EA017735B1

EA017735B1 - Циклические депсипептиды

Info

Publication number: EA017735B1
Application number: EA201000329A
Authority: EA
Inventors: Филипп Крастель; Бригитта-Мария Лихти; Йозеф Готтфрид Майнгасснер; Эстер Шмитт; Эрвин Пол Шрайнер
Original assignee: Новартис Аг
Priority date: 2007-08-17
Filing date: 2008-08-14
Publication date: 2013-02-28
Also published as: CU23943B1; PE20091007A1; AU2008290567B2; ZA201000776B; KR20120123579A; PT2183273T; CN103298827B; ES2632392T3; ECSP109968A; US9127044B2; CR11251A; AU2008290567A1; CA2696570A1; PL2183273T3; MX2010001849A; PE20141199A1; BRPI0815547A2; KR20100044893A; EP2183273B1; JP5520824B2

Abstract

Изобретение относится к циклическим депсипептидам или их производным формулы (I) и их применению, например, в качестве ингибиторов калликреина 7 или эластазы нейтрофилов человека.

Description

Настоящее изобретение относится к циклическим депсипептидам или к их производным.

Предпосылки создания изобретения

Калликреин 7 является сериновой протеазой 81, относится к семейству генов калликреина и проявляет химотрипсиноподобную активность. Калликреин 7 человека (К7ч, КЬК7 или фермент химотрипсинового типа из рогового слоя (ХРС), 8^155рго1 Р49862) играет важную роль в физиологии кожи (1, 2, 3). В основном он экспрессируется в коже, и как недавно было установлено, играет важную роль в физиологии кожи. К7ч принимает участие в деградации межклеточных связующих структур ороговевшего плоского эпителия в процессе отшелушивания клеток кожи. Процесс отшелушивания строго регулируется и находится в неустойчивом равновесии с продуцированием бе ηονο корнеоцитов, чтобы поддерживать постоянную толщину рогового слоя, который является внешним слоем кожи и принимает основное участие в функционировании барьера кожи. В связи с этим было установлено, что К7ч расщепляет корнеодесмосомальные белки - корнеодесмозин и десмоколлин 1 (4, 5, 6). Деградация корнеодесмосом необходима для отшелушивания. Кроме того, недавно было установлено, что фермент К7ч расщепляет два деградирующих липиды фермента-З-глюкоцереброзидазу и кислую сфингомиелиназу (7). Оба деградирующих липиды фермента секретируются совместно с их субстратами - глюкозилцерамидами и сфингомиелином, и расщепляют эти полярные предшественники липидов с образованием более неполярных продуктов, например, церамидов, которые затем встраиваются во внеклеточную многослойную мембрану. Структура многослойной мембраны играет важную роль в функционировании клеточного барьера. И наконец было установлено, что К7ч активирует предшественник интерлейкина-1З (ИЛ-1З), при этом образуется его активная форма ίη νίίτο (8). Так как кератиноциты экспрессируют ИЛ-1З, но не активную форму специфического ИЛ-1З конвертирующего фермента (ИКФ или каспаза 1), можно предположить, что активация ИЛ-1З в эпидермисе человека происходит под действием другой протеазы, предположительно фермента К7ч.

Недавно была установлена взаимосвязь повышенной активности К7ч с воспалительными заболеваниями кожи, такими как атопический дерматит, псориаз или синдром Незертона. Такая повышенная активность может привести к неконтролируемой деградации корнеодесмом, что в свою очередь может привести к разрегулированному отшелушиванию, повышенной деградации расщепляющих липиды ферментов и повреждению структуры многослойной мембраны или неконтролируемой активации провоспалительного цитокина ΗΠ-1β. В результате нарушается функционирование клеточного барьера и развивается воспаление (см. также νθ-Ά-2004/108139).

В связи с тем, что активность К7ч контролируется на нескольких уровнях, повышенную активность К7ч при воспалительных заболеваниях кожи могут вызывать различные факторы. Во-первых, на количество экспрессированной протеазы могут влиять генетические факторы. Например, в качестве такой генетической связи недавно был выявлен полиморфизм 3'-иТК.(3'-нетранслируемая область) в гене К7ч (9). Авторы предполагают, что описанная вставка из 4 п.о. в 3'-ϋΤΚ. гена К7ч стабилизирует мРНК К7ч, что приводит к сверхэкспрессии К7ч. Во-вторых, так как К7ч секретируется из многослойных тел в межклеточное пространство рогового слоя в виде профермента и не способен самоактивироваться, то для его активации требуется другая протеаза, например, К5ч (5). Неконтролируемая активность такого активирующегося фермента может привести к сверхэкспрессии К7ч. В-третьих, активированный К7ч можно ингибировать природными ингибиторами, такими как ЬЕКТ1, АЬР или элафин (10, 11), сниженный уровень экспрессии таких ингибиторов или их отсутствие может привести в повышенной активности К7ч. Недавно было установлено, что мутации в гене 8р1пк5, кодирующем ЬЕКТ1, являются причиной развития синдрома Незертона (12), а одноточечная мутация в гене связана с атопическим дерматитом (13, 14). И наконец, другим уровнем контроля активности К7ч является рН. рН-Оптимум К7ч находится в интервале от нейтрального до слабо щелочного рН (2), а градиент рН по направлению от внутреннего до внешнего слоев кожи составляет от нейтрального до кислого рН. Факторы окружающей среды, такие как мыло, могут привести к повышению рН во внешних слоях рогового слоя до рН-оптимума К7ч, и тем самым повысить активность К7ч.

Гипотеза о взаимосвязи увеличения активности К7ч с заболеваниями кожи, вызванными повреждением барьера кожи, включающими воспалительные и гиперпролиферативные заболевания кожи, подтверждается следующими данными. Во-первых, у пациентов с синдромом Незертона наблюдается зависимое от фенотипа увеличение активности сериновых протеаз, снижение количества корнеодесмосом, снижение уровня расщепляющих липиды ферментов -β-глюкоцереброзидазы и кислой сфингомиелиназы, и нарушенная функция барьера кожи (15, 16). Во-вторых, у трансгенных мышей со сверхэкспрессией К7ч наблюдается фенотип кожи, аналогичный фенотипу пациентов с атопическим дерматитом (17, 18, 19). В-третьих, установлено, что у пациентов с атопическим дерматитом кожи и псориазом наблюдаются повышенные уровни К7ч (17, 20). Более того, повышенная активность К7 и связанная с этим дисфункция эпителиального барьера могут играть важную роль в патологии других эпителиальных заболеваний, таких как воспалительное заболевание кишечника и болезнь Крона.

Следовательно, К7ч можно рассматривать как потенциальную мишень для лечения заболеваний,

- 1 017735 связанных с эпителиальной дисфункцией, таких как воспалительные и/или гиперпролиферативные заболевания, и зудящих заболеваний кожи, таких как атопический дерматит, псориаз, синдром Незертона, или других зудящих дерматозов, таких как узелковая почесуха, неспецифический зуд у людей пожилого возраста, а также другие заболевания, связанные с дисфункцией эпителиального барьера, такие как воспалительное заболевание кишечника и болезнь Крона, и таким образом существует необходимость в разработке специфических модуляторов (агонистов или ингибиторов) К7ч.

Эластаза нейтрофилов человека (НЭч, известная также под названием эластаза лейкоцитов, ЛЭч) относится к семейству сериновых протеаз типа химотрипсина. рН-Оптимум ее каталитической активности составляет приблизительно 7, а каталитический участок включает три образующих водородные связи аминокислотных остатка: Н1§57, А§р102 и 8ет195 (нумерация соответствует последовательности химотрипсина), которые образуют так называемую каталитическую триаду. Фермент состоит из одной полипептидной цепи, включающей 218 аминокислотных остатка и четыре дисульфидных связи. Гомология последовательности с другими эластинолитическими или не-эластинолитическими сериновыми протеиназами составляет от 30 до 40%. НЭч предпочтительно расщепляет окисленную цепь В инсулина, содержащую остаток валина в положении Р1, но также расщепляет связи, содержащие остатки аланина, серина или цистеина в положении Р1.

НЭч локализована в азурофильных гранулах полиморфноядерных лейкоцитов (ПМЯЛ), которые характеризуются достаточной высокой концентрацией НЭч (3 мкг фермента/10 клеток). Основная физиологическая функция фермента заключается в расщеплении бактерий и иммунокомплексов, он также принимает участие в защитном механизме организма-хозяина. НЭч способствует также миграции нейтрофилов из крови в различные ткани, такие как дыхательные пути, в ответ на факторы хемотаксиса. НЭч принимает также участие в ранозаживлении, регенерации ткани и апоптозе ПМЯЛ.

Наряду с эластином (высоко эластичный и высокогидрофобный компонент соединительной ткани легких, артерий, кожи и связок), НЭч расщепляет множество белков, проявляющих важную биологическую функцию, включая коллагены различного типа, мембранные белки и протеогликаны хрящевых тканей. НЭч косвенно способствует деградации белков внеклеточного матрикса за счет активации проколлагеназы, простромелизина и прожелатиназы. НЭч инактивирует также ряд эндогенных ингибиторов протеиназ, таких как а2-антиплазмин, а1-антихимотрипсин, антитромбин и тканевой ингибитор металлопротеиназ.

В легочной системе активность внеклеточной эластазы строго контролируется ингибитором а1протеаз (а1Р1), ответственным за защиту нижних дыхательных путей от эластолитической деградации, в то время как секреторный ингибитор протеиназы лейкоцитов в основном защищает верхние дыхательные пути. В ряде патофизиологических состояний легких, например, при эмфиземе легких, хроническом бронхите и муковисцидозе, эндогенные ингибиторы эластаз неэффективны в регуляции активности НЭч.

Предполагается, что НЭч является первичным источником повреждения тканей, связанного с воспалительными заболеваниями, таким как энфизема легких, респираторный дистресс-синдром взрослых (РДСВ), хронический бронхит, хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ), легочная гипертензия, и с другими воспалительными заболеваниями, такими как легочная дисплазия у недоношенных новорожденных. НЭч принимает участие в патогенезе повышенной и аномальной секреции дыхательных путей, обычно связанной с воспалительными заболеваниями дыхательных путей. Таким образом, бронхоальвеолярная промывная жидкость (БАПЖ), полученная от пациентов с диагнозом хронического бронхита и муковисцидоза, характеризуется повышенной активностью НЭч. Более того, полагают, что избыточная эластаза принимает участие не только в развитии указанных хронических воспалительных заболеваний, но и острых воспалительных заболеваний, таких как ХОБЛ и септический шок.

Следовательно, НЭч можно рассматривать как потенциальную мишень для лечения заболеваний, связанных с активностью НЭч, таких как воспалительные заболевания, такие как энфизема легких, респираторный дистресс-синдром взрослых (РДСВ), хронический бронхит, хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ), легочная гипертензия, и другие воспалительные заболевания, а также легочная дисплазия у недоношенных новорожденных, и заболевания, связанные с повышенной и аномальной секрецией дыхательных путей, а также острые воспалительные заболевания. Таким образом существует необходимость в разработке специфических модуляторов (агонистов или ингибиторов) НЭч.

Лечение можно проводить местным или системным способом, например, с использованием кремов, мазей и суппозиториев, или подкожным или внутривенным способом или ингаляцией, соответственно.

Род Сйопбтошусек относится к семейству Ро1уапд1асеае, принадлежащему к порядку Мухососса1е§ класса дельта-протеобактерий. Бактерии порядка Мухососса1е§, также называемые миксобактериями, являются грамотрицательными бактериями палочковидной формы и обладают двумя выраженными отличиями от большинства других бактерий. Они закрепляются и начинают расти на твердых поверхностях, используя механизм активного перемещения и агрегирования для формирования плодовых тел при наступлении голодания (КаЦет (2003)) В настоящем изобретении предлагаются циклические депсипептиды, продуцируемые штаммом Сйопбтошусек и способные специфически модулировать калликреин 7.

- 2 017735

Краткое описание сущности изобретения

В одном объекте настоящего изобретения предлагаются циклические депсипептиды или их производные формулы (I) ^А3

II

X—А—А;--ОА.

(I) где сложноэфирная связь расположена между карбоксигруппой А₇ и гидроксигруппой А₂, где X и Л! каждый независимо являются необязательными, и где X обозначает любой химический остаток, А₁ обозначает стандартную аминокислоту, которая не является аспарагиновой кислотой, или производное указанной стандартной аминокислоты, Л₂ обозначает треонин или серии, А₃ обозначает неосновную аминокислоту или ее неосновное производное, А₄ обозначает Айр, дегидро-АНР, пролин или его производное, А₅обозначает изолейцин или валин, А₆ обозначает тирозин или его производное, А₇ обозначает лейцин, изолейцин или валин.

В другом варианте циклические депсипептиды или их производные характеризуются формулой (I')

где X и А₁ имеют значения, определенные в пунктах формулы изобретения, и где

К2 обозначает Н или метил,

КЗ обозначает боковую цепь неосновной аминокислоты или ее неосновное производное,

К5 обозначает боковую цепь изолейцина или валина,

К6 обозначает боковую цепь тирозина или его производного,

К7 обозначает боковую цепь лейцина, изолейцина или валина,

Υ обозначает водород или метил, и где Айр замещен остатками дегидро-АНР, Айр-1, Айр-ΙΙ, пролина или его производного.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтически приемлемым солям указанных циклических депсипептидов или их производных.

В циклических депсипептидах по настоящему изобретению X обозначает Н или ацил, например, СНзСН2СН(СНз)СО, (СНз)2СНСН2СО или (СНз^СНСО.

В циклических депсипептидах А₁ обозначает глутамин, глутаминовую кислоту или ее производное, например нитрил глутамина или сложный эфир глутаминовой кислоты.

В циклических депсипептидах А₂ обозначает треонин или его производное.

В циклических депсипептидах А₃ обозначает лейцин.

В циклических депсипептидах А₆ обозначает тирозин.

В некоторых вариантах циклических депсипептидов А₄ обозначает производные 3-аминопиперидин-2-она, Айр, Айр-Ι или Айр-ΙΙ.

В некоторых вариантах циклических депсипептидов или их производных X обозначает (СН3)2СНСО, А1 обозначает глутамин, глутаминовую кислоту или ее производное, А2 обозначает треонин, А3 обозначает лейцин, А4 обозначает Айр или его производное, А5 обозначает изолейцин или валин, А₆ обозначает тирозин или его производное, А₇ обозначает изолейцин или валин.

В других вариантах циклических депсипептидов или их производных X обозначает СН₃СН₂СН(СН₃)СО, А₁ обозначает глутамин, глутаминовую кислоту или ее производное, А₂ обозначает треонин, А3 обозначает лейцин, А4 обозначает Айр или его производное, А5 обозначает изолейцин, А6 обозначает тирозин или его производное и А7 обозначает изолейцин.

В некоторых вариантах циклических депсипептидов или их производных X обозначает СН3СН2СН(СН3)СО, А1 обозначает глутамин, глутаминовую кислоту или ее производное, А2 обозначает треонин, А3 обозначает лейцин, А4 обозначает дегидро-АНР или его производное, А5 обозначает изолейцин, А6 обозначает тирозин или его производное и А7 обозначает изолейцин.

В других вариантах циклических депсипептидов или их производных X обозначает (СН3)2СНСН2СО, А1 обозначает глутамин, глутаминовую кислоту или ее производное, А2 обозначает треонин, А3 обозначает лейцин, А4 обозначает дегидро-АНР, Айр или его производное, А5 обозначает изолейцин, А₆ обозначает тирозин или его производное и А₇ обозначает изолейцин.

Настоящее изобретение также относится к циклическим депсипептидам или их производным, формулы (Ι)

А₃-А“А—А₆

X—А—А;--О---А₇ ⁷ (I) где сложноэфирная связь расположена между карбоксигруппой А₇ и гидроксигруппой А₂, где X

- 3 017735 обозначает (СНз)₂СНСН₂СО, Άΐ обозначает глутамин, глутаминовую кислоту или ее производное, А₂обозначает треонин, А₃ обозначает лейцин, А₄ обозначает Айр или пролин или его производное, А₅ обозначает фенилаланин, А₆ обозначает тирозин или его производное и А₇ обозначает валин.

В конкретных вариантах X обозначает (СН₃)₂СНСН₂СО, А₁ обозначает глутамин, глутаминовую кислоту или ее производное, А₂ обозначает треонин, А₃ обозначает лейцин, А₄ обозначает Айр или его производное, А5 обозначает фенилаланин, А6 обозначает тирозин или его производное и А7 обозначает валин.

В других вариантах X обозначает (СН₃)₂СНСН₂СО, А₁ обозначает глутамин, глутаминовую кислоту или ее производное, А2 обозначает треонин, А3 обозначает лейцин, А4 обозначает пролин или его производное, А5 обозначает фенилаланин, А6 обозначает тирозин или его производное и А7 обозначает валин. В этих вариантах атом азота амидной связи между А₅ и А₆ замещен метилом.

В циклическом депсипептиде или его производном А₁, А₂, А₃, А₅, А₆ и А₇ обозначают Ьаминокислоты. Кроме того А₄ обозначает (38,6К)-Айр.

Настоящее изобретение также относится к применению указанных выше депсипептидов и их производных в качестве лекарственных средств, например, для лечения рака, прежде всего рака яичников, или для лечения воспалительных и/или гиперпролиферативных и зудящих кожных заболеваний, таких как келоидные рубцы, гипертрофические рубцы, угри, атопический дерматит, псориаз, пустулезный псориаз, розовые угри, синдром Незертона, или других зудящих дерматозов, таких как узелковая почесуха, неспецифический зуд у людей пожилого возраста, а также других заболеваний с дисфункцией эпителиального барьера, таких как старческая кожа, воспалительное заболевание кишечника и болезнь Крона, а также панкреатит или рак, прежде всего рак яичников, муковисцидоз (МВ), хроническое обструктивное заболевание легких (ХОЗЛ), фиброз легких, респираторный дистресс-синдром взрослых, хронический бронхит, наследственная эмфизема, ревматоидный артрит, воспалительное заболевание кишечника, псориаз, астма.

В одном варианте настоящего изобретения предлагается также применение указанных выше депсипептидов и их производных в качестве лекарственных средств, предназначенных для лечения воспалительных и/или гиперпролиферативных и зудящих кожных заболеваний, таких как келоидные рубцы, гипертрофические рубцы, угри, атопический дерматит, псориаз, пустулезный псориаз, розовые угри, синдром Незертона, или других зудящих дерматозов, таких как узелковая почесуха, неспецифический зуд у людей пожилого возраста, а также других заболеваний с дисфункцией эпителиального барьера, таких как старческая кожа, воспалительное заболевание кишечника и болезнь Крона, а также панкреатит или рак, прежде всего рак яичников.

В другом варианте настоящего изобретения также предлагается применение указанных выше депсипептидов и их производных в качестве лекарственных средств, предназначенных для лечения муковисцидоза (МВ), хронического обструктивного заболевания легких (ХОЗЛ), фиброза легких, респираторного дистресс-синдрома взрослых, хронического бронхита, наследственной эмфиземы, ревматоидного артрита, воспалительного заболевания кишечника, псориаза, астмы.

В еще одном варианте настоящего изобретения также предлагается применение указанных выше депсипептидов и их производных в качестве лекарственных средств, предназначенных для лечения воспалительных и/или гиперпролиферативных и зудящих кожных заболеваний, таких как келоидные рубцы, гипертрофические рубцы, угри, атопический дерматит, псориаз, пустулезный псориаз, розовые угри, синдром Незертона, или других зудящих дерматозов, таких как узелковая почесуха, неспецифический зуд у людей пожилого возраста.

Настоящее изобретение также включает способы продуцирования циклического депсипептида или его производного, например, при культивировании штамма Сйоийтотусек, его вариантов или мутантных форм, в пригодной среде, и необязательно химической модификации полученного таким образом циклического депсипептида, или при экспрессии генов биосинтеза штамма Сйоийтотусек, его вариантов или мутантных форм, в гетерологическом микробном штамме-хозяине, и необязательно химической модификации полученного таким образом циклического депсипептида.

Указанные способы осуществляют с использованием штаммов Сйоийтотусек стоса1и8 (Ό8Μ 19329) или Сйоийтотусек гоЬи81и8 (Ό8Μ 19330) или Сйоийтотусек ар1си1а1и8 (Ό8Μ 21595).

Настоящее изобретение также относится к выделенному микроорганизму Сйоийтотусек, продуцирующему циклический депсипептид или его производное, депонированному в коллекции Ό8Μ под номером Ό8Μ 19329 или Ό8Μ 19330 или Ό8Μ 21595, и к циклическому депсипептиду или его производному, продуцированному выделенным микроорганизмом Сйоийтотусек.

Описание фигур

Фиг. 1 - ¹Н ЯМР спектр соединения формулы (II) (600 МГц, ДМСО-й₆).

Фиг. 2 - ¹³С ЯМР спектр соединения формулы (II) (150 МГц, ДМСО-й₆).

Фиг. 3 - ¹Н ЯМР спектр соединения формулы (VIII) (600 МГц, ДМСО-й₆).

Фиг. 4 - ¹³С ЯМР спектр соединения формулы (VIII) (150 МГц, ДМСО-й₆).

Фиг. 5 - ¹Н ЯМР спектр производного циклического депсипептида формулы (II), где Айр превращают в 3-аминопиперидин-2-он (пример 4).

- 4 017735

Фиг. 6 - ¹Н ЯМР спектр производного циклического депсипептида, полученного в примере 5 (500 МГц, ДМСО-0б).

Фиг. 7 - ¹Н ЯМР спектр производного циклического депсипептида, полученного в примере 19 (500 МГц, ДМСО-06).

Фиг. 8 - ¹Н ЯМР спектр производного циклического депсипептида, полученного в примере 21 (500 МГц, ДМСО-06).

Фиг. 9 - ¹Н ЯМР спектр производного циклического депсипептида, полученного в примере 26 (500 МГц, ДМСО-06).

Фиг. 10 - ¹Н ЯМР спектр производного циклического депсипептида, полученного в примере 32 (500 МГц, ДМСО-06).

Фиг. 11 - ¹Н ЯМР спектр производного циклического депсипептида, полученного в примере 44 (500 МГц, ДМСО-06).

Фиг. 12 - ¹Н ЯМР спектр производного циклического депсипептида, полученного в примере 45 (500 МГц, ДМСО-06).

Подробное описание изобретения

Как описано выше в данном контексте и в пунктах формулы изобретения, в одном объекте настоящего изобретения предлагаются циклические депсипептиды или их производные формулы (I)

А, А. А₅ А₆ ι I

X—А—А,--О---А₇ (I) где сложноэфирная связь расположена между карбоксигруппой А₇ и гидроксигруппой А₂, где X и А₁ каждый независимо являются необязательными, и где X обозначает любой химический остаток, А₁обозначает стандартную аминокислоту, которая не является аспарагиновой кислотой, А₂ обозначает треонин или серии, А3 обозначает неосновную стандартную аминокислоту или ее неосновное производное, А₄ обозначает Айр, дегидро-АНР, пролин или его производное, А₅ обозначает изолейцин или валин, А₆обозначает тирозин или его производное, А7 обозначает лейцин, изолейцин или валин.

К2 обозначает боковую цепь треонина или серина,

В циклических депсипептидах или их производных атом азота в амидной связи между А₅ и А₆ за мещен метилом.

В циклических депсипептидах по настоящему изобретению X обозначает Н или ацил, например СНзСН2СН(СНз)СО, (СНз)2СНСН2СО или (СНзДСНСО.

В циклических депсипептидах А₁ обозначает глутамин, глутаминовую кислоту или ее производное.

В циклических депсипептидах А₂ обозначает треонин.

В циклических депсипептидах А₆ обозначает тирозин или его производное.

В некоторых вариантах циклических депсипептидов А₄ обозначает производные 3аминопиперидин-2-она, Айр, Айр-Ι или Айр-ΙΙ.

В некоторых вариантах циклического депсипептида или его производного X обозначает (СН3)2СНСО, А1 обозначает глутамин, глутаминовую кислоту или ее производное, А2 обозначает треонин, А3 обозначает лейцин, А4 обозначает Айр или его производное, А5 обозначает изолейцин или валин, А₆ обозначает тирозин или его производное, А₇ обозначает изолейцин или валин.

В других вариантах циклического депсипептида или его производного X обозначает СН3СН2СН(СН3)СО, А1 обозначает глутамин, глутаминовую кислоту или ее производное, А2 обозначает треонин, А3 обозначает лейцин, А4 обозначает Айр или его производное, А5 обозначает изолейцин, А6

- 5 017735 обозначает тирозин или его производное и А₇ обозначает изолейцин.

В некоторых вариантах циклического депсипептида или его производного X обозначает СН₃СН₂СН(СН₃)СО, А1 обозначает глутамин, глутаминовую кислоту или ее производное, А₂ обозначает треонин, А₃ обозначает лейцин, А₄ обозначает дегидро-АНР или его производное, А₅ обозначает изолейцин, А₆ обозначает тирозин или его производное и А₇ обозначает изолейцин.

В других вариантах циклического депсипептида или его производного X обозначает (СН3)2СНСН2СО, А1 обозначает глутамин, глутаминовую кислоту или ее производное, А2 обозначает треонин, А₃ обозначает лейцин, А₄ обозначает дегидро-АНР или его производное, А₅ обозначает изолейцин, А6 обозначает тирозин или его производное и А7 обозначает изолейцин.

Настоящее изобретение кроме того относится к циклическим депсипептидам или их производным формулы (I) ^А3 ^А4 ^А5 Аб ι I

X—А—А:--О---А₇ <1) где сложноэфирная связь расположена между карбоксигруппой А₇ и гидроксигруппой А₂, где X обозначает (СН₃)₂СНСН₂СО, А₁ обозначает глутамин, глутаминовую кислоту или ее производное, А₂обозначает треонин, А₃ обозначает лейцин, А₄ обозначает Айр или пролин или его производное, А₅ обозначает фенилаланин, А₆ обозначает тирозин или его производное и А₇ обозначает валин.

