KR100220087B1

KR100220087B1 - 프로릴엔도펩티다제 저해제인 아그로시베닌 화합물 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR100220087B1
Application number: KR1019960012086A
Authority: KR
Inventors: 유익동; 이인경; 김원곤; 김종평; 유인자
Original assignee: 박호군; 한국과학기술연구원
Priority date: 1996-04-20
Filing date: 1996-04-20
Publication date: 1999-09-01
Also published as: KR970070004A

Abstract

본 발명은 아그로시베닌 화합물(2,2,5,5,7-펜타메틸-6-옥소-5,-디히드로-1,4-디아자인단), 그의 유도체 및 약학적으로 허용가능한 이들의 염을 제공한다. 본 발명에 따른 아그로시베닌 화합물은 버들송이 버섯으로부터 추출될 수 있으며, 이 화합물은 뇌의 퇴행성 질환을 야기시키는 프롤릴 엔도펩티다제의 활성을 저해하는 작용을 가지고 있다.

또한 아그로시베닌 화합물을 함유하는 버들송이 버섯의 추출물과 프롤릴 엔도펩티다제의 저해제 조성물이 제공된다.

Description

프롤릴엔도펩티다제 저해제인 아그로시베닌 화합물 및 그 제조방법

제1도는 아그로시베닌(agrocybenin) 화합물의 수소 핵자기 공명(¹H-NMR)스펙트럼,

제2도는 아그로시베닌 화합물의 탄소 핵자기 공명(¹³C-NMR)스펙트럼.

발명의 이용 분야

본 발명은 알쯔하이머병(Alzheimer disease(AD)) 등의 노인성 치매 질환을 유발하는, 프롤릴 엔도펩티다제(prolyl endopeptidase(PEP))의 활성을 저해하는 알카로이드계 아그로시베닌(agrocybenin)화합물과 그 제조방법, 아그로시베닌 화합물을 함유하는 버들송이 버섯의 추출물 및 아그로시베닌 화합물을 유효성분으로 하는 프롤릴 엔도펩티다제 저해제 조성물에 관한 것이다.

발명의 배경

뇌의 퇴행성 질환 중의 하나인 알쯔하이머병에 대한 관심이 최근 10년 동안에 급격히 증가하였다. 알쯔하이머병으로 알려지고 있는 노인성 치매 질환은 노인 인구가 급증하고 있는 현재, 최대의 노인 질환일 뿐만 아니라, 앞으로 올 21세기에는 인류가 당면할 최대의 보건 문제로 등장하고 있다. 앞으로 평균 수면이 증가할수록 이 병이 큰 사회적 문제를 야기시킬 것이라고 예상되고 있으며, 인간이 태초부터 갈망하던 장수에 가장 큰 도전이 되고 있다.

노인성 치매라는 것은 정신 기능의 전반적인 장애의 중후군을 말하며, 치매의 원인으로는 알쯔하이머병, 현관 질환(다경색 치매), 알쯔하이머병과 다경색 치매의 혼합형, 파킨슨병, 저갑상선증, 알코올성 치매 등 다양하다. 알쯔하이머병은 뇌조직을 현미경으로 검사함으로써만 정확하게 진단할 수 있다. 이 질환은 Alois Alzheimer(1907)의 이름을 딴 것으로 증상은 선택적으로 기억 장애를 일으키는 것으로, 비교적 가까운 과거의 일을 기억하는데 장애가 있다. 이 질환은 처음에 뇌의 고등 기능 전반에서 장애가 생기고 나중에는 운동 장애, 요실금 및 변실금으로 진행된다.

이러한 노인성 치매의 병변은 큰 분자량을 가진 전구단백질(APP695, APP714, APP751, APP770)로부터 멀티캐탈리틱 프로테이나제(multicatalytic proteinase(MCP)) 또는 프롤릴 엔도펩티다제(prolyl endopeptidase(PEP))와 같은 혹은 비슷한 효소에 의해서 아밀로이드 베타 단백질 부분이 짤라져서 이 베타 단백질 부분이 세포내와 혈관에 침착되기 때문인 것으로 파악되고 있다. 반면에 정상 상태에서는 아밀로이드 대사 효소(Amyloid degrading enzyme(ADE))에 의해서 베타 단백질의 중간 부분인 N 말단의 15-16번째 아미노산 부위에서 짤라져서 결국 아밀로이드 베타 단백질이 세포 외로 배출된다.

