KR100446090B1 - 사우로락탐계 알카로이드의 퇴행성 뇌신경계 질환의 예방과 치료제로서의 용도 및 이 화합물을 유효성분으로 함유하는 약학적 제제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 하기 화합물 1, 2 또는 3을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌신경계 질환의 예방과 치료용 조성물에 관한 것이다.

,

사우로락탐(화합물 1) N-메틸-아리스토락탐 BII(화합물 2)

사우로락탐-3-O-(E)-p-메톡시신나메이트

Description

사우로락탐계 알카로이드의 퇴행성 뇌신경계 질환의 예방과 치료제로서의 용도 및 이 화합물을 유효성분으로 함유하는 약학적 제제 {Pharmaceutical preparations containing an saurolactam alkaloid derivative for prevention and treatment of neurodegenerative disease}

본 발명은 하기 화합물 1, 2 또는 3을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌신경계 질환의 예방과 치료용 조성물에 관한 것이다.,사우로락탐(화합물 1) N-메틸-아리스토락탐 BII(화합물 2)사우로락탐-3-O-(E)-p-메톡시신나메이트

최근 노인 인구의 증가와 병행하여 퇴행성 뇌신경계 질환을 앓고 있는 환자가 급증하고 있다. 대표적인 퇴행성 뇌신경계 질환으로 노인성 치매를 들 수 있다. 노인성 치매는 기억력의 상실, 학습력의 저하가 주 증상인 질환으로 환자는 물론 그 가족까지 함께 커다란 고통을 겪어 이미 사회적인 문제로 대두되어 이의 예방 및 치료에 대한 관심은 날로 높아져 가고 있다. 한편, 생명과학과 과학기술의 눈부신 발달로 인간의 삶은 질적으로 향상되었으나 이에 따른 성인병의 발병률 역시 높아지고 있어 이로 인한 2차적인 증상에 따른 퇴행성 뇌신경계 질환, 예를 들면 뇌졸중의 발병률 또한 높아지고 있다. 이와 같이 퇴행성 뇌신경계 질환의 발병은 여러 가지 원인에 의하여 계속 증가되고 있으나 아직까지도 이들 질환을 효과적으로 예방하거나 치료할 수 있는 의약품은 개발되어 있지 않다고 하여도 과언은 아니다.

퇴행성 뇌신경계 질환은 노화에 의한 뇌신경세포의 구조적 퇴화, 순환기 장애 등 다른 성인병에 기인한 2차적 증상, 또는 교통사고, 산업재해, 일산화탄소 중독 등 다양한 물리적, 기계적 요인에 의하여 뇌가 손상을 입으면 일어날 수 있다 (Rothman, S. M. (1984) Synaptic release of excitatory amino acid neurotransmitter mediates anoxic neuronal death. J. Neurosci. 4: 1884-1891, and Weiloch, T. (1985) Hypoglycemia-induced neuronal damage prevented by an NMDA antagonists. Science 230: 681-683).

이상과 같은 이유로 뇌에 혈류량이 감소되거나, 뇌로의 혈액 공급이 차단되어 뇌조직이 저산소, 저포도당 상태가 되면 뇌는 정상대사를 할 수 없어 결국은 회복될 수 없는 손상을 입게 되는데 이러한 경우는 발작(stroke), 외상(trauma) 및 허혈성 손상(ischemic injury)뿐만 아니라 퇴행성 뇌신경계 질환에서 아주 흔하게 볼 수 있다.( Benveniste, H., Drejer, J., Schousboe, A. and Diemer, N. H. (1984) Elevation of the extracellular concentrations of glutamate and aspartate in rat hippocampus during transient cerebral ischemia monitored by intracerebral microdialysis. J. Neurochem. 43: 1369-1374; and Hagberg, H., Lehmann, A., Saucberg, M., Nystrom, B., Jacobson, I. and Hamberger, A. (1985) Ischemia-induced shift of inhibitory and excitatory amino acids from intra- to extracellular compartments. J. Cereb. Blood Flow & Metab. 5: 413-419).

뇌조직의 손상은 크게 두 가지 기전에 의한 것으로 알려졌는데, 첫 번째로는 세포막 전압의 변화에 의한 흥분성 아미노산 유리의 증가에 의한 것이며, 두 번째로는 직접적인 산화적 스트레스( oxidative stress)에 의한 것이다 ( Choi, D. W. (1988) Glutamate neurotoxicity and disease of the nervous system. Neuron 1: 623-634; and Coyle, J. T. and Purrfarcken, P. (1993) Oxidative stress, glutamate and neurodegenera- tive disorders. Science 262: 689-695). 최근의 연구에 따르면 글루타메이트는 ionotrophic receptor를 활성화시킴으로써 oxidative stress를 일으키는 주된 원인물질로 생각되고 있어 글루타메이트성 신경의 이상은 stroke, trauma 및 ischemic injury의 주 발병원인으로 여겨지고 있다 ( Halliwell, B and Gutteridge J. M. (1985a) Oxygen radicals and the nervous system. Trends Neurosci. 5: 22-26; and Halliwell, B and Gutteridge J. M. (1985b) The importance of free radicals and catalytic metal ions in human diseases. Mol. Aspects Med. 8: 89-193). 뇌의 혈류량이 감소하게 되면 신경 접합부에서 글루타메이트의 유리가 증가되며, 신경세포 안으로의 유입이 감소되어 세포 외의 글루타메이트 농도가 급속히 증가되면서 독성을 유발시켜 결국 신경세포는 사멸하게 된다 (Benveniste, H., Drejer, J., Schousboe, A. and Diemer, N. H. (1984) Elevation of the extracellular concentrations of glutamate and aspartate in rat hippocampus during transient cerebral ischemia monitored by intracerebral microdialysis. J. Neurochem. 43: 1369-1374; and Hagberg, H., Lehmann, A., Saucberg, M., Nystrom, B., Jacobson, I. and Hamberger, A. (1985)Ischemia-induced shift of inhibitory and excitatory amino acids from intra- to extracellular compartments. J. Cereb. Blood Flow & Metab. 5: 413-419). 이러한 글루타메이트에 의한 신경독성은 아주 강력하고 빠르게 나타나는 "급성독성"과 저농도의 글루타메이트에 노출되었거나 고농도의 글루타메이트에 단시간 노출되었을 경우 나타나는 "만성독성"으로 나누어진다 ( Choi, D. W. (1988) Glutamate neurotoxicity and disease of the nervous system. Neuron 1: 623-634). 급성독성은 세포 외에 있는 Ca²⁺이 세포 내로 과량으로 유입되어 시작되며, 세포의 삼투압 유지를 위해 뒤따르는 Na⁺, K⁺및 Cl^-등의 이온들의 유입으로 말미암아 세포는 부풀게 되고 결국 터져 죽는 형태로 나타난다 ( Kauppisen, R. A., McMahonm, H. T. and Nicholls, D. G. (1988) Ca²⁺-dependent and Ca²⁺-independent glutamate release, energy status and cytosolic free Ca²⁺concentration in isolated nerve terminals following metabolic inhibition: Possible relevance to hypoglycemia and anoxia, Neurosci. 27: 175-182; and Garthwaite, G. and Garthwaite, J. (1988) In vitro neurotoxicity of excitatory acid ]analogues during cerebellar development, J. Neurosci. 17: 755-767).