В конкретных вариантах X обозначает (СН₃)₂СНСН₂СО, А₁ обозначает глутамин, глутаминовую кислоту или ее производное, А₂ обозначает треонин, А₃ обозначает лейцин, А₄ обозначает Айр или его производное, А₅ обозначает фенилаланин, А₆ обозначает тирозин или его производное и А₇ обозначает валин.

В других вариантах X обозначает (СН₃)₂СНСН₂СО, А₁ обозначает глутамин, глутаминовую кислоту или ее производное, А₂ обозначает треонин, А₃ обозначает лейцин, А₄ обозначает пролин или его производное, А₅ обозначает фенилаланин, А₆ обозначает тирозин или его производное и А₇ обозначает валин. В указанных вариантах атом азота в амидной связи между А₅ и А₆ замещен метилом.

В циклическом депсипептиде или его производном А₁, А₂, А₃, А₅, А₆ и А₇ обозначают йаминокислоты. Кроме того А₄ обозначает (38,6К)-Айр.

А₅ обозначает изолейцин, фенилаланин или валин. А₅ обозначает прежде всего изолейцин или валин, предпочтительно изолейцин.

В другом варианте А₅ обозначает фенилаланин, прежде всего если А₄ не обозначает Айр, и остальные остатки имеют значения, как определено в п.1.

Еще в одном варианте А₄ обозначает 5-гидроксипролин и А₅ обозначает изолейцин, а остальные остатки имеют значения, как определено в п.1.

В другом варианте А₄ обозначает Айр и А₅ обозначает изолейцин, а остальные остатки имеют значения, как определено в п.1.

Еще в одном варианте А₄ обозначает Айр1 и А₅ обозначает изолейцин, а остальные остатки имеют значения, как определено в п.1.

В другом варианте А₄ обозначает Айр-ΙΙ и А₅ обозначает изолейцин, а остальные остатки имеют значения, как определено в п.1.

Еще в одном варианте А₄ обозначает Айр, А₅ и А₇ обозначают изолейцин, а остальные остатки имеют значения, как определено в п.1.

В другом варианте А₄ обозначает Айр-Ι, А₅ и А₇ обозначают изолейцин, а остальные остатки имеют значения, как определено в п.1.

Еще в одном варианте А₄ обозначает Айр-ΙΙ, А₅ и А₇ обозначают изолейцин, а остальные остатки имеют значения, как определено в п.1.

В другом варианте А₄ обозначает 5-гидроксипролин, А₅ и А₇ обозначают изолейцин, а остальные остатки имеют значения, как определено в п.1.

Как указано в данном контексте, А1 обозначает глутамин, глутаминовую кислоту, орнитин или производное глутамина, такое как, например, нитрил глутамина, сложный эфир глутаминовой кислоты, такой как С₁-С₁₂алкиловый эфир (например, метиловый эфир глутаминовой кислоты) или такой как С₆-С₂₄ариловый эфир (например, фениловый или бензиловый эфир глутаминовой кислоты).

Настоящее изобретение также относится к применению указанных выше циклических депсипептидов или их производных в качестве лекарственных средств, например, для лечения рака, прежде всего рака яичников, или для лечения воспалительных и/или гиперпролиферативных и зудящих кожных заболеваний, таких как келоидные рубцы, гипертрофические рубцы, угри, атопический дерматит, псориаз, синдром Незертона, или других зудящих дерматозов, таких как узелковая почесуха, неспецифический зуд у людей пожилого возраста, а также других заболеваний, связанных с дисфункцией эпителиального барьера, таких как воспалительное заболевание кишечника и болезнь Крона, а также панкреатит.

В одном варианте настоящего изобретения также предлагается применение указанных выше депсипептидов и их производных в качестве лекарственных средств, предназначенных для лечения воспалительных и/или гиперпролиферативных и зудящих кожных заболеваний, таких как келоидные рубцы, ги

- 6 017735 пертрофические рубцы, угри, атопический дерматит, псориаз, пустулезный псориаз, розовые угри, синдром Незертона, или других зудящих дерматозов, таких как узелковая почесуха, неспецифический зуд у людей пожилого возраста, а также других заболеваний с дисфункцией эпителиального барьера, таких как старческая кожа, воспалительное заболевание кишечника и болезнь Крона, а также панкреатит или рак, прежде всего рак яичников.

В одном варианте настоящего изобретения также предлагается применение указанных выше депсипептидов и их производных в качестве лекарственных средств, предназначенных для лечения муковисцидоза (МВ), хронического обструктивного заболевания легких (ХОЗЛ), фиброза легких, респираторного дистресс-синдрома взрослых, хронического бронхита, наследственной эмфиземы, ревматоидного артрита, воспалительного заболевания кишечника, псориаза, астмы.

В другом варианте настоящего изобретения также предлагается применение указанных выше депсипептидов и их производных в качестве лекарственных средств, предназначенных для лечения воспалительных и/или гиперпролиферативных и зудящих кожных заболеваний, таких как келоидные рубцы, гипертрофические рубцы, угри, атопический дерматит, псориаз, пустулезный псориаз, розовые угри, синдром Незертона, или других зудящих дерматозов, таких как узелковая почесуха, неспецифический зуд у людей пожилого возраста.

Настоящее изобретение также включает способы продуцирования циклического депсипептида или его производного, например, при культивировании штамма Сйопйгошусез, его вариантов или мутантных форм, в пригодной среде, и необязательно способы химической модификации полученного таким образом циклического депсипептида, или при экспрессии генов биосинтеза штамма Сйопйгошусез, его вариантов или мутантных форм, в гетерологическом микробном штамме-хозяине, и необязательно способы химической модификации полученного таким образом циклического депсипептида.

Указанные способы осуществляют с использованием штамма Сйопйгошусез сгоса1и8 (Э8М 19329) или Сйопйгошусез гоЬиз1из (Э8М 19330) или Сйопйгошусез ар1си1а1из (Э8М 21595).

Настоящее изобретение также относится к выделенному микроорганизму Сйопйгошусез, продуцирующему циклический депсипептид или его производное, депонированному в коллекции Э8М под номером Э8М 19329 или Э8М 19330 или Э8М 21595, и к циклическому депсипептиду или его производному, продуцированному выделенным микроорганизмом Сйопйгошусез.

Настоящее изобретение включает циклический депсипептид или его производное формулы (I) ^А3 ^А4 ^А5 Аб ΐ I

X—А—А---О---А₇

О) где сложноэфирная связь образуется между карбоксигруппой А₇ и гидроксигруппой А₂, где X и Αχ каждый независимо является необязательным, и где

X обозначает Н или группу, аминомодифицирующую группу, и ее обычно выбирают из арилкарбонила или ацила,

А1 обозначает глутамин, орнитин, глутаминовую кислоту или ее производное,

А2 обозначает треонин или серии,

А3 обозначает лейцин,

А₄ обозначает Айр, 3-аминопиперидин-2-он, дегидро-АНР, Айр-Ι, Айр-П, пролин, 5-гидроксипролин или его производное, причем участок присоединения А3 к А5 включает атом азота и карбоксильный атом кислорода (за счет замены атома водорода на связь) в составе пролина и 5-гидроксипролина, где Айр, 3-аминопиперидин-2-он, дегидро-АНР, Айр-Ι и Айр-ΙΙ имеют значения, определенные ниже, и где участок присоединения А3 к А5 включает атомы азота указанных соединений (за счет замены атома водорода на связь)

где X обозначает О или связь, и К обозначает органический остаток или радикал, как определено в

- 7 017735

п.3,

Л₅ обозначает изолейцин, фенилаланин или валин,

Аб обозначает тирозин, Ν-Ме-тирозин или его производное,

Άγ обозначает лейцин, изолейцин или валин, или их фармацевтически приемлемую соль.

Депсипептид по п.1, где X обозначает СНзСН₂СН(СНз)СО, (СНзДСНС^СО, (СНзДСНСО, СН3СО или фенил-СО.

Депсипептид по п.1, где атом азота амидной связи между Л₅ и Аб замещен метилом и где группа ОН в остатке тирозина обозначает ОК, где К выбирают из группы, включающей водород, С1-Спалкил, С2-С12 алкенил, С₂-С1₂алкинил, галоген(С_гСп)алкил, галоген(С₂-С1₂)алкенил, галоген(С₂-С1₂)алкинил, С1.С12 алкоксикарбонил, С1-С_палкоксикарбонил(С1-С12)алкил, С^С^алкиламинокарбонил, незамещенный или дополнительно замещенный арилом, арилалкилом, арилалкенилом или арилалкинилом, гетероциклилом и гетероциклилалкилом.

Депсипептид по п.1, где А4 обозначает производные З-аминопиперидин-2-она: Айр, Айр-Ι или Айр11, где К выбирают из группы, включающей С1_Спалкил, С2-С_палкенил, С2-С^алкинил, галоген(С_гС_п) алкил, С1-С12алкокси(С1-С12)алкил, С1-С12алкокси(С1-С12)алкокси(С1-С12)алкил, гидрокси(С1-С12)алкил, фенил и фенил(С1-Сб)алкил.

Депсипептид по п.1, где ацильный остаток X обозначает СНзСН2СН(СНз)СО или (СН3ДСНСО,

А1 обозначает глутамин, глутаминовую кислоту или ее производное,

А2 обозначает треонин,

Аз обозначает лейцин,

А4 обозначает Айр, з-аминопиперидин-2-он, пролин, 5-гидроксипролин или его производное,

А₅ обозначает изолейцин,

А7 обозначает изолейцин или валин, предпочтительно изолейцин.

Депсипептид по любому из предшествующих пунктов, где Л4 обозначает Айр, Айр-Ι, заминопиперидин-2-он, пролин или 5-гидроксипролин, предпочтительно Айр, Айр-Ι, з-аминопиперидин2-он, или 5-гидроксипролин, также предпочтительно Айр, Айр-Ι или 5-гидроксипролин, более предпочтительно Айр.

Депсипептид по п.1, который обозначает соединение формулы Л или В

где X и А1 имеют значения, определенные в п.1, и где

КЗ обозначает боковую цепь лейцина,

К5 обозначает боковую цепь изолейцина или валина, прежде всего К5 обозначает боковую цепь изолейцина,

Кб обозначает боковую цепь тирозина, необязательно модифицированного, прежде всего необязательно модифицированного по гидроксильной группе, как определено в п.3,

К7 обозначает боковую цепь лейцина, изолейцина или валина, прежде всего К7 обозначает боковую цепь изолейцина,

Υ обозначает водород или метил, прежде всего Υ обозначает метил.

Циклический депсипептид по любому из предшествующих пунктов, где А_ь А2, Аз, А₅, Аб и Λγ обозначают й-аминокислоты.

Циклический депсипептид по любому из предшествующих пунктов, где Л4 обозначает (з8,6К)-Айр.

Циклический депсипептид по любому из предшествующих пунктов, где А обозначает глутамин, орнитин или производное глутамина, как описано в любом из примеров в настоящем описании, и указанный депсипептид, например, выбирают из нитрила глутамина, сложного эфира глутаминовой кислоты, такого как С1-С12алкиловый эфир (например, метиловый эфир глутаминовой кислоты) или С6-С24 ариловый эфир (например, фениловый или бензиловый эфир глутаминовой кислоты).

Фармацевтическая композиция, включающая циклический депсипептид по любому из предшествующих пунктов в смеси с фармацевтически приемлемым носителем и/или ингредиентом.

Циклический депсипептид по любому из предшествующих пунктов для применения в качестве лекарственного препарата, прежде всего для применения, как описано в пунктах, относящихся к способам лечения пациента, таких как пп.1з-15, и применение указанных депсипептидов для получения лекарст

- 8 017735 венного средства, предназначенного для лечения заболевания или нарушения, как описано в указанных пунктах, относящихся к способам лечения.

Способ лечения субъекта, страдающего от воспалительных и/или гиперпролиферативных и зудящих кожных заболеваний, таких как келоидные рубцы, гипертрофические рубцы, угри, атопический дерматит, псориаз, пустулезный псориаз, розовые угри, синдром Незертона, или от других зудящих дерматозов, таких как узелковая почесуха, неспецифический зуд у людей пожилого возраста, а также других заболеваний с дисфункцией эпителиального барьера, таких как старческая кожа, воспалительное заболевание кишечника и болезнь Крона, а также панкреатит или рак, прежде всего рак яичников, муковисцидоз (МВ), хроническое обструктивное заболевание легких (ХОЗЛ), фиброз легких, респираторный дистресс-синдром взрослых, хронический бронхит, наследственная эмфизема, ревматоидный артрит, воспалительное заболевание кишечника, псориаз, астма, и указанный способ заключается во введении указанному субъекту терапевтически эффективного количества циклического депсипептида или его производного по любому из пп.1-10.

Способ лечения субъекта по п.13, где субъект страдает от келоидных рубцов, гипертрофических рубцов, угрей, атопического дерматита, псориаза, пустулезного псориаза, розовых угрей, синдрома Незертона или других зудящих дерматозов, таких как узелковая почесуха, неспецифический зуд у людей пожилого возраста, а также других заболеваний, связанных с дисфункцией эпителиального барьера, таких как старческая кожа, воспалительное заболевание кишечника и болезнь Крона, а также панкреатит или рак, прежде всего рак яичников.

Способ лечения субъекта по п.14, где субъект страдает от келоидных рубцов, гипертрофических рубцов, угрей, атопического дерматита, псориаза, пустулезного псориаза, розовых угрей, синдрома Незертона или других зудящих дерматозов, таких как узелковая почесуха, неспецифический зуд у людей пожилого возраста, а также других заболеваний, связанных с дисфункцией эпителиального барьера, таких как старческая кожа.

Способ лечения субъекта по п.13, где субъект страдает от муковисцидоза (МВ), хронического обструктивного заболевания легких (ХОЗЛ), фиброза легких, респираторного дистресс-синдрома взрослых, хронического бронхита, наследственной эмфиземы, ревматоидного артрита, воспалительного заболевания кишечника, псориаза, астмы.

Способ продуцирования циклического депсипептида или его производного по любому из пп.1-10, который заключается в культивировании штамма С1опйготусе8, его вариантов или мутантных форм в пригодной среде, и необязательно способ химической модификации полученного таким образом циклического депсипептида.

Способ продуцирования циклического депсипептида или его производного по любому из пп.1-10, который заключается в экспрессии генов биосинтеза штамма Сйопйготусе®, его вариантов или мутантных форм, в гетерологическом микробном штамме-хозяине, и необязательно способ химической модификации полученного таким образом циклического депсипептида.

Способ по п.17 или 18, где штамм обозначает Сйопйготусе® сгоса1л8 (Ό8Μ 19329) или Сйопйготусе8 гоЬи81и8 (Ό8Μ 19330) или СНопйготусез арюи1а1и8 (Ό8Μ 21595).

Выделенный микроорганизм С’1юпйготусе8. продуцирующий циклический депсипептид или его производное по любому из п.п.1-10, депонированный в коллекции Ό8Μ под номером Ό8Μ 19329 или Ό8Μ 19330 или Ό8Μ 21595.

Циклический депсипептид или его производное, продуцированный выделенным микроорганизмом С’1юпйготусе8 по п.20 или полученный способом по пп.17-18.

Способ получения производного циклического депсипептида или его производного по п.1, который включает следующие варианты:

а) получение производного циклического депсипептида или его производного по п.1, где А₄ обозначает

ΝΗ при обработке соединения, где А₄ обозначает

органической или неорганической кислотой или кислотой Льюиса при температуре от -78 до 150°С,

б) получение производного циклического депсипептида или его производного по п.1, где А₄ обозначает

- 9 017735

при обработке соединения, где А₄ обозначает Мо

ΝΗ молекулярным водородом или его источником в присутствии катализатора в растворителе при температуре от -50 до 100°С,

в) получение производного циклического депсипептида или его производного по п.1, где А₄ обозначает

при обработке соединения, где А₄ обозначает

органической или неорганической кислотой или кислотой Льюиса в присутствии восстанавливающего агента при температуре от -78 до 150°С, или

г) получение производного циклического депсипептида или его производного по п.1, где А₄ обо значает

замещенным или незамещенным спиртом и органической или неорганической кислотой или кислотой Льюиса при температуре от -78 до 150°С,

где К предпочтительно обозначает Н, алкил, замещенный алкил, при обработке соединения, где А₁обозначает С1п или Азп и А₄ обозначает

ΝΗ к

где К предпочтительно обозначает Н, алкил, замещенный алкил, замещенным или незамещенным спиртом и органической или неорганической кислотой или кислотой Льюиса в присутствии или отсутствие растворителя при температуре от -78 до 150°С,

е) получение соединений, где А1 обозначает

- 10 017735

где К предпочтительно обозначает Н, ОН, О-алкил, замещенный О-алкил, О-ацил при обработке соединения, где А₁ обозначает О1п или Азп и А₄ обозначает

дегидратирующим агентом в присутствии или отсутствие растворителя при температуре от -78 до 150°С,

ж) получение соединений, где А₄ обозначает и А₆ обозначает

где К предпочтительно обозначает алкил, замещенный алкил, ацил, алкоксикарбонил, при обработке соединения, где А₄ обозначает

и А₆ обозначает Туг, алкилирующим агентом или ацилирующим агентом в присутствии или отсутствие растворителя при температуре от -78 до 150°С.

Циклический депсипептид или его производное или его фармацевтически приемлемая соль, прежде всего и как описано в данном контексте и/или в примерах.

Конкретные варианты циклических депсипептидов по настоящему изобретению включают

- 11 017735

Циклические депсипептиды формул (ΙΙ)-(νΐΙ), (ΧΙ)-(Χΐν) и (XVII) продуцируются штаммом С1юпбтошусек сгоса1и8 по настоящему изобретению (Ό8Μ 19329).

Другие конкретные варианты циклических депсипептидов по настоящему изобретению включают

Циклические депсипептиды формул (νΐΙΙ)-(Χ) продуцируются штаммом Сйопбтошусек гоЬн51н5 по настоящему изобретению (Ό8Μ 19330).

Циклические депсипептиды формул (Χν)-(ΧνΙ) продуцируются штаммом Сйопбтошусек ар1си1аШ5 по настоящему изобретению (Ό8Μ 21595).

- 12 017735

Список сокращений

Айр - 3-амино-6-гидроксипиперидин-2-он;

Ό8ΜΖ - немецкая коллекция микроорганизмов и культуральных клеток;

К7ч - калликреин 7 человека;

ЖХВР - жидкостная хроматография высокого разрешения; рО₂ - парциальное давление кислорода в питательной среде (100% насыщение воздухом); об./об./мин скорость аэрации (объем воздуха/объем культуральной среды/мин.

Термин химический остаток обозначает любую органическую или неорганическую группу. Химический остаток включает, не ограничиваясь только ими, замещенную или незамещенную алифатическую группу, например, С₁-С₃алкил, С₁-С₆алкил или С₁-С₁₂алкил, замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный арилалкил, замещенный или незамещенный гетероарил или галоген. Например, остаток, как определено в пунктах формулы, обозначает любые химические группы, описанные ниже в данном контексте.

Термин химический остаток включает, не ограничиваясь только ими, аминокислоты, пептиды, полипептиды, белки и т. п.

Примеры неорганических остатков обозначают, например, галогены, такие как Вг или С1.

Термин алифатическая группа обозначает неароматический остаток, который содержит любую комбинацию атомов углерода, атомов водорода, атомов галогена, кислорода, азота или других атомов, и необязательно содержит одну или более ненасыщенных связей, например, двойные и/или тройные связи. Алифатическая группа является прямой, разветвленной или циклической структурой, предпочтительно содержит от приблизительно 1 до приблизительно 24 атомов углерода, более предпочтительно содержит от приблизительно 1 до приблизительно 12 атомов углерода. Кроме алифатических углеводородных групп алифатические группы включают, например, полиалкоксиалкилы, такие как полиалкиленгликоли, полиамины и полиимины. Указанные алифатические группы могут содержать заместители.

Термины С₁-С₃алкил, С₁-С₆алкил или С₁-С₁₂алкил, использованные в данном контексте, обозначают насыщенные углеводородные радикалы с прямой или разветвленной цепью, содержащие от одного до трех, от одного до шести или от одного до двенадцати атомов углерода, соответственно. Примеры С₁С₃алкильных радикалов включают метил, этил, пропил и изопропил, примеры С₁-С₆алкильных радикалов включают, не ограничиваясь только ими, метил, этил, пропил, изопропил, н-бутил, трет-бутил, вторбутил, н-пентил, неопентил и н-гексил, а примеры С₁-С₁₂алкильных радикалов включают, не ограничиваясь только ими, этил, пропил, изопропил, гексил, гептил, октил, нонил, децил, ундецил, додецил и т.п.

Термин замещенный алкил, использованный в данном контексте, обозначает алкил, такой как С₁С1₂алкил или С₁-С₆алкил, замещенный одним, двумя, тремя или более алифатическими заместителями. Пригодные алифатические заместители включают, не ограничиваясь только ими, -Р, -С1, -Вг, -I, -ОН, защищенную гидроксигруппу, алифатические простые эфиры, ароматические простые эфиры, оксогруппу, -ΝΟ₂, -СЫ, -С₁-С₁₂алкил, необязательно замещенный галогеном (такой как пергалогеналкилы), -С₂-С₁₂алкенил, необязательно замещенный галогеном, -С₂-С₁₂алкинил, необязательно замещенный галогеном, -ΝΗ₂, защищенную аминогруппу, -ЫН-С₁-С₁₂алкил, -ЫН-С₂-С₁₂алкенил, -ЫН-С₂-С₁₂алкинил, -ЫН-С₃С₁₂ииклоалкил, -ЫН-арил, -ЫН-гетероарил, -ЫН-гетероциклоалкил, -диалкиламиногруппу, -диариламиногруппу, -дигетероариламиногруппу, -О-С₁-С₁₂алкил, -О-С₂-С₁₂алкенил, -О-С₂-С₁₂алкинил, -О-С₃-С₁₂циклоалкил, -О-арил, -О-гетероарил, -О-гетероциклоалкил, -С(О)-С₁-С₁₂алкил, -С(О)-С₂С1₂алкенил, -С(О)-С₂-С₁₂алкинил, -С(О)-С₃-С₁₂циклоалкил, -С(О)-арил, -С(О)-гетероарил, -С(О)гетероциклоалкил, -СОЫН₂, -СОЫН-С₁-С₁₂алкил, -СОЫН-С₂-С₁₂алкенил, -СОЫН-С₂-С₁₂алкинил, -СОЫНС₃-С₁₂циклоалкил, -СОЫН-арил, -СОЫН-гетероарил, -СОЫН-гетероциклоалкил, -СО₂-С₁-С₁₂алкил, -СО₂С₂-С₁₂алкенил, -СО₂-С₂-С₁₂алкинил, -СО₂-С₃-С₁₂циклоалкил, -СО₂-арил, -СО₂-гетероарил, -СО₂гетероциклоалкил, -ОСО₂-С₁-С₁₂алкил, -ОСО₂-С₂-С₁₂алкенил, -ОСО₂-С₂-С₁₂алкинил, -ОСО₂-С₃С₁₂циклоалкил, -ОСО₂-арил, -ОСО₂-гетероарил, -ОСО₂-гетероциклоалкил, -ОСОЫН₂, -ОСОЫН-С₁С₁₂алкил, -ОСОЫН-С₂-С₁₂алкенил, -ОСОыН-С₂-С₁₂алкинил, -ОСОЫН-С₃-С₁₂циклоалкил, -ОСОЫН-арил, -ОСОЫН-гетероарил, -ОСОЫН-гетероциклоалкил, ЫНС(О)-С₁-С₁₂алкил, -ЫНС(О)-С₂-С₁₂алкенил, -ЫНС(О)-С₂-С₁₂алкинил, -ЫНС(О)-С₃-С₁₂циклоалкил, -ЫНС(О)-арил, -ЫНС(О)-гетероарил, -ЫНС(О)гетероциклоалкил, -ЫНСО₂-С₁-С₁₂алкил, -ЫНСО₂-С₂-С₁₂алкенил, -ЫНСО₂-С₂-С₁₂алкинил, -ЫНСО₂-С₃С₁₂циклоалкил, -ЫНСО₂-арил, -ЫНСО₂-гетероарил, -ЫНСО₂-гетероциклоалкил, ЫНС(О)ЫН₂, ЫНС(О)ЫНС₁-С₁₂алкил, -ЫНС(О)ЫН-С₂-С₁₂алкенил, -ЫНС(О)ЫН-С₂-С₁₂алкинил, -ЫНС(О)ЫН-С₃-С₁₂циклоалкил, -ЫНС(О)ЫН-арил, -ЫНС(О)ЫН-гетероарил, -ЫНС(О)ЫН-гетероциклоалкил, ЫНС(8)ЫК₂, ЫНС(8)ЫН-С₁С₁₂алкил, -ЫНС(8)ЫН-С₂-С₁₂алкенил, -ЫНС(8)ЫН-С₂-С₁₂алкинил, -ЫНС(8)ЫН-С₃-С₁₂циклоалкил, -ЫНС(8)ЫН-арил, -ЫНС(8)ЫН-гетероарил, -ЫНС(8)ЫН-гетероциклоалкил, ЫНС(ЫН)ЫН₂, ЫНС(ЫН)ЫНС₁-С₁₂алкил, -ЫНС(ЫН)ЫН-С₂-С₁₂алкенил, -ЫНС(ЫН)ЫН-С₂-С₁₂алкинил, -ЫНС(ЫН)ЫН-С₃С₁₂циклоалкил, -ЫНС(ЫН)ЫН-арил, -ЫНС(ЫН)ЫН-гетероарил, -ЫНС(ЫН)ЫН-гетероциклоалкил, ЫНС(ЫН)-С₁-С₁₂алкил, -ЫНС(ЫН)-С₂-С₁₂алкенил, -ЫНС(ЫН)-С₂-С₁₂алкинил, -ЫНС(ЫН)-С₃-С₁₂циклоалкил, -ЫНС(ЫН)-арил, -ЫНС(ЫН)-гетероарил, -ЫНС(ЫН)-гетероциклоалкил, С(ЫК)ЫН-С₁-С₁₂алкил, -С(ЫН)ЫН-С₂-С₁₂алкинил, -С(ЫК)ЫН-С₂-С₁₂алкинил, -С(ЫН)ЫН-С₃-С₁₂циклоалкил, -С(ЫН)ЫН-арил, -С(ЫН)ЫН-гетероарил, -С(ЫН)ЫН-гетероциклоалкил, -8(О)-С₁-С₁₂алкил, -8(О)-С₂-С₁₂алкенил, -8(О)-С₂- 13 017735

С₁₂алкинил, -8(О)-С₃-С₁₂циклоалкил, -8(О)-арил, -8(О)-гетероарил, -8(О)-гетероциклоалкил, -8Ο₂ΝΗ₂, -8О₂ХН-С₁-С₁₂алкил, -8О₂NΗ-С₂-С₁₂алкенил, -8О₂NΗ-С₂-С₁₂алкинил, -8О₂NΗ-С₃-С₁₂циклоалкил, -8О₂NΗ-арил, -8О₂NΗ-гетероарил, -8О₂NΗ-гетероциклоалкил, -№Н8О₂-С₁-С₁2алкил, ^БОг-О-Сиалкенил, -NΗ8О₂-С₂-С₁₂алкинил, -NΗ8О₂-С₃-С₁₂циклоалкил, -ЛН8О₂-арил, -NΗ8О₂-гетероарил, -NΗ8О₂гетероциклоалкил, -СН₂ПН₂, -СН₂8О₂СН₃, -арил, -арилалкил, -гетероарил, -гетероарилалкил, -гетероциклоалкил, -С₃-С₁₂циклоалкил, полиалкоксиалкил, полиалкоксигруппу, -метоксиметоксигруппу,

-метоксиэтоксигруппу, -8Н, -8-С₁-С₁₂алкил, -8-С₂-С₁₂алкенил, -8-С₂-С₁₂алкинил, -8-С₃-С₁₂циклоалкил, -8-арил, -8-гетероарил, -8-гетероциклоалкил или метилтиометил. Следует понимать, что указанные арилы, гетероарилы, алкилы и т.п. дополнительно замещены.