베타 단백질은 β플리티드 쉬트(pleated sheet) 구조를 가지고 있어서 β아밀로이드 단백질이라고 부르고 있으며, 대개 42-43개의 아미노산으로 구성된다. 이 베타 단백질은 정상 노인에서도 소량 발견되고 있으나, 유전성 알쯔하이머병의 일부나 유전성의 출혈로 인한 치매 환자에서는 한개의 염기에 돌연변이가 발생되어 이로 인해 신경 세포에 독성을 유발시킨다. 특히, 이전에 언급된 베타 단백질원인 전구 단백질은 여러 말초 조직에서도 발현이 되나 베타 단백질 침착은 뇌에서만 발생되고 있다.

한편, 전구단백질로부터 β플리티드 쉬트 구조를 포함한 베타 단백질 부분을 형성하는 프롤릴 엔도펩티다제는 폴리펩티드 사슬에서 프롤릴 잔기의 카르보닐 측쇄에 있는 펩티드 결합을 선택적으로 짜르는 역할을 가지고 있다. 이러한 절단 부위의 특이성으로 인해 β플리티드 쉬트 구조를 가진 베타 단백질이 형성되고 뇌에 축적됨으로서 알쯔하이머병 등의 뇌기능 장애를 유발하게 된다. 이러한 프롤릴 엔도펩티다제에 의한 베타 단백질 형성은 알루미늄과 같은 중금속이나 환경 오염에 의해 촉진될 가능성이 있으며, 환경 오염이 더욱 가속되고 있는 현시점에서 베타 단백질의 축적으로 인한 뇌기능 질환은 더욱 늘어날 것으로 예상된다.

종래 기술

이와 같이 뇌조직내에 침착되는 B^-플리티드 쉬트 구조를 가진 아밀로이드 베타 단백질을 생성하는 프롤릴 엔도펩티다제는 1971년 Walter 등에 의해 사람의 자궁에서 발견되었고 여러 포유 동물의 조직, 특히 뇌, 해초류의 스펌(sperm), 그리고 후라보박테리움(flavobacterium)에서 분리되었다.

뇌의 퇴행성 질환을 예방하고 치유하는데 있어서, 이러한 프롤릴 엔도펩티다제의 활성을 저해시킴에 의해 뇌의 퇴행성 질환을 예방ㆍ치유할 수 있으므로, 프롤릴 엔도펩티다제 저해제에 대한 연구가 진행되었다. 프롤릴 엔도펩티다제 저해제는 이전에 쥐의 뇌로부터 분리한 바 있으며, 최근 미생물 대사산물 및 천연물로부터 PEP 활성을 저해하는 저분자 물질을 탐색하는 연구가 진행되고 있다.

본 발명에서는 식용 버섯인 버들송이 버섯(Agrocybe cylindraceae)으로부터 PEP 활성을 저해하는 아그로시베닌을 분리, 정제하고 구조를 규명하며 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

발명의 요약

본 발명의 목적은 다음 구조식(Ⅰ)으로 표시되는 알카로이드계 PEP 활성 저해작용을 가진 아그로시베닌, 그의 유도체 및 약학적으로 허용가능한 이들의 염을 제공하는 것이다.

(1)

본 발명의 다른 목적은 버들송이 버섯으로부터 상기 구조식의 화합물을 추출하는 것으로 이루어진 아그로시베닌 화합물의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 유효 성분으로서 상기식의 아그로시베닌, 그의 유도체 및 화학적, 약학적으로 허용가능한 이들의 염으로 이루어진 PEP 저해제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 아그로시베닌 화합물을 함유하는 버들송이 버섯의 추출물을 제공하는 것이다.

발명의 상세한 설명

이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명의 아그로시베닌 화합물(2,2,5,5,7-펜타메틸-6-옥소-5,6-디히드로-1,4-디아자인-단)은 기질에 대하여 경쟁적(competitive) 저해 양상을 보이므로, 본 발명의 아그로시베닌 화합물은 기질이 효소의 활성 부위(catalytic site)에 결합하는 것을 방해함으로써 효소의 활성을 저해하는 것으로 판단되고 있다.