글루타메이트에 의한 만성독성은 글루타메이트의 수용체인 NMDA 수용체와 non-NMDA 수용체인 kainic acid/AMPA 수용체를 활성화시킴으로써 일어난다 ( Coyle, J. T. and Purrfarcken, P. (1993) Oxidative stress, glutamate andneurodegenera- tive disorders. Science 262: 689-695.). 즉, 글루타메이트에 의해 NMDA와 non-NMDA 수용체가 활성화되어 Ca²⁺유입되고 세포 내 calcium-dependent 효소인 phospholipase A2가 비정상적으로 활성화되면 polyunsaturated free fatty acids 생성이 증가되고, superoxide radical 및 hydroxyl radical과 같은 free radicals가 과다하게 생성되어 세포의 과산화를 촉진시켜 결국은 세포가 죽게 되는 만성독성이 일어나게 된다 ( Coyle, J. T. and Purrfarcken, P. (1993) Oxidative stress, glutamate and neurodegenera- tive disorders. Science 262: 689-695; Halliwell, B and Gutteridge J. M. (1985a) Oxygen radicals and the nervous system. Trends Neurosci. 5: 22-26; Halliwell, B and Gutteridge J. M. (1985b) The importance of free radicals and catalytic metal ions in human diseases. Mol. Aspects Med. 8: 89-193; Siesjo, B. K. and Wieloch, J. (1985) Cerebral metabolism in ischaemia: neurochemical basis for therapy. Br. J. Anaesth. 47: 47-62; Sladeczek, F., Pin, J. P., Recasens, M., Bokaerk, J. and Weiss, S. (1985) Glutamate stimulates inositol phosphate formation in striatal neurones. Nature 317: 717-719; and Choi, D. W. and Koh, J. (1987) Ionic dependence of glutamate neurotoxicity. J. Neurosci. 7: 369-379). NMDA 수용체가 활성화되면 nitric oxide 합성효소의 활성도 또한 증대되어 nitric oxide이 과다하게 생성되며 이 또한 세포의 과산화를 촉진시킨다 ( Strijbos, P. J. L. M. Leach, M. J. and Garthwaite, J. (1996) Vicious cycle involving Na+ channels,glutamate release and NMDA receptors mediates delayed neurodegeneration through nitric oxide formation. J. Neurosci. 16: 5004-5013). 글루타메이트에 의한 신경독성은 글루타메이트의 길항물질, Na+ 및 Ca2+ channel 차단제, 항산화제, free radical chain breakers 및 xanthine dehydrogenase로부터 xanthine oxidase로의 전환을 억제하는 효소인 antiproteases 등에 의하여 방지될 수 있으나 특히, NMDA 수용체에 대한 길항물질이 효과적이다 ( Choi, D. W., Koh, J. and Peters, S. (1988) Pharmacology of glutamate neurotoxicity in cortical cell culture: attenuation by NMDA antagonists. J. Neurosci. 8: 185-196; and Olney, J. W. and Sharpe, I. G. (1969) Brain lesions in an infant rhesus monkey treated with monsodium glutamate. Science 166: 368-388)

한편, 노인성 치매를 일으키는 주원인 질환인 알쯔하이머씨 병의 치료제를 개발하기 위하여서는 글루타메이트성 신경의 경우는 상반된 연구 결과들에 따라 그 기능을 항진시키는 면 (효능제의 이용)과 억제시키는 면 (길항제의 이용) 모두에서 진행되고 있다. 즉, 글루타메이트성 신경이 손상되어 글루타메이트의 양이 감소되면 기억력과 학습력이 저하되며 퇴행성 뇌신경계 질환인 알쯔하이머씨 병 환자의 경우 글루타메이트 수용체인 NMDA 수용체 수가 75-87%, non-NMDA 수용체 수가 45-69% 감소된다 ( Cowburn, R., Hardy, J., Roberts, P. and Briggs, R. (1988) Regional distribution of pre- and postsynaptic glutamatergic function in Alzheimer's disease. Brain Res. 452: 403-407; Greenamyre, J. T., Penney, J. B., D'Amato, C. J. and Young A. B. (1987) Dementia of the Alzheimer's type:Changes in hippocampal L-[3H] glutamate binding,. J. Neurochem. 48: 543-551; and Chalmers, D. T., Dewar, D., Graham, D. I., Brooks, D. N. and McCulloch, J. (1990) Differential alternations of cortical glutamatergic binding sites in senile dementia of the Alzheimer type. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1352-1356). 뿐만 아니라 글루타메이트 수용체는 기억력과 학습력에 관여한다고 알려진 뇌의 부위에 집중적으로 분포되어 있어, 알쯔하이머씨 병에서의 기억력 상실과 학습력 저하가 글루타메이트 수용체의 이상에 의하여 크게 영향을 받으리라 생각된다 ( Izquierdo, I. (1991) Role of NMDA receptors in memory. Trends Pharm. Sci. 12: 260- 265). 기억과 학습시 세포 내 calcium 이온이 증가하고, 단백분해효소가 활성화되어 글루타메이트 수용체가 증가하게 되어 결과적으로 시냅스에서 장시간동안 구조 및 화학적인 변화가 일어남으로써 기억과 학습을 할 수 있다는 것이 가장 가능성 있는 가설로 여겨지고 있다 (Thompson, R. F. (1986) The neurobiology of learning and memory. Science 233: 941- 947). 알쯔하이머씨 병은 기억력 상실이 대표적으로 인지되는 질환이고 글루타메이트 효능제 역시 학습력과 기억력에 중대한 역할을 하는 것으로 알려져 있기 때문에 효능제를 투여하여 기억력 상실의 치료제로 사용할 가능성이 연구되고 있으며, 몇몇 효능제가 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다 ( Willetts, J., Balster, R. L., Leander, J. D. (1990) The behavioral pharmacology of NMDA receptor antagonists. Trends Pharmacol Sci 11: 423-428). 그러나 알쯔하이머씨 병 환자에서는 대뇌피질과 해마의 글루타메이트성 신경의 시냅스 전말단에서의 글루타메이트 uptake에 이상이 생겼으며, 글루타메이트를 대사시켜 GABA를 합성하는 효소인 glutamic acid decarboxylase의 양이 감소되어 결과적으로는 시냅스에서의 글루타메이트의 양이 증가하게 되는 결과를 초래하게 되었다 ( Willetts, J., Balster, R. L., Leander, J. D. (1990) The behavioral pharmacology of NMDA receptor antagonists. Trends Pharmacol Sci 11: 423-428).

본 연구에서는 상기의 문헌적 고찰을 바탕으로 하여 예로부터 건망이나 뇌졸중 등의 퇴행성 뇌신경계 질환에 유효하다고 알려져 민간이나 전승의약에서 사용되어온 생약을 중심으로 일차배양한 흰쥐의 대뇌피질세포에서 뇌신경계에 미치는 영향을 검색하였다. 즉, 일차배양한 흰쥐의 대뇌피질세포에 생약의 총 메탄올 추출물을 투여한 후 과량의 글루타메이트를 작용시켜 유발되는 신경세포의 사멸에 어떠한 영향을 미치는가를 알아보던 중 삼백초의 총 메탄올 추출물이 유의성 있는 뇌신경세포 보호 활성을 가짐을 알 수 있었다.