Термины С₂-С₁₂алкенил или С₂-С₆алкенил, использованные в данном контексте, обозначают одновалентную группу, полученную из углеводородного остатка, содержащего от двух до двенадцати или от двух до шести атомов углерода и по крайней мере одну углерод-углеродную двойную связь за счет удаления одного атома водорода. Алкенильные группы включают, не ограничиваясь только ими, например, этенил, пропенил, бутенил, 1-метил-2-бутен-1-ил, алкадиены и т.п.

Термин замещенный алкенил, использованный в данном контексте, обозначает группы С₂С12алкенил или С2-С6алкенил, как определено выше, замещенные одним, двумя, тремя или более алифатическими заместителями.

Термины С₂-С₁₂алкинил или С₂-С₆алкинил, использованные в данном контексте, обозначают одновалентную группу, полученную из углеводородного остатка, содержащего от двух до двенадцати или от двух до шести атомов углерода и по крайней мере одну углерод-углеродную тройную связь за счет удаления одного атома водорода. Примеры алкенильных групп включают, не ограничиваясь только ими, например, этинил, 1-пропинил, 1-бутинил и т.п.

Термин замещенный алкинил, использованный в данном контексте, обозначает группы С₂С12алкинил или С2-С6алкинил, как определено выше, замещенные одним, двумя, тремя или более алифатическими заместителями.

Термин С₁-С₆алкоксигруппа, использованный в данном контексте, обозначает группу С₁-С₆алкил, как определено выше, присоединенную к остальному фрагменту молекулы через атом кислорода. Примеры С1-С6алкоксигруппы включают, не ограничиваясь только ими, метокси, этокси, пропокси, изопропокси, н-бутокси, втор-бутокси, трет-бутокси, н-пентокси, неопентокси и н-гексокси.

Термин галоген, использованный в данном контексте, обозначает атом, выбранный из фтора, хлора, брома и иода.

Термин арил, использованный в данном контексте, обозначает моно- или бициклическую карбоциклическую циклическую систему, содержащую один или два ароматических цикла, и включает, не ограничиваясь только ими, фенил, нафтил, тетрагидронафтил, инданил, иденил и т. п.

Термин замещенный арил, использованный в данном контексте, обозначает арильную группу, как определено выше, замещенную одним, двумя, тремя или более ароматическими заместителями.

Ароматические заместители включают, не ограничиваясь только ими, -Р, -С1, -Вг, -I, -ОН, защищенную гидроксигруппу, алифатические простые эфиры, ароматические простые эфиры, оксогруппу, -ΝΘ₂, -ΌΝ, -С1-С1₂алкил, необязательно замещенный галогеном (такой как пергалогеналкил), -С₂-С1₂алкенил, необязательно замещенный галогеном, -С2-С12алкинил, необязательно замещенный галогеном, -ПН₂, защищенную аминогруппу, -NΗ-С1-С1₂алкил, -NΗ-С₂-С1₂алкенил, -NΗ-С₂-С1₂алкинил, -ХН-С₃С1₂циклоалкил, -NΗ-арил, -NΗ-гетероарил, -NΗ-гетероциклоалкил, -диалкиламиногруппу, -диариламиногруппу, -дигетероариламиногруппу, -О-С1-С12алкил, -О-С2-С12алкенил, -О-С2-С12алкинил, -О-С3С12циклоалкил, -О-арил, -О-гетероарил, -О-гетероциклоалкил, -С(О)-С1-С12алкил, -С(О)-С2-С12алкенил, -С(О)-С2-С12алкинил, -С(О)-С3-С12циклоалкил, -С(О)-арил, -С(О)-гетероарил, -С(О)-гетероциклоалкил, -СОNΗ₂, -СОNΗ-С1-С1₂алкил, -СОNΗ-С₂-С1₂алкенил, -СОNΗ-С₂-С1₂алкинил, -СОNΗ-С₃-С1₂циклоалкил, -СОNΗ-арил, -СОNΗ-гетероарил, -СОNΗ-гетероциклоалкил, -СО₂-С1-С1₂алкил, -СО₂-С₂-С₁₂алкенил, -СО2-С2-С12алкинил, -СО2-С3-С12циклоалкил, -СО2-арил, -СО2-гетероарил, -СО2-гетероциклоалкил, -ОСО2-С1-С12алкил, -ОСО2-С2-С12алкенил, -ОСО2-С2-С12алкинил, -ОСО2-С3-С12циклоалкил, -ОСО2-арил, -ОСО₂-гетероарил, -ОСО₂-гетероциклоалкил, -ОСОПН₂, -ОСОNΗ-С₁-С₁₂алкил, -ОСОNΗ-С₂-С₁₂алкенил, -ОСОNΗ-С₂-С₁₂алкинил, -ОСОпН-С₃-С₁₂циклоалкил, -ОСОЯН-арил, -ОСОЯН-гетероарил, -ОСОЯНгетероциклоалкил, -ННС(О)-С|-С|₂алкил. -ПНС(О)-С₂-С₁₂алкенил, -ПНС(О)-С₂-С₁₂алкинил, -ПНС(О)-С₃С₁₂циклоалкил, -ПНС(О)-арил, -ПНС(О)-гетероарил, -ПНС(О)-гетероциклоалкил, -ИНСО^^-С^алкил, -ПНСО₂-С₂-С₁₂алкенил, -ПНСО₂-С₂-С₁₂алкинил, -ПНСО₂-С₃-С₁₂циклоалкил, -ПНСО₂-арил, -ПНСО₂гетероарил, -ПНСО₂-гетероциклоалкил, ПНС(О)ПН₂, КНС^ПН-Ц-С^алкил, -ПНС(О)ПН-С₂С₁₂алкенил, -ПНС(О)ПН-С₂-С₁₂алкинил, -ПНС(О)ПН-С₃-С₁₂циклоалкил, -ПНС(О)ПН-арил, -ПНС(О)ПНгетероарил, -ПНС(О)ПН-гетероциклоалкил, ПНС(8)ПН₂, NΗС(8)NΗ-С₁-С₁₂алкил, -ПНС(8)ПН-С₂С₁₂алкинил, -ПНС(8)ПН-С₂-С₁₂алкинил, -ПНС(8)ПН-С₃-С₁₂циклоалкил, -ПНС(8)ПН-арил, -ННС(8)ННгетероарил, -ПНС(8)ПН-гетероциклоалкил, ПНС(ПН)ПН₂, NΗС(NΗ)NΗ-С₁-С₁₂алкил, -ПНС(НН)ПН-С₂С₁₂алкенил, -ПНС(ЫН)ПН-С₂-С₁₂алкинил, -ПНС(ПН)ПН-С₃-С₁₂циклоалкил, -ПНС(ПН)ПН-арил, -NΗС(NΗ)NΗ-гетероарил,-NΗС(NΗ)NΗ-гетероциклоалкил, МН^МН)-^ -С₁₂алкил, -Ν4 Τ’(Ν Н )-С₂-С₁₂ алкенил, -NΗС(NΗ)-С₂-С₁₂алкинил, -NΗС(NΗ)-С₃-С₁₂циклоалкил, -NΗС(NΗ)-арил, -ПНС(ЫН)

- 14 017735 гетероарил, -ΝΗΟ’(ΝΗ)-гетероциклоалкил, -С(НН)НН-С|-С|₂алкил. -С(ХН)ИН-С₂-С1₂алкенил, -0(ΝΗ)ΝΗС₂-С₁₂алкинил, -С(МН)МН-С₃-С₁₂циклоалкил, -Ο’(ΝΗ)ΝΗ-;·ιριττ -С^Н^Н-гетероарил. -Ο’(ΝΗ)ΝΗгетероциклоалкил, -З(О)-С₁-С₁₂алкил, -З(О)-С₂-С₁₂алкенил, -8(О)-С₂-С₁₂алкинил, -8(О)-С₃-С₁₂ циклоалкил. -8(О)-арил, -8(О)-гетероарил, -8(О)-гетероциклоалкил, -ЗО₂ИН₂, -ЗО₂МН-С₁-С₁₂алкил, -8О₂ЯН-С₂С₁₂алкенил, -ЗО₂МН-С₂-С₁₂алкинил, -ЗО₂МН-С₃-С₁₂циклоалкил, -ЗО₂МН-арил, -ЗО₂МН-гетероарил, -ЗО₂МН-гетероциклоалкил, -МНЗО^Ц-Спалкил, -МНЗО₂-С₂-С₁₂алкенил, -МНЗО₂-С₂-С₁₂алкинил, -ЫНЗО₂-С₃-С₁₂циклоалкил, -МНЗО₂-арил, -ИНЗО₂-гетероарил, -МНЗО₂-гетероциклоалкил, -СН₂ЯН₂, -СН₂ЗО₂СН₃, -арил, -арилалкил, -гетероарил, -гетероарилалкил, -гетероциклоалкил, -С₃-С₁₂циклоалкил, полиалкоксиалкил, полиалкоксигруппу, -метоксиметоксигруппу, -метоксиэтоксигруппу, -ЗН, -З-С₁-С₁₂алкил, -З-С₂-С₁₂алкенил, -3-С₂-С₁₂алкинил, -3-С₃-С₁₂циклоалкил, -δ-арил, -З-гетероарил, -З-гетероциклоалкил или метилтиометил. Следует понимать, что указанные арилы, гетероарилы, алкилы и т.п. дополнительно замещены.

Термин арилалкил, использованью в данном контексте, обозначает арильную группу, присоединенную к остальному фрагменту молекулы через С₁-С₃алкил или С₁-С₆алкил. Примеры арилалкила включают, не ограничиваясь только ими, бензил, фенетил и т.п.

Термин замещенный арилалкил, использованный в данном контексте, обозначает арилалкильную группу, как определено выше, замещенную одним, двумя, тремя или более ароматическими заместителями.

Термин гетероарил, использованный в данном контексте, обозначает моно-, би- или трициклический ароматический радикал или цикл, содержащий от пяти до десяти атомов в цикле, из которых по крайней мере один атом в цикле выбирают из З, О и Ν, ноль, один или два атома в цикле обозначают дополнительные гетероатомы, независимо выбранные из З, О и Ν, а остальные атомы в цикле обозначают углерод, причем любой атом N или З, содержащийся в цикле, необязательно находится в окисленном состоянии. Гетероарил включает, не ограничиваясь только ими, пиридинил, пиразинил, пиримидинил, пирролил, пиразолил, имидазолил, тиазолил, оксазолил, изоксазолил, тиадиазолил, оксадиазолил, тиофенил, фуранил, хинолинил, изохинолинил, бензимидазолил, бензооксазолил, хиноксалинил и т. п. Гетероароматический цикл связан с остальным фрагментом молекулы через атом углерода или гетероатом.

Термин замещенный гетероарил, использованный в данном контексте, обозначает гетероарильную группу, как определено выше, замещенную одним, двумя, тремя или четырьмя ароматическими заместителями.

Термин С₃-С₁₂циклоалкил, использованный в данном контексте, обозначает одновалентную группу, полученную из моноциклического или бициклического насыщенного карбоциклического соединения за счет удаления одного атома водорода. Примеры включают, не ограничиваясь только ими, циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, бицикло [2.2.1] гептил и бицикло[2.2.2]октил.

Термин замещенный С₃-С₁₂циклоалкил, использованный в данном контексте, обозначает С₃-С₁₂циклоалкильную группу, как определено выше, замещенную одним, двумя, тремя или более алифатическими заместителями.

Термин гетероциклоалкил, использованный в данном контексте, обозначает неароматический 5-, 6- или 7-членный цикл, или би- или трициклическую конденсированную систему, где (1) каждый цикл содержит от одного до трех гетероатомов, независимо выбранных из кислорода, серы и азота, (2) каждый 5-членный цикл не содержит двойных связей или содержит 1 двойную связь, а каждый 6-членный цикл не содержит двойных связей или содержит 1 или 2 двойных связей, (3) гетероатомы азота и серы необязательно находятся в окисленном состоянии, (4) гетероатом азота необязательно является четвертичным, (5) любой из указанных выше циклов конденсирован с бензольным циклом, и (6) остальные атомы в цикле обозначают атомы углерода, которые необязательно замещены оксогруппой. Примеры гетероциклоалкильных групп включают, не ограничиваясь только ими, [1.3]диоксолан, пирролидинил, пиразолинил, пиразолидинил, имидазолинил, имидазолидинил, пиперидинил, пиперазинил, оксазолидинил, изоксазолидинил, морфолинил, тиазолидинил, изотиазолидинил, хиноксалинил, пиридазинонил и тетрагидрофурил.

Термин замещенный гетероциклоалкил, использованный в данном контексте, обозначает гетероциклоалкильную группу, как определено выше, замещенную одним, двумя, тремя или более алифатическими заместителями.

Термин гетероарилалкил, использованный в данном контексте, обозначает гетероарилалкильную группу, присоединенную к остальному фрагменту молекулы через С₁-С₃алкил или С₁-С₆алкил. Примеры гетероарилалкила включают, не ограничиваясь только ими, пиридинилметил, пиримидинилэтил и т.п.

Термин замещенный гетероарилалкил, использованный в данном контексте, обозначает гетероарилалкильную группу, как определено выше, замещенную одним, двумя, тремя или более ароматическими заместителями.

Термин С₁-С₃алкиламиногруппа, использованный в данном контексте, обозначает одну или две С₁-С₃алкильных групп, как определено выше, присоединенных к остальному фрагменту молекулы через атом азота. Примеры С₁-С₃алкиламиногрупп включают, не ограничиваясь только ими, метиламиногруппу, диметиламиногруппу, этиламиногруппу, диэтиламиногруппу и пропиламиногруппу. Термин алки

- 15 017735 ламиногруппа обозначает группу формулы -ПН(С₁-С₃алкил), где С₁-С₁₂алкил имеет значение, как определено ранее.

Термин диалкиламиногруппа обозначает группу формулы -Ы(С₁-С₁₂алкил)(С₁-С₁₂алкил), где С₁-С₁₂алкил имеет значение, как определено ранее. Примеры диалкиламиногрупп включают, не ограничиваясь только ими, диметиламиногруппу, диэтиламиногруппу, метилэтиламиногруппу, пиперидино и т. п.

Термин алкоксикарбонил обозначает сложноэфирную группу, например, алкоксигруппу, присоединенную к остальному фрагменту молекулы через карбонильную группу, такую как метоксикарбонил, этоксикарбонил и т.п.

Термин карбоксальдегид, использованный в данном контексте, обозначает группу формулы -СНО.

Термин карбоксигруппа, использованный в данном контексте, обозначает группу формулы -СООН.

Термин карбоксамид, использованный в данном контексте, обозначает группу формулы -С(О)ПН(С₁-С₁₂алкил) или -С(О)П(С₁-С₁₂алкил)(С₁-С₁₂алкил), -ί’(Ό)ΝΗ₂. -ЫНС(О)(С₁-С₁₂алкил), -Ы(С₁С12алкил)С(О)(С1-С12алкил) и т.п.

Термин гидроксизащитная группа, использованный в данном контексте, обозначает химически лабильный остаток, который защищает гидроксильную группу от нежелательных реакций в ходе синтеза. После проведения указанного синтеза гидроксизащитную группу, описанную в данном контексте, можно селективно удалить. Гидроксизащитные группы описаны в книге Т. Н. Огееп и Ρ.Ο.Μ. ХУиК Рго1есЬуе Огоирк ίη Огдашс 8уп1йек18, 3-е изд., ЛоПп Уйеу & 8опк, №\ν Уогк, (1999). Примеры гидроксизащитных групп включают бензилоксикарбонил, 4-нитробензилоксикарбонил, 4-бромбензилоксикарбонил, 4-метоксибензилоксикарбонил, метоксикарбонил, трет-бутоксикарбонил, изопропоксикарбонил, дифенилметоксикарбонил, 2,2,2-трихлорэтоксикарбонил, 2-(триметилсилил)этоксикарбонил, 2-фурфурилоксикарбонил, аллилоксикарбонил, ацетил, формил, хлорацетил, трифторацетил, метоксиацетил, феноксиацетил, бензоил, метил, трет-бутил, 2,2,2-трихлорэтил, 2-триметилсилилэтиловый эфир, 1,1-диметил-2пропенил, 3-метил-3-бутенил, аллил, бензил, пара-метоксибензилдифенилметил, трифенилметил (тритил), тетрагидрофурил, метоксиметил, метилтиометил, бензилоксиметил, 2,2,2-трихлорэтоксиметил, 2-(триметилсилил)этоксиметил, метансульфонил, пара-толуолсульфонил, триметилсилил, триэтилсилил, триизопропилсилил и т.п. Предпочтительными гидроксизащитными группами являются ацетил (Ас или С(О)СН₃), бензоил (Вп или -С(О)С₆Н₅) и триметилсилил (ΤΜ8 или -81(Сн₃)₃).

Термин защищенная гидроксигруппа, использованный в данном контексте, обозначает гидроксигруппу, защищенную защитной группой, как определено выше, включая, например, бензоил, ацетил, триметилсилил, триэтилсилил, метоксиметил.

Термин аминозащитная группа, использованный в данном контексте, обозначает химически лабильный остаток, который защищает аминогруппу от нежелательных реакций в ходе синтеза. После проведения указанного синтеза аминозащитную группу, как описано в данном контексте, можно селективно удалить. Аминозащитные группы описаны в книге Т. Н. Огееп и Ρ.Ο.Μ. ХУиК РгоЮсЙуе Огоирк ίη Огдашс 8уййе515, 3-е изд., 1ойп \УПеу & 8опк, №\ν Уогк, (1999). Примеры аминозащитных групп включают, не ограничиваясь только ими, трет-бутоксикарбонил, 9-флуоренилметоксикарбонил, бензилоксикарбонил и т. п.

Термин защищенная аминогруппа использованный в данном контексте, обозначает аминогруппу, защищенную защитной группой, как определено выше.

Термин ацил обозначает кислотный остаток, включая, не ограничиваясь только ими, остатки карбоновых кислот, карбаминовых кислот, угольных кислот, сульфоновых кислот и фосфорных кислот. Примеры включают алифатические карбонилы, ароматические карбонилы, алифатические сульфонилы, ароматические сульфонилы, алифатические сульфинилы, ароматические сульфинилы, алифатические сульфамилы, ароматические сульфамилы, ароматические фосфаты и алифатические фосфаты.

Термин аминокислота обозначает молекулу, которая содержит аминогруппу и карбоксильную группу, общей формулы NН₂СНΒСООН. Термин аминокислота включает стандартные аминокислоты и нестандартные аминокислоты.

Термин стандартная аминокислота обозначает аланин, аргинин, аспарагин, аспарагиновую кислоту, цистеин, глутаминовую кислоту, глутамин, глицин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, пролин, серии, треонин, триптофан, тирозин и валин.

Термин стандартная аминокислота, которая не является аспарагиновой кислотой обозначает аминокислоту, которую выбирают из группы, включающей аланин, аргинин, аспарагин, цистеин, глутаминовую кислоту, глутамин, глицин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, пролин, серии, треонин, триптофан, тирозин и валин. В случае глутамина или глутаминовой кислоты производное обозначает, например, нитрил или сложный эфир, такой как, например, нитрил глутамина, сложный эфир глутаминовой кислоты.

Термин нестандартная аминокислота обозначает аминокислоты (молекулу, которая содержит аминогруппу и карбоксильную группу), которые не относятся к стандартным аминокислотам. Примеры

- 16 017735 нестандартных аминокислот обозначают селеноцистеин (входит в состав некоторых белков и кодируется кодоном УГА), пирролизин (который используется некоторыми метанобразующими бактериями, продуцирующими метан, входит в состав ферментов и кодируется кодоном УАГ), лантионин, 2-аминоизомасляную кислоту, дегидроаланин, 3-амино-6-гидрокси-2-пиперидон, γ-аминомасляную кислоту, орнитин, цитруллин, гомоцистеин, допамин или гидроксипролин.

Термин неосновная стандартная аминокислота обозначает аланин, аспарагин, аспарагиновую кислоту, цистеин, глутаминовую кислоту, глутамин, глицин, изолейцин, лейцин, метионин, фенилаланин, пролин, серии, треонин, триптофан, тирозин и валин.

Термин Айр (3-амино-6-гидроксипиперидин-2-он) обозначает нестандартную аминокислоту, входящую в состав, например, цианобактерий. Термин производные Айр включает, не ограничиваясь только ими, 3-амино-3,4-дигидро-1Н-пиридин-2-он (дегидро-АНР), 3-аминопиперидин-2-он и производные АНР и простых и сложных эфиров. Предпочтительно производные Айр обозначают 3аминопиперидин-2-он, или Айр-Ι или Айр-ΙΙ, как показано ниже, где Я выбирают из группы, включающей С1-С1₂алкил, С₂-С1₂алкенил, С₂-С1₂алкинил, галоген(С1-С1₂)алкил, С1-С1₂алкокси(С1-С1₂)алкил, С₁-С₁₂алкокси(С1-С1₂)алкокси(С1-С1₂)алкил, гидрокси(С1-С1₂)алкил, фенил и фенил(С1-С₆)алкил.

Различные члены указанного семейства нестандартных аминокислот обозначают:

Производное пролина включает, например, 5-гидроксипролин.

Термин производные аминокислот включает, не ограничиваясь только ими, О-алкил, О-арил, Оацил, 8-алкил, 8-арил, 8-8-алкил, алкоксикарбонил, О-карбонилалкоксигруппу, карбонат, Окарбониларилоксигруппу, О-карбонилалкиламиногруппу, О-карбонилариламиногруппу, Ν-алкил, Νдиалкил, Ν-триалкиламмоний, Ν-ацил, Ν-карбонилалкоксигруппу, Ν-карбониларилоксигруппу, Νкарбонилалкиламиногруппу, Ν-карбонилариламиногруппу, Ν-сульфонилалкил или Ν-сульфониларил.

Термин производные неосновных стандартных аминокислот включает, не ограничиваясь только ими, О-алкил, О-арил, О-ацил, 8-алкил, 8-арил, 8-8-алкил, алкоксикарбонил, О-карбонилалкоксигруппу, карбонат, О-карбониларилоксигруппу, О-карбонилалкиламиногруппу, О-карбонилариламиногруппу, Νалкил, Ν-диалкил, Ν-триалкиламмоний, Ν-ацил, Ν-карбонилалкоксигруппу, Ν-карбониларилоксигруппу, Ν-карбонилалкиламиногруппу, Ν-карбонилариламиногруппу, Ν-сульфонилалкил или Ν-сульфониларил.

Термин производное тирозина включает, не ограничиваясь только ими, О-алкил, О-арил, Огетероарил, О-ацил, О-РО3Н и О-8О3Н, а также галогенированные в орто- или мета-положении производные.

Группа ОН в составе тирозина может обозначать ОЯ, где Я выбирают из группы, включающей водород, С1-С1₂алкил, С₂-С1₂алкенил, С₂-С1₂алкинил, галоген(С1-С1₂)алкил, галоген(С₂-С1₂)алкенил, галоген(С₂-С1₂)алкинил, С₁-С₁₂алкоксикарбонил, С1-С1₂алкоксикарбонил(С1-С1₂)алкил, С1-С1₂алкиламинокарбонил, незамещенный или дополнительно замещенный арилом, арилалкилом, арилалкенилом или арилалкинилом, гетероциклилом и гетероциклилалкилом.

Термин производное депсипептида включает, не ограничиваясь только ими, модифицированные депсипептиды, как описано в данном контексте, и более подробно ниже в разделе Примеры. Указанные производные можно получить по известным методикам.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтически приемлемым солям и производным соединений по настоящему изобретению, а также к способам получения указанных соединений. Один способ получения соединения заключается в культивировании штамма Сйопбготусек, его вариантов или

- 17 017735 мутантных форм в пригодных условиях, предпочтительно по методике ферментации, описанной ниже.