본 발명에 따른 아그로시베닌 화합물의 PEP 저해 활성은 Yoshimoto 등의 방법에 의해 측정한다. 즉, 프롤릴 엔도펩티다제로서, 플라보박테리움 메닝고셉티쿰(Flavobacterium meningocepticum)으로부터 분리 정제된 프롤릴 엔도펩티다제(EC 3, 4, 21, 26)를 사용하고, 기질로서 카르보벤질옥시-글리실-L-프롤릴-ρ-니트로-아닐리드를 사용한다. 이 때 프롤릴 엔도펩티다제는 프롤릴 잔기의 카르복실 측쇄에 있는 펩티드 결합을 선택적으로 짜르는 프로테아제이다. 프롤릴 엔도펩티다제와 기질을 반응시킨 후 생성되는 ρ-니트로아닐리드의 양을 측정함으로서 아그로시베닌 화합물의 분리정제에 지표가 되는 PEP 저해 정도를 구할 수 있다.

구체적으로 말하자면, 100mM Tris-HCl 완충액(pH 7.0) 166μl, 후라보박테리움 메닝고셉티쿰의 PEP 효소(Seikagaku Kogyo Co. Ltd., 100mM Tris-HCl 완충액, pH 7.0내 0.1 unit/ml) 10μl가 들어 있는 96웰 마이크로플레이트에 시료 10μl를 가하여 잘 섞은 다음 5분 동안 예비 배양한 후 여기에 기질 용액인 2mM의 카르보벤질옥시글리실-L-프롤릴-ρ-니트로아닐리드(40% 디옥산 100mM Tris-HCl 완충액, pH 7.0내)를 14μl 넣어 반응계의 전체 부피 200μl인 반응 용액을 30℃에서 60분 동안 반응시킨다. 반응이 끝난 후 프롤릴 엔도펩티다제에 의해 생성된 p-니트로아닐리드의 양을 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 405nm에서의 흡광도로 측정한다. 이 때 활성은 무처리군과 비교하여 상대적인 백분율로 나타낸다.

A : 저해제를 넣은 것의 반응 전 흡광도

B : 저해제를 넣은 것의 반응 후 흡광도

C : 저해제를 넣지 않은 것의 반응 전 흡광도

D : 저해제를 넣지 않은 것의 반응 후 흡광도

저해활성 농도(IC₅₀)는 통상 200μg/ml 이하면 효과가 있는 것으로 보는데, 본 발명의 아그로시베닌 화합물의 경우 28μl/ml이므로 상당한 저해 활성이 있다.

저해상수(Ki)는 효소 반응 과정의 이중 역수 작도법인 라인위버-버크 작도(Lineweaver-Burk plot)에 의해 저해제를 참가했을 때와 참가하지 않았을 때로 부터 다음식에 의하여 계산한다.

Km : 저해제를 넣지 않은 경우 미카엘리스 상수(최대 반응속도의 절반이 되는 기질의 농도)

Km' : 저해제를 넣은 경우 미카엘리스 상수

[I] : 첨가한 저해제의 농도(M)

본 발명의 아그로시베닌 화합물의 저해율은 28μg/ml의 농도에서 무처리군과 비교하여 그 상대 저해율이 50%로서 충분한 효과를 가지고 있다.

본 발명의 아그로시베닌을 제조하는 방법은 버들송이 버섯을 세절한다음 메탄올 등의 추출 용매를 가하여 하룻밤 침출하는 것으로 이루어진다.

버들송이 버섯은 대전광역시 소재 농촌지도소로부터 분양 받을 수 있다. 버들송이 버섯은 자실체에 유효 물질이 주로 함유되어 있으므로, 버들송이 버섯의 자실체를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 아그로시베닌의 제조 과정에서 얻어진 아그로시베닌을 함유한 버들송이 버섯의 추출물도 프롤릴 엔도펩티다제의 저해활성을 가지고 있으므로 저해제로서 유용하다.

본 발명의 아그로시베닌은 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하여 프롤릴 엔도펩티다제의 활성을 저해하는 저해제 조성물로서 바람직하다. 이 때 약학적으로 허용되는 부형제는 제약 분야에서 일반적으로 사용되는 부형제라면 어느 것이나 가능하다. 이 조성물의 유효량은 본 기술 분야에서 숙련된 자라면 일반적인 방법에 의해 추정될 수 있다. 실험관 실험에 의하면, 본 발명의 아그로시베닌 화합물의 저해 활성 농도(IC₅₀) 28μl/ml에서 50%의 저해 활성을 나타낸다.