삼백초는 삼백초과 (Saururaceae)에 속하는 다년생 초본으로 민간에서 풀 전체 또는 뿌리나 잎이 풍독 (風毒), 이뇨 (利尿), 수종 (水腫), 임질 (淋疾), 간염 (肝炎), 폐렴 (肺炎), 변독 (便毒), 고혈압 (高血壓) 등의 치료에 사용되어 왔다 (정 보섭, 신 민교 : 향약대사전, 영림사, 서울, 812-814 (1990). 삼백초는 잎, 꽃 및 뿌리가 백색이며, 윗부분의 화서 (花序)밑에 달린 3개의 잎이 흰색으로 변하므로 삼백초 (三白草)라 하며, 삼백초의 뿌리는 삼백초근 (三白草根)이라 불린다. 삼백초과에는 전세계적으로 3속 4 - 5종의 식물이 분포하며, 우리나라에는 삼백초과 식물로 삼백초속에 속하는 삼백초와 일본에서 귀화한 것으로 추정되는 약모밀속에 속하는 약모밀 (Houttuynia cordata Thunb.)의 2속 2종이 분포한다. 삼백초속 식물은 전세계에 2종이 분포하며 아시아에 분포하는 삼백초 (Saururus chinensis)와 북아메리카에 1종 (Saururus cernuus, Lizard tail)이 있다 (이 영노 : 원색 한국식물도감, 교학사, 서울, pp 218-219 (1972)). 삼백초는 명의별록 (名??別錄)에 수재되어 있으며, 7-9월에 지상부를 채집하여 햇빛에 말려 사용한다. 미 (味)는 고신 (苦辛)하고 성 (性)은 한 (寒)하며, 간 (肝), 폐 (肺), 신경 (腎經)에 들어간다. 습열 (濕熱), 청리 (淸利), 소독 (消毒), 해독 (解毒)의 효능이 있는 것으로 알려져 있다 ( 정 보섭, 신 민교 : 향약대사전, 영림사, 서울, 812-814 (1990).

삼백초의 화학 성분에 대한 연구는 그 동안 주로 지상부의 flavonoids, alkaloids, amino acids, fatty acids, quinone 및 정유 성분에 대해 진행되었다. 전초의 정유 성분으로는 methyl-n-nonyl-ketone이 주성분으로 보고되었으며, 이 이외에도 α-pinene, camphene, linalool, safrol, β-caryophyllene, humulene 등이 보고된 바 있다 ( Choe, K. H., Yoon, C. H. and Kwon, S. J. (1988b) Chemical composition of Saururaceae growing in Korea - on volatile constituents of Saururus chinensis by GC/MS. Punsok kwahak 1: 259-262; and Choe, K. H., Kwon, S. J. and Lee K. C. (1989) Chemical composition of Saururaceae growing in Korea - on fatty acids and amino acids of Houttuynia cordata and Saururus chinensis. Punsok kwahak 2: 285-288). 삼백초 지상부의 주성분의 하나인flavonoid로는 hyperin, quercetin, isoquercitrin 및 quercitrin 등이 보고되었으며 ( Choe, K. H., Yoon, C. H. and Kwon, S. J. (1994) A study of chemical constituents of Saururaceae growing in Korea - on flavonoid constituents of Saururus chinensis. Anal. Sci. Technol. 7: 11-15; Sung, S. H., Kwon, S. H., Cho, N. J. and Kim, Y. C. (1997) Hepatoprotective flavonolglycosides of Saururus chinensis Herbs. Phytotherapy Res. 11: 500-503; and Wang, E. C., Shih, M. H., Liu, M. C., Chen, M. T. and Lee, G. H. (1996) Studies on constituents of Saururus chinensis. Heterocycles 43: 969-972). emodin, physcion 등의 quinone 계열 성분과 carpanone 계열의 lignan도 보고되었다.(Crohare, R., Priestap, H. A., Farina, M., Cedola, M. and Ruveda, E. A. (1962) Aristolactams of Aristolochia argentina. Phytochemistry 13: 1957-1960),

또한, aristolactam 계열의 alkaloid인 saurolactam이 삼백초의 세포독성 성분으로 분리되었으며(Priestap, H. A. (1989) 13C-NMR spectroscopy of aristolochic acid and aristolactams. Magn. Reson. Chem. 27: 460-465), 동일 계열의 alkaloid인 N-methyl-aristolactam BII도 분리 보고되었다 ( Crohare, R., Priestap, H. A., Farina, M., Cedola, M. and Ruveda, E. A. (1962) Aristolactams of Aristolochia argentina. Phytochemistry 13: 1957-1960). 한편, cupric acid, linoleic acid 및 lauric acid의 지방산과 alanine, valine, glutamic acid, aspartic acid, leucine, isoleucine 및 proline의 아미노산의 존재도 확인되었다 (Priestap, H. A. (1985a) Seven aristolactams from Aristolochia argentina. Phytochemstry 24: 849-852).

이에 본 연구에서는 삼백초 및 삼백초근의 추출물, 삼백초로부터 분리한 단일물질 및 이들로부터 합성된 유도체들을 퇴행성 뇌신경계 질환의 치료제로 개발하기 위한 기초연구를 수행하고 그 작용기전을 밝힘으로써 뇌졸중이나 노인성 치매와 같은 퇴행성 질환 등을 예방하거나 이를 치료할 수 있는 의약품으로써 개발 가능한 후보물질로 제시하고자 한다.

도 1은 oxidative stress의 지표인 세포 내 peroxide의 양을 정량하여 S-MCA의 신경세포 보호활성을 측정하여 나타낸 그래프이다.

삼백초의 추출은 메탄올, 에탄올 또는 프로판올과 같은 저급 알칸올, 메틸렌클로라이드 또는 클로로포름과 같은 염소화탄화수소, 헥산 또는 헵탄과 같은 탄화수소류, 벤젠, 톨루엔 등과 같은 방향족 탄화수소, 또는 이들의 혼합용매중에서 추출한다.

다음에 실시예 및 실험예로서 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

실시예 1

삼백초의 추출 및 분획

음건한 삼백초 10kg을 CHCl₃- MeOH (1 : 1)의 혼합용매로 3회, 2시간 동안 열탕 추출하였고, 감압농축하여 총 엑스 1kg을 얻었다. 삼백초 엑스 (1.8kg)를 증류수에 현탁시킨 다음, CH₂Cl₂으로 분획하고 감압농축하여 CH₂Cl₂분획과 물 분획을 얻었다. 농축한 CH₂Cl₂분획물을 다시 90% MeOH에 현탁시킨 다음, n-헥산으로 분획하여 90% MeOH 분획물 (120g)과 n-헥산으로 분획물 (60g)을 얻었다.

실시예 2

화합물 1의 분리 및 동정

n-헥산 분획 (60g)을 n-헥산 : EtOAc의 혼합용매 (100:1 → 0:1)로 실리카겔 크로마토그래피하여 20개의 소분획 (Fr. 1 ∼ 20)으로 나누었다 (Scheme 1). 이 중 6번 소분획 (600 mg)을 n-헥산 : CH₂Cl₂: MeOH (5 : 1 : 1)의 혼합용매로 Sephadex LH-20 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 알칼로이드 조분획 (200 mg)을 얻었다. 이를 MeOH : AcCN : H₂O (30:30:40)의 혼합용매로 high performance liquid chromatography (HPLC)를 실시하여 Rt 14.15 min의 peak를 분취하여 감압 하에 농축하였다. 이를 MeOH를 사용하여 재결정하여 무색 침상 결정인 화합물 1 (100 mg)을 얻었다.

