KR100742185B1 - 항산화 활성을 가지는 펩타이드 함유 청국장 추출물 및이의 제조 방법 - Google Patents
항산화 활성을 가지는 펩타이드 함유 청국장 추출물 및이의 제조 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 항산화 활성을 가지는 펩타이드 함유 청국장 추출물 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의한 펩타이드 함유 청국장 추출물의 제조 방법은 순환식 HPLC를 이용하여 보다 간단하게 추출물을 제조할 수 있고, 본 발명에 의하여 제조된 펩타이드 함유 청국장 추출물은 높은 항산화 활성을 가지므로 건강 기능성 식품 소재로의 이용 가치가 매우 높다.
항산화 활성, 청국장, 순환식 HPLC
Description
도 1은 농축된 청국장 시료를 순환식 HPLC(Recycling Prepatative HPLC)를 이용하여 GS-310 컬럼(column)으로 분획한 크로마토그램을 나타낸 것이다. 왼쪽에서 오른쪽의 방향으로 분획물 1 내지 분획물 4를 나타낸다.
도 2는 상기 도 1에서 얻어진 분획물 중 분획물 2를 순환식 HPLC를 이용하여 W-252 컬럼으로 분획한 크로마토그램을 나타낸 것이다. 왼쪽에서 오른쪽의 방향으로 재분획물 2-1 내지 재분획물 2-5를 나타낸다.
도 3a는 상기 도 1에서 얻어진 분획물들의 DPPH법에 의한 항산화 활성을 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 3b는 상기 도 1에서 얻어진 분획물들의 NBT 환원법에 의한 환원억제력을 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 4a는 상기 도 2에서 얻어진 재분획물들의 DPPH법에 의한 항산화 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 4b는 상기 도 2에서 얻어진 재분획물들의 NBT 환원법에 의한 환원억제력을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 5a는 상기 도 1에서 분리된 4종의 분획물 중 항산화 활성이 높은 분획물 2를 분석용 HPLC를 이용하여 분자량 특성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 5b는 상기 도 2에서 분리된 5종의 재분획물 중 항산화 활성이 높은 재분획물 2-2를 분석용 HPLC를 이용하여 분자량 특성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 5c는 상기 도 2에서 분리된 5종의 재분획물 중 항산화 활성이 높은 재분획물 2-3을 분석용 HPLC를 이용하여 분자량 특성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 6a는 아미노산 자동분석기를 이용하여 청국장의 아미노산 조성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 6b는 아미노산 자동분석기를 이용하여 재분획물 2-2의 아미노산 조성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 6c는 아미노산 자동분석기를 이용하여 재분획물 2-3의 아미노산 조성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 항산화 활성을 가지는 펩타이드 함유 청국장 추출물 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
식품 중의 단백질은 섭취된 후 가수분해되는데, 이때 생성되는 펩타이드(peptide)나 아미노산(amino acid)은 여러 가지 기능을 갖게 된다. 식품 중의 펩타이드는 영양학적으로 단백질을 생합성하기 위한 필수 아미노산의 공급원이 되며, 향미, 용해성, 거품성 및 유화성 등 식품의 물성에도 크게 영향을 미친다. 콩에는 약 40%의 함량으로 대두단백질이 함유되어 있는데, 이것은 발효 등의 가공 과정 중에 매우 다양한 펩타이드 및 아미노산을 생성한다. 일반적으로 펩타이드는 영양소로서의 기능뿐만 아니라 여러 가지 생체 조절 기능도 나타내는 것으로 알려져 있다.
펩타이드는 2~10개 정도의 아미노산의 결합으로 이루어진 것으로, 보통 분자량 10,000 이하의 것을 의미한다. 생체 내에 존재하는 펩타이드는 여러 가지 생리활성을 나타내는데, 최근 식품 중에 존재하는 펩타이드의 생체 조절기능 및 생리활성에 대해 관심이 증대되고 있다. 모든 발효식품은 발효과정 중에 단백질이 분해되어 여러 분자량의 펩타이드가 생성되는데, 천연단백질에서 얻어지는 펩타이드는 생체내에서 각종의 생리활성을 가지는 것으로 알려져 있다. 펩타이드 성분은 항암, 항종양 활성, 혈압강하, 혈청콜레스테롤 강하, 면역증강, 칼슘흡수 촉진 등의 다양한 생리활성을 나타낸다.