Соли соединений по настоящему изобретению, содержащих по крайней мере одну солеобразующую группу, получают по стандартным методикам. Например, соли соединений по настоящему изобретению, содержащих кислотные группы, получают при обработке указанных соединений соединениями металлов, такими как соли щелочных металлов пригодных органических карбоновых кислот, например, натриевая соль 2-этилгексановой кислоты, органическими соединениями щелочных или щелочноземельных металлов, такими как соответствующие гидроксиды, карбонаты или гидрокарбонаты, такие как гидроксид, карбонат или идрокарбонат натрия или калия, соответствующими соединениями кальция или аммония или пригодным органическим амином, предпочтительно в стехиометрическом количестве или в присутствии небольшого избытка солеобразующего агента. Кислотно-аддитивные соли соединений по настоящему изобретению получают по стандартным методикам, например, при обработке указанных соединений кислотой или ионно-обменным реагентом. Внутренние соли соединений по настоящему изобретению, содержащих кислотную и основную солеобразующие группы, например, свободную карбоксильную группу и свободную аминогруппу, получают, например, при нейтрализации солей, таких как кислотно-аддитивные соли, до рН, соответствующего электрической точке, например, слабыми основаниями или при обработке ионообменниками.

Соли можно превратить в свободные соединения по стандартным методикам, например, соли металлов и аммония при обработке пригодными кислотами, а кислотно-аддитивные соли, например, при обработке пригодным основанием.

Смеси изомеров, полученные по настоящему изобретению, можно разделить на индивидуальные изомеры известными способами, например, диастереоизомеры при распределении в многофазных смесях растворителей, при перекристаллизации и/или хроматографией, например, на силикагеле, или жидкостной хроматографией среднего давления на обращено-фазовой колонке, а рацематы разделяют, например, при образовании солей с оптически чистыми солеобразующими реагентами и разделением полученной таким образом смеси диастереоизомеров, например, фракционной кристаллизацией или хроматографией на колонках с оптически активными материалами.

Промежуточные и конечные продукты можно обрабатывать и/или очищать по стандартным методикам, например, методами хроматографии, распределения, (пере-/кристаллизации и т.п.

Циклические депсипептиды по настоящему изобретению ингибируют химотрипсин-подобные протеазы. Примеры химотрипсин-подобных протеаз включают эластазы и калликреин 7. Прежде всего циклические депсипептиды по настоящему изобретению являются эффективными ингибиторами калликреина 7.

Термин ингибитор обозначает циклический депсипептид, который ингибирует ферментативную реакцию, при этом мерой ингибирования является величина Ι0₅ο, составляющая менее 100 мкМ, например, 50 мкМ, 30 мкМ, 20 мкМ или 10 мкМ. Прежде всего предпочтительны циклические депсипептиды, характеризующиеся величиной Ιί.'₅₀ менее 30 мкМ для калликреина 7 человека, например, циклические депсипептиды, характеризующиеся величиной Κ’₅₀ менее 10 мкМ, 1 мкМ, 100 нМ, 50 нМ, 40 нМ, 40 нМ, 30 нМ, 20 нМ, 10 нМ или менее. Например, величина Ιί.'₅₀ для соединений, описанных в примерах 5, 19 и 33, составляет 0,009 мкМ, 0,007 мкМ, 0,005 мкМ, соответственно. Величину Ιί.'₅₀ для калликреина 7 человека можно определять с использованием субстрата с гашением флуоресценции Ас-Ши-А8р(ЕИАЫ§)Бу5-Рго-Пе-Беи-Р11еЛАг8-Б.еи-Шу-Бу5(ИАВСАБ)-Ши-НН2 (где ^л обозначает расщепляемую связь по данным МС) фирмы Вю8уп1ап (Берлин, Германия). Ферментативную реакцию проводили в 50 мМ натрийцитратном буферном растворе, рН 5,6, содержащем 150 мМ №1С1 и 0,05% (мас./об.) СНАР8. Величину ГС50 определяли при комнатной температуре в 384-луночном планшете. Конечный объем реакционной смеси для анализа во всех лунках составлял 30 мкл. Исследуемые соединения растворяли в 90% (об./об.) ДМСО/вода и разбавляли в воде (содержащей 0,05% (мас./об.) СНАР8) в 3 раза, при этом получали требуемые 11 конечных концентраций соединения: 0,3 нМ, 1 нМ, 3 нМ, 10 нМ, 30 нМ, 100 нМ, 300 нМ, 1 мкМ, 3 мкМ, 10 мкМ и 30 мкМ. Для анализа в каждую лунку добавляли 10 мкл смеси вода/СНАР8 (+ исследуемое соединение), затем 10 мкл раствора протеазы (разбавленный буферным раствором для анализа 1,5х). Концентрация протеазы в конечном растворе для анализа составляла 0,2 нМ (концентрацию фермента определяли методом Бредфорд). После инкубации при комнатной температуре в течение 1 ч реакцию инициировали при добавлении 10 мкл раствора субстрата (субстрат растворяли в буферном растворе для анализа 1,5х, конечная концентрация 2 мкМ). Действие соединения на ферментативную активность оценивали с использованием графиков зависимости ингибирования в % от концентрации ингибитора и по двум значениям, первое значение регистрировали непосредственно после добавления субстрата (1=0) и второе значение через 1 ч (1=60 мин). Величину ΚΑ₀ рассчитывали методом нелинейного регрессионного анализа с использованием программного обеспечения ^ΕΓΟ, версия. 4.0 ΙΌ Вн51пс55 8о1и1юп Ь1б., 6ш1бГотб, 8штеу, Великобритания).

Термины заболевания и нарушения, которые поддаются лечению или профилактике циклическими депсипептидами, включают заболевания, связанные с химотрипсин-подобными протеазами, более предпочтительно, заболевания, связанные с активностью эластазы или калликреина 7. Предпочтительны

- 18 017735 также заболевания, связанные с эластазой нейтрофилов человека. Заболевания и нарушения, которые поддаются лечению или профилактике циклическими депсипептидами по настоящему изобретению, включают боль, острое воспаление, хроническое воспаление, артрит, воспаленные суставы, бурсит, остеоартрит, ревматоидный артрит, юношеский ревматоидный артрит, септический артрит, фибромиалгию, системную красную волчанку, флебит, тендинит, высыпания, псориаз, угри, экзему, лицевую себорейную экзему, экзему рук, лица или шеи, инфекции крайней плоти, дерматомикоз стопы, свищевые инфекции, инфицированные топические язвы, пупочные инфекции у новорожденных, зуд, связанный с морщинами, шрамами, келоидными рубцами, фурункулами, бородавками и с аллергией, геморрой, раны, раневые инфекции, раны от ожогов, грибковые инфекции и иммунные нарушения, включая аутоиммунные заболевания. Предпочтительные заболевания, которые поддаются лечению или профилактике циклическими депсипептидами по настоящему изобретению, включают хроническое обструктивное заболевание легких (включая легочную эмфизему и хронический бронхит), хроническую и острую интерстициальную пневмонию, идиопатическую интерстициальную пневмонию (ИИП), диффузный глубокий бронхит, муковисцидоз легких, острое повреждение легких (ОПЛ)/острый респираторный дистресс-синдром (ОРДС), бронхоэктаз, астму, панкреатит, нефрит, гепатит (печеночная недостаточность), хронический ревматоидный артрит, артросклероз, остеоартрит, псориаз, парадонтоз, атеросклероз, отторжение трансплантата, повреждение тканей при ишемии/реперфузии, шок, сепсис, коагулопатию, включая рассеянную внутрисосудистую коагуляцию (РВК) и тромбоз глубоких вен, конъюктивит, кератит, язву роговицы, болезнь Крона, системную красную волчанку. Более предпочтительные заболевания, которые поддаются лечению или профилактике циклическими депсипептидами по настоящему изобретению, включают эпителиальную дисфункцию или эпителиальное заболевание, которое включает, не ограничиваясь только ими, воспалительные и/или гиперпролиферативные и зудящие кожные заболевания, такие как келоидные рубцы, гипертрофические шрамы, угри, атопический дерматит, псориаз, синдром Незертона или другие зудящие дерматозы, такие как узелковая почесуха, неспецифический зуд у людей пожилого возраста, а также другие заболевания, связанные с дисфункцией эпителиального барьера, такие как воспалительное заболевание кишечника и болезнь Крона, муковисцидоз, хроническое обструктивное заболевание легких (ХОЗЛ), легочный фиброз, респираторный дистресс синдром у взрослых, хронический бронхит, наследственная эмфизема, ревматоидный артрит, воспалительное заболевание кишечника, псориаз, астму. В другом предпочтительном варианте циклические депсипептиды по настоящему изобретению можно использовать для лечения рака, прежде всего рака яичников.

Заболевания и нарушения, которые поддаются лечению или профилактике циклическими депсипептидами по настоящему изобретению, включают воспалительные и/или гиперпролиферативные и зудящие кожные заболевания, такие как келоидные рубцы, гипертрофические шрамы, угри, атопический дерматит, псориаз, пустулезный псориаз, розовые угри, синдром Незертона или другие зудящие дерматозы, такие как узелковая почесуха, неспецифический зуд у людей пожилого возраста, а также другие заболевания, связанные с дисфункцией эпителиального барьера, такие как старческая кожа, воспалительное заболевание кишечника и болезнь Крона, а также панкреатит или рак, прежде всего рак яичников, муковисцидоз, хроническое обструктивное заболевание легких (ХОЗЛ), легочный фиброз, респираторный дистресс-синдром у взрослых, хронический бронхит, наследственная эмфизема, ревматоидный артрит, воспалительное заболевание кишечника, псориаз и астму.

Заболевания и нарушения, которые более предпочтительно поддаются лечению или профилактике циклическими депсипептидами по настоящему изобретению, включают келоидные рубцы, гипертрофические шрамы, угри, атопический дерматит, псориаз, пустулезный псориаз, розовые угри, синдром Незертона или другие зудящие дерматозы, такие как узелковая почесуха, неспецифический зуд у людей пожилого возраста, а также другие заболевания, связанные с дисфункцией эпителиального барьера, такие как старческая кожа, воспалительное заболевание кишечника и болезнь Крона, а также панкреатит или рак, прежде всего рак яичников.

Предпочтительные заболевания и нарушения, которые поддаются лечению или профилактике циклическими депсипептидами по настоящему изобретению, включают муковисцидоз, хроническое обструктивное заболевание легких (ХОЗЛ), легочный фиброз, респираторный дистресс-синдром у взрослых, хронический бронхит, наследственную эмфизему, ревматоидный артрит, воспалительное заболевание кишечника, псориаз и астму.

Заболевания и нарушения, которые даже более предпочтительно поддаются лечению или профилактике циклическими депсипептидами по настоящему изобретению, включают келоидные рубцы, гипертрофические шрамы, угри, атопический дерматит, псориаз, пустулезный псориаз, розовые угри, синдром Незертона или другие зудящие дерматозы, такие как узелковая почесуха, неспецифический зуд у людей пожилого возраста, а также другие заболевания, связанные с дисфункцией эпителиального барьера, такие как старческая кожа.

Калликреин 7 человека (К7ч) является ферментом, который проявляет активность сериновой протеазы и локализован в коже человека. Впервые он был описан как фермент химотрипсинового типа из рогового слоя (ХРС), который может играть роль в отшелушивании рогового слоя за счет расщепления белков рогового слоя (например, корнеодесмозин и плакоглобин). Роговой слой является внешним слоем

- 19 017735 эпидермиса, формирующим барьер, и состоит из ороговевших эпителиальных клеток, окруженных высокоорганизованными липидами. Он непрерывно образуется в результате эпидермальной дифференциации, а постоянная толщина рогового слоя в нормальном эпидермисе поддерживается за счет равновесия между пролиферацией кератиноцитов и отшелушиванием. Повышенная экспрессия ХРС при воспалительном заболевании кожи может иметь этиологическое значение (Напззоп и др. (2002)). Было установлено, что у трансгенных мышей с экспрессией калликреина 7 человека эпидермальными кератиноцитами развиваются патологические изменения кожи с повышенной толщиной эпидермиса, гиперкератозом, воспалением кожи и тяжелым пруритом. Была установлена генетическая взаимосвязь между вставкой из 4 п.о. (ААСС) в З'-иТК-фрагменте (З'-нетранслируемая область) гена химотрипсиноподобного фермента рогового слоя и атопическим дерматитом (Уа811орои1о8 и др. (2004)), что свидетельствует о важной роли фермента в развитии атопического дерматита. Атопическим дерматитом является заболевание, при котором наблюдается повреждение барьера кожи и которое поражает 15-20% детей.

Калликреин 7 является сериновой протеазой 81, относится к семейству генов калликреина и проявляет химотрипсиноподобную активность. Калликреин 7 человека (К7ч, КЬК7 или фермент химотрипсинового типа из рогового слоя (ХРС), 8уу18врго1 Р49862) играет важную роль в физиологии кожи (1, 2, 3). В основном он экспрессируется в коже и, как было установлено, играет важную роль в физиологии кожи. К7ч принимает участие в деградации межклеточных связующих структур ороговевшего плоского эпителия в процессе отшелушивания клеток кожи. Процесс отшелушивания строго регулируется и находится в неустойчивом равновесии с продуцированием бе поуо корнеоцитов, чтобы поддерживать постоянную толщину рогового слоя, который является внешним слоем кожи и который принимает основное участие в функционировании барьера кожи. В связи с этим было установлено, что К7ч расщепляет корнеодесмосомальные белки - корнеодесмозин и десмоколлин 1 (4, 5, 6). Деградация корнеодесмосом необходима для отшелушивания. Кроме того, недавно было установлено, что фермент К7ч расщепляет два деградирующих липиды фермента -β-глюкоцереброзидазу и кислую сфингомиелиназу (7). Оба деградирующих липиды фермента секретируются совместно с их субстратами - глюкозилцерамидами и сфингомиелином - и расщепляют эти полярные предшественники липидов с образованием более неполярных продуктов, например, церамидов, которые затем встраиваются во внеклеточную многослойную мембрану. Структура многослойной мембраны играет важную роль в функционировании клеточного барьера. И наконец было установлено, что К7ч активирует предшественник интерлейкина-Щ (ΠΠ-1β), при этом образуется его активная форма ίη νίΙΐΌ (8). Так как кератиноциты экспрессируют ИЛ-Щ, но не активную форму специфического ИЛ-1 [1 конвертирующего фермента (ИКФ или каспаза 1), можно предположить, что активация ИЛ-Щ в эпидермисе человека происходит под действием другой протеазы, предположительно фермента К7ч.

Недавно была установлена взаимосвязь повышенной активности К7ч с воспалительными заболеваниями кожи, такими как атопический дерматит, псориаз или синдром Незертона. Такая повышенная активность может привести к неконтролируемой деградации корнеодесмом, что в свою очередь может привести к разрегулированному отшелушиванию, повышенной деградации расщепляющих липиды ферментов и повреждению структуры многослойной мембраны или неконтролируемой активации провоспалительного цитокина ИЛ-11. В результате нарушается фукционирование клеточного барьера и развивается воспаление (см. также АО-А-2004/108139).

В связи с тем, что активность К7ч контролируется на нескольких уровнях, повышенную активность К7ч при воспалительных заболеваниях кожи могут вызывать различные факторы. Во-первых, на количество экспрессированной протеазы могут влиять генетические факторы. Например, в качестве такой генетической связи недавно был выявлен полиморфизм 3'-иТК(3'-нетранслируемая область) в гене К7ч (9). Авторы предполагают, что описанная вставка из 4 п.о. в 3'-иТК-фрагменте гена К7ч стабилизирует мРНК К7ч, что приводит к сверхэкспрессии К7ч. Во-вторых, так как К7ч секретируется из многослойных тел в межклеточное пространство рогового слоя в виде профермента и не способен самоактивироваться, то для его активации требуется другая протеаза, например, К5ч (5). Неконтролируемая активность такого активирующегося фермента может привести к сверхэкспрессии К7ч. В-третьих, активированный К7ч можно ингибировать природными ингибиторами, такими как ЬЕКИ, АЬР или элафин (10, 11). сниженный уровень экспрессии таких ингибиторов или их отсутствие может привести в повышенной активности К7ч. Недавно было установлено, что мутации в гене зр1пк5, кодирующем ЬЕКИ, являются причиной развития синдрома Незертона (12), а одноточечная мутация в гене связана с атопическим дерматитом (13, 14). И наконец, другим уровнем контроля активности К7ч является рН. рН-Оптимум К7ч находится в интервале от нейтрального до слабо щелочного рН (2), а градиент рН по направлению от внутреннего до внешнего слоев кожи составляет от нейтрального до кислого рН. Факторы окружающей среды, такие как мыло, могут привести к повышению рН во внешних слоях рогового слоя до рН-оптимума К7ч, и тем самым повысить активность К7ч.

Повышенная активность К7ч связана с заболеваниями кожи, вызванными повреждением барьера кожи, включающими воспалительные и гиперпролиферативные заболевания кожи. Во-первых, у пациентов с синдромом Незертона наблюдается зависимое от фенотипа увеличение активности сериновых про

- 20 017735 теаз, снижение количества корнеодесмосом, снижение уровня расщепляющих липиды ферментов - βглюкоцереброзидазы и кислой сфингомиелиназы, и нарушенная функция барьера кожи (15, 16). Вовторых, у трансгенных мышей со сверхэкспрессией К7ч наблюдается фенотип кожи, аналогичный фенотипу пациентов с атопическим дерматитом (17, 18, 19). В-третьих, установлено, что у пациентов с атопическим дерматитом кожи и псориазом наблюдаются повышенные уровни К7ч (17, 20). Более того, повышенная активность К7 и связанная с этим дисфункция эпителиального барьера могут играть важную роль в патологии других эпителиальных заболеваний, таких как воспалительное заболевание кишечника и болезнь Крона.

Следовательно, К7ч можно рассматривать как потенциальную мишень для лечения заболеваний, связанных с эпителиальной дисфункцией, таких как воспалительные и/или гиперпролиферативные заболевания, и зудящих заболеваний кожи, таких как келоидные рубцы, гипертрофические рубцы, угри, атопический дерматит, псориаз, пустулезный псориаз, розовые угри, синдром Незертона, или других зудящих дерматозов, таких как узелковая почесуха, неспецифический зуд у людей пожилого возраста, а также другие заболевания, связанные с дисфункцией эпителиального барьера, такие как воспалительное заболевание кишечника и болезнь Крона, а также панктеатит или рак, прежде всего рак яичников, и таким образом существует необходимость в разработке специфических модуляторов (агонистов или ингибиторов) К7ч.

Эластаза нейтрофилов человека (НЭч, известная также под названием эластаза лейкоцитов, ЛЭч) относится к семейству сериновых протеаз типа химотрипсина. рН-Оптимум ее каталитической активности составляет приблизительно 7, а каталитический участок включает три образующих водородные связи аминокислотных остатка: Н1§57, А§р102 и 8ег195 (нумерация соответствует последовательности химотрипсина), которые образуют так называемую каталитическую триаду. Фермент состоит из одной полипептидной цепи, включающей 218 аминокислотных остатка и четыре дисульфидных связи. Гомология последовательности с другими эластинолитическими или неэластинолитическими сериновыми протеиназами составляет от 30 до 40%. НЭч предпочтительно расщепляет окисленную цепь В инсулина, содержащую остаток валина в положении Р1, но также расщепляет связи, содержащие остатки аланина, серина или цистеина в положении Р1.

НЭч локализована в азурофильных гранулах полиморфноядерных лейкоцитов (ПМЯЛ), которые характеризуются достаточной высокой концентрацией НЭч (3 мкг фермента/10 клеток). Основная физиологическая функция фермента заключается в расщеплении бактерий и иммунных комплексов, он также принимает участие в защитном механизме организма-хозяина. НЭч способствует также миграции нейтрофилов из крови в различные ткани, такие как дыхательные пути, в ответ на факторы хемотаксиса. НЭч принимает также участие в ранозаживлении, регенерации ткани и апоптозе ПМЯЛ.

Наряду с эластином (высоко эластичный и высоко гидрофобный компонент соединительной ткани легких, артерий, кожи и связок), НЭч расщепляет множество белков, проявляющих важную биологическую функцию, включая коллагены различного типа, мембранные белки и протеогликаны хрящевых тканей. НЭч косвенно способствует деградации белков внеклеточного матрикса за счет активации проколлагеназы, простромелизина и прожелатиназы. НЭч инактивирует также ряд эндогенных ингибиторов протеиназ, таких как а2-антиплазмин, а1-антихимотрипсин, антитромбин и тканевой ингибитор металлопротеиназ.

В легочной системе активность внеклеточной эластазы строго контролируется ингибитором а1протеаз (α1β1), ответственным за защиту нижних дыхательных путей от эластолитической деградации, в то время как секреторный ингибитор протеиназы лейкоцитов в основном защищает верхние дыхательные пути. В ряде патофизиологических состояний легких, например, при эмфиземе легких, хроническом бронхите и муковисцидозе, эндогенные ингибиторы эластаз неэффективны в регуляции активности НЭч.

Следовательно, НЭч можно рассматривать как потенциальную мишень для лечения заболеваний, связанных с активностью НЭч, таких как воспалительные заболевания, такие как энфизема легких, респираторный дистресс-синдром взрослых (РДСВ), хронический бронхит, хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ), легочная гипертензия, и другие воспалительные заболевания, а также легочная дисплазия у недоношенных новорожденных, и заболевания, связанные с повышенной и аномальной секрецией дыхательных путей, а также острые воспалительные заболевания. Таким образом существует не

- 21 017735 обходимость в разработке специфических модуляторов (агонистов или ингибиторов) НЭч.

В одном объекте депсипептиды по настоящему изобретению получают при культивировании штамма Сйопбготусек сгоса!ик, депонированного в коллекции Ό8Μ 24 апреля 2007 г. под номером Ό8Μ 19329, или штамма Сйопбготусек гоЬик!ик депонированного в коллекции Ό8Μ 24 апреля 2007 г. под номером Ό8Μ 19330, или штамма Сйопбготусек ар1си1а!ик, депонированного в коллекции Ό8Μ 23 июня 2007 г. под номером Ό8Μ 21595.

Депонирование штаммов проводили согласно инструкциям Будапештского международного соглашения по индентификации и депонированию микроорганизмов для оформления патентов. Депонированные штаммы безоговорочно и без ограничения доступны для использования после публикации патента. Депонированные штаммы представлены только для ознакомления специалистов в данной области техники и депонирование не требуется для применения указанных штаммов на практике.

Следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается культивированием конкретных штаммов Сйопбготусек сгоса!ик, Сйопбготусек гоЬик!ик и Сйопбготусек ар1си1а!ик. Напротив, в настоящее изобретение включено культивирование других организмов, способных продуцировать депсипептиды, таких как мутантные формы или варианты штаммов, которые можно получить из организма по известным методикам, таким как облучение рентгеновскими лучами, в УФ-свете, обработка химическими мутагенами, действие фагов, селекция с использованием антибиотиков и т.п.

Депсипептиды по настоящему изобретению можно получить в результате биосинтеза различных микроорганизмов, которые могут синтезировать соединения по настоящему изобретению и которые включают, но не ограничиваясь только ими, бактерии порядка Μуxососса1ек, так называемые миксобактерии. Примеры членов, принадлежащих к роду миксобактерий, включают, но не ограничиваясь только ими, Сйопбготусек, 8огаидшт, Ро1уаидшт, Вуккорйада, Нар1оаидшт, 1айи1а, Маииосукйк, КоГПепа. Μуxососсик, Сога11ососсик, Сук!оЬас!ег, Агсйапдшт, 8бдта!е11а, Нуа1апдшт, Μе1^ΐΐаηд^ит, Рухкоссик. Таксономия миксобактерий является сложной системой и описана в книге Саггйу Ο.Μ., Ве11 Ι.Υ., Ы1Ьигп Т.6., Тахопотк оиШпе оГ 1Пе ргокагуокк, Вегдеу'к тапиа1 оГ кукктайс Ьаскгю1о§у, 2-е изд., вып.5.0 (май 2004), Бйр://141.150.157.80/ЬегдеукоиШпе/тат.Ыт).

Соединения формул Д^УИ) получают в ходе аэробной ферментации в пригодной среде в контролируемых условиях при высеивании культур Сйопбготусек сгосакк, Сйопбготусек гоЬиккк и Сйопбготусек ар1си1а!ик. Пригодной средой является предпочтительно водная среда, содержащая источники ассимилируемых углерода, азота и неорганических солей.

Пригодные среды включают, но не ограничиваясь только ими, питательные среды, описанные ниже в примерах 1 и 2. Ферментацию проводили в течение от приблизительно 3 до приблизительно 20 сут при температуре от приблизительно 10°С до приблизительно 40°С, однако оптимальные результаты можно получить предпочтительно в ходе ферментации при приблизительно 30°С. Величина рН питательной среды в ходе ферментации составляет от приблизительно 6,0 до приблизительно 9,0.

Культуральную среду, засеянную продуцирующими депсипептиды микроорганизмами, можно инкубировать в аэробных условиях, с использованием, например, ротационной качалки или ферментера с мешалкой. Аэрацию можно осуществлять при продувке засеянной культуральной жидкости воздухом, кислородом или соответствующей газообразной смесью в ходе инкубации. Как только образуется достаточное количество депсипептидов, их можно концентрировать и выделять стандартными методами, например, с использованием экстракции, хроматографии, осаждения или кристаллизации, и/или по описанным в данном контексте методикам. Например, при экстракции культуральную жидкость смешивают с пригодным органическим растворителем, таким как н-бутанол, этилацетат, циклогексан, н-гексан, толуол, н-бутилацетат или 4-метил-2-пентанон, с последующим перемешиванием, при этом получают депсипептиды в органическом растворителе, который удаляют при пониженном давлении. Полученный остаток можно необязательно растворить, например, в воде, этаноле, метаноле или их смеси, и повторно экстрагировать пригодным органическим растворителем, таким как гексан, четыреххлористый углерод, дихлорметан или их смесь. После удаления растворителя соединения можно дополнительно очищать с использованием хроматографических методов. Пример носителей для хроматографии включает стационарные фазы, такие как силикагель или оксид алюминия, а в качестве элюента можно использовать органические растворители или их смеси, включая простые эфиры, кетоны, сложные эфиры, галогенированные углеводороды или спирты, или с использованием обращено-фазовой хроматографии на модифицированном силикагеле, содержащем различные функциональные группы, а в качестве элюента можно использовать органические растворители или их водные смеси, такие как ацетонитрил, метанол или тетрагидрофуран при различном рН. Другой пример включает распределительную хроматографию, например, в режиме твердое вещество-жидкость или жидкость-жидкость. Можно также использовать гельфильтрафию, например, на сефадексе ЬН-20 (81дта-А1бгкй), а в качестве элюента использовать различные растворители, предпочтительно спирты.