화합물 1의 구조결정

황색 분말

UV (CHCl₃) λmax (log ε): 388.10 (3.88), 314.20 (3.94), 287.20 (4.45),276.50 (4.42), 262.10 (4.42), 235.50 (4.56) nm

IR (KBr) νmax: 3220, 1701, 1648, 1427, 1319, 1257, 1031, 972, 835, 737, 604 cm^-1

EIMS (m/z) (rel. int.): 279 [M⁺] (100), 264 (31), 236 (25), 194 (61)

¹H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ 10.32 (OH), 9.10 (1 H, dd, J = 8.85, 2.50 Hz, H-5), 7.94 (1 H, dd, J = 8.16, 2.25 Hz, H-8), 7.62 (1 H, s, H-2), 7.58 (2 H, td, J = 7.00, 7.25 Hz, H-6 and H-7), 7.28 (1 H, s, H-9), 4.01 (3 H, s, OCH₃), 3.38 (3 H, s, NCH₃) ppm

¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ 166.79 (C-1), 152.17 (C-3), 148.81 (C-4), 136.93 (C-9a), 134.64 (C-4a), 129.01 (C-8), 127.44 (C-6), 126.86 (C-5), 126.30 (C-8a), 125.57 (C-7), 120.96 (C-1a and 1b), 120.14 (C-5a), 113.60 (C-2), 103.48 (C-9), 59.52 (OCH₃), 26.17 (NCH₃) ppm

이상의 이화학적 및 분광학적 결과를 근거로 화합물 1을 10-aminomethyl-4-methoxy- 3-hydroxy-phenanthrene-1-carboxylic acid lactam인 사우로락탐으로 추정하였으며, 문헌치와 비교하여 동정하였다.( Crohare, R., Priestap, H. A., Farina, M., Cedola, M. and Ruveda, E. A. (1962) Aristolactams of Aristolochia argentina. Phytochemistry 13: 1957-1960; Priestap, H. A. (1989) 13C-NMR spectroscopy of aristolochic acid and aristolactams. Magn. Reson. Chem. 27: 460-465; and Priestap, H. A. (1985a) Seven aristolactams from Aristolochia argentina. Phytochemstry 24: 849-852).

실시예 3

화합물 2의 분리 및 동정

화합물 1의 분리과정 중 semi-prep. HPLC에서 Rt 15.90 min의 peak를 분취하여 화합물 1과 동일한 방법으로 화합물 2 (10 mg)를 얻었다.

화합물 2의 구조결정

미황색의 분말

UV (CHCl₃) λmax (log ε): 380.00 (3.74), 314.20 (3.78), 285.20 (4.33), 275.00 (4.35), 261.20 (4.27), 230.00 (4.41) nm

IR (KBr) νmax: 3220, 1701, 1648, 1427, 1319, 1257, 1031, 972, 835, 737, 604 cm^-1

EIMS (m/z) (rel. int.): 279 [M⁺] (100), 264 (59), 236 (66)

¹H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ 10.85 (NH), 9.12 (1 H, dd, J = 8.32, 2.01 Hz, H-5), 7.94 (1 H, dd, J = 8.32, 2.01 Hz, H-8), 7.85 (1 H, d, J = 2.01 Hz, H-3), 7.57 (2 H, m, H-6 and H-7), 7.14 (1 H, s, H-9), 4.10 (3 H, s, OCH₃),4.01 (3 H, s, OCH₃) ppm

¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ 168.85 (C-1), 154.71 (C-3), 150.86 (C-4), 135.80 (C-9a), 135.30 (C-4a), 129.51 (C-8), 127.95 (C-6), 127.30 (C-5), 126.38 (C-8a), 125.96 (C-7), 123.78 (C-1a), 122.60 (C-1b), 120.75 (C-5a), 110.37 (C-2), 105.07 (C-9), 60.39 (OCH₃), 57.40 (OCH₃) ppm

이상의 이화학적 및 분광학적 결과를 근거로 화합물 2를 10-aminomethyl-3,4-dimethoxy-phenanthrene-1-carboxylic acid lactam인 N-메틸-아리스토락탐 BII로 추정하였으며, 문헌치 와 비교 검토하여 동정하였다.( Crohare, R., Priestap, H. A., Farina, M., Cedola, M. and Ruveda, E. A. (1962) Aristolactams of Aristolochia argentina. Phytochemistry 13: 1957-1960; Priestap, H. A. (1989) 13C-NMR spectroscopy of aristolochic acid and aristolactams. Magn. Reson. Chem. 27: 460-465; and Priestap, H. A. (1985a) Seven aristolactams from Aristolochia argentina. Phytochemstry 24: 849-852).

실시예 4

화합물 3의 합성 및 동정

삼백초에서 분리한 사우로락탐과 (E)-p-메톡시신남산(methoxycinnamic acid)을 에스테르화 반응을 이용하여 화합물 3를 합성하였다. 사우로락탐 (10 mg), (E)-p-메톡시신남산, 디사이클로헥실 카보디이미드 및 4-디메틸 아미노피리딘을 round bottomed flask에 넣고 Ar 기류하에서 무수 toluene으로 녹인 후, Oil bath로 70℃까지 가온하고 교반하면서 18 시간 반응시켰다. TLC로 반응을 확인한 후 celite를 통과하여 반응 중에 생성된 urea를 제거하였다. 여액을 농축하여 n-hexane : CH₂Cl₂: MeOH (5:1:1) 용매로 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 시행하여 화합물 3를 분리하였다.

화합물 3의 구조결정

황색의 분말

EIMS (m/z) (rel. int.): 409 (17) [M⁺], 293 (16), 279 (14) [M⁺-cinnamic acid], 224 (9) 178 (100), 164 (72), 131(56)

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃): δ 9.10 (1 H, d, J = 8.32 Hz, H-5), 8.00 (1 H, d, J = 15.90 Hz, H-7'), 7.92 (1H, s, H-2), 7.87 (1 H, m, H-8), 7.69 - 7.55 (4 H, m, H-2', 3', 5', 6'), 7.45 (2 H, m, H-6 and H-7), 7.10 (1 H, s, H-9), 6.75(1H, d, J = 15.90 Hz, H-8'), 4.01 (3 H, s, OCH₃), 3.50 (3 H, s, NCH₃) ppm

이상의 이화학적 및 분광학적 결과를 근거로 화합물 3을 사우로락탐 3-O-(E)-p-메톡시신나메이트로 결정하였다.

실험예 1

1. 실험동물

Sprague-Dawley계 흰쥐를 서울대학교 동물사육장에서 공급받아 서울대학교 약학대학 실험동물실에서 사육하였다. 사육장의 환경은 실내온도를 22 ± 5 ℃로 유지하고 조명시간을 아침 7시에서 저녁 7시로 고정하였으며, 사료는 조단백 23.2%, 조지방 4.0%, 조섬유 6.0%, 조회분 10.0%, 조칼슘 0.6%, 조인 0.4% 등이 함유된 고형사료 (서울, 삼양사)를 사용하였다.

2. 흰쥐의 대뇌피질세포의 분리 및 배양

흰쥐 태자의 대뇌 부분만을 적출하여 해부현미경 밑에서 조심스럽게 meninges를 제거한 후 대뇌조직을 0.25% trypsin으로 30분간 처리하여 조직을 연화시켜 개개의 세포가 유리되도록 하였다. 분리한 대뇌피질세포를 1.0 × 10⁶cells/dish 또는 2.0 × 10⁵cells/dish가 되게 하여 collagen 또는 poly-L-lycine으로 도포한 배양 용기 (Falcon, 15 x 24 mm)에 이식하였다. 배양액은 DMEM 90%, fetal bovine serum 10%, penicillin 100 IU/ml과 streptomycin 100 μg/ml 으로 구성된 배양액을 사용하였다. 세포의 배양은 37 ℃ 배양기에서 공기 (95%)와 CO₂(5%)의 혼합기체를 계속 공급하면서 수행하였으며 배양 4일이 지난 후 5 x 10^-5M 5-fluorodeoxyuridine으로 처리하여 신경세포가 아닌 다른 세포의 성장을 억제시켰다.(Choi, D. W. (1985) Glutamate neurotoxicity in cortical cell culture iscalcium dependent. Neurosci. Lett. 58: 293-297).