지금까지 알려진 펩타이드의 생체조절 기능으로는 ACE(Angiotensin Converting Enzyme) 저해효과에 의한 혈압강하 효과, 피브리노겐(Fibrinogen), 피브로넥틴(Fibronectin), 라미닌(Laminin) 등의 혈전 저해 효과가 알려져 있으며, 식품 중에는 우유의 k-카제인(k-casein), 쌀 단백질, 대두 단백질 및 된장 등이 혈전저해 펩타이드를 함유하고 있는 것으로 보고된 바 있다.
또한, 면역증강 펩타이드는 생체방어를 위한 면역반응의 초기단계에서 호중구나 대식세포의 탐식작용 등에 관여하게 되는데, 많은 펩타이드가 탐식작용 등을 촉진함으로써 면역증강 효과를 나타내는 것으로 보고되었다. 이들 펩타이드는 우유와 모유의 A-카제인 및 B-카제인, 면역글로불린(immunoglobulin), 대두글로불린, 오브알부민(ovalbumin), 쌀 단백질 등에 함유되어 있는 것으로 알려져 있다.
또한, 식품 중에 함유된 펩타이드 중 일부는 소화과정 중 담즙산과 결합하여 분변 중에 배설되는 콜레스테롤 양을 증가시키고, 결과적으로 혈중 콜레스테롤 함량을 낮추는 것으로 알려져 있으며, 대두단백질 가수분해물에 함유된 펩타이드의 경우, 펩타이드의 표면소수도가 높을수록 콜레스테롤 감소 효과는 더욱 증대된다고 알려져 있다.
뿐만 아니라, 펩타이드는 각종 종양세포에 세포독성을 나타내므로써 항암효과를 나타낸다고 보고된 바 있다. 특히, 우리나라의 재래식 간장, 된장, 대두 가수분해물에서 분리된 각종 펩타이드가 생쥐의 대식세포 종양세포주, 생쥐 섬유아세포주, 인간 대장암 세포주 등에 대한 항암 활성이 있는 것으로 보고된 바 있다.
이와 같은 다양한 생리활성이 있는 펩타이드는 지금까지 우유, 달걀, 치킨, 생선류, 해산물 및 콩 단백질 등에서 분리되어 사용되어 있으나, 한국의 전통발효식품 중에서 분리된 예는 지금까지 미미한 실정이다.
본 발명의 목적은 보다 간단하면서도 항산화 활성이 높은 펩타이드 함유 청국장 추출물의 제조 방법 및 상기 제조 방법에 의하여 제조된 항산화 활성이 높은 펩타이드 함유 청국장 추출물을 제공하는 것이다.
본 발명의 항산화 활성을 가지는 펩타이드 함유 청국장 추출물의 제조 방법은 하기의 각 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 한다:
(1) 콩을 원료로 청국장을 제조하는 단계,
(2) 제조된 청국장을 분말화시킨 후 탈지시키는 단계,
(3) 탈지된 시료를 메탄올로 추출한 후 농축하는 단계,
(4) 농축된 시료를 순환식 HPLC를 사용하여 분획물을 얻는 단계,
(5) 상기 분획물 중 항산화 활성을 가지는 분획물을 순환식 HPLC를 사용하여 항산화 활성을 가지는 재분획물을 얻는 단계.
상기 단계 (1)에서 사용되는 콩은, 일반적으로 청국장을 제조하는데 사용되는 것이면 종류를 불문하나, 바람직하게는 대두이다.
