 분획물을 시료로하여 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 안지오텐신 Ⅰ전환효소에 대한 저해활성을 측정한 결과, 다음 표 1에 나타낸 바와 같이 저해율은 62.48%였다.
[실시예 3]
상기 실시예 2에서 제조된 시료를 소량의 물에 분산시킨 후, 에틸에테르를 가하여 클로로필을 제거한 후 앰버라이트(amberlite) XAD-2 칼럼(길이 35㎝, 내경 4.5㎝)에 로딩(loading)하고 증류수 500㎖, 50% 메탄올 수용액 500㎖ 및 100% 메탄올 500㎖를 순차적으로 흘려 각각 분획하였다. 이 과정을 통하여 얻은 각각의 분획물들은 감압농축기로 농축하고 진공하에서 건조하여 각각 증류수 분획물, 50% 메탄올 수용액 분획물 및 100% 메탄올 분획물을 제조하였다.
상기한 분획물들을 시료로하여 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 안지오텐신 Ⅰ전환효소에 대한 저해활성을 측정한 결과, 다음 표 1에 나타낸 바와 같이 가장 높은 활성을 보인 100% 메탄올 분획물의 저해율은 74.92%였다.
[실시예 4]
상기 실시예 3에서 제조된 50% 메탄올 수용액 분획물과 100% 메탄올 분획물을 혼합하고 소량의 콜로로포름에 녹인 후, 미리 충전된 실리카겔(머크사) 컬럼(길이 28㎝, 내경 3.6㎝)에 로딩하였다. 이 컬럼에 클로로포름-메탄올 혼합용매를 혼합비율이 10:0에서 0:10이 되도록 변화시키면서 용출시켜 분획하였다. 각각의 분획물들에 대하여 실리카겔(silicagel) 박층크로마토그래피(thin layer chromatography)로 분리상태를 확인하고 동일한 분리 경향을 보인 것들끼리 합쳐 이들을 각각 감압농축한 후 A, B 및 C 등 3개의 분획물을 제조하였다.
상기한 분획물들을 시료로하여 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 안지오텐신 Ⅰ전환효소에 대한 저해활성을 측정한 결과, 다음 표 1에 나타낸 바와 같이 가장 높은 활성을 보인 분획물 B의 저해율은 80.72%였다.
[실시예 5]
상기 실시예 4에서 제조된 B분획물과 C분획물을 섞어 소량의 물에 녹인 후, 미리 충전된 시그마(sigma)사 세파덱스(sephadex) LH-20 컬럼(길이 15㎝, 내경 3.6㎝)에 로딩하였다.
먼저 증류수-메탄올 혼합용매를 혼합비율이 10:0에서 0:10이 되도록 변화시키면서 용출시켰다. 각각의 분획물들에 대하여 실리카겔 박층크로마토그래피로 분리상태를 확인하고 동일한 분리 경향을 보인 것들끼리 합친 후 이들을 각각 감압 농축하여 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ 및 Ⅴ 등 5개의 분획물을 제조하였다.
상기한 분획물들을 시료로하여 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 안지오텐신 Ⅰ전환효소에 대한 저해활성을 측정한 결과, 다음 표 1에 나타낸 바와 같이 가장 높은 활성을 보인 분획물 Ⅲ의 저해율은 82.74%였다.
[실시예 6]
상기 실시예 5로부터 제조된 것들중 분획물 Ⅲ로부터 최종적으로 안지오텐신 Ⅰ전환효소 저해물질을 분리하기 위하여 상기 분획물을 메탄올(특급시약)에 완전히 녹인 후, 0.2㎛ 막여과지(membrane filter)로 여과하여 고속액체크로마토그래피에 의해 저해 활성물질을 분리하였다.
고속액체크로마토그래피는 미국 워터스사 제품인 모델510을 사용하였으며, 고정상으로는 일본 토요사 제품인 ODS-80TM(내경 7.8㎜, 길이 300㎜)를 사용하였고, 이동상으로는 25% 메탄올 수용액을 1분당 2.2㎖의 유속으로 흘려주었다. 활성물질은 자외선검출기를 이용하여 254㎚에서 검출하였다.
이상과 같이, 고속액체크로마토그래피를 이용하여 P-1, P-2, P-3 및 P-4 등 4종의 화합물을 분리하였으며, 각각의 화합물들을 시로료하여 상기 실시예 1과 같은 방법으로 안지오텐신 Ⅰ전환효소에 대한 저해 활성을 측정하였을 때 화합물 P-4가 가장 높은 활성을 나타내었으며, 표 1에 나타낸 바와 같이 이 물질의 저해율은 92.00%인 것으로 확인되었다.
[실시예 7]
상기 실시예 6에서 제조된 안지오텐신 Ⅰ전환효소에 대한 저해 활성물질로 확인된 화합물 P-4는 백색의 분말로, 소량의 대상시료를 10% 메탄올 수용액에 완전히 녹이고 0.2㎛ 막여과지로 여과한 후 자외선 분광계(일본 Shimadzu사, UV-2401PC)에 의해 자외선 흡광 스캐닝(200∼285㎚)을 실시하였다. 도 2에서는 저해 활성물질의 자외선 흡광 스캐닝 결과를 나타내었다.
[실시예 8]
상기 실시예 6에서 제조된 안지오텐신 Ⅰ전환효소에 대한 저해 활성물질로 확인된 화합물 P-4의 분자량은 에프에이비-질량분석기(FAB-MS, 일본 JEOL사) 시스템을 이용하여 측정하였다. 이때, 용매는 물, 가스는 제논(Xe)를 사용하였고, 온도는 초기온도 25℃, 최고온도 320℃, 측정온도 30.1℃였으며, 포지티브 이온모드(positive ion mode) 상태에서 글리세롤 매트릭스(glycerol matrix)를 기준물질로하여 피크를 확인하였다. 도 3에는 저해 활성물질의 질량분석 결과를 나타내었다.