3. 삼백초 추출물 및 분리 물질의 투여

삼백초의 총 추출물, 분획물 및 분리한 화합물은 DMSO (최종농도 0.1% 이내)에 용해시킨 후 증류수로 희석하여 1mg/ml의 농도로 제조한 다음 millipore membrane (0.22 μm, Millex-GV, U.S.A.)을 통과시켜 무균상태로 만들고 농도를 달리하여 투여하였다.

1) MTT assay

배양 중인 대뇌피질세포의 배양액에 MTT (1mg/ml)를 배양액의 10%가 되도록 가하고 계속하여 3시간 더 배양한 후 생성된 formazan을 DMSO로 녹여낸 다음 540nm에서 흡광도를 측정하였다.(Mosmann, T. (1983) Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immuno. Methods 65: 55-61).

2) Nitric oxide의 정량

일차배양한 대뇌피질세포로부터 배양액 중으로 유리되는 NO는 NO를 nitrite로 전환시켜 측정하는 Dawson 등의 방법을 이용하여 측정하였다.(Dawson, V. L., Brahbhatt, H. P., Mong, J. A. and Dawson, T. M. (1994) Expression of inducible nitric oxide synthase causes delayed neurotoxicity in primary mixed neuronal-glial cortical cultures. Neuropharmacology 33: 1425-1430).

3) 세포 내 Ca²⁺양 정량

일차배양한 대뇌피질세포에 존재하는 Ca²⁺의 양은 Grynkiewicz 등의 방법을 이용하여 측정하였다.(Grynkiewicz, G., Poenie, M. and Tsien, R.Y. (1985) A new generation of calcium indicators with greatly improved fluorescence properties. J. Biol. Chem. 260: 3440-3450).

4) 항산화 효소의 활성

일차배양한 흰쥐의 대뇌피질세포에 존재하는 항산화 효소인 superoxide dismutase, catalase 및 glutathione peroxidase의 활성은 기존의 측정방법 (McCord, J. M., Fridovich, I. Superoxide dismutase, An enzymatic function for erythrocuprein (hemocuprein). J. Biol. Chem. 244: 6049-6055 (1969); Beers, R. F., Sizer, I. W. A spectrophotometric method for measuring the breakdown of hydrogen peroxide by catalase. J. Biol. Chem. 195: 133-140 (1952); and Flohe, L., Gunzler, W. A. Assays of glutathione peroxidase. Method Enzymol. 105: 114-121 (1984))을 수정한 방법으로 측정하였다.(Kim, Y. C., Kim, S. R., Markelonis, G. J., Oh, T. H. Ginsenosides Rb1 and Rg3 protect cultured rat cortical cells from glutamate-induced neurodegeneration. J. Neurosci. Res. 53: 426-432 (1998); and Lee MK, Yeo S, Kim J, Markelonis GJ, Oh TH, Kim YC (2000) Cynandione A from Cynanchum wilfordii protects cultured cortical neurons from toxicity induced by H2O2, L-glutamate, and kainate. J. Neurosci.Res. 59: 259-264).

5) 세포 내 peroxide양 정량

일차배양한 대뇌피질세포에서 글루타메이트에 의해 과다하게 생성되는 peroxide의 양은 Goodman과 Mattson의 방법을 이용하여 측정하였다 (Goodman Y and Mattson, MP (1994) Selected forms of β-amyloid precursor protein protect hippocampal neurons against amyloid -peptide induced oxidative injury. Exp. Neurol. 128: 1-12).

6) 통계처리

통계적 유의성 검토는 각 실험군의 수를 3으로 하였으며 (n=3) 대조치로부터의 변동을 "ANOVA test"로 하였다. P값이 5% 미만일 때는 통계적으로 유의성이 있다고 판정하였다.

7) 결과 및 고찰

일차배양한 흰쥐의 대뇌피질세포에서 글루타메이트에 의한 신경독성에 미치는 삼백초의 총 추출물 및 각 분획물의 효과를 MTT assay로 측정하였다. 그 결과를 표 1에 나타내었다. (Table 1). 즉, 흰쥐에서 대뇌피질세포를 분리하여 20일간 배양한 후 삼백초의 총 추출물 및 각 분획물을 농도별로 투여하고 1시간 후에 50μM 글루타메이트로 신경독성을 유발시켰다. 신경독성 유발 30분 후에 배양액을 DMEM으로 갈아준 후 삼백초의 총 추출물 및 각 분획물을 다시 투여하고 24시간 더 계속하여 배양하였다 (Throughout treatment). 삼백초의 총 추출물, CH2Cl2 분획 및 n-hexane 분획물은 글루타메이트에 의한 신경독성 유발을 유의성있게 차단시키는 효과가 있었다. 일차배양한 흰쥐의 대뇌피질세포에서 유의성 있는 뇌신경세포 보호활성을 나타낸 n-hexane 분획물을 n-hexane:EtOAc (100:1→0:1)의 혼합용매로 silica gel column chromatography를 수행하여 20개의 소분획으로 나누었다. 이들 중 알칼로이드 정색반응인 dragendorff 시약에 양성을 나타내는 6번 소분획을 Sephadex LH-20 column chromatography와 semi-preparative HPLC를 실시하여 compounds 1과 2를 분리하였다. Compounds 1 및 2는 이화학적 및 분광학적 자료를 바탕으로 각각 사우로락탐 및 N-메틸-아리스토락탐 BII로 동정하였다. 그 구조식을 아래에 나타내었다.

Saurolactam(화합물 1) N-methyl-Aristolactam BII(화합물 2)

Saurolactam-3-O-(E)-p-methoxycinnamate(화합물 3)

분리한 아리스토락탐계 알칼로이드의 뇌신경세포 보호 활성을 일차배양한 흰쥐의 대뇌피질세포에서 검색하였다. 즉, 사우로락탐 및 N-메틸-아리스토락탐 BII를 0.1 μM에서 10.0μM의 농도로 throughout treatment하고 MTT assay를 시행하여 뇌신경세포 보호효과를 측정한 결과, 1.0 및 10.0 μM에서 유의성 있는 뇌신경세포 보호활성을 가짐을 알았다.그 결과를 표 2에 나타내었다. (Table 2).