단계 (1)에서의 청국장 제조과정은 공지된 일반적인 제조과정이 적용될 수 있다. 구체적으로는, 콩을 물에 20~30시간, 바람직하게는 24시간 동안 침지시킨 후, 콩이 완전히 물러질 때까지 3~8시간, 바람직하게는 6시간 동안 증자하고, 상기 증자된 콩은 볏짚을 첨가하여 20~30시간, 바람직하게는 24시간 동안 발효시킨다.
상기 단계 (2)에서 분말화시키는 과정은, 구체적으로는, 제조된 청국장을 -70℃의 온도에서 냉동시키고, 이를 동결건조기를 사용하여 건조시킨 후, 믹서기를 사용하여 분말화하는 것이 바람직하나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 탈지는 분말화된 시료에 헥산을 사용하여 수행되는데, 구체적으로는, 청국장 분말을 플라스크에 넣고 헥산을 넣은 후, 이를 잘 흔들어 준 뒤 일정시간이 지나면 헥산을 따라내는 과정을 7~10회 반복하여 탈지시키며, 상기 과정 후 상온에서 헥산을 날려보낸다.
상기 단계 (3)에서 탈지된 시료를 메탄올로 추출하는 과정은, 100% 메탄올을 사용하여 12~36시간 동안 추출하는 것이 바람직하며, 24시간 동안 추출하는 것이 가장 바람직하다. 추출된 시료는 35℃의 온도에서 감압농축기로 메탄올이 완전히 날아가도록 농축한다.
상기 단계 (4)에서 사용되는 순환식 HPLC는, 많은 양의 시료를 우수한 분리능으로 분리할 수 있는 것으로서, 최대 3g, 부피로는 50ml까지 시료 주입이 가능한 장치이다. 분획에 사용되는 컬럼, 이동상에 사용되는 용매, 흡광도 및 유속 등의 조건은 당업자에 의하여 적절하게 조절 가능하다.
구체적인 예로서, 상기 단계 (4)는, 청국장 분획물을 얻는데 사용되는 컴럼으로서 GS-310 컬럼을 사용하고, 이동상으로 100% 메탄올을 사용하고, 흡광도는 280nm에서, 분당 5ml의 유속인 조건에서 수행될 수 있다.
상기의 구체적인 예에서의 조건으로 순환식 HPLC를 수행할 경우, 피크(peak)가 나타나는 총 4종의 분획물을 다음의 시간별로 얻을 수 있다:
(1) 분획물 1: 38~53분(15분간),
(2) 분획물 2: 53~70분(17분간),
(3) 분획물 3: 70~85분(15분간),
(4) 분획물 4: 85~96분(11분간).
상기 단계 (4)에서 얻어진 분획물에 대한 항산화 활성은 공지의 방법인 DPPH 법 및 NBT 환원법에 따라 측정이 가능하다. 상기 항산화 활성 측정의 결과로부터 항산화 활성이 높은 분획물을 얻고, 다음의 단계 (5)의 재분획에 사용한다. 구체적인 예로서, 상기 4종의 분획물 중 항산화 활성을 높게 나타내는 분획물 2를 재분획에 사용할 수 있다.
상기 단계 (5)의 재분획에 사용되는 순환식 HPLC는, 상기 단계 (4)의 청국장 분획물을 얻는데 사용되는 것과 동일한 것을 사용하는 것이 바람직하다.
구체적인 예로서, 상기 단계 (5)는, 상기 단계 (4)에서 얻어진 항산화 활성이 높게 나타난 분획물 2를 W-252 컬럼을 사용하고, 이동상으로 100% 메탄올을 사용하고, 흡광도는 280nm으로 하고, 분당 3.5ml의 유속인 조건에서 수행될 수 있다.
상기의 구체적인 예에서의 조건으로 순환식 HPLC를 수행할 경우, 피크(peak)가 나타나는 총 5종의 재분획물을 다음의 시간별로 얻을 수 있다:
(1) 재분획물 2-1: 46~55분(9분간),
(2) 재분획물 2-2: 55~69분(14분간),
(3) 재분획물 2-3: 69~86분(17분간),
(4) 재분획물 2-4: 86~115분(29분간),
(5) 재분획물 2-5: 115~155분(40분간).