Как известно в данной области техники, процессы продуцирования, а также выделения и очистки

- 22 017735 можно контролировать рядом аналитических методов, включая биоанализ, ТСХ, ЖХВР или их комбинацию, с использованием различных методов детекции, в случае ТСХ обычно используют облучение в УФсвете, проявление парами иода или распыление окрашивающими реагентами, в случае ЖХВР обычно используют УФ-свет, методы МС или светорассеяния. Например, в случае ЖХВР используют обращенофазовую колонку с модифицированным силикагелем, а в качестве элюента - линейный градиент полярного смешивающегося с водой растворителя в воде при определенном значении рН с использованием УФ-детектора при различных длинах волн, а также МС-детектора.

Полученные в ходе биосинтеза микроорганизмов депсипептиды необязательно можно модифици ровать статистическим или направленным методом, при этом получают производные или структурные аналоги указанных соединений Такие производные или структурные аналоги обладают аналогичной функциональной активностью и включены в объем настоящего изобретения. Депсипептиды можно необязательно модифицировать по известным методикам или как описано в данном контексте.

Например, производные депсипептидов по настоящему изобретению можно получить при модификации циклических депсипептидов формулы

указанная модификация включает

а) получение соединения, где А₄ обозначает

Мо

органической или неорганической кислотой, например, трифторуксусной кислотой, серной кислотой, хлористо-водородной кислотой или кислотой Льюиса, например, эфиратом нитрофторида бора, в растворителе, например, в дихлорметане, ТГФ или в отсутствие растворителя, при температуре от -78°С до 150°С, предпочтительно от -30°С до КТ,

б) получение соединения, где А₄ обозначает к О ^Н2^М -'У

ΝΗ молекулярным водородом или его источником, например, циклогексеном, формиатом аммония, в присутствии катализатора, например, палладия, в растворителе, например, 2-пропаноле при температуре от -50 до 100°С, предпочтительно при КТ,

в) получение соединения, где А₄ обозначает

ΝΗ

органической или неорганической кислотой, например, серной кислотой, хлористо-водородной кислотой или кислотой Льюиса, например, эфиратом трифторида бора, в присутствии восстанавливающего агента, например, триэтилсилана, в присутствии растворителя, например, дихлорметана, ТГФ или в отсутствие растворителя, при температуре от -78 до 150°С, предпочтительно от -50°С до КТ,

г) получение соединения, где А4 обозначает

- 23 017735 при обработке соединения, где А₄ обозначает

замещенным или незамещенным спиртом и органической или неорганической кислотой, например, трифторуксусной кислотой, серной кислотой, хлористоводородной кислотой или кислотой Льюиса, например, солями металла в растворителе, например, в замещенном или незамещенном спирте, ТГФ, дихлорметане, предпочтительно в замещенном или незамещенном спирте или в отсутствие растворителя при температуре от -78 до 150°С, предпочтительно от -30 до 50°С,

д) получение соединений, где Ах обозначает

где η равно 1, 2 и А₄ обозначает

где К предпочтительно обозначает Н, алкил, замещенный алкил, при обработке соединения, где А_хобозначает Οίη или Азп и А₄ обозначает

где К предпочтительно обозначает Н, алкил, замещенный алкил, замещенным или незамещенным спиртом и органической или неорганической кислотой, например, трифторуксусной кислотой, серной кислотой, хлористо-водородной кислотой или кислотой Льюиса, например, эфиратом трифторида бора в растворителе, например, в замещенном или незамещенном спирте, ТГФ, дихлорметане, предпочтительно в замещенном или незамещенном спирте или в отсутствие растворителя при температуре от -78°С до 150°С, предпочтительно от -30°С до КТ,

е) получение соединений, где Ах обозначает

где η равно 1, 2 и А₄ обозначает

где К предпочтительно обозначает Н, ОН, О-алкил, замещенный О-алкил, О-ацил, при обработке соединения, где А_х обозначает Οίη или Азп и А₄ обозначает

дегидратирующим агентом, например, ангидридом трифторуксусной кислоты в присутствии основания, например, диизопропилэтиламина (Э1РЕА), в растворителе, например, дихлорметане или в отсут- 24 017735 ствие растворителя при температуре от -78°С до 150°С, предпочтительно от -30°С до КТ, ж) получение соединений, где А₄ обозначает

и А₆ обозначает где К предпочтительно обозначает алкил, замещенный алкил, ацил, алкоксикарбонил, при обработке соединения, где А₄ обозначает

и А₆ обозначает Туг, алкилирующим агентом, например, метилиодидом, бензилбромидом, пропаргилбромидом, или ацилирующим агентом, например, этилхлорформиатом или алкил- или арилизоцианатом, в присутствии основания, например, карбоната натрия, в растворителе, например, ДМФА, или в отсутствие растворителя при температуре от -78 до 150°С, предпочтительно от -30°С до КТ, предпочтительно при обработке ультразвуком.

Если не указано иное, следует понимать, что все перечисленные в настоящем описании и формуле изобретения числа, относящиеся к количеству ингредиентов, свойствам, таким как молекулярная масса, условия реакции, величины Κ₅₀ и т.п., во всех случаях можно изменять в соответствии с термином приблизительно. В связи с этим, если не указано прямо противоположное, числовые параметры, указанные в настоящем описании и прилагаемой формуле изобретения, являются приблизительными. По крайней мере и не ограничивая предел применения принципов эквивалентов к объему формулы изобретения, каждый числовой параметр представлен в виде значащей цифры с учетом обычных методов округления. Несмотря на то, что числовые диапазоны и параметры, представляющие широкий объем изобретения, являются приблизительными, числовые значения, указанные в примерах, таблицах и фигурах, представлены по возможности в виде более точных значений. Представляется очевидным, что любые числовые значения включают определенные ошибки, которые наблюдаются в результате изменений условий экспериментов, испытаний соединений, статистического анализа и т. п.

Если не указано иное, все технические и научные термины, использованные в настоящем контексте, имеют стандартные значения, известные в данной области техники, к которой принадлежит настоящее изобретение. Хотя на практике или при испытаниях соединений по настоящему изобретению можно ис пользовать аналогичные или эквивалентные методы и материалы, пригодные методы и материалы описаны ниже. Все публикации, заявки и патенты или другие ссылки, перечисленные в данном контексте, включены в данное описание в качестве ссылок. В случае конфликта, основанием является настоящее описание, включая определения терминов. Кроме того, материалы, методы и примеры представлены только для иллюстрации изобретения и не ограничивают его объем.

Примеры

Пример 1. Получение соединений.

Пример 1.1. Получение соединений формул (Π)-(νΠ), (ΧΓ^ζΧΣν) и (XVII).

Штамм.

Штамм был однозначно отнесен к виду Сйоийготусе®, основываясь на морфологических признаках плодовых тел, а также на части последовательности гена 168-РНК. С.сгоса1и8 относят к первой группе биологического риска по классификации Ό8ΜΖ (Ό8ΜΖ (2007)). Род Сйоийготусе8 относится к семейству Ро1уаи§1асеае, принадлежащему к порядку Мухососса1е8 класса дельта-протеабактерии. Бактерии порядка Мухососса1е8, также называемые миксобактериями, являются грамотрицательными бактериями палочковидной формы и обладают двумя выраженными отличиями от большинства других бактерий. Они закрепляются и начинают расти на твердых поверхностях, используя механизм активного перемещения и агрегирования для формирования плодовых тел при наступлении голодания (Ка18ег (2003)).

Штамм Сйоийготусе8 сгоса!и8 по настоящему изобретению был депонирован в коллекции Ό8ΜΖ под номером 19329.

Штамм Сйоийготусе8 сгоса!и8 относится к нежизнеспособной культуре и его нельзя культивировать в виде чистой культуры без сопутствующего штамма. Сопутствующий штамм можно получить и поддерживать в виде чистой культуры при высеивании штрихом полоски совместной культуры, исполь

- 25 017735 зуя в качестве посевного погруженную культуру с агаровой средой (среда ЬВ). Аналогичные результаты получены учеными из г. Рейгенбах (1асоЫ и др. (1996), 1асоЫ и др. (1997)). На основании частичной последовательности ДНК гена 168-рРНК сопутствующего штамма по настоящему изобретению для штамма Сйопйготусек сгоса!ик, Вокеа 1ЫоохИалк из подкласса КЫхоЫаКк наибольшая степень гомологии наблюдается с последовательностью ДНК в составе альфа-протеобактерий. Гомология фрагмента 168рРНК, содержащего 424 п.о., составляет приблизительно 98% по сравнению с последовательностью штамма АЕ508112 (В.1ЫоохИапк) из генофонда. В. НИоохИалк выделяли из твердых образцов, которые собирали на различных сельскохозяйственных полях в округе Калькутты, Индия. Этот штамм окисляет восстановленные неорганические серосодержащие соединения в присутствии некоторых органических субстратов и был описан в качестве нового вида и нового рода 1996 году (Пак и др. (1996)). Филогенетическое древо, построенное исходя из последовательности 168-РНК всех пяти описанных видов рода Вокеа, показывает, что сопутствующий штамм Вокеа, выделенного из С.сгоса1ик, занимает особое положение.

Культивирование.

Культивирование штамма проводили в ферментере объемом 100 л по следующей методике. Сначала 5 мл (10%) жидкой культуры штамма Сйопйготусек сгоса!ик высеивали в 50 мл среды ΜΌ1 (состав описан в статье Войе и др. (200з), табл. 6) в качалочных колбах с отбойниками объемом 200 мл. После инкубации в течение 11 сут при з0°С на ротационной качалке при 120 об/мин первую промежуточную культуру высевали по 10 мл (10%) в среде МЭ1 (5x100 мл) в пяти качалочных колбах с отбойниками объемом 500 мл. После инкубации в течение 7 сут при з0°С на ротационной качалке при 120 об/мин вторую промежуточную культуру высевали по 25 мл (5%) в среде МЭ1 (19x500 мл) в качалочных колбах с отбойниками объемом 2 л. После инкубации в течение 6 сут при з0°С на ротационной качалке при 150 об/мин вторую промежуточную культуру (9,5 л, 9,5%) использовали для высеивания в среду РОЬ1 (100 л) (состав описан в статье Кипхе и др. (1995), табл. 7).

Полученную основную культуру (100 л) загружали в стандартный стальной ферментер объемом 100 л. Температуру поддерживали при з0°С, аэрацию проводили со скоростью 20 л/мин (0,2 об.воздуха/ об.культуры/мин) и перемешивали при 50 об/мин. В ферментере поддерживали избыточное давление 0,5 бар. Величину рН в культуре поддерживали в диапазоне 6,9-7,1 при добавлении зн. Н₂8О₄ или зн. №ЮН. После достижения лаг-фазы через приблизительно 1 сут потребление кислорода увеличивалось через приблизительно 4 сут, что указывало на экспоненциальный рост культуры. В течение последних 2 сут потребление кислорода в некоторой степени снижалось, что указывало на стационарную фазу культуры. Через 7 сут титр циклического депсипептида формулы II составлял 5,з мг/л, полученную культуральную жидкость собирали.

Экстракция.

Всю культуральную жидкость переносили в стальной сосуд объемом 1600 л и декантировали в течение 1 ч. Влажный клеточный осадок (200 г) собирали со дна сосуда фильтрованием через бумажный фильтр. Клеточный осадок экстрагировали з раза в течение з0 мин по 10 л этилацетата. Затем остаточную воду отделяли от фазы растворителя. Фазу растворителя промывали водой (5 л) и упаривали, при этом получали сухой экстракт, так называемый клеточный экстракт. Фильтрат культуральной жидкости экстрагировали этилацетатом (200 л). Смесь выдерживали в течение 2 ч, органическую фазу отделяли, промывали водой (20 л) и упаривали, при этом получали сухой экстракт, так называемый экстракт из культурального фильтрата.

Выделение соединения.

Экстракт из культурального фильтрата (4,4 г) растворяли в метаноле (80 мл). Нерастворимые ингредиенты удаляли при центрифугировании и супернатант упаривали досуха, при этом получали сухой экстракт (з,з г). Экстракт растворяли в МеОН (7,5 мл), ДМСО (з мл) и дихлорметане (0,5 мл) и очищали обращенно-фазовой хроматографией (\Уа1егк ЗипПге КР18, 10 мкл, з0х150 мм), элюент: 0,01% муравьиная кислота (растворитель А1 и ацетонитрил, содержащий 0,1% муравьиной кислоты (растворитель В), скорость потока 50 мл/мин. Градиент описан в табл.1. При очистке проводили 7 циклов хроматографии. Собранные фракции после каждого цикла анализировали методом ЖХВР, фракции, содержащие циклический депсипептид по настоящему изобретению, объединяли и упаривали в вакууме досуха, при этом получали 1з4 мг циклического депсипептида формулы II, чистота >97% и 80 мг, чистота 90%.

- 26 017735

Таблица 1. Градиент ЖХВР, очистка циклического депсипептида формулы II.

Время(мин)	Растворитель А (%)	Растворитель В (%)
0,0	90	10
1,0	90	10
23,0	50	50
23,1	0	100
27,0	0	100
27,1	90	10
30,0	90	10

Таблица 2. Градиент, нормально-фазовое разделение.

Время (мин)	Циклогексан (%)	Этилацетат (%)	Метанол (%)
0	75	25	0
10	75	25	0
33	25	75	0
56	20	70	10
79	0	50	50
93	0	50	50

Клеточный экстракт (6,67 г) растворяли в дихлорметане/метаноле, 4:1. Раствор фильтровали и фильтрат пропускали через диатомовую землю (2 г диатомовой земли/1 г экстракта, 1зо1и1е®, 11'ИстаΙίοηαί 8огЬеШ ТссНпо1о§у ЬЙ., Негщоей М1й С1ат. Великобритания), затем упаривали. Твердый остаток наносили на колонку с силикагелем (4x18 см, 90 г силикагеля 40-63) и проводили элюцию в градиенте циклогексана, этилацетата и метанола. Градиент описан в табл.2, скорость потока 28 мл/мин. Собирали фракции объемом по 28 мл. Фракции объединяли согласно пикам поглощения в УФ, получали 12 фракций (А-Ь). Фракции, содержащие депсипептиды (Н-Ι) по настоящему изобретению, затем очищали обращенно-фазовой хроматографией. Хроматографию и обработку фракций проводили аналогично тому, как описано для экстракта культурального фильтрата, при этом получали циклический депсипептид формулы II (46,1 мг), циклический депсипептид формулы III (17,9 мг) и смесь депсипептидов формулы (VI) и (VII) (6,1 мг, 1:1). Структуру соединений (VI) и (VII) подтверждали по данным МС с высоким разрешением и при сравнении спектров Н-ЯМР смеси соединений (VI) и (VII) со спектрами Н-ЯМР соединения (II).

Было установлено, что другие циклические депсипептиды формулы II содержатся в клеточном экстракте в более низких концентрациях. Из смеси этих других циклических депсипептидов выделяли соединения формул (IV), (V) и (XI)-(XV) и (XVII).

Характеристика соединени.

Физические данные соединения формулы II.

ИК (таблетка КВг): 3337, 3297, 3062, 2966, 2936, 2877, 1736, 1659, 1533, 1519, 1464, 1445, 1410, 1385, 1368, 1249, 1232, 1205, 989, 832 см^-1.

МС (ЕТ, 9.4 Т АРЕХ-Ш): найд. 951,5165, рассч. для С₄₆Н72Ы₈О₁₂+Ыа: 951,5162.

Ή ЯМР (600 МГц, й₆-ДМСО) 5_Н: -0,10 (3Н, й, I 7,0 Гц), 0,65 (4Н, т), 0,78 (3Н, й, I 7,0 ГЦ), 0,82 (3Н, ΐ, I 7,2 Гц), 0,85 (3Н, й, I 7,0 Гц), 0,89 (3Н, й, I 7,0 Гц), 1,02 (1Н, т), 1,03 (6Н, 2хй, I 7,0 Гц), 1,10 (1Н, т), 1,21 (3Н, ά, I 7,0 Гц), 1,25 (1Н, т), 1,40 (1Н, т), 1,52 (1Н, т), 1,76 (6Н, т), 1,84 (1Н, т), 1,93 (1Н, т), 2,15 (2Н, т), 2,48 (1Н, т), 2,59 (1Н, т), 2,69 (1Н, т), 2,72 (3Н, з), 3,17 (1Н, т), 4,32 (2Н, т), 4,44 (2Н, т), 4,64 (1Н, й, I 9,5 Гц), 4,71 (1Н, т), 4,94 (1Н, з), 5,06 (1Н, т), 5,49 (1Н, т), 6,08 (1Н, й, I 2,2 Гц), 6,65 (2Н, й, I 8,4), 6,74 (1Н, з), 7,00 (2Н, й, I 8,4 Гц), 7,27 (1Н, з), 7,36 (1Н, й, I 9,5 Гц), 7,66 (1Н, й, I 10,2 Гц), 7,74 (1Н, й, I 8,8 Гц), 8,02 (1Н, й, I 8,1 Гц), 8,43 (1Н, й, I 8,1 Гц), 9,19 (1Н, з).

¹³С-ЯМР (150 МГц, й₆-ДМСО) 5_С: 10,35 СН₃, 11,22 СН₃, 13,79 СН₃, 16,00 СН₃, 17,63 СН₃, 19,49 2хСН₃, 20,83 СН₃, 21,72 СН₂, 23,30 СН₃, 23,70 СН₂, 24,16 СН, 24,41 СН₂, 27,35 СН₂, 29,74 СН₂, 30,07 СН₃, 31,44 СН₂, 33,13 СН, 33,19 СН₂, 33,68 СН, 37,39 СН, 39,05 СН₂, 48,75 СН, 50,59 СН, 52,01 СН, 54,11 СН, 54,65 СН, 55,24 СН, 60,60 СН, 71,86 СН, 73,89 СН, 115,28 2хСН, 127,31 С(]. 130,35 2хСН, 156,25 С(]. 169,09 С(]. 169,25 С(]. 169,34 С(]. 169,74 С(]. 170,60 С(]. 172,41 С(]. 172,52 С(]. 173,78 С(]. 176,32 С(].

Физические данные соединения формулы III.

МС (ЕТ, 9.4 Т АРЕХ-Ш): найд.: 965,5318, рассч. для С₄₇Н₇₄Ы₈О1₂+Ыа: 965,5318.

Ή-ЯМР (600 МГц, й₆-ДМСО) 5_Н: -0,10 (3Н, й, I 7,0 Гц), 0,64 (4Н, т), 0,78 (3Н,й, I 7,0 Гц), 0,82 (3Н, ΐ, I 7,0 Гц), 0,83 (3Н, ΐ, I 7,3 Гц), 0,85 (3Н, й, I 7,0 Гц), 0,89 (3Н, й, I 7,0 Гц), 1,01 (3Н, й, I 7,1 Гц), 1,04 (1Н, т), 1,10 (1Н, т), 1,21 (3Н, й, I 7,0 Гц), 1,25 (1Н, т), 1,32 (1Н, т), 1,40 (1Н, т), 1,53 (2Н, т), 1,77 (6Н, т), 1,84 (1Н, т), 1,92 (1Н, т), 2,12 (1Н, т), 2,16 (1Н, т), 2,28 (1Н, т), 2,59 (1Н, т), 2,68 (1Н, т), 2,72 (3Н, з),

- 27 017735

3,17 (1Н, т), 4,32 (1Н, т), 4,38 (1Н, т), 4,43 (1Н, й, 1 10,2 Гц), 4,46 (1Н, т), 4,63 (1Н, й, 1 9,5 Гц), 4,71 (1Н, т), 4,94 (1Н, т), 5,06 (1Н, т), 5,49 (1Н, т), 6,11 (1Н, ушир.8), 6,65 (2Н, й, 1 8,8 Гц), 6,73 (1Н, 8), 7,00 (2Н, й, 1 8,8 Гц), 7,27 (1Н, 8), 7,37 (1Н, й, 1 9,5 Гц), 7,66 (1Н, й, 1 10,2 Гц), 7,75 (1Н, й, 1 9,7 Гц), 8,07 (1Н, й, 1 8,1 Гц), 8,45 (1Н, й, 1 8,8 Гц), 9,24 (1Н, ушир.)

Физические данные соединения формулы IV.

МС (ЕТ, 9.4 Т ΑΡΕΧ-ΙΙΙ): найд.: 947,5196, рассч. для С₄₇Н₇₂Х₈Оц+Ха: 947,5213.

Ή ЯМР (600 МГц, й₆-ДМСО) 5_Н: 0,08 (3Н, й, I 7,0 Гц), 0,68 (3Н, ί, I 7,2 Гц), 0,71 (3Н, й, I 7,0 Гц), 0,78 (3Н, й, I 7,0 Гц), 0,83 (3Н, ί, I 7,3 Гц), 0,84 (1Н, т), 0,87 (3Н, ί, I 7,2 Гц), 0,88 (3Н, й, I 7,0 Гц), 0,99 (3Н, й, I 7,1 Гц), 1,08 (1Н, т), 1,17 (3Н, й, I 6,7 Гц), 1,18 (1Н, т), 1,31 (2Н, т), 1,43 (1Н, т), 1,51 (1Н, т), 1,54 (1Н, т), 1,76 (2Н, т), 1,90 (1Н, т), 1,94 (1Н, т), 2,01 (1Н, т), 2,10 (1Н, т), 2,16 (1Н, т), 2,26 (1Н, т), 2,46 (2Н, т), 2,73 (1Н, т), 2,74 (3Н, 8), 3,19 (1Н, т), 4,34 (1Н, т), 4,36 (1Н, т), 4,51 (1Н, т), 4,55 (1Н, т),

4.66 (1Н, й, I 10,0 Гц), 4,79 (1Н, й, I 11,0 Гц), 5,19 (1Н, т), 5,28 (1Н, т), 5,44 (1Н, т), 6,25 (1Н, й, I 7,3 Гц), 6,33 (1Н, й, I 8,8 Гц), 6,68 (2Н, й, I 8,8 Гц), 6,75 (1Н, 8), 7,04 (2Н, й, I 8,8 Гц), 7,28 (1Н, 8), 7,32 (1Н, й, I 8,8 Гц), 7,91 (1Н, й, I 9,5 Гц), 8,05 (1Н, й, I 8,1 Гц), 8,57 (1Н, й, I 8,9 Гц), 9,38 (1Н, ушир.)

Физические данные соединения формулы V.

МС (ЕТ, 9.4 Т ΑΡΕΧ-ΙΙΙ): найд.: 933,5053, рассч. для С₄6Н₇₀Х₈О₁₁+Ыа: 953,5056

Ή ЯМР (600 МГц, й₆-ДМСО) 5_Н: 0,08 (3Н, й, I 7,0 Гц), 0,68 (3Н, ί, I 7,2 Гц), 0,71 (3Н, й, I 7,0 Гц), 0,79 (3Н, й, I 7,0 Гц), 0,83 (1Н, т), 0,88 (3Н, ί, I 7,2 Гц), 0,89 (3Н, й, I 7,0 Гц), 1,01 (3Н, й, I 7,0 Гц), 1,03 (3Н, й, I 7,0 Гц) 1,08 (1Н, т), 1,17 (3Н, й, I 6,7 Гц), 1,20 (1Н, т), 1,31 (1Н, т), 1,42 (1Н, т), 1,54 (1Н, т), 1,74 (2Н, т), 1,91 (2Н, т), 2,02 (1Н, т), 2,10 (1Н, т), 2,15 (1Н, т), 2,46 (3Н, т), 2,75 (3Н, 8), 2,76 (1Н, т), 3,19 (1Н, т), 4,32 (1Н, т), 4,34 (1Н, т), 4,51 (1Н, т), 4,55 (1Н, т), 4,66 (1Н, й, I 9,5 Гц), 4,79 (1Н, й, I 11,0 Гц), 5,19 (1Н, т), 5,28 (1Н, т), 5,43 (1Н, т), 6,25 (1Н, й, I 7,0 Гц), 6,33 (1Н, й, I 8,5 Гц), 6,68 (2Н, й, I 8,8 Гц), 6,75 (1Н, 8), 7,04 (2Н, й, I 8,8 Гц), 7,28 (1Н, 8), 7,31 (1Н, й, I 8,8 Гц), 7,90 (1Н, й, I 9,5 Гц), 7,99 (1Н, й, I 8,1 Гц), 8,52 (1Н, й, I 8,8 Гц), 9,30 (1Н, ушир.)

Физические данные соединения формулы ΧΙ.

МС (Ε8Ι): положит.иониз.: т/ζ 951,5 (Μ+Ыа), отриц.иониз.: т/ζ 927,5 (М-Н), ММ моноизотопа

928.5, СА.Н ХВО';

Ή ЯМР (600 МГц, й₆-ДМСО) 5_Н: -0,11 (3Н, й, I 6,6 Гц), 0,64 (4Н, т), 0,77 (3Н,й, I 6,6 Гц), 0,83 (3Н, т), 0,85 (3Н, т), 0,87 (3Н, т), 0,89 (3Н, т), 1,01 (3Н, т), 1,10 (1Н, т), 1,21 (3Н, й, I 5,9 Гц), 1,32 (1Н, т),

1,40 (1Н, т), 1,52 (2Н, т), 1,75 (5Н, т), 1,84 (1Н, т), 1,91 (1Н, т), 2,05 (1Н, т), 2,15 (2Н, т), 2,27 (1Н,т),

2,59 (1Н, т), 2,68 (1Н, т), 2,73 (3Н, 8), 3,16 (1Н, т), 4,31 (1Н, т), 4,37 (1Н, т), 4,43 (1Н, т), 4,45 (1Н,т),

4,63 (1Н, й, I 8,8 Гц), 4,69 (1Н, т), 4,94 (1Н, т), 5,05 (1Н, т), 5,50 (1Н, т), 6,15 (1Н, ушир.8), 6,65 (2Н,й, I

8,1 Гц), 6,75 (1Н, 8), 7,00 (2Н, й, I 8,1 Гц), 7,29 (1Н, 8), 7,37 (1Н, й, I 9,5 Гц), 7,64 (1Н, й, I 9,5 Гц), 7,78 (1Н, й, I 8,8 Гц), 8,09 (1Н, й, I 8,1 Гц), 8,49 (1Н, й, I 9,5 Гц), (ОН группа тирозина не детектируется).