사우로락탐 및 N-메틸-아리스토락탐 BII가 어떠한 기전으로 글루타메이트에 의한 신경독성을 차단시키는지 알아보기 위하여 우선 화합물의 투여시기를 달리하여 보았다. 즉, 사우로락탐 및 N-메틸-아리스토락탐 BII를 농도별로 글루타메이트로 독성을 유발시키기 1시간 전부터 글루타메이트로 독성을 유발시킬 때까지만 투여하고 (pre-treatment), 배양액을 DMEM으로 교환하고 24시간 더 배앙한 후 MTT assay를 시행하였다. 그 결과를 표 3에 나타내었다. (Table 3). 또한, 20일간 배양한 흰쥐의 대뇌피질세포에 글루타메이트를 30분간 작용시켜 독성을 유발시킨 후 DMEM으로 갈아주면서 사우로락탐 및 N-메틸-아리스토락탐 BII를 농도별로 투여하고 24시간 더 계속하여 배양하고 (post-treatment) MTT assay를 시행하였다. 그 결과를 표 4에 나타내었다. (Table 4). 사우로락탐 및 N-메틸-아리스토락탐 BII를 throughout 처리하거나 post- treatment하였을 때는 모두 유의성있게 뇌신경세포를 보호하는 효과를 나타내었다. 그러나, 두 알칼로이드를 pre-treatment 하였을 때는 그 활성이 나타나지 않거나 (사우로락탐을 작용시킨 경우) 약하게 나타나는 것 (N-메틸-아리스토락탐 BII를 작용시킨 경우)을 확인할 수 있었다. 이러한 결과로부터 사우로락탐 및 N-메틸-아리스토락탐 BII의 뇌신경세포 보호활성은 글루타메이트의 수용체에 직접적으로 작용하여 나타나는 것이라기 보다는 글루타메이트 수용체의 과발현 후 일어나는 일련의 반응과정 중에 작용하여 나타나는 것으로 일단은 추정할 수 있었다. 사우로락탐 및 N-메틸-아리스토락탐 BII가 과량의 글루타메이트로 인한 독성유발의 초기단계에서 세포 내로 과다하게 유입되는 Ca²⁺의 양을 유의성있게 감소시키지 못한다는 실험결과가 이러한 추정을 뒷받침한다고 할 수 있겠다 (data not shown).

이에 글루타메이트로 신경독성을 유발시키는 일련의 과정 중 가장 대표적인 원인으로 알려진 nitric oxide (NO)의 과다한 생성에는 어떠한 영항을 미치는가를 알아보았다. 두 아리스토락탐 알칼로이드 중 뇌신경세포 보호활성이 우수하였던 N-메틸-아리스토락탐 BII를 글루타메이트로 신경독성이 이미 유발된 흰쥐의 대뇌피질세포에 0.1μM에서 10.0μM까지 농도별로 post-treatment하고 글루타메이트에 의한 독성에 의하여 증가되는 NO의 생성에는 어떠한 영향을 미치는가를 그 양을 정량하여 알아보았다. 그 결과를 표 5에 나타내었다. (Table 5). N-메틸-아리스토락탐 BII는 글루타메이트의 독성에 의해 증가된 NO의 양을 1.0μM에서 86.8% 수준까지 감소시켰다. 이러한 N-메틸-아리스토락탐 BII의 효과는 양성대조약물인 N^ω-nitro-L-arginine의 효과보다 훨씬 우수하였다. 이에 N-메틸-아리스토락탐 BII는 직접적으로 nitric oxide synthase에 작용하여 NO의 생성을 저해시키거나 또는 항산화효소의 활성을 증대시킴으로 세포에 직접적인 독성물질로 작용하는 peroxynitrite의 생성을 저하시킴으로써 뇌신경세포 보호활성을 나타나는 것이라고 추정할 수 있었다.

따라서, N-메틸-아리스토락탐 BII의 뇌신경세포 보호활성이 항산화 효소의 활성 증대에 기인한 것인가를 일차배양한 흰쥐의 대뇌피질세포 내에 존재하는 SOD, catalase 및 glutathione peroxidase의 활성을 측정함으로써 알아보았다. 그러나 N-메틸-아리스토락탐 BII는 항산화 효소의 활성에는 유의성 있는 영향을 미치지 못하였다 (data not shown).

이에 N-메틸-아리스토락탐 BII는 직접적으로 nitric oxide synthase에 작용하여 NO의 생성을 저해시킴으로써 뇌신경세포 보호활성을 가지는 것으로 일단은 생각할 수 있으며 이를 뒷받침 수 있는 연구수행은 진행 중이다.

한편, 본 연구실에서는 일차배양한 흰쥐의 대뇌피질세포를 이용하여 현삼의 주성분인 (E)-p-메톡시신남산의 뇌신경세포 보호활성을 확인하고 이를 특허출원한 바 있다 (특허출원번호: 98-28189). 이에 본 연구에서는 아리스토락탐 알칼로이드의 뇌신경세포 보호활성 증대를 목적으로 사우로락탐의 hydroxyl group에 (E)-p-메톡시신남산을 결합시킨 사우로락탐-3-O-(E)-p-메톡시신나메이트 (S-MCA)를 합성하고 (위 구조식 참조) 뇌신경세포 보호활성을 검색하였다. 흰쥐의 대뇌피질세포를 20일간 배양하고 S-MCA를 0.1 μM에서 10.0 μM까지 농도별로 pre-treatment 처리하거나 post-treatment하였을 경우, 모두 유의성 있는 뇌신경세포 보호활성을 나타내었다. 그 결과를 표 6 및 7에 나타내었다. (Tables 6 and 7). 이러한 S-MCA의 뇌신경세포 보호활성은 (E)-p-methoxycinnamic acid를 post-treatment하였을 경우 뇌신경세포 보호활성이 감소된다는 점과 아리스토락탐 알칼로이드를 pre-treatment하였을 때에 뇌신경세포 보호활성이 약한 단점을 모두 개선시킨 결과라고 할 수 있겠다. 즉, S-MCA는 (E)-p-메톡시신남산의 신경세포 사멸 차단 효과와 아리스토락탐 알칼로이드의 신경독성 유발 후 생존율 개선 효과의 두 가지 장점을 모두 가지므로 퇴행성 뇌신경계 질환의 예방이나 치료제로 개발될 수 있는 가능성이 한층 높아졌다고 생각할 수 있겠다.

이러한 S-MCA의 뇌신경세포 보호활성은 일차배양한 흰쥐의 대뇌피질세포를 이용한 여러 다른 실험들을 통해서 입증할 수 있었다. 즉, 아리스토락탐 알칼로이드의 경우는 글루타메이트로 인한 독성유발의 초기단계에 세포 내로 유입되는 과량의 Ca²⁺의 양에는 별다른 영향을 미치지 못하였으나, S-MCA를 0.1 μM에서 10.0 μM의 농도로 처리하였을 경우에는 세포 내로 유입되는 Ca²⁺을 유의성 있게 차단시켜 거의 정상상태 때의 수준까지 감소시켰다. 그 결과를 표 8에 나타내었다. (Table 8). 이러한 S-MCA의 효과로 S-MCA는 글루타메이트 수용체의 과발현 후에 뒤따르는 Ca²⁺-dependent enzyme의 활성화를 효과적으로 차단시킬 수 있을 것으로 기대되었다. 이에 S-MCA가 Ca²⁺-dependent enzyme인 NOS의 활성화에 따른 세포 내 NO의 생성량에는 어떠한 영향을 미치는가를 알아보았다. 그 결과를 표 9에 나타내었다. (Table 9). S-MCA는 pre- 또는 post-treatment하였을 경우 모두 글루타메이트로 인하여 독성을 입은 세포 내에서 과다하게 생성되는 NO의 양을 유의성 있게 감소시켜 산화적 스트레스(oxidative stress)를 차단시킴을 알 수 있었다. 이에, 산화적 스트레스의 지표인 세포 내 peroxide의 양을 정량하여 S-MCA의 신경세포 보호활성을 측정하여 보았다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.(The effects of saurolactam-3-O-(E)-p-methoxycinnamate on peroxide content on glutamate-insulted rat cortical cells in prea- or post-treatmentb. a Pre-treatment : Sample treatment was conducted 1hr prior to the glutamate insult. b Post-treatment: Sample treatment was conducted right after the 30 min-glutamate insult. c Glutamate-treated differs significantly from the control at a level of p < 0.01.). 즉, S-MCA를 pre-treatment하거나 post-treatment하면 글루타메이트에 의하여 세포 내에서 과량으로 생성되는 peroxide의 양을 정상상태 때의 수준까지 감소시켜, S-MCA는 글루타메이트 수용체의 과발현에 따르는 산화적 스트레스를 효과적으로 차단시킴을 알 수 있었다.