이하 본 발명을 실시예에 따라 구체적으로 기술하면 다음과 같다. 그러나, 본 발명이 이들 실시예에 국한하는 것으로 의도되지 않으며, 특허청구범위에서 정의된 본 발명의 진의 및 범위를 벗어나지 않는 많은 변형 및 치환이 가능하다는 것은 당 분야의 숙련자들에게 자명하며, 그러한 변형 및 치환 역시 본 발명의 범위에 포함한다.

실시예 1 아그로시베닌의 분리정제

버들송이 버섯(Agrocybe cylindraceae) 2Kg을 세절하고 메탄올을 가하여 하룻밤 침출하여 활성물질을 추출하였다. 추출된 용매는 회수하고 나머지는 메탄올을 이용하여 2회 더 추출하여 추출액을 모두 모은 후 감압 농축하여 메탄올을 제거하였다. 추출 농축된 활성 분획을 디아이온(diaion) HP-20 컬럼에 흡착시키고 50% 메탄올로 씻은 후 100% 메탄올로 용출하고 메탄올을 제거하였다. 농축된 활성 분획을 클로로포름으로 추출하고 클로로포름을 농축하여 소량의 혼합용매(클로로포름 : 메탄올 = 100 : 1)에 녹인 후 실리카겔 컬럼(70-230 메쉬, Merck)에서 흡착크로마토그라피(클로로포름 : 메탄올 = 100 : 1 내지 50 : 1의 혼합용매로 용출)를 행하여 활성 분획을 농축하였다. 농축된 활성 분획을 소량의 클로로포름에 녹인 후 실리카겔 prep TLC(Merck, 5744)를 클로로포름 : 메탄올 = 1 : 1의 용매로 용출하여 황갈색의 신규 화합물 아그로시베닌(10mg)을 순수 분리하였다.

아그로시베닌의 물리화학적 특성

1 . 물질의 성상 황갈색 분말

2. 분자량 206

3. 분자식 C₁₂H₁₈N₂O

4. 고분해능 질량 분석치(M)⁺206.1444

5. 용점 175℃

6. 자외선 흡수 스펙트럼

UV λ_MAXMeOH(ε) 223(16,800), 333(9,200)

7. 핵자기 공명(NMR) 스펙트럼

클로로포름(CDCL₃)을 용매로 하고 케트라메틸실란(TMS)을 표준 물질로 하여 측정

한 수소 핵자기 공명(¹H NMR) 스펙트럼, 탄소 핵자기 공명(¹³C NMR) 스펙트럼은 각각 제1도 및 제2도에 제시된다.

실시예 2 아그로시베닌 화합물의 PEPase 저해 활성

아그로시베닌 화합물의 프롤릴 엔도펩티다제 저해 활성은 후라보박테리아(Flavobacterium)의 효소를 사용하여 조사하였다(Yamakawa, N. et. al., Chem. Pharm. Bull. 34:256-2263, 1986). 즉 후라보박테리아 메닝고셉티쿰으로부터 정제된 프롤릴 엔도펩티다제에 카르보벤질록시글리실-L-프롤릴-ρ-니트로아닐리드를 기질로 하여 반응시킨 후 생성되는 p-니트로아닐린의 양을 410nm에서 흡광도를 측정함으로써 프롤릴 엔도펩티다제 저해 활성을 조사하였다. 이 때 활성은 무처리군과 비교하여 상대적인 저해율을 백분율(%)로 나타냈다. 그 결과 저해율은 50%이고, 아그로시베닌의 저해 활성 농도(IC₅₀)는 28 ppm이며, Ki 값은 6.15 × 10^-5M이었다.

Claims

(정정)다음식의 구조식(Ⅰ)으로 표시되는 아그로시베닌 화합물 및 약학적으로 허용 가능한 이들의 염.

(1)
(정정) 버들송이 버섯으로부터 추출하는 것으로 이루어진 제1항의 아그로시베닌 화합물 및 약학적으로 허용가능한 이들의 염의 제조방법.
(정정) 제2항에 있어서, 버들송이 버섯의 자실체를 사용하는 것이 특징인 아그로시베닌 화합물 및 약학적으로 허용가능한 이들의 염의 제조방법.