Физические данные соединения формулы ΧΙΙ.

МС (Ε8Ι): положит.иониз.: т/ζ 923,5 (Μ+Ыа), отриц.иониз.: т/ζ 899,5 (М-Н), ММ моноизотопа

900.5, С44Н68Ы8О12

Ή ЯМР (500 МГц, й₆-ДМСО) 5_Н: -0,11 (3Н, й, I 6,4 Гц), 0,63 (4Н, т), 0,75 (3Н, й, I 6,4 Гц), 0,83(6Н, й, I 7,0 Гц), 0,87 (3Н, й, I 6,4 Гц), 1,03 (1Н, т), 1,10 (1Н, т), 1,20 (3Н, й, I 6,4 Гц), 1,25 (1Н, т), 1,38(1Н,

т), 1,50 (1Н, т), 1,73 (1Н, т), 1,75 (2Н, т), 1,77 (1Н, т), 1,79 (3Н, т), 1,85 (3Н, 8), 1,85 (1Н, т), 2,12(1Н,

т), 2,16 (1Н, т), 2,55 (1Н, т), 2,67 (1Н, т), 2,70 (3Н, 8), 3,13 (1Н, т), 4,30 (1Н, т), 4,40 (1Н, т), 4,43(2Н,

т), 4,59 (1Н, й, I 9,5 Гц), 4,71 (1Н, т), 4,92 (1Н, т), 5,02 (1Н, т), 5,46 (1Н, т), 6,08 (1Н, ушир.8), 6,62 (2Н, й, I 8,5 Гц), 6,71 (1Н, 8), 6,97 (2Н, й, I 8,5 Гц), 7,22 (1Н, 8), 7,34 (1Н, й, I 9,2 Гц), 7,64 (1Н, й, I 9,5 Гц), 7,93 (1Н, й, I 9,2 Гц), 8,06 (1Н, й, I 7,6 Гц), 8,39 (1Н, й, I 8,5 Гц), 9,06 (1Н, ушир.8).

Физические данные соединения формулы ΧΙΙΙ.

МС (ЕТ, 9.4 Т ΑΡΕΧ-ΙΙΙ): найд.: 961,5039, рассч. для С₄Н \₈О -\а: 985,5005

Ή ЯМР (500 МГц, й₆-ДМСО) 5_Н: -0,12 (3Н, й, I 6,4 Гц), 0,62 (4Н, т), 0,75 (3Н, й, I 6,4 Гц), 0,81 (4Н, т), 0,87 (3Н, й, I 6,4 Гц), 1,08 (1Н, т), 1,20 (3Н, т), 1,22 (3Н, т), 1,38 (1Н, т), 1,46 (1Н, т), 1,50 (1Н, т), 1,71 (1Н, т), 1,73 (2Н, т), 1,76 (2Н, т), 1,82 (1Н, т), 1,94 (1Н, т), 2,01 (1Н, т), 2,23 (2Н, т), 2,56 (1Н, т),

2.66 (1Н, т), 2,69 (3Н, 8), 3,13 (1Н, т), 4,30 (1Н, т), 4,41 (2Н, т), 4,55 (1Н, т), 4,65 (1Н, й, I 9,5 Гц), 4,70 (1Н, т), 4,92 (1Н, т), 5,04 (1Н, т), 5,48 (1Н, т), 6,09 (1Н, ушир.8), 6,64 (2Н, й, I 8,5 Гц), 6,81 (1Н, 8), 6,97 (2Н, й, I 8,5 Гц), 7,33 (1Н, 8), 7,35 (1Н, й, I 9,2 Гц), 7,46 (2Н, ί, I 7,3 Гц), 7,53 (1Н, ί, I 7,3 Гц), 7,66 (1Н, й, I 9,5 Гц), 7,88 (2Н, й, I 7,3 Гц), 7,95 (1Н, й, I 9,5 Гц), 8,46 (1Н, й, I 8,5 Гц), 8,71 (1Н, й, I 7,3 Гц); (ОН-группа тирозина не детектируется).

Физические данные соединения формулы ΧΙν.

МС (Ε8Ι): положит.иониз.: т/ζ 927,5 (М+Н), отриц.иониз.: т/ζ 925,5 (М-Н), ММ моноизотопа 926,5, ^С47^Н74^Ы8^О11

Ή ЯМР (500 МГц, й₆-ДМСО) 5_Н: 0,00 (1Н, т), 0,48 (3Н, ί, I 7,5 Гц), 0,70 (3Н,й, I 7,0 Гц), 0,73 (3Н, ί, I 7,0 Гц), 0,76 (3Н, й, I 7,3 Гц), 0,79 (3Н, ί, I 7,3 Гц), 0,83 (6Н, й, I 6,4 Гц), 0,89 (1Н, т), 0,95 (1Н, т), 0,98 (3Н, й, I 7,0 Гц), 1,04 (3Н, й, I 6,1 Гц), 1,09 (1Н, т), 1,17 (1Н, т), 1,28 (1Н, т), 1,31 (1Н, т), 1,36 (1Н, т), 1,38 (1Н, т), 1,55 (1Н, т), 1,61 (1Н, т), 1,68 (1Н, т), 1,79 (1Н, т), 1,82 (1Н, т), 1,95 (2Н, т), 2,15 (3Н, т),

- 28 017735

2,25 (1Н, т), 2,66 (3Н, 8), 2,76 (1Н, т), 3,14 (1Н, т), 3,40 (1Н, т), 3,42 (1Н, т), 4,33 (1Н, т), 4,36 (1Н, т), 4,45 (2Н, т), 4,55 (2Н, т), 4,69 (1Н, т), 5,06 (1Н, т), 6,63 (2Н, й, I 8,2 Гц), 6,71 (1Н, ушир.8), 7,01 (2Н, й, I

8.2 Гц), 7,27 (1Н, ушир.8), 7,36 (1Н, й, I 9,5 Гц), 8,00 (1Н, й, I 9,5 Гц), 8,17 (1Н, й, I 4,00 Гц), 8,22 (1Н, й, I

7.3 Гц), 8,53 (1Н, й, I 9,5 Гц), 9,14 (1Н, ушир.8)

Физические данные соединения формулы XVII.

МС (Ε8Ι): положит.иониз.: т/ζ 985,4 (М+Ыа), отриц.иониз.: т/ζ 961,5 (М-Н), ММ моноизотопа 962,5, С45Н70Ы8О138.

Ή ЯМР (600 МГц, й₆-ДМСО) 5_Н: совпадения величины химических сдвигов не наблюдаются (смесь двух диастереомеров, структуру подтверждали при сравнении с другими родственными соединениями, например, соединением (ΙΙ).

Пример 1.2. Получение соединений формул νΙΙΙ, К, X.

Штамм.

Штамм был однозначно отнесен к виду Сйопйготусе8 гоЬи81и8, основываясь на морфологических признаках плодовых тел, а также на части последовательности гена 168-РНК. С.гоЬи81и8 относят к первой группе биологического риска по классификации Э8М2 (Э8М2 (2007)). Род Сйопйготусе8 относится к семейству Ро1уапщасеае. принадлежащему к порядку Мухососса1е8 класса дельта-протеабактерии. Бактерии порядка Мухососса1е8, также называемые миксобактериями, являются грамотрицательными бактериями палочковидной формы и обладают двумя выраженными отличиями от большинства других бактерий. Они закрепляются и начинают расти на твердых поверхностях, используя механизм активного перемещения и агрегирования для формирования плодовых тел при наступлении голодания (Ка18ег (2003)).

Штамм Сйопйготусе8 гоЬи81и8 по настоящему изобретению был депонирован в коллекции Э8М2 под номером 19330.

Культивирование.

Культивирование штамма проводили в ферментере объемом 100 л по следующей методике. Сначала 20 мл (20%) жидкой культуры штамма Сйопйготусе8 гоЬи81и8 высеивали в среде МЭ1 (6x100 мл) (состав описан в статье Войе и др. (2003), табл. 6) в качалочных колбах с отбойниками объемом 500 мл. После инкубации в течение 1 сут при 30°С на ротационной качалке при 120 об/мин первую промежуточную культуру высевали по 100 мл (25%) в среде МЭ1 (6x400 мл) в качалочных колбах с отбойниками объемом 2 л. После инкубации в течение 3 сут при 30°С на ротационной качалке при 120 об/мин вторую промежуточную культуру высевали в среде МЭ1 (19x500 мл) в качалочных колбах с отбойниками объемом 20 л. Температуру поддерживали при 30°С, аэрацию проводили со скоростью 20 л/мин (1,0 об.воздуха/об.культуры/мин) и перемешивали при 80 об/мин. В ферментере поддерживали избыточное давление 0,5 бар. Хотя рН культуральной жидкости не контролировали, рН в культуре незначительно изменялся от рН 6,95 в начале культивирования до рН 6,88 в день 7.

После инкубации в течение 7 сут всю вторую промежуточную культуру (18 л, 20%) использовали для высеивания в среду РОЬ1 (90 л) (состав описан в статье Ките и др. (1995)), исходный объем 108 л. Полученную основную культуру загружали в стандартный стальной ферментер объемом 100 л. Температуру поддерживали при 30°С, аэрацию проводили со скоростью 30 л/мин (0,3 об.воздуха/об.культуры/ мин) и перемешивали при 50 об/мин и затем через 4 сут со скоростью 80 об/мин. В ферментере поддерживали избыточное давление 0,5 бар. Величину рН в культуре поддерживали в диапазоне 6,8-7,2 при добавлении 3н. Н₂8О₄ или 1,5н. ЫаОН. Через 14 сут титр циклического депсипептида составлял 3 мг/л, полученную культурную жидкость собирали.

Экстракция.

Всю культуральную жидкость переносили в стальной сосуд объемом 1600 л и декантировали в течение 1 ч. Влажный клеточный осадок (приблизительно 200 г) собирали со дна сосуда фильтрованием через бумажный фильтр. Клеточный осадок экстрагировали 3 раза в течение 30 мин по 10 л этилацетата. Затем остаточную воду отделяли от фазы растворителя. Фазу растворителя промывали водой (5 л) и упаривали, при этом получали сухой экстракт, так называемый клеточный экстракт. Фильтрат культуральной жидкости экстрагировали этилацетатом (200 л). Смесь выдерживали в течение 2 ч, органическую фазу отделяли, промывали водой (20 л) и упаривали, при этом получали сухой экстракт (12,5 г), так называемый экстракт из культурального фильтрата.

Выделение соединения.

Каждый экстракт (из мицелия и культурального фильтрата) растворяли в дихлорметане/метаноле, 4:1. Раствор фильтровали и фильтрат пропускали через диатомовую землю (2 г диатомовой земли/1 г экстракта, ПоЫе®, !п1егпа(1опа1 8огЬеп! Тесйпо1оду Ь1й., Непдоей М1й 61ат, Великобритания), затем упаривали. Твердый остаток наносили на колонку с силикагелем (4x18 см, 100 г силикагеля 40-63) и проводили элюцию в градиенте циклогексана, этилацетата и метанола. Градиент описан в табл.4, скорость потока 28 мл/мин. Собирали фракции объемом 28 мл. Фракции объединяли согласно пикам поглощения в УФ. Фракции, содержащие циклический депсипептид (Н-1) по настоящему изобретению, затем очищали обращенно-фазовой хроматографией (\Уа1ег8 8ипПге КР18, 10 мкл, 30x150 мм), элюент: 0,01% муравьиная кислота (растворитель А1 и ацетонитрил, содержащий 0,1% муравьиной кислоты (растворитель

- 29 017735

В), скорость потока 50 мл/мин. Градиент описан в табл.5. Для нанесения на колонку материал растворяли в МеОН/ДМСО (1:1, концентрация 200 мг/мл). Собранные фракции анализировали методом ЖХВР, фракции, содержащие циклический депсипептид по настоящему изобретению, объединяли и упаривали в вакууме досуха. После хроматографии получали циклический депсипептид формулы VIII (52 мг), чистота >97%. Из объединенных экстрактов всего получали 85 мг очищенного циклического депсипептида формулы VIII.

Установлено, что другие циклические депсипептиды формулы VIII также содержатся в клеточном экстракте в небольших концентрациях. Из этих других депсипептидов выделяли циклические депсипептиды формул IX и X.

Таблица 4. Градиент, нормально-фазовое разделение

Таблица 5. Градиент ЖХВР, очистка циклического депсипептида формулы VIII

Время (мин)	Растворитель А (%)	Растворитель В (%)
0,0	75	25
1,0	75	25
23,0	55	45
23,1	0	100
27,0	0	100
27,1	75	25
30,0	75	25

Среда (величину рН доводили до 7,0 при добавлении 50 мМ НЕРЕ8)

Таблица 6. ΜΌ1 (Среда для предварительного культивирования)

Соединение	Концентрация (г/л)
Казитон	3
СаС1₂х2 Н₂0	0,5
Μβ8Ο₄χ7 Н₂0	2
О(+)-Глюкоза, не содержащая воду	1
Цианокобаламин	0,5 мг
Пеногаситель В	0,2 мл
Раствор ферриоксамина (100 нг/мл)	1 мл

Таблица 7. РОЬ1 (Среда для продуцирования)

Соединение	Концентрация (г/л)
Белок из картофеля	4
Растворимый крахмал	3
СаС1₂х2 Н₂0	0,5
М§8О₄х7 Н₂0	2
Цианокобаламин	0,25 мг
НЕРЕ8	12
Стандартный раствор микроэлементов 1901	1 мл
ΧΑϋ16	35

Характеристика соединений.

Физические данные соединения формулы VIII.

МС (ЕТ, 9.4 Т АРЕХ-Ш): найд.: 985,5007, рассч. для С₄Н \₈О-_;-\а: 985,5005.

Ή ЯМР (600 МГц, а₆-ДМСО) 5_Н: 0,74 (6Н, ά, I 7,0 Гц), 0,85 (3Н, а, I 7,0 Гц), 0,88 (3Н, а, I 7,0 Гц), 0,89 (6Н, а, I 7,0 Гц), 1,18 (3Н, а, I 6,7 Гц), 1,32 (1Н, т), 1,46 (1Н, т), 1,57 (2Н, т), 1,72 (3Н, т), 1,81 (1Н, т), 1,88 (1Н, т), 1,98 (1Н, т), 2,02 (2Н, т), 2,11 (3Н, т), 2,42 (1Н, т), 2,73 (1Н, т), 2,77 (3Н, 8), 2,87 (1Н,

- 30 017735

т), 3,12 (1Н, т), 3,64 (1Н, т), 4,23 (1Н, т), 4,40 (1Н, т), 4,58 (1Н, б, 1 9,5 Гц), 4,75 (2Н, т), 4,93 (1Н, т), 5,07 (1Н, 8), 5,40 (1Н, т), 6,03 (1Н, 8), 6,74 (1Н, 8), 6,79 (2Н, б, 1 8,4 Гц), 6,84 (2Н, б, 1 7,8 Гц), 7,02 (2Н, б, 1

8,4 Гц), 7,10 (1Н, б, 1 9,3 Гц), 7,14 (1Н, ΐ, 1 7,8 Гц), 7,19 (2Н, ΐ, 1 7,8 Гц), 7,26 (1Н, 8), 7,42 (1Н, б, 1 9,8 Гц), 7,89 (1Н, б, 1 9,2 Гц), 8,03 (1Н, б, 1 7,9 Гц), 8,38 (1Н, б, 1 8,9 Гц), 9,40 (1Н, 8).

¹³С ЯМР (150 МГц, бе-ДМСО) 5_С: 17,13 СН₃, 17,63 СН₃, 19,32 СН₃, 20,90 СН₃, 21,64 СН₂, 22,34 СН₃, 22,34 СН₃, 23,32 СН₃, 24,10 СН, 25,63 СН, 27,63 СН₂, 29,30 СН₂, 30,37 СН₃, 30,86 СН, 31,52 СН₂, 32,83 СН₂, 35,33 СН₂, 38,98 СН₂, 44,42 СН₂, 48,52 СН, 50,19 СН, 50,24 СН, 51,99 СН, 54,62 СН, 55,63 СН, 60,90 СН, 71,86 СН, 73,70 СН, 115,32 2хСН, 126,21 СН, 127,50 Сд, 127,74 2хСН, 129,42 2хСН, 130,43 2хСН, 136,72 Сд, 156,23 Сд, 168,93 Сд, 169,18 Сд, 169,18 Сд, 170,18 Сд, 170,39 Сд, 171,72 Сд, 171,96 Сд, 172,50 Сд, 173,82 Сд.

Физические данные соединения формулы IX.

МС (ЕТ, 9.4 Т АРЕХ-ΙΙΙ): найд.: 969,5058, рассч. для С₄₉Н₇₀^Оц+Ж 969,5056.

Ή ЯМР (600 МГц, б₆-ДМСО) 5_Н: 0,53 (3Н, б, 1 6,6 Гц), 0,73 (3Н, б, 1 6,6 Гц), 0,74 (3Н, б, 1 6,6 Гц), 0,81 (3Н, б, 1 6,6 Гц), 0,86 (6Н, б, 1 6,6 Гц), 1,08 (3Н, б, 1 6,5 Гц), 1,20 (1Н, т), 1,33 (3Н, т), 1,52 (1Н, т), 1,64 (1Н, т), 1,80 (2Н, т), 2,01 (1Н, т), 2,04 (2Н, т), 2,15 (4Н, т), 2,25 (1Н, т), 2,30 (1Н, т), 2,74 (3Н, 8), 2,83 (1Н, т), 3,12 (1Н, т), 3,32 (1Н, т), 3,38 (1Н, т), 4,14 (1Н, т), 4,27 (1Н, т), 4,40 (1Н, т), 4,59 (1Н, т), 4,61 (1Н, т), 4,94 (1Н, т), 4,99 (1Н, т), 5,10 (1Н, т), 6,42 (2Н, б, 1 8,8 Гц), 6,75 (1Н, 8), 7,04 (2Н, б, 1 8,8 Гц),7,10 (1Н, ΐ, 1 7,3 Гц), 7,15 (2Н, ΐ, 1 7,3 Гц), 7,23 (2Н, б, 1 7,3 Гц), 7,30 (1Н, 8), 7,41 (1Н, б, 1 9,5 Гц), 8,05 (1Н, б, 1 9,5 Гц), 8,23 (1Н, б, 1 8,1 Гц), 8,47 (1Н, б, 1 4,4 Гц), 8,71 (1Н, б, 1 10,2 Гц), (сигнал протонов гидрокси-группы не детектируется).

Физические данные соединения формулы X.

МС (ЕТ, 9.4 Т АРЕХ-ΙΙΙ): найд.: 955,4896, рассч. для СвВДРц+Ыа: 955,4900.

'Н ЯМР (600 МГц, бб-ДМСО) 5_Н: совпадения величин химических сдвигов не наблюдается (смесь ротамеров), структуру подтверждали при сравнении спектров ЯМР (отсутствие Ν-метилгруппы) со спектром ЯМР соединения (ΙΧ).

Пример 1.3. Получение соединений формул (ХУ-ХУ!).

Штамм.

Штамм был однозначно отнесен к виду Сйопбготусе8 ар1си1а1и8. основываясь на морфологических признаках плодовых тел, а также на части последовательности гена 168-РНК. С.ар1си1а1и8 относят к первой группе биологического риска по классификации Ό8ΜΖ (Ό8ΜΖ (2007)). Род Сйопбготусе8 относится к семейству Ро1уапд1асеае, принадлежащему к порядку Мухососса1е8 класса дельта-протеабактерии. Бактерии порядка Мухососса1е8, также называемые миксобактериями, являются грамотрицательными бактериями палочковидной формы и обладают двумя выраженными отличиями от большинства других бактерий. Они закрепляются и начинают расти на твердых поверхностях, используя механизм активного перемещения и агрегирования для формирования плодовых тел при наступлении голодания (Ка18ег (2003)).

Штамм Сйопбготусе8 ар1си1а1и8 по настоящему изобретению был депонирован в коллекции Ό8ΜΖ под номером 21595.

Культивирование.

Сначала 20 мл (20%) жидкой культуры штамма Сйопбготусе8 ар1си1а1и8 высеивали в среду ΜΌ1 (10x100 мл) (состав описан в статье Вобе и др. (2003), табл. 6) в качалочных колбах с отбойниками объемом 500 мл. После инкубации в течение 6 сут при 30°С на ротационной качалке при 120 об/мин культуральную жидкость (1 л) переносили в одноразовую емкость для ферментации \Уате Ьад в смеси с 5 л среды ΜΌ1. После инкубации в реакторе Вю \Уате 200 8Р8 (\Уате В|о1ес АС, Швейцария) в течение 7 сут в одноразовую емкость добавляли среду М7/14 (40 л) для индукции продуцирования. Клетки собирали через 19 сут.

Экстракция.

Для сбора клеток воздух из верхней части одноразовой емкости удаляли в вакууме и емкость подвешивали для осаждения смолы и клеток. После осаждения в течение 1 ч супернатант (43 л) удаляли и отбрасывали. Остаток (7 л), содержащий клетки и смолу, замораживали в течение ночи. После размораживания клетки и смолу отделяли фильтрованием через бумажный фильтр. Фильтрат отбрасывали. Осадок (клетки/смола, масса влажного осадка составляет приблизительно 3 кг) переносили в металлический сосуд и два раза экстрагировали этилацетатом два раза (по 15 л), в ходе первой экстракции смесь перемешивали в течение 5 мин. Смесь, полученную после двух экстракций, фильтровали на бумажном фильтре и фильтраты объединяли. После отделения органической фазы от водной фазы органическую фазу промывали очищенной водой (2 л) и упаривали досуха. Водную фазу отбрасывали.

Выделение соединения.

Экстракт (5 г) растворяли в дихлорметане/метаноле, 4:1. Раствор фильтровали и фильтрат пропускали через диатомовую землю (2 г диатомовой земли/1 г экстракта, кокИе®, !п1егпа(1опа1 8огЬеШ Тесйпо1оду Мб., Непдоеб Μι6 С1ат, Великобритания), затем упаривали. Твердый остаток наносили на колонку с силикагелем (4x18 см, 100 г силикагеля 40-63) и проводили элюцию в градиенте циклогексана, этилацетата и метанола. Градиент описан в табл.2, скорость потока 28 мл/мин. Собирали фракции объемом

- 31 017735 мл. Фракции объединяли согласно пикам поглощения в УФ. Фракции, содержащие циклический депсипептид по настоящему изобретению, затем очищали обращенно-фазовой хроматографией (\Ма(ег8 §ииПге КР18, 10 мкл, 30x150 мм), элюент: 0,01% муравьиная кислота (растворитель А) и ацетонитрил, содержащий 0,1% муравьиной кислоты (растворитель В), скорость потока 50 мл/мин. Градиент описан в табл.1. Для нанесения на колонку материал растворяли в МеОН/ДМСО (1:1, 1,6 мл). Собранные фракции анализировали методом ЖХВР, фракции, содержащие циклический депсипептид по настоящему изобретению, объединяли и упаривали в вакууме досуха. После хроматографии экстракта получали 7 мг очищенного циклического депсипептида формулы XV и 1,2 г очищенного циклического депсипептида формулы XVI.

Среда.

Таблица 8. МЭ1 (среда для предварительной культуры).

Соединение	Концентрация г/л
Казитон	3
СаС1₂х2 Н₂О	0,5
М§8О₄х7 Н₂О	2
0(+)-Глюкоза, не содержащая воду	1
Цианокобаламин	0,5 мг
Пеногаситель В	0,2 мл
Раствор ферриоксамина (100 нг/мл)	1 мл

(Величину рН доводили до 7,0 при добавлении 50 мМ НЕРЕ8)

Таблица 9. М7/14 (Среда для продуцирования).

Соединение	Концентрация (г/л)
Дрожжевой экстракт	1
СаС1₂х2 Н₂О	1
М_ё8О₄х7 Н₂О	1
Картофельный крахмал	5
НЕРЕ8	12
Белок из картофеля	5
0(+)-глюкоза, не содержащая воду	2
Цианобаламин	0,1 мг
Пеногаситель В	0,2 мл
Раствор ферриоксамина (100 нг/мл)	3 мл
Смола ХАО-16	35

Величину рН доводили до 7,4.

Характеристика соединений. Физические данные соединения формулы XV.

МС (ЕТ, 9,4 Т АРЕX-III): найд.: 1014,5272, рассч. для СзоШ^Оп+Ыа: 1014,5276.

¹Н ЯМР (600 МГц, а₆-ДМСО) 5_Н: 0,72 (3Н, а, I 6,6 Гц), 0,82 (3Н, а, I 6,6 Гц), 0,85 (6Н, а, I 6,6 Гц), 1,01 (1Н, т), 1,02 (6Н, а, I 6,6 Гц), 1,17 (3Н, а, I 6,6 Гц), 1,21 (1Н, т), 1,31 (1Н, т), 1,36 (2Н, т), 1,42 (1Н,

т), 1,49 (1Н, т), 1,54 (1Н, т), 1,56 (1Н, т), 1,69 (3Н, т), 1,79 (1Н, т), 1,81 (1Н, т), 2,40 (1Н, т), 2,48 (1Н,

т), 2,73 (1Н, т), 2,76 (3Н, 8), 2,87 (1Н, т), 2,91 (1Н, т), 2,98 (1Н, т), 3,10 (1Н, т), 3,63 (1Н, т), 4,22 (1Н,

т), 4,42 (1Н, 1а, I 8,1, 5,1 Гц), 4,58 (1Н, т), 4,75 (2Н, т), 4,90 (1Н, т), 5,06 (1Н, т), 5,38 (1Н, т), 5,42 (2Н, ушир.), 5,96 (1Н, ΐ, I 5,5 Гц), 6,06 (1Н, ушир.8), 6,78 (2Н, а, I 8,1 Гц), 6,83 (2Н, а, I 7,3 Гц), 7,00 (2Н, а, I 8,1 Гц), 7,10 (1Н, а, I 9,5 Гц), 7,14 (1Н, ΐ, I 7,3 Гц), 7,19 (2Н, ΐ, I 7,3 Гц), 7,46 (1Н, а, I 9,5 Гц), 7,77 (1Н, а, I

9,5 Гц), 7,97 (1Н, а, I 8,1 Гц), 8,37 (1Н, а, I 8,8 Гц), 9,50 (1Н, ушир.8).