본 연구를 통하여 처음으로 합성이 시도된 화합물인 사우로락탐-3-O-(E)-p- 메톡시신나메이트 (S-MCA)는 이상의 모든 실험을 통하여 기특허출원한 (E)-p-메톡시신남산이나 본 연구에서 처음으로 뇌신경세포 보호활성이 밝혀진 아리스토락탐 알칼로이드의 단점을 유의성 있게 개선시켰다고 할 수 있겠다.

이상의 실험결과로부터 본 연구에서는 일차배양한 흰쥐의 대뇌피질세포를 이용하여 2종의 아리스토락탐 알칼로이드 즉, 사우로락탐 및 N-메틸-아리스토락탐 BII의 뇌신경세포 보호활성과 그 작용기전을 처음으로 밝혔으며, 사우로락탐 및 N-메틸-아리스토락탐 BII의 뇌신경세포 보호활성을 개선시키기 위하여 사우로락탐-3-O-(E)-p-메톡시신나메이트을 합성하여 뇌신경세포 보호활성을 밝히고 그 작용기전을 제시하였다.

표 1. Neuroprotective effect of each fraction of S. chinensis Herbs on cell viability in glutamate-insulted rat cortical cells in throughout treatment^a.

Concentration Viability

(μg/ml) (%)

Control 100.0 ± 4.2

Glutamate-treated^b0.0 ± 1.3

Total extract 1 8.0 ± 0.5

10 24.1 ± 1.2*

100 45.1 ± 1.5**

CH₂Cl₂fr. 1 1.0 ± 3.0

10 27.6 ± 3.6*

100 52.6 ± 2.9**

n-Hexane fr. 1 60.4 ± 1.8***

10 50.6 ± 0.7**

100 34.3 ± 2.0*

90% MeOH fr. 1 7.5 ± 0.8

10 14.6 ± 1.7

100 0.9 ± 2.2

Aqueous fr. 1 no effect

10 no effect

100 no effect

n-BuOH fr. 1 no effect

10 no effect

100 no effect

a Throughout treatment: combined treatment of pre-treament and recovery only.

b Glutamate-treated differs significantly from the control at a level of p < 0.001.

Control is the value for primary cultures of rat cortical cells. Control value for MTT was 1.03±0.08 optical density (OD). Glutamate-treated is the value for primary cultures of rat cortical cells exposed to glutamate for 15min. Glutamate-treated value for MTT was 0.58±0.02 OD.

Viability is calculated as 100 X (OD of sample treated - OD of Glutamate-treated )/(OD of control - OD of Glutamate-treated ).

Results differ significantly from the Glutamate-treated at a level of *: p<0.05, **: p<0.01, **:p<0.001.

표 2. Effects of saurolactam or N-methyl-aristolactam BII on cell viability in glutamate- insulted rat cortical cells in throughout treatment^a.

Concentration Viability

(μM) (%)

Control 100.0 ± 4.2

Glutamate-treated^b0.0 ± 1.3

saurolactam 0.1 no effect

1.0 39.0 ± 1.8*

10.0 46.6 ± 2.1**

N-methyl-aristolactam BII 0.1 no effect

1.0 60.8 ± 2.1 ***

10.0 52.2 ± 3.2 **

a The experimental protocol, nomenclature and foot notes for Table 2 are precisely same as describerd under the legend to Table 1.

표 3. Neuroprotective effect of saurolactam or N-methyl-aristolactam BII on cell viability in glutamate-insulted rat cortical cells in pre-treatment^a.

Concentration Viability

(μM) (%)

Control 100.0 ± 4.2

Glutamate-treated^b0.0 ± 1.3

saurolactam 0.1 0.0 ± 4.5

1.0 0.0 ± 2.1

10.0 toxic effect

N-methyl-aristolactam BII 0.1 0.0 ± 7.8

1.0 0.0 ± 3.2

10.0 32.2 ± 0.8*

a Pretreatment: Sample treatment was conducted 1hr prior to the glutamate insult.

b Glutamate-treated differs significantly from the control at a level of p < 0.001.

The nomenclature and foot notes for Table 3 are precisely same as describerd under the legend to Table 1.

표 4. Neuroprotective effects of saurolactam or N-methyl-aristolactam BII on cell viability on glutamate-insulted rat cortical cells in post-treatment^a.

Concentration Viability

(μM) (%)

Control 100.0 ± 4.2

Glutamate-treated^b0.0 ± 1.3

saurolactam 0.1 0.0 ± 2.9

1.0 66.3 ± 2.1 **

10.0 32.1 ± 1.9 *

N-methyl-aristolactam BII 0.1 58.5 ± 5.8 **

1.0 68.4 ± 3.5 ***

10.0 47.8 ± 2.9 **

a Post-treatment: Sample treatment was conducted right after the 30 min-glutamate insult.

b Glutamate-treated differs significantly from the control at a level of p < 0.001.

The nomenclature and foot notes for Table 4 are precisely same as describerd under the legend to Table 1.

표 5. The effect of N-methyl-Aristolactam BII on NO content released from glutamate- insulted rat cortical cells in post-treatment^a.

Concentration Nitrite

(μM) (nM)

Control 75.5±2.7

Glutamate-treated^b145.7±5.2

N-methyl-aristolactam BII 0.1 87.0±0.8**

1.0 86.8±2.2**

10.0 103.2±1.2*

N^ω-nitro-L-arginine^c1.0 103.9±3.5*

10.0 88.5±4.1**

100.0 109.7±1.9*

a The experimental protocol, nomenclature and foot notes for Table 5 are precisely same as describerd under the legend to Table 4.

b Glutamate-treated differs significantly from the control at a level of p < 0.01.

c N^ω-nitro-L-arginine: nitric oxide synthase inhibitor

표 6. Neuroprotective effect of saurolactam-3-O-(E)-p-methoxycinnamate on cell viability in glutamate-insulted rat cortical cells in pre-treatment^a.

Concentration Viability

(μM) (%)

Control 100.0 ± 4.2

Glutamate-treated^b0.0 ± 1.3

saurolactam-3-O- 0.1 29.8 ± 8.2 *

(E)-p-methoxycinnamate 1.0 67.2 ± 9.6 ***

10.0 80.6 ± 9.5 ***

a Pre-treatment: Sample treatment was conducted 1hr prior to the glutamate insult.

b Glutamate-treated differs significantly from the control at a level of p < 0.001.

The nomenclature and foot notes for Table 6 are precisely same as described under the legend to Table 1.

표 7. Neuroprotective effect of saurolactam-3-O-(E)-p-methoxycinnamate oncell viability on glutamate-insulted rat cortical cells in post-treatment^a.

Concentration Viability

(μM) (%)

Control 100.0 ± 4.2

Glutamate-treated^b0.0 ± 1.3

saurolactam-3-O- 0.1 62.1 ± 1.8***

(E)-p-methoxycinnamate 1.0 70.3 ± 3.2***

10.0 48.2 ± 1.5**

a Post-treatment: Sample treatment was conducted right after the 30 min-glutamate insult.

b Glutamate-treated differs significantly from the control at a level of p < 0.001.