상기 단계 (5)에서 얻어진 재분획물에 대한 항산화 활성은 분획물의 항산화 활성을 측정하는 방법과 동일한 측정 방법에 따라 측정할 수 있다.
상기의 측정법에 의하여, 상기 구체적인 예에서의 재분획물 2-1 내지 2-5는 모두 항산화 활성을 가지는 것으로 나타났으며, 특히, 재분획물 2-2 및 재분획물 2-3이 우수한 항산화 활성을 가지는 것으로 나타났다.
본 발명의 항산화 활성을 가지는 펩타이드 함유 청국장 추출물은, 상기 제조방법에 의하여 얻어진 항산화 활성을 가지는 분획물 또는 항산화 활성을 가지는 재분획물을 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기의 구체적인 예에 있어서는, 항산화 활성을 가지는 펩타이드 함유 청국장 추출물은, 상기한 분획물 2 또는 재분획물 2-1 내지 재분획물 2-5 중 1종 이상을 포함하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는, 재분획물 2-1 및 재분획물 2-3을 포함할 수 있다.
상기 재분획물 2-2 및 재분획물 2-3은 8종의 아미노산으로 구성된 항산화활성이 높은 펩타이드를 함유한다.
본 발명의 항산화 활성을 가지는 펩타이드 함유 청국장 추출물은 식품 첨가물로서 여러가지 기능성 식품 소재로 사용될 수 있다.
본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 구체적으로 이해될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
[
실시예
]
1. 청국장 제조
2004년산 국산콩(황금콩) l,000g을 물에 24시간 침지시킨 후, 콩이 완전히 물러질 때까지 대략 6시간 압력밥솥을 이용하여 증자하였다. 증자된 콩은 35g의 볏짚을 첨가하여 24시간 발효시켰다. 이때 발효된 청국장의 무게는 약 2037.1g이었다.
2. 동결건조, 탈지, 메탄올 추출 및 감압농축
제조된 청국장은 -70℃의 초저온 냉동고에서 급속 동결시킨 후, 이를 동결건조기를 이용하여 건조시키고, 상기 건조된 시료를 만능 슈퍼믹(대성아트론 제품)을 이용하여 분말화하였다. 분말화된 청국장 1kg을 삼각 플라스크에 넣고, 헥산(Hexane) 3L를 첨가하여 잘 흔들어 준 다음 방치한 후 헥산을 따라내었다. 이와 같은 탈지 과정은 지방이 완전히 제거될 때까지 10회 반복 수행하였다. 그 후, 입구가 넓은 통에 옮겨서 헥산이 날아가게 두었다. 상기 탈지된 시료를 100% 메탄올로 24시간 추출하였다. 메탄올 추출물은 여과를 실시하고, 얻어진 여과물은 35℃에서 감압농축기(LABO ROTA 300 Resona)로 농축을 하고, 이를 다시 HPLC 등급의 메탄올로 용해 후, HPLC용 여과지로 여과하였다.
3. 순환식
HPLC
를 이용한 청국장 메탄올 추출물의 분리
순환식 HPLC(JAI Associates Recycling Preparative HPLC)를 사용한 청국장의 메탄올 추출물로부터 각 분획물의 분리는 GS-310 컬럼(20×500mm)을 이용하여, 이동상은 100% 메탄올로 흡광도 280nm(JAI UV-3702)로 고정하였다. 추출물의 주입량(Injection volume)은 추출물이 1g 정도 포함되도록 계산하여 10ml 씩 주입하였으며, 이때 순환식 HPLC의 유속(flow rate)은 분당 5ml로 고정하였고, 분획물 1은 38~53분(15분간), 분획물 2는 53~70분(17분간), 분획물 3은 70~85분(15분간) 및 분획물 4는 85~96분(11분간)으로 하여 얻었다. 이와 같은 작업을 50회 반복하여 4종의 분획물을 얻은 후, 각각을 감압농축하였다.