Физические данные соединения формулы XVI.

МС (ЕМ): положит.иониз.: т/ζ 1004,4 (М+Ыа), отриц.иониз.: т/ζ 976,5 (М-Н), ММ моноизотопа 977,5, С49Н71Ы9О12.

¹Н ЯМР (600 МГц, а₆-ДМСО) 5_Н: 0,72 (6Н, а, I 6,6 Гц), 0,85 (3Н, а, I 6,6 Гц), 0,87 (3Н, а, I 6,6 Гц), 1,01 (6Н, а, I 6,6 Гц), 1,17 (3Н, а, I 6,6 Гц), 1,30 (1Н, т), 1,35 (2Н, т), 1,43 (1Н, т), 1,48 (1Н, т), 1,56 (1Н, т), 1,57 (1Н, т), 1,69 (1Н, т), 1,71 (2Н, т), 1,79 (1Н, т), 2,08 (1Н, т), 2,41 (1Н, т), 2,48 (1Н, т), 2,77 (3Н, 8), 2,87 (1Н, т), 2,92 (1Н, т), 2,98 (1Н, т), 3,09 (1Н, т), 3,63 (1Н, т), 4,22 (1Н, т), 4,42 (1Н, ίύ, I 8,1, 5,1 Гц), 4,57 (1Н, т), 4,74 (1Н, т), 4,76 (1Н, т), 4,91 (1Н, т), 5,06 (1Н, 8), 5,39 (1Н, т), 5,43 (2Н, ушир.8), 5,96 (1Н, ΐ, I 5,5 Гц), 6,07 (1Н, ушир.8), 6,78 (2Н, а, I 8,1 Гц), 6,84 (2Н, а, I 7,3 Гц), 7,00 (2Н, а, I 8,1 Гц), 7,11 (1Н, а, I 9,5 Гц), 7,15 (1Н, ΐ, I 7,3 Гц), 7,19 (2Н, ΐ, I 7,3 Гц), 7,42 (1Н, а, I 9,5 Гц), 7,78 (1Н, а, I 9,5 Гц), 7,98 (1Н, а, I 8,1 Гц), 8,39 (1Н, а, I 8,8 Гц), 9,52 (1Н, ушир.8).

- 32 017735

Пример 2. Определение биологической активности ш νίΙΐΌ.

Соединения по настоящему изобретению, например, включая соединения формул ΙΙ-Х, обладают фармакологической активностью и, следовательно, их можно использовать в качестве фармацевтических препаратов. Например, было установлено, что соединения по настоящему изобретению ингибируют активность калликреина-7 и активность эластазы нейтрофилов человека.

Значения Ιί.'₅₀ соединений по настоящему изобретению составляют от 1 нМ до 10 мкМ по данным анализа, который описан ниже.

Пример 2.1. Ингибирующая активность ш νίΙΐΌ в отношении калликреина-7.

Материалы и буферные растворы.

Нефлуоресцентный субстрат Αс-О1и-Α8р(Ε^ΑN§)-^у8-Ρ^о-I^е-^еи-Ρйе^ΛΑ^д-^еи-О1у-^у8(^ΑВСΥ^)Ο1υ-ΝΗ₂ (где ^л обозначает расщепляемую связь, по данным анализа МС) фирмы ВюкуШап (Берлин, Германия) хранили в виде исходного 5 мМ раствора в ДМСО при -20°С. Для анализа использовали реагенты квалификации чистый для анализа. Ферментативные реакции проводили в 50 мМ буферном растворе цитрата натрия, рН 5,6, содержащем 150 мМ №1С1 и 0,05% (мас./об.) СНАР8.

Все растворы, содержащие белки и пептиды, обрабатывали в силиконизированных пробирках (Ь1Ге 8ук1ешк Пеыдп, Μе^еηкс11\νаηά. Швейцария). Растворы соединений, а также растворы ферментов и субстратов, переносили в 384-луночный планшет (черный, СИп1р1а(е, номер по каталогу 95040020 ЬаЬкук1ешк Оу, Финляндия) с помощью 96-канальной автоматической пипетки СуВ1-Уе11 (СуВю АО, Иена, Германия).

Оборудование для определения ИФ.

Интенсивность флуоресценции (ИФ) определяли на ридере (ИИга Ενо1иΐ^оη ТЕСАН Μаеηηеάо^Γ. Швейцария). Прибор снабжен комбинированным полосовым фильтром 350 нм (ширина полосы 20 нм) и 500 нм (ширина полосы 25 нм), для возбуждения и испускания флуоресценции, соответственно. Для увеличения отношения сигнал/помехи использовали соответствующее дихроичное зеркало. Использовали оптические фильтры и дихроичное зеркало фирмы ТЕСАН Перед измерением флуорофоры в каждой лунке возбуждали тремя вспышками.

Определение значений ГС₅₀.

Для расчета значений Ιί.'₅₀ анализ проводили при комнатной температуре в 384-луночных планшетах. Конечный объем реакционной смеси во всех лунках составлял 30 мкл. Исследуемые соединения растворяли в 90% (мас./об.) ДМСО/воде и при разбавлении водой (содержащей 0,05% (мас./об.) СНАР8) получали 3-кратные серийные разведения. Для анализа использовали 11 конечных концентраций: 0,3 нМ, 1 нМ, 3 нМ, 10 нМ, 30 нМ, 100 нМ, 300 нМ, 1 мкМ, 3 мкМ, 10 мкМ и 30 мкМ. Для каждого анализа в лунку добавляли 10 мкл воды/СНАР8 (± исследуемое соединение), затем раствор протеазы (10 мкл) (разбавленный в 1,5 раза буферным раствором для анализа). Концентрация протеазы в конечном растворе для анализа составляла 0,2 нМ (концентрацию фермента определяли методом Бредфорд). После инкубации при комнатной температуре в течение 1 ч реакцию инициировали добавлением 10 мкл раствора субстрата (субстрат разбавляли буферным раствором для анализа в 1,5 раза, конечная концентрация составляла 2 мкМ). Влияние соединений на ферментативную активность оценивали по кривым линейной зависимости и определяли по двум величинам, первую величину определяли непосредственно после добавления субстрата и вторую через 1 ч. Значение Ιί.'₅₀ рассчитывали по кривой зависимости ингибирования (%) от концентрации ингибитора, с использованием программного обеспечения для нелинейного регрессионного анализа (ΧΕίΙΐ, версия 4.0, ΙΌ Виктекк 8о1ийоп ЬШ., Ош1бГогб, 8иггеу, Великобритания).

Циклические депсипептиды, ингибирующие калликреин-7, и величины Ιί.'₅₀ представлены в табл.11. Таблица 10

	Циклический депсипептид формулы (II)	Циклический депсипептид формулы (111)
Фермент	1Сзо мкМ	1С50 мкМ
Калликреин-7 человека	0,001	0,0004

Таблица 11

Циклический депсипептид формулы	Эластаза нейтрофилов человека 1С;о (мкМ)	Калликреин7 человека Ю50 (мкМ)
формула II	0,01	0,001
формула III	0,01	0,0004
формула IV	0,07	0,005
формула V	0,06	0,006
формула IX	0,01	0,001
формула X	0,2	0,02
формула XII	0,05	0,004

- 33 017735

Циклический депсипептид формулы	Эластаза нейтрофилов человека 1С50 (мкМ)	Калликреин7 человека 1С;о (мкМ)
формула ХШ	0,03	0,0007
формула XIV	2,7	0,2
формула XV	0,08	0,004
пример 4	0,055	0,006
пример 5	0,005	0,008
пример 6	0,055	0,095
пример 7	0,006	0,050
пример 9	0,003	0,002
пример 10	0,009	0,0035
пример 11	0,012	0,006
пример 12	0,006	0,0085
пример 13	0,004	0,006
пример 14	0,005	0,01
пример 15	0,005	0,015
пример 16	0,005	0,015
пример 17	0,0075	0,003
пример 18	0,0025	0,005
пример 19	0,0135	0,0065
пример 20	0,008	0,0015
пример 21	0,009	0,0025
пример 22	0,04	0,006
пример 23	0,003	0,005
пример 24	0,004	0,007
пример 25	0,0025	0,00375
пример 26	0,0045	0,00085
пример 27	0,02	0,003
пример 28	0,03	0,0025
пример 29	0,025	0,003
пример 30	4,55	1,05
пример 31	0,3	0,2
пример 32	0,03	0,1
пример 33	0,035	0,0045
пример 34	0,005	0,004
пример 35	0,003	0,0085
пример 36	0,0035	0,0085
пример 37	0,0025	0,0045
пример 3 8	0,0015	0,004
пример 39	0,0035	0,0085
пример 40	0,0025	0,0065
пример 41	0,001	0,002
пример 42	0,001	0,001
пример 43	0,001	0,0002
пример 44	0,009	0,0035

Циклический депсипептид формулы	Эластаза нейтрофилов человека 1С50 (мкМ)	Калликреин7 человека1С$о (мкМ)
пример 45	0,003	0,002
пример 46	0,1	0,01
пример 47	0,01	0,1

Пример 2.2. Ингибирующая активность ίη νίΐΐΌ в отношении эластазы нейтрофилов человека.

Материалы и буферные растворы.

Для анализа использовали эластазу нейтрофилов человека (номер по каталогу 8Е563) фирмы Е1а§11п Ртобисй Сотрапу, Ιπο. (ЕРС, О\\'еп5тП1е. США). Сухой порошок (чистота >95%, по данным фирмыпроизводителя) растворяли в 20 мМ буферном растворе ацетата натрия, рН 5,0, содержащем 50% (мас./об.) глицерин, и аликвотные части замораживали при -80°С.

Нефлуоресцентный субстрат (^АΒСΥ^-8е^-61и-Vа1^ΛА8η-^еи-А8р-А1а-61и-Рйе-Е^АN§, где ^л означает расщепляемую связь по данным анализа МС) фирмы Вю8уп1ап (Берлин, Германия) хранили в виде исходного 5 мМ раствора в ДМСО при -20°С. Для анализа использовали реагенты квалификации чистый для анализа.

Ферментативные реакции проводили в 100 мМ буферном растворе трис/НС1, рН 7,5, содержащем 500 мМ ЫаС1 и 0,05 % (мас./об.) СНАР8.

Все растворы, содержащие белки и пептиды, обрабатывали в силиконизированных пробирках (ЫЕе

- 34 017735

8у51ет5 Эеыдп, Мегепксйтапб, Швейцария).

Растворы соединений, а также растворы ферментов и субстратов, переносили в 384-луночный планшет (черный С11шр1а1е, номер по каталогу 95040020 ЬаЬкуйетк Оу, Финляндия) с помощью 96канальной автоматической пипетки СуВ1-\Уе11 (СуВю АС, Иена, Германия).

Оборудование для определения ИФ.

Интенсивность флуоресценции (ИФ) определяли на ридере (И11га Еуо1и1юп ТЕСАК МаеппебогГ, Швейцария). Прибор снабжен комбинированным полосовым фильтром 350 нм (ширина полосы 20 нм) и 500 нм (ширина полосы 25 нм), для возбуждения и испускания флуоресценции, соответственно. Для увеличения отношения сигнал/помехи использовали соответствующее дихроичное зеркало. Использовали оптические фильтры и дихроичное зеркало фирмы ТЕСАК Перед измерением флуорофоры в каждой лунке возбуждали тремя вспышками.

Циклические депсипептиды, ингибирующие эластазу нейтрофилов человека, и величины Κ.'₅₀ представлены в табл.11.

Кроме того, циклические депсипептиды ингибируют химотрипсин человека, значения Κ.'₅₀ находятся в диапазоне от 0,001 мкМ до 0,02 мкМ.

Биологическую активность циклического депсипептида формулы УШ определяли в присутствии калликреина 7. Указанный циклический депсипептид ингибирует калликреин 7 человека, значение Κ.'₅₀составляет менее 3 нМ. Указанный циклический депсипептид ингибирует химотрипсин человека и эластазу нейтрофилов человека, значения Κ.'₅₀ составляют 0,004 мкМ и 0,0025 мкМ, соответственно.

Пример 3. Определение ингибирующей активности в отношении калликреина-7 ш У11го.

А) Тест на регенерацию кожного барьера у мышей после его повреждения.

Метод.

Повреждение кожного барьера осуществляли в группах бесшерстных мышей 8КН1 при повторном отслаивании кожи диском для соскоба кожи фирмы 8-8с.|ате®. Процедуру завершали, когда трансэпидермальная потеря влаги (ТЭПВ) достигала >40 мг/см²/ч. ТЭПВ определяли на приборе Те^ате1ег ТМ210 (Соигаде КЕа/ака, Кельн, Германия). Сразу после повреждения кожного барьера на рану наносили 10 мМ исследуемое соединение (30 мкл). Контрольных животных обрабатывали аналогичным образом, но на рану наносили только растворитель (этанол/пропиленгликоль, 3:7 (мас./об.)). ТЭПВ измеряли до, сразу после и через 3 ч после повреждения кожного барьера. Для каждого животного рассчитывали регенерацию в % по формуле: (1-[ТЭПВ через 3 ч - базовая линия ТЭПВ]/[ТЭПВ сразу после повреждения - базовая линия ТЭПВ])х 100%.

Результаты.

После однократного нанесения соединения (циклический депсипептид формулы ΙΙ) наблюдается ускоренная регенерация кожного барьера на 57% по сравнению с мышами, которых несколько раз обрабатывали только растворителем (р<0,05), табл. 12.

Таблица 12

Животные	Регенерация кожного барьера, % среднее значение (СО), п: 4 особи в каждой группе
Обработка 10 мМ раствором исследуемого соединения (циклический депсипептид формулы П)	72,0 (9,1)
Обработка только растворителем	45,8 (8,0)

Б) Тест на противовоспалительную активность на модели мышей с аллергическим контактным дерматитом (АКД).

Метод.

Мышей Сг1:ИМК1 сенсибилизировали в день 1 при нанесении на бритое брюшко 50 мкл 2% оксазолона, затем в день 8 наносили 10 мкл оксазолона на внутреннюю поверхность правого уха. В качестве контроля использовали необработанное левое ухо, а дерматит оценивали в день 9 по различию массы ушной раковины (как мера воспалительного отека). Животных лечили при нанесении местным способом исследуемого соединения (10 мкл) или только растворителя через 30 мин после повторной сенсибилизации. Эффективность лечения оценивали по подавлению воспалительного отека уха в % по сравнению с контрольным ухом.

Результаты.

После однократного нанесения исследуемого соединения (циклический депсипептид формулы ΙΙ) наблюдали подавление воспалительного отека при АКД на 40% (10 мМ) и 46% (30 мМ) (р<0,001 по сравнению с особями, обработанными только растворителем (табл.13, 14).

- 35 017735

Таблица 13

Животные	Δ массы уха» среднее значение (СО), п: 8 особей в каждой группе	Подавление воспалитель ного отека, % среднее значение±СО
Обработка 30 мМ раствором исследуемого соединения (циклический депсипептид формулы II)	15,3 (5,4)	46±7,5
Обработка 10 мМ раствором исследуемого соединения (циклический депсипептид формулы II)	17,0 (4,8)	40±6,9
Обработка только + растворителем	28,1 (4,6)

+: смесь диметилацетамида/этанола/ацетона (1:2:2)

Таблица 14

	Подавление воспалительного отека, %	Подавление воспалительного отека, %
	Концентрация исследуемого соединения	Концентрация исследуемого соединения
Соединение формулы	30 мМ	10 мМ
пример 9	38	42
пример 10	25	22
пример 23	40	48
пример 25	38	39
пример 43	55	42

В) Тест на противовоспалительную активность на модели свиней с аллергическим контактным дерматитом (АКД).

За восемь дней перед оценкой АКД для сенсибилизации на оба уха и в обе паховые складки животных внутрикожно наносили 10% 2,4-динитрофторбензол (500 мкл, ДНФБ, растворенного в смеси ДМСО/ацетон/оливковое масло (1:5:3, об./об./об.)) по 100 мкл на каждый участок. Ответную реакцию на сенсибилизацию оценивали при нанесении 15 мкл ДНФБ (1,0%) на противоположные участки (каждый по 7 см ). Для лечения исследуемое соединение и плацебо (только растворитель) наносили на противоположные участки (по 2 участка) каждого животного через 0,5 и 6 ч после сенсибилизации. Исследуемые участки обследовали в клинических условиях через 24 ч после сенсибилизации, когда наблюдалась максимальная воспалительная реакция. Изменения оценивали в баллах от 0 до 4 (табл.15), причем общая максимальная оценка составляла 12 баллов на один исследуемый участок. Покраснение кожи определяли методом рефлектометрии (величина а*).

Таблица 15. Оценка клинических симптомов на исследуемых участках, пораженных АСД

Оценка в баллах	Эритема/интенсивность	Эритема/степень развития	Уплотнение
0	отсутствует	отсутствует	отсутствует
1	практически невидимая	небольшие пятна	практически не пальпируется
2	слабая степень	большие пятна	слабая степень уплотнения
3	значительная	сливающиеся пятна	уплотнение значительное
4	тяжелая степень (или синюшное окрашивание)	однородное покраснение	значительное уплотнение или повышенной степени

Результаты.

При нанесении на участки, пораженных АКД, 1% раствора исследуемого соединения (циклический депсипептид формулы II) наблюдается подавление пораженных участков (клинических воспалительных изменений) на 30% (р<0,01) и снижение покраснения кожи на 27% (р<0,05) (табл.16).

- 36 017735

Таблица 16

Исследуемые участки	Клиническая оценка в баллах (среднее значение, СО, п: 8+)	Величина А* (среднее значение, СО, п: 8+)
Лечение 1% раствором исследуемого соединения (циклический депсипептид формулы II)	5,1 (1,7)	8,6(1,4)
Лечение плацебо (растворитель)	7,2 (1,9)	12,0 (2,5)

Исследуемые участки	Клиническая оценка в баллах (среднее значение, СО, п: 8+)	Величина А* (среднее значение, СО, п: 8+)
Подавление по сравнению с участками, обработанными плацебо⁺	29,9 (11,7)	27,0 (2,5)

+: 2 исследуемых участка каждого из 4 животных.

Пример 4. Модификация циклического депсипептида по настоящему изобретению.

а) Одностадийный метод.

В раствор циклического депсипептида формулы II (20 мг) и триэтилсилана (0,027 мл) в дихлорметане/ацетонитриле (2 мл, 1:1) при -50°С медленно добавляли эфирата трифторида бора (0,014 мл). Реакционную смесь нагревали до -5°С и выдерживали при этой температуре в течение еще з0 мин, выливали в насыщенный раствор NΆНСО₃ и экстрагировали ЕЮАс. Органический слой сушили над сульфатом натрия и растворитель удаляли в вакууме. Полученный остаток очищали ЖХВР (Х1егга, 5 см, градиент ацетонитрил/аммоний-карбонатный буферный раствор рН 10), при этом получали производное циклического депсипептида формулы II (9,8 мг), где остаток Айр превращен в з-аминопиперидин-2-он. МС (Е8Ц 9з5,з6 [Μ+Νβ]⁺.

б) Двухстадийный метод.

В раствор циклического депсипептида формулы II (1 г) в дихлорметане/ацетонитриле (з00 мл, 1:1) при -50°С медленно добавляли эфират трифторида бора (0,68 мл). Реакционную смесь нагревали до -20°С. Затем медленно добавляли дополнительное количество эфирата трифторида бора (0,68 мл), поддерживая указанную температуру реакционной смеси до полного потребления исходного соединения (ЖХВР). Затем реакционную смесь выливали в насыщенный раствор NΆНСО₃ и экстрагировали ЕЮАс. Органический слой сушили над сульфатом натрия и растворитель удаляли в вакууме, при этом получали производное циклического депсипептида формулы II, в котором Айр превращен в з-амино-з,4-дигидро1Н-пиридин-2-он. МС (Е8Ц 9зз,28 [М+№]'.

Неочищенное соединение растворяли в 2-пропаноле (400 пл), добавляли Рй/С (115 мг, 10%) и смесь гидрировали при атмосферном давлении до полного потребления исходного соединения (ЖХВР). Полученный остаток очищали хроматографией (8Ю₂, циклогексан/ЕЮАс (1:1) + 10% МеОН), при этом получали производное циклического депсипептида формулы II (684 мг), в котором Айр превращен в заминопиперидин-2-он.

Пример 5. Получение производного циклического депсипептида по настоящему изобретению.

В раствор циклического депсипептида формулы II (75 мг, 0,081 ммоля) в 1-РгОН (5 мл) добавляли серную кислоту (з0 мкл) и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 48 ч. Затем реакционную смесь разбавляли дихлорметаном и промывали насыщенным раствором бикарбоната натрия. После высушивания органического слоя над сульфатом натрия растворитель удаляли и полученный остаток очищали хроматографией на силикагеле (циклогексан/ЕЮАс (1:1) + 10% МеОН), при этом получали производное циклического депсипептида формулы II (65 мг, выход 8з%), в котором Айр превращен в з-амино6-пропоксипиперидин-2-он. МС (Е8Ц 99з,з7 [М+№].

Следующие соединения получали по аналогичной методике, но с использованием соответствующего спирта:

- з7 017735

Таблица 17

Пример	К.	МС (Ε8Ι) [Μ+Να]⁺
б	1-октил	1063,41
7	2,2,2-трифторэти л	1033,30
8	2-пропил	993,43
9	бензил	1041,16
10	этил	979,22
И	1 -бутил	1007,29
12	изобутил	1007,35
13	2-метоксиэтил	1009,31
14	2-гидроксиэтил	995,28
15	2-(2-гидроксиэтокси)этил	1039,31
16	2-(2-метоксиэтокси)этил	1053,33
17	метил	965,27
18	пропаргил	989,21

Одновременно по аналогичной методике получали следующие соединения:

Таблица 18

Пример	К.1, К.2	МС (Ε8Ι) [Μ+Να]⁺
19	1-пропил	1136,33
20	метил	980,21

Пример 21. Получение производного циклического депсипептида по настоящему изобретению

Раствор циклического депсипептида формулы II (25 мг, 0,027 ммоль) в дихлорметане (2 мл) охлаждали до 0°С. Затем добавляли О!РЕА и ангидрид трифторуксусной кислоты (АТФУ). Реакционную смесь медленно нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение еще 4 ч. Реакционную смесь разбавляли дихлорметаном, промывали соляной кислотой и насыщенным раствором бикарбоната натрия. После высушивания органического слоя над сульфатом натрия растворитель удаляли и полученный остаток очищали хроматографией на силикагеле (циклогексан/Е1ОАс (1:1) + 10% МеОН), при этом получали производное циклического депсипептида формулы II (14 мг, выход 57%), в котором амид в боковой цепи А! превращен в нитрил. МС (ЕМ): 933,30 |М+№|'.

Следующие соединения получали по аналогичной методике:

Таблица 19

Пример	К	МС (Ε8Ι) [Μ+Ν3]⁺
22	н	917,30
23	этил	961,20
24	1-пропил	975,29
25	бензил	1023,14

Пример 26. Получение производного циклического депсипептида по настоящему изобретению.

Раствор циклического депсипептида формулы II (25 мг, 0,027 ммоля) в дихлорметане (2 мл, ДХМ) охлаждали до 0°С. Затем медленно добавляли ЭРЕ-А (24 мкл) и гексилхлорформиат (14 мкл). Реакционную смесь нагревали до КТ и перемешивали в течение еще 4 ч. Реакционную смесь разбавляли дихлорметаном, промывали соляной кислотой, насыщенным раствором бикарбоната натрия и солевым раствором. После высушивания органического слоя над сульфатом натрия растворитель удаляли и полученный остаток очищали хроматографией на силикагеле (циклогексан/Е1ОАс (1:1) + 10% МеОН), при этом полу

- 38 017735 чали производное циклического депсипептида формулы ΙΙ (20 мг, выход 70%), в котором фенольный остаток А₆ превращен в соответствующий гексиловый эфир карбоновой кислоты. МС (Ε8Ι): 1079,41 [Μ+Ка].

Следующие соединения получали по аналогичной методике, но при использовании соединения, описанного в примере 4, в качестве исходного соединения.

Таблица 20

Пример	К	МС (Ε8Ι) [М ' Ма]⁺
27	изобутил	1035,38
28	2-метоксиэтил	1037,36
29	этил	1007,35
30	к	1347,63
31	1 -октил	1091,42

Пример 32. Получение производного циклического депсипептида по настоящему изобретению.

В смесь циклического депсипептида, полученного в примере 5 (200 мг, 0,21 ммоль), К₂СО₃ (57,5 мг, 0,41 ммоль) в сухом ацетоне (2 мл) добавляли (Е)-3-фенил-2-пропенилбромид (60,5 мг, 0,31 ммоль) и обрабатывали ультразвуком в течение ночи (температура повышалась до приблизительно 50°С). Реакционную смесь разбавляли дихлорметаном и промывали водой. После высушивания органического слоя над сульфатом натрия растворитель удаляли и полученный остаток очищали ЖХВР (15 см 2отЬах, ацетонитрил/водный буферный раствор КН₄ОАс: градиент от 20 до 95%), при этом получали производное циклического депсипептида (пример 5, 100 мг, 45%), в котором А₆ превращен в О-((Е)-3-фенил-2пропен-1-ил)-й-тирозин. МС (Ε8Ι): 1109,37 |Μ+№|'.

Следующие соединения получали по аналогичной методике, но при обработке циклических депсипептидов (примеры 4 или 5) соответствующим алкилирующим реагентом.

Пример	К.1	К2	МС (Ε8Ι) [Μ+Να]⁺
33	н	трет-бутоксикарбонилметил	1049,33
34	пропокси	трет-бутоксикарбонилметил	1107,33
35	пропокси	1 -(Е)-пент-2-енил	1061,36
36	пропокси	1 -(Е)-4,4,4-трифторбут-2-енил	1101,25
37	пропокси	метил	1007,29

Пример	К.1	К.2	МС (Ε5Ι) [Μ+Να]⁺
38	пропокси	3 -метилбут-2-енил	1061,36
39	пропокси	бензил	1083,38
40	пропокси	аллил	1033,37
41	пропокси	пропаргил	1031,25

Пример 42. Получение производного циклического депсипептида по настоящему изобретению.