[실시예 9]
상기 실시예 6에서 제조된 안지오텐신 Ⅰ전환효소에 대한 저해 활성물질인 화합물 P-4에 대한 핵자기공명(NMR) 스펙트럼을 측정하였다. 사용한 기종은 미국 브루커사 모델 AMX 500으로1H-NMR 스펙트럼은 125㎒에서,13C-NMR 스펙트럼은 500㎒에서 각각 측정하였으며, 측정온도는 30℃였다. 핵자기공명 흡수위치(chemical shift)는 시료 20㎎을 DMSO-δ6에 녹여 측정한 후, 트리메틸실란(TMS)으로 나타내었다.
[실시예 10]
천연 식용채소인 돌미나리로부터 안지오텐신 Ⅰ전환효소에 대한 강력한 저해 활성물질로 확인된 아데노신의 절대적 저해활성을 측정하였다. 절대적 저해활성은 안지오텐신 Ⅰ전환효소의 활성을 50% 저해하는 농도(IC50)를 구하여 결정하였다. 아데노신의 저해활성과 비교검토한 대상시료로는 아데노신과 동일한 계열의 물질들인 씨티딘(cytidine), 구아노신(guanosine), 이노신(inosine) 및 우리딘(uridine) 등을 사용하였다.
각 대상시료의 농도별 저해활성은 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 실시하였으며, 각각의 시료의 농도는 반응액중 최종농도가 120㎍/250㎕, 180㎍/250㎕, 240㎍/250㎕, 260㎍/250㎕가 되도록 조정하여 시험하였으며, 각각의 농도에서 구한 저해율로부터 통상적인 방법에 의해 IC50을 구하였다.
다음 표 2는 실시예 10로부터 아데노신, 씨티딘, 구아노신, 이노신 및 우리딘의 IC50을 구한 결과를 나타냈다. 이 결과로부터 아데노신과 동일계열의 물질중 비교적 높은 안지오텐신 Ⅰ전환효소에 대한 저해활성을 보인 이노신의 경우 IC50이 121.94㎍/250㎕임을 고려하면, 아데노신의 저해활성은 실시예에서 사용된 동일계열의 물질들에 비해 약 2∼4.5배 가량이 높은 것으로 확인되었다.
상술한 바와 같이, 본 발명에서는 안지오텐신 Ⅰ전환효소에 대해 저해활성을 가진 돌미나리로부터 각종 용매분획 및 크로마토그래피를 통해 저해 활성물질을 순수정제 하였으며, 각종 기기분석에 의하여 이 물질은 아데노신임을 확인하였고, 또한 아데노신은 화학적 구조상 동일한 계열의 물질들에 비해 가장 높은 안지오텐신 Ⅰ전환효소에 대한 저해활성을 갖는 것을 확인하였으며, 천연 식용채소에서 분리된 아데노신은 인체에 대한 부작용이 전혀 없는 것으로 이미 밝혀져 있는 바, 본 발명에 따른 아데노신은 혈관 수축작용을 갖는 안지오텐신 Ⅲ의 생성을 막고 혈관 이완작용을 갖는 브래디키닌의 분해를 억제하는 안지오텐신 Ⅰ전환효소를 저해하여 고혈압 억제제로 유용한 효과가 있음을 알 수 있다.

Claims (6)

  1. 한국산 돌미나리로부터 추출된 아데노신이 유효성분으로 함유된 것임을 특징으로 하는 안지오텐신 Ⅰ전환효소 저해제.
  2. 한국산 돌미나리 분말을 아세톤 수용액으로 추출하는 과정, 상기 아세톤 수용액 추출물을 부탄올으로 분획하는 과정, 그리고 상기 부탄올 분획물을 앰버라이트(amberlite) XAD-2, 실리카겔, 세파덱스(sephadex) LH-20 및 고속액체크로마토그래피(HPLC) 상에서 순자척으로 분리하는 과정이 포함되는 것을 특징으로 하는 아데노신이 유효성분으로 함유된 안지오텐신 Ⅰ전환효소 저해제의 제조방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 앰버라이트(amberlite) 수지 분리과정에서는 증류수, 50% 메탄올 수용액 및 메탄올으로 순차적으로 흘려주는 것을 특징으로 하는 아데노신이 유효성분으로 함유된 안지오텐신 Ⅰ전환효소 저해제의 제조방법.
  4. 제2항에 있어서, 상기 실리카겔 분리과정에서는 클로로포름-메탄올 혼합용매를 용출용매로 사용하는 것을 특징으로 하는 아데노신이 유효성분으로 함유된 안지오텐신 Ⅰ전환효소 저해제의 제조방법.
  5. 제2항에 있어서, 상기 세파덱스(sephadex) 분리과정에서는 증류수-메탄올 혼합용매를 용출용매로 사용하는 것을 특징으로 하는 아데노신이 유효성분으로 함유된 안지오텐신 Ⅰ전환효소 저해제의 제조방법.
  6. 제2항에 있어서, 상기 고속액체크로마토그래피(HPLC) 분리과정에서는 25% 메탄올 수용액을 이동상으로 사용하는 것을 특징으로 하는 아데노신이 유효성분으로 함유된 안지오텐신 Ⅰ전환효소 저해제의 제조방법.
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