4.
DPPH
법과
NBT
환원법에 의한 항산화 활성 검정
50%의 에탄올(ethanol)에 용해된 0.35mM DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl) 용액 2.5ml에 분획물을 0.2ml 첨가한 후, 1분간 반응시켜 흡광분광광도계(VARIAN CARY 300, UV-Visible Spectrophotometer)를 사용하여 517nm의 흡광도에서 메탄올을 대조군으로 하여 흡광도를 측정하였다. 청국장의 메탄올 추출물의 DPPH 활성은 8.8%이었으나, 4종의 분획물 중 분획물 2는 72.4%로 높은 DPPH 활성을 나타냈다(도 3a).
NBT(Nitro blue tetrazolium) 환원법은 시험관에 반응용액 3ml를 넣고, 60uL의 분획물과 30uL의 리보플라빈(riboflavin)을 넣고, 25℃의 조건에서 20-W Sylvania Groiux fluorescent lamp에서 7분간 반응시킨 후, 메탄올을 대조군으로 하여 560nm에서 측정하였다. NBT 환원억제력의 측정결과 청국장의 활성이 54.6%였으나, 분획물 2는 81.4%로 활성이 높았다(도 3b).
상기 항산화 활성의 검정결과로부터 분획물 2가 높은 항산화 활성을 나타냄을 확인하고, 분획물 2를 대상으로 순환식 HPLC에 의한 재분획을 반복 실시하였다.
5. 순환식
HPLC
에 의한 재분획
순환식 HPLC(JAI Associates Recycling Preparative HPLC)를 사용하여 활성이 높은 분획물 2를 재분획하였다. 이때 사용된 컬럼은 W-252(20×500mm)로, 이동상은 100% 메탄올로 흡광도 280nm(JAI UV-3702), 이동상의 유속은 분당 3.5ml를 유지하였다. 이 때, 재분획물 2-1은 46~55분(9분간), 재분획물 2-2는 55~69분(14분간), 재분획물 2-3은 69~86분(17분간), 재분획물 2-4는 86~115분(29분간) 및 재분획물 2-5는 115~155분(40분간)으로 하여 얻었다. 얻어진 재분획물을 감압농축하고, 이들 중 활성이 높은 분획을 얻기 위하여 항산화활성을 검정하였다.
6.
재분획물을
DPPH
법과
NBT
환원법에 의한 항산화 활성 검정
수집된 재분획물의 DPPH 활성의 검정은 상기 4와 동일한 방법에 의하여 수행하였다. 메탄올을 대조군으로 측정한 결과, 재분획물 중의 재분획물 2-2의 DPPH 활성이 73.3%로 높은 활성을 나타내었다(도 4a).
NBT 환원법은 상기 4와 동일한 방법에 의하여 수행하였다. 메탄올을 대조군으로 560nm에서 측정한 결과, NBT환원 억제력은 재분획물 2-2가 69.1%, 재분획물 2-3이 70.5%로 각각 높은 활성을 나타내었다(도 4b).
7. 분석용
HPLC
에 의한
분획물의
분자량 특성 구명
분석용 HPLC인 Millenium32 HPLC Workstation System(Waters, USA)를 이용하여 Reverse-phase C18 컬럼(4.6×250mm, Phenomenex, USA)으로 Waters 2487 검출기로 210nm에서 얻어진 분획물 2, 재분획물 2-2 및 분획물 2-3의 분자량 특성을 조사하였다. 시료의 주입량(injection volume)은 20uL이고, 유속은 분당 1ml를 유지하였다. 이때 사용된 이동상은 두개의 용매를 사용하였는데, 용매 A는 0.1%의 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid:TFA) 초순수용액이고, 용매 B는 0.1%의 TFA가 함유된 아세토니트릴(acetonitrile) 용액이었다. 결과는 도 5에 나타내었다. 분리된 분획물의 특성을 검토한 결과, 검출된 피크로부터 분리된 물질이 저 분자량의 물질로 구성되어 있음을 확인할 수 있었다.