The nomenclature and foot notes for Table 7 are precisely same as described under the legend to Table 1.

표 8. The effect of saurolactam-3-O-(E)-p-methoxycinnamate on [Ca²⁺]i on glutamate- insulted rat cortical cells in pre-treatment^a.

Concentration [Ca²⁺]i

(μM) (nM)

Control 75.5 ± 15.0

Glutamate-treated^b425.4 ± 20.0

saurolactam-3-O- 0.1 233.3 ± 14.9 ***

(E)-p-methoxycinnamate 1.0 145.8 ± 26.3 ***

10.0 96.1 ± 4.1 ***

a Pre-treatment : Sample treatment was conducted 1hr prior to the glutamate insult.

b Glutamate-treated differs significantly from the control at a level of p < 0.001.

The nomenclature and foot notes for Table 8 are precisely same as described under the legend to Table 1.

표 9. The effect of saurolactam-3-O-(E)-p-methoxycinnamate on NO content on glutamate-insulted rat cortical cells in pre^a- or post-treatment^b.

Concentration Nitrite (nM)

(μM) pre-treatment post-treatment

Control 70.5 ± 15.0

Glutamate-treated^c165.9 ± 10.5

saurolactam-3-O- 0.1 125.0 ± 6.8* 143.6 ± 5.7

(E)-p-methoxycinnamate 1.0 74.8 ± 6.5** 97.5 ± 26.3**

10.0 71.4 ± 2.1** 118.1 ± 2.1**

a Pre-treatment : Sample treatment was conducted 1hr prior to the glutamate insult.

b Post-treatment: Sample treatment was conducted right after the 30 min-glutamate insult.

c Glutamate-treated differs significantly from the control at a level of p < 0.01.

The nomenclature and foot notes for Table 8 are precisely same as describedunder the legend to Table 1.

따라서 삼백초 엑스와 그로부터 분리된 일반구조식 (I)의 화합물은 퇴행성 뇌신경계 질환의 치료제로서 사용될 수 있다.

본 발명의 일반구조식 ( I )의 화합물은 일일 1mg 내지 200mg을 1 내지 3회 투여할 수 있다. 본 발명의 화합물은 환자의 체중, 성별, 나이 및 질병의 정도에 따라서 그 사용량을 증감할 수 있다.

본 발명의 일반구조식 ( I )의 화합물은 퇴행성 뇌신경계 질화의 예방과 치료에 사용될 수 있고, 이 화합물은 통상으로 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 약제학적으로 통상으로 하용되는 약학적 제제, 예를들면 주사제, 액제, 시럽제, 정제, 캡슐제 등으로 제제화하여 약학적 제제를 제조할 수 있다.

다음에 제제실시예로서 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

제제실시예 1

화합물 1 10mg

주사용 멸균증류수 적량

pH조절제 적량

화합물 1을 주사용 증류수에 용해하고 pH 조절제로 pH약 7.6로 조절한 다음 전체를 2ml로 한 후 2ml용량의 앰플에 충진하고 멸균하여 주사제를 제조한다.

제제 실시예 2

화합물 2 2mg

주사용 멸균증류수 적량

pH조절제 적량

화합물 2를 주사용 멸균증류수에 용해하고 pH조절제로 pH약 7.2로 조절하고 전체를 2ml로 한 다음 2ml용량의 앰플에 충진하여 주사제를 제조한다.

제제실시예 3

화합물 3 10mg

유당 100mg

전분 100mg

스테아린산 마그네슘 적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제실시예 4

화합물 1 10mg

유당 100mg

전분 50mg

스테아린산 마그네슘 적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제실시예 5

화합물 2 5mg

유당 50mg

전분 50mg

탈크 2mg

스테아린산마그네슘 적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충진하여 캡슐제를 제조한다.

제제실시예 6

화합물 3 5mg

유당 100mg

전분 93mg

탈클 2mg

스테아린산 마그네슘 적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충진하여 캡슐제를 제조한다.

제제실시예 7

화합물 3 50mg

설탕 20g

이성화당 20g

레몬향 적량

정제수를 가하여 전체 100ml

상기의 성분을 통상의 액제의 제조방법에 따라서 혼합하고 100ml 의 갈색병에 충진하고 멸균시켜서 액제를 제조한다.

제제실시예 8

화합물 1 100mg

설탕 20g

이성화당 20g

레몬향 적량

정제수를 가하여 전체 100ml

상기의 성분을 통상의 액제의 제조방법에 따라서 혼합하고 100ml 의 갈색병에 충진하고 멸균시켜서 액제를 제조한다.

1. 일차배양한 흰쥐의 대뇌피질세포에 글루타메이트를 투여하여 신경독성을 유발시켰을 경우, 삼백초의 총 추출물, CH₂Cl₂분획물 및 n-헥산 분획물은 농도 의존적으로 유의성 있는 뇌신경세포 보호 활성을 나타내었다.

2. 삼백초의 n-헥산 분획으로부터 2종의 아리스토락탐 알칼로이드를 분리하고 각종 이화학적 및 분광학적 결과를 근거로 각각 사우로락탐 및 N-메틸-아리스토락탐 BII로 동정하였다. 사우로락탐 및 N-메틸-아리스토락탐 BII는 0.1 μM에서 10.0 μM의 농도에서 유의성 있는 뇌신경세포 보호활성을 나타내었다.

3. N-메틸-아리스토락탐 BII는 글루타메이트에 의해 증가된 NO의 양을 1μM에서 86.8% 수준까지 감소시켜 직접적으로 nitric oxide synthase에 작용하여 NO의 생성을 저하시키는 효과를 가지는 것으로 추정할 수 있었다.

4. 또한, 사우로락탐에 뇌신경세포 보호활성을 갖는 물질로 기특허출원한 (E)-p-메톡시신남산을 결합시켜 사우로락탐 3-O-(E)-p-메톡시신나메이트를 합성하였다. 새로이 합성된 사우로락탐 3-O-(E)-p-메톡시신나메이트는 뇌신경세포 보호활성 발현에 있어서 아리스토락탐 알칼로이드와 (E)-p-메톡시신남산의 장점만을 갖춘 탁월한 뇌신경세포 보호활성을 갖는 것으로 나타났다.

이상의 실험결과로 삼백초의 총 메탄올 추출물, CH₂Cl₂분획물, n-헥산 분획물 및 아리스토락탐 계열 알칼로이드와 이의 신나메이트 유도체는 뇌졸중 및 치매의 예방이나 치료제로 개발될 수 있으리라 기대된다.

Claims (4)

1. 하기 구조식의 화합물 1, 화합물 2 또는 화합물 3을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌신경계 질환의 예방과 치료용 조성물:

   ,

   사우로락탐(화합물 1) N-메틸-아리스토락탐 BII(화합물 2)

   사우로락탐-3-O-(E)-p-메톡시신나메이트(화합물 3)
2. 하기 구조식의 화합물 1, 화합물 2 또는 화합물 3을 유효성분으로 함유하고, 약제학적으로 허용되는 부형제와 혼합하고 통상의 약학적 제제의 제조방법으로 약학적 제제로 제제화시켜서 제조된 퇴행성 뇌신경계 질환의 예방과 치료효과를 가지는 약학적 제제:

   ,

   사우로락탐(화합물 1) N-메틸-아리스토락탐 BII(화합물 2)

   사우로락탐-3-O-(E)-p-메톡시신나메이트(화합물 3)
3. 하기 구조식의 사우로락탐-3-O-(E)-p-메톡시신나메이트:
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