8. 아미노산 분석을 통한
펩타이드의
아미노산 조성 확인
농축된 분획물 2-2 및 분획물 2-3에 6N의 HCl용액(용액 1) 3ml를 가하여, 110℃에서 24시간 동안 가수분해시킨 후, 활성화된 Sep-pak C18 cartridge로 여과하고, 아미노산 분석기(L-8800 Amino acid autoanalyzer, Japan)로 분석하였다. Sep-pak C18 cartridge의 활성화 방법은 용액 1:0.1% TFA, 용액 1:메탄올(80:20, v/v), 용액 1:메탄올(70:30, v/v)의 순서로 5ml를 통과시켜 Sep-pak C18 cartridge를 활성화하였다. 청국장, 재분획물 2-2 및 재분획물 2-3의 아미노산 조성은 다음의 표 1에 나타내었다. 아미노산 분석 결과 항산화 활성이 높은 재분획물 2-2 및 재분획물 2-3은 각각 8종의 아미노산으로 구성된 펩타이드에 해당됨을 확인하였다.
아미노산 | 청국장(%) | 재분획물 2-2(%) | 재분획물 2-3(%) |
Asp | 12.3 | 15.9 | 14.1 |
Thr | 6.9 | 4.1 | 6.6 |
Ser | 5.5 | 5.1 | 7.4 |
Glu | 19.3 | 9.7 | 15.0 |
Gly | 11.7 | 49.8 | 36.6 |
Ala | 4.5 | - | - |
Cys | 0.7 | - | - |
Val | 10.6 | - | - |
Met | 1.3 | - | - |
Ile | 1.8 | - | - |
Leu | 4.5 | - | - |
Tyr | 0.4 | - | - |
Phe | 0.8 | - | - |
Lys | 4.3 | 4.7 | 7.2 |
NH3 | 3.3 | - | - |
His | 4.3 | 6.0 | 7.9 |
Arg | 1.1 | 4.6 | 5.1 |
Pro | 6.7 | - | - |
이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명에 의한 펩타이드 함유 청국장 추출물의 제조 방법은 순환식 HPLC를 이용하여 보다 간단하게 추출물을 제조할 수 있고, 본 발명에 의하여 제조된 펩타이드 함유 청국장 추출물은 높은 항산화 활성을 가지므로 건강 기능성 식품 소재로의 이용 가치가 매우 높다.
Claims (5)
- (1) 콩을 원료로 청국장을 제조하는 단계,(2) 제조된 청국장을 분말화시킨 후 탈지시키는 단계,(3) 탈지된 시료를 메탄올로 추출한 후 농축하는 단계,(4) 농축된 시료를 순환식 고성능액체크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 분획물을 얻는 단계,(5) 상기 분획물 중 항산화 활성을 가지는 분획물을 순환식 고성능액체크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 항산화 활성을 가지는 재분획물을 얻는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 항산화 활성을 가지는 펩타이드 함유 청국장 추출물의 제조 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 항산화 활성을 가지는 분획물 및 항산화 활성을 가지는 재분획물은 디피피에이치(DPPH:1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)법 또는 엔비티(NBT:nitro blue tetrazolium)환원법에 의하여 검정되는 것을 특징으로 하는 항산화 활성을 가지는 펩타이드 함유 청국장 추출물의 제조 방법.
- 제1항 또는 제2항의 방법에 의하여 얻어지는 항산화 활성을 가지는 분획물 또는 항산화 활성을 가지는 재분획물을 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화 활성을 가지는 펩타이드 함유 청국장 추출물.
- 삭제
- 제3항의 항산화 활성을 가지는 펩타이드 함유 청국장 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020060015978A KR100742185B1 (ko) | 2006-02-20 | 2006-02-20 | 항산화 활성을 가지는 펩타이드 함유 청국장 추출물 및이의 제조 방법 |
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2006
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