В смесь циклического депсипептида (пример 5, 200 мг, 0,21 ммоля), иодида натрия (46,5 мг, 0,31 ммоля) и К2СО3 (57,5 мг, 0,41 ммоля) в сухом ацетоне (2 мл) добавляли 3-(хлорметил)-1,5-диметил-1Н

- 39 017735 пиразол (44 мг, 0,31 ммоля) и смесь обрабатывали ультразвуком в течение ночи (температура повышалась до приблизительно 50°С). Реакционную смесь разбавляли дихлорметаном и промывали водой. После высушивания органического слоя над сульфатом натрия растворитель удаляли и полученный остаток очищали ЖХВР (15 см ХогЕах, ацетонитрил/водный буферный раствор ЫН₄ОАс: градиент от 20 до 95%), при этом получали производное циклического депсипептида (пример 5, 90 мг, 40,5%), в котором остаток А6 превращен в О-(1,5-диметил-1Н-пиразол-3-ил)метил-Ь-тирозин. МС (Ε8Ι): 1101,39 [М+Ыа]⁺.

Пример 43. Соединение, в котором остаток А6 заменен на остаток О-(1,5-диметил-1Н-пиразол-3ил)метил-Ь-тирозин, получали при обработке по аналогичной методике циклического депсипептида формулы ΙΙ. МС (Ε8Ι): 1059,19 [М+Ыа]⁺.

Пример 44. Получение производного циклического депсипептида по настоящему изобретению

В раствор циклического депсипептида (пример 33, 17 мг, 0,0165 ммоля) в дихлорметане (2 мл) добавляли трифторуксусную кислоту (845 мкл) и перемешивали при КТ в течение 4 ч. Реакционную смесь разбавляли толуолом и растворитель удаляли в вакууме, при этом получали соответствующую неочищенную кислоту (22,5 мг).

Указанную кислоту (20 мг), трет-бутиловый эфир 8-амино-3,6-диоксаоктановой кислоты (6,81 мг, 0,031 ммоля) и НАТи (15,8 мг, 0,041 ммоля) растворяли в сухом ДМФА (2 мл), добавляли ОГЕРА (11 мкл) и перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь разбавляли ЕЮАс и промывали насыщенным раствором ЫаН8О₄, насыщенным раствором ЫаНСО₃ и солевым раствором. После высушивания органического слоя над сульфатом натрия растворитель удаляли и полученный остаток очищали ЖХВР (15 см /.огНах, ацетонитрил/буферный раствор ЫН₄ОАс: градиент от 20 до 95%), при этом получали указанное в заголовке соединение (7 мг, выход 29%). МС (Ε8Ι): 1194,32 [М+Ыа]⁺.

Трет-бутиловый эфир 8-амино-3,6-диоксаоктановой кислоты.

Трет-бутиловый эфир 8-(9-флуоренилметоксикарбониламино)-3,6-диоксаоктановой кислоты (100 мг, 0,226 ммоля) в сухом ДМФА (1 мл) обрабатывали пиперидином (89,5 мкл, 0,862 ммоля) при КТ в течение 3 ч. Растворитель упаривали и остаток очищали хроматографией на силикагеле (градиент циклогексан/ЕЮАс/ЕЮАс/МеОН (1:1) + 3% МеОН), при этом получали указанное в заголовке соединение (12 мг, 24%). МС (Ε8Ι): 220,08 [М+Н]⁺.

Трет-бутиловый эфир 8-(9-флуоренилметоксикарбониламино)-3,6-диоксаоктановой кислоты.

Раствор 8-(9-флуоренилметоксикарбониламино)-3,6-диоксаоктановой кислоты (150 мг, 0,389 ммоля), изобутилен (546 мг, 9,73 ммоля) и 95-98% Н₂8О₄ (4,3 мкл) перемешивали при КТ в течение 3 сут. Реакционную смесь разбавляли дихлорметаном и промывали насыщенным раствором бикарбоната натрия. После высушивания органического слоя над сульфатом натрия растворитель удаляли и полученный остаток очищали хроматографией на силикагеле (градиент циклогексан/ЕЮАс), при этом получали указанное в заголовке соединение (145 мг, 84,4%). МС (Ε8Ι): 464,12 [М+Ыа]⁺.

Пример 45. Получение производного циклического депсипептида по настоящему изобретению.

В смесь соединения (пример 41, 101 мг, 0,1 ммоль) и Ει,ιΙ (40 мг) в смеси толуол/ДМФА (11 мл, 10:1) добавляли ОШРА (50 л) и 1М раствор 1-азидо-2-[2-(2-азидоэтокси)этокси]этана (1 мл), перемеши

- 40 017735 вали при 45°С в течение 6 ч. Затем реакционную смесь промывали насыщенным водным раствором ЫаН₂РО₄, сушили над сульфатом натрия и растворитель упаривали. Полученный остаток очищали хроматографией (81О₂, циклогексан/ЕЮАс (1:1) + 20% МеОН), при этом получали указанное в заголовке соединение (14 мг, 11,7%). МС (ЕМ): 1231.34 [Μ+Να]⁺.

Пример 46. Получение производного циклического депсипептида по настоящему изобретению.

Раствор депсипептида формулы II (25 мг) в воде (25 мл) перемешивали при КТ. В этом растворе по данным анализа ЖХВР идентифицирован дополнительный пик, который соответствует соединению, образующемуся в равновесии с депсипептидом формулы (II). Через 20 сут раствор лиофилизировали и дополнительный пик выделяли методом обращенно-фазовой хроматографии, как описано в примере 1, при этом получали циклический депсипептид (пример 46, 0,75 мг), в котором Айр превращен в 5гидроксипролин.

МС (ЕМ): положит.иониз.: т/ζ 951,5 (Μ+Ν), отриц.иониз : т/ζ 927,4 (М-Н), ММ моноизотопа 928,5, С46Н72НА2.

Ή ЯМР (600 МГц, й₆-ДМСО) 5_Н: 0,00 (1Н, т), 0,50 (3Н, ΐ, I 7,3 Гц), 0,71 (3Н, т), 0,76 (3Н, ΐ, I 7,0 Гц), 0,76 (3Н, й, I 7,3 Гц), 0,85 (6Н, й, I 6,6 Гц), 0,88 (1Н, т), 1,00 (1Н, т), 1,03 (3Н, й, I 6,6 Гц), 1,06 (6Н, й, I 6,6 Гц), 1,10 (1Н,т), 1,16 (1Н, т), 1,26 (1Н, т), 1,36 (1Н, т), 1,43 (1Н, т), 1,51 (2Н, т), 1,79 (1Н, т), 1,83 (1Н, т), 1,97 (1Н, т), 1,99 (1Н, т). 2,17 (2Н, ΐ, I 7,7 Гц), 2,39 (1Н, т), 2,48 (1Н, т), 2,67 (3Н, з), 2,78 (1Н, т), 3,43 (1Н, т), 4,32 (1Н, т), 4,33 (1Н, т), 4,45 (1Н, т), 4,48 (1Н, т), 4,58 (1Н, т), 4,61 (1Н, т), 4,67 (1Н, т), 5,09 (1Н, т), 5,47 (1Н, т), 6,66 (2Н, й, I 8,1 Гц), 6,74 (1Н, ушир.з), 7,03 (2Н, й, I 8,1 Гц), 7,31 (1Н, ушир.з), 7,33 (1Н, й, I 9,5 Гц), 8,04 (1Н, й, I 9,5 Гц), 8,17 (1Н, й, I 8,1 Гц), 8,23 (1Н, й, I 2,9 Гц), 8,43 (1Н, й, й 9,5 Гц), 9,25 (1Н, ушир.з), (сигнал ОН-группы гидроксипролина отсутствует).

Пример 47. Получение производного циклического депсипептида по настоящему изобретению.

Раствор депсипептида формулы II (100 мг) в 0,5н. НС1 (25 мл) перемешивали при 50°С в течение 24

ч. Величину рН реакционной смеси доводили до 7 при добавлении 5н. NаОН и смесь экстрагировали этилацетатом. Органический слой сушили над сульфатом натрия и растворитель удаляли в вакууме. Полученный остаток очищали обращенно-фазовой хроматографией (аналогичные условия, как описано в примере 1), при этом получали циклический депсипептид (пример 47, 17 мг), в котором остаток глутамина в А1 заменен на остаток глутаминовой кислоты.

МС (ЕМ): положит.иониз.: т/ζ 952,8 (Μ+Ν), отриц.иониз.: т/ζ 928,5 (М-Н), ММ моноизотопа 929,5, С^Нт^тОв.

Ή ЯМР (600 МГц, й6-ДМСО) 5н: -ОД 1 (3Н, й, I 6,6 Гц), 0,64 (4Н, т), 0,77 (3Н, й, I 6,6 Гц), 0,81 (3Н, ΐ, I 7,3 Гц), 0,84 (3Н, й, I 6,6 Гц), 0,88 (3Н, й, I 6,6 Гц), 1,02 (6Н, т), 1,05 (1Н, т), 1,10 (1Н, т), 1,19 (3Н, й, I 5,9 Гц), 1,24 (1Н, т), 1,40 (1Н, т), 1,51 (1Н, т), 1,75 (1Н, т), 1,78 (5Н, т), 1,85 (2Н, т), 2,10 (2Н, т), 2,45 (1Н, т), 2,60 (1Н, т), 2,67 (1Н, т), 2,71 (3Н, з), 3,20 (1Н, т), 4,28 (1Н, т), 4,29 (1Н, т), 4,44 (2Н, т), 4,63 (1Н, й, I 9,5 Гц), 4,69 (1Н, т), 4,93 (1Н, т), 5,04 (1Н, т), 5,47 (1Н, т), 6,24 (1Н, ушир.з), 6,64 (2Н, й, I 8,8 Гц), 6,99 (2Н, й, I 8,8 Гц), 7,37 (1Н, й, I 9,5 Гц), 7,69 (1Н, й, I 9,5 Гц), 7,80 (1Н, й, I 9,5 Гц), 8,51 (1Н, й, й 8,8 Гц), 8,57 (1Н, й, й 5,1 Гц), сигнал ОН-группы тирозина и глутаминовой кислоты отсутствует).

В настоящем изобретении также предлагаются:

1. Циклический депсипептид или его производное формулы (I)

А₃ А—А— А₆

X—А—А:--О---А₇ ¹² (I)

- 41 017735 где сложноэфирная связь расположена между карбоксигруппой А₇ и гидроксигруппой А₂, где X и А₁ каждый независимо является необязательным, и где

X обозначает любой остаток

А₁ обозначает стандартную аминокислоту, которая не является аспарагиновой кислотой,

А2 обозначает треонин или серии,

А3 обозначает неосновную стандартную аминокислоту или ее неосновное производное,

А4 обозначает Айр, дегидро-АНР, пролин или его производное,

А5 обозначает изолейцин или валин,

А6 обозначает тирозин или его производное,

А7 обозначает лейцин, изолейцин или валин, или фармацевтически приемлемая соль циклического депсипептида или ее производное.

2. Циклический депсипептид или его производное по п.1, где атом азота в амидной связи между А₅и А₆ замещен метилом.

3. Циклический депсипептид или его производное по любому из п.1 или 2, где X обозначает Н или ацильный остаток.

4. Циклический депсипептид или его производное по любому из пп.1-3, где X обозначает СН3СН2СН(СН3)СО, (СН3)2СНСН2СО или (СН3)2СНСО.

5. Циклический депсипептид или его производное по любому из пп.1-4, где А₁ обозначает глутамин.

6. Циклический депсипептид или его производное по любому из пп.1-5, где А₂ обозначает треонин.

7. Циклический депсипептид или его производное по любому из пп.1-6, где А₃ обозначает лейцин.

8. Циклический депсипептид или его производное по любому из пп.1-7, где А₆ обозначает тирозин.

9. Циклический депсипептид или его производное по любому из пп.1-8, где А₄ обозначает Айр, производное 3-амино-2-пиперидона.

10. Циклический депсипептид или его производное по любому из п.п.1-4, где X обозначает (СН3)2СНСО,

А₁ обозначает глутамин,

А2 обозначает треонин,

А3 обозначает лейцин,

А4 обозначает АНР или его производное,

А5 обозначает изолейцин или валин,

А6 обозначает тирозин или его производное,

А7 обозначает изолейцин или валин.

11. Циклический депсипептид или его производное по любому из п.п.1-4, где X обозначает СН3СН2СН(СН3)СО,

А₁ обозначает глутамин,

А₂ обозначает треонин,

А₃ обозначает лейцин,

А4 обозначает АНР или его производное,

А5 обозначает изолейцин,

А6 обозначает тирозин или его производное,

А7 обозначает изолейцин.

12. Циклический депсипептид или его производное по любому из п.п.1-4, где X обозначает СН3СН2СН(СН3)СО,

А1 обозначает глутамин,

А2 обозначает треонин,

А3 обозначает лейцин,

А4 обозначает дегидро-АНР или его производное,

А₅ обозначает изолейцин,

А₆ обозначает тирозин или его производное,

А7 обозначает изолейцин.

13. Циклический депсипептид или его производное по любому из пп.1-4, где X обозначает (СН3)2СНСН2СО,

А1 обозначает глутамин,

А2 обозначает треонин,

А3 обозначает лейцин,

А5 обозначает изолейцин,

А₆ обозначает тирозин или его производное,

А₇ обозначает изолейцин.

14. Циклический депсипептид или его производное формулы (Ι)

- 42 017735

А--^А4--^А5~4-6 ΐ I

X—А—А---О---А₇ где сложноэфирная связь расположена между карбоксигруппой А7 и гидроксигруппой А2, и где X обозначает (СН₃)₂СНСН₂СО,

А₁ обозначает глутамин,

А₂ обозначает треонин,

А3 обозначает лейцин,

А₄ обозначает Айр или пролин или его производное,

А5 обозначает фенилаланин,

А6 обозначает тирозин или его производное,

А7 обозначает валин, или фармацевтически приемлемая соль циклического депсипептида или ее производное.

15. Циклический депсипептид или его производное по п.14, где X обозначает (СН₃)₂СНСН₂СО,

А₁ обозначает глутамин,

А2 обозначает треонин,

А3 обозначает лейцин,

А₄ обозначает Айр или его производное,

А5 обозначает фенилаланин,

А6 обозначает тирозин или его производное,

А7 обозначает валин.

16. Циклический депсипептид или его производное по п.14, где X обозначает (СН₃)₂СНСН₂СО,

А1 обозначает глутамин,

А2 обозначает треонин,

А₃ обозначает лейцин,

А4 обозначает пролин или его производное,

А5 обозначает фенилаланин,

А6 обозначает тирозин или его производное,

А7 обозначает валин.

17. Циклический депсипептид или его производное по п.14, где атом азота в амидной связи между А5 и А6 замещен метилом.

18. Циклический депсипептид или его производное по любому из пп.1-17, где А₁, А₂, А₃, А₅, А₆ и А₇обозначают Ь-аминокислоты.

19. Циклический депсипептид или его производное по любому из пп.1-18, где А₄ обозначает (3З,6К)-Айр.

20. Циклический депсипептид или его производное по любому из пп.1-19 для применения в качестве лекарственного средства.

21. Циклический депсипептид или его производное по любому из пп.1-21 для применения в качестве лекарственного средства, предназначенного для лечения рака, прежде всего рака яичников, или для лечения воспалительных и/или гиперпролиферативных и зудящих кожных заболеваний, таких как келоидные рубцы, гипертрофические рубцы, угри, атопический дерматит, псориаз, пустулезный псориаз, розовые угри, синдром Незертона или других зудящих дерматозов, таких как узелковая почесуха, неспецифический зуд у людей пожилого возраста, а также других заболеваний, связанных с дисфункцией эпителиального барьера, таких как старческая кожа, воспалительное заболевание кишечника и болезнь Крона, а также панкреатит или рак, прежде всего рак яичников.

22. Фармацевтическая композиция, включающая циклический депсипептид или его производное по любому из пп.1-19.

23. Способ лечения субъекта, страдающего от воспалительных и/или гиперпролиферативных и зудящих кожных заболеваний, таких как келоидные рубцы, гипертрофические рубцы, угри, атопический дерматит, псориаз, пустулезный псориаз, розовые угри, синдром Незертона или других зудящих дерматозов, таких как узелковая почесуха, неспецифический зуд у людей пожилого возраста, а также других заболеваний, связанных с дисфункцией эпителиального барьера, таких как старческая кожа, воспалительное заболевание кишечника и болезнь Крона, а также панкреатит или рак, прежде всего рак яичников, и указанный способ заключается во введении указанному субъекту терапевтически эффективного количества циклического депсипептида или его производного по любому из пп.1-20.

24. Способ продуцирования циклического депсипептида или его производного по любому из пп.119, который заключается в культивировании штамма Сйоибготусек, его вариантов или мутантных форм в пригодной среде, и необязательно способ химической модификации полученного таким образом циклического депсипептида.

25. Способ продуцирования циклического депсипептида или его производного по любому из пп.119, который заключается в экспрессии генов биосинтеза штамма Сйоибготусек, его вариантов или мутантных форм в гетерологическом микробном штамме-хозяине, и необязательно способ химической мо

- 43 017735 дификации полученного таким образом циклического депсипептида.

26. Способ по п.24 или 25, где штамм обозначает Сйоп0гошусе8 сгосаШ8 (Э8М 19329) или Сйопбгошусе8 гоЬи8Ш8 (Э8М 19330).

27. Выделенный микроорганизм Сйоηά^ошусе8, продуцирующий циклический депсипептид или его производное по любому из пп.1-19, депонированный в коллекции Э8М под номером Э8М 19329 или Э8М 19330.

28. Циклический депсипептид или его производное, продуцированный выделенным микроорганизмом Сйоηά^ошусе8 по п.27 или полученный способом по пп.24-26.

29. Способ получения производного циклического депсипептида или его производного по п.1, который включает следующие варианты:

б) получение производного циклического депсипептида или его производного по п.1, где А4 обозначает

ΝΗ при обработке соединения, где А₄ обозначает Мо

в) получение производного циклического депсипептида или его производного по п.1, где А4 обозначает

г) получение производного циклического депсипептида или его производного по п.1, где А4 обозначает при обработке соединения, где А₄ обозначает

замещенным или незамещенным спиртом и органической или неорганической кислотой или кислотой Льюиса при температуре от -78 до 150°С.

- 44 017735

Список литературы [Войе НВ, 7едде1 В, 811акотекк1 В, \Уеп2е1 8С, Ке1сйелЬасй Н, Мй11ег К] 8(его1й Ьюкул(йеЫк ίη ргокагуо(ек: |йеп(й1са(1оп о£ шухоЬас(епа1 к(его1йк апй с1отпд о£ (йе £1гк( Ьас(епа1 2,з(8)-ох|йокс|иа1епе сус1аке £гот (йе шухоЬас(епиш 8йдша(е11а аигалйаса. Мо1 М1сгоЬю1 47:471-481, (200з).

[Эак 8К, М1кйга АК, Ттйа11 ВЕ Катеу РА, 8(аскеЬгапй( Е] ОхЫайол £о (й|оки1£а(е Ьу а лете Ьас(егшт, Вокеа (ЫоохМалк (к(гат ВЕ42) дел. лоу., кр. лоу.: Ала1ук1к о£ рйу1оделу Ьакей оп сйето(ахопоту апй 168 пЬокоша1 ЭХА кедиелстд. Ы( I 8ук( Вас(епо1 46:981-987, (1996).

|О|сйопагу о£ №(ига1 Ргойис(к] Эюйолагу о£ №(ига1 ргойис(к ол СЭ-КОМ, уегкюл 15.2, 2007, Натрел Эа(а кегу1сек й(й. (2007).

[Э8М7] Эекспрйол о£ Ью1одюа1 пкк дгоир £о Сйолйгошусек кйатк ауайаЫе ол (йе тееЬк1(е ййр://тетете.йкш2.йе/, (2007).

|Оег(й К, Ргайе11 А, Рег1оуа О, и др.] МухоЬас(епа: ргойслеп( ргойисегк £о лоуе1 па(ига1 ргойис(к тейй уапоик Ыо1од1са1 асЙуШек - рак( алй £и(иге Ыо(есйпо1од1са1 акрес(к тейй (йе £осик ол (йе делик 8огапдшш. 1 Вю(есйло1 106:2зз-25з, (200з). [Напккол й, Васктап А, Νγ А, Ей1илй М, Екйо1ш Е, Екк(гапй Натшагк(гош В, Тоте11 1, \¥а11Ьгапй( Р, \¥еппЬо Н, Еде1гий Т] Ер1йегта1 оуегехргеккюл о£ к(га(ит сотеит сйушойурйс епгуте т ш1се: а тойе1 £ог сйгол1с йсйу йегтаййк. I Й1уек( Эегта(о1 118:444-449, (2002).

ЦкЫйа К, Ма(кийа Н, Мигакаш1 М, Υатадисй^ К] Тйе АЬко1и(е 8(егеосйет1к(гу о£ шюгорерйл 90. Те(гайейгол 1еКегк з7:51-52. (1996).

ЦасоЫ СА, Ке1сйелЬаск Н, Ттйа11 ВЕ 8(аскеЬгапй( Е] Салй1йа(ик сотйапк, а ЬаЫепиш йутд т сосийиге те1(й Сйолйготусек сгоса(ик (МухоЬас(епа). Ы( I 8ук( Вас(епо1 46:119-122, (1996).

ЦасоЫ СА, Аккшик В, КетйелЬасй Н, 8(аскеЬгапй( Е] Мо1еси1аг еуМелсе £ог аккоЫайол Ье(теееп (йе 8рйтдоЬас(епиш-йке огдашкт Салй1йа(ик сотйапк алй (йе шухоЬас(епит Сйолйготусек сгоса(ик. Арр1 Елуйол М1сгоЫо1 6з:719-72з, (1997).

Цапкеп К, Килке В, КетйелЬасй Н, Ноа£1е О] Тйе ащйагой А апй В, лоуе1 1косйгошаполек £гош Сйолйгошусек сгоса(ик (МухоЬас(епа): ЕоЫйол апй к(гис(иге еЫЫйайол. Еиг 1 Огд Сйет 2002:917-921, (2002).

[Ка1кег Ώ] Соирйлд се11 тоуетеп( (о ши1(1се11и1аг йеуе1ортеп( т шухоЬас(епа.

№(иге Кеу1етек М1соЫо1 1:45-54, (200з).

|Кипге В, 1апкеп К, 8акке Р, и др.] СйолйгатМек А ~ Э, лете апй&лда1 апй су(ок(аОс йерлрербйек £гош Сйолйготусек сгоса(ик (МухоЬас(епа): Ргойисйоп, рйук1сосйеш1са1 алй Ыо1од1са1 ргорегйек. 1 АпйЫойск 48:1262-1266, (1995).

[йа 8со1а В, Ма11е( М-Ν, Опшол( РАЭ, Каои1( Ό] Вокеа елеае кр. лоу., Вокеа шаккШелЫк кр. лоу. апй Вокеа уекйткп кр. лоу., 1ко1а(ей £гош йокрйа1 теа(ег киррйек, алй ешелйа(1ол о£ (йе делик Вокеа (Эак и др. 1996). Ы( I 8ук( Еуо1 М1сгоЫо1 5з:15-20, (200з).

| йее АΥ, 8ш1(ка ТЛ, Волщикйал К, С1агйу I] А(ош1с к(гис(иге о£ (йе (гуркт-А90720А сошр1ех: а ил1£1ей арргоасй (о к(гис(иге апй Ылсйол. Сйеш1к(гу & Вю1оду 1:11з- 117,(1994).

[Ма(ет и, 8сй1еЬегдег С, Ыакостс 8, \¥ескеккег 1, 8сйик ОЕ] Втйтд к(гис(иге о£ е1ак(аке тЫЬйог ксур(ойл А. Сйеш1к(гу & Вю1оду 10:997-1001, (200з).

[Кай1й 8, и др.] Мо1еси1аг алй Ыосйеш1са1 к(ий1ек о£ сйолйгатМе £огтайол - Ыдй1у су(о(ох1с ла(ига1 ргойис(к £гош Сйолйгошусек сгоса(ик Сш с5. Сйеш & Вю1 14:667-681,(2006).

[КоиЫател й, Раийл й, 8иоша1ател 8, Нуйател Н, Вшкеша ^, Наке1кот К, 81уолел К] Оелек елсойтд £ог кул(йе(акек о£ сусйс йерйреййек, апайаепорербййек, т АлаЬаела кйат 90. Мо1еси1аг М1сгоЫо1оду з7:156-167, (2000).

[Уакйорои1ок Υ, Согк МЦ Мигрйу К, и др.] Оелейс аккоЫайол Ье(тееел ал ААСС ткегйол т (йе з’ИТК о£ (йе к(га(иш сотеиш сйушойурйс ел/уше деле алй а(орю йегтаййк. 1 Ыуек( Эегта(о1 12з:62-66, (2004).

Claims

ФОРМУЛЛ ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Циклический депсипептид, характеризующийся формулой (I) ^Аз ^АГ“^АГ~ |б

X—А—А;--О---А₇ ^{12 1} т где сложноэфирная связь образуется между карбоксигруппой Л₇ и гидроксигруппой А₂, где ацильный остаток X обозначает СН_зСН₂СН(СН_з)СО или (СН_з)₂СНСО,

А₁ обозначает глутамин, глутаминовую кислоту или их производные,

А2 обозначает треонин,

Аз обозначает лейцин,

А₄ обозначает Айр, з-аминопиперидин-2-он, пролин, 5-гидроксипролин или его производное,

Л5 обозначает изолейцин,

А₆ обозначает тирозин, Ν-Ме-тирозин или его производное,

Л₇ обозначает изолейцин или валин, предпочтительно изолейцин, или его фармацевтически приемлемая соль.

- 45 017735
2. Депсипептид по п.1, где атом азота амидной связи между А₅ и А₆ замещен метилом, а группа ОН в остатке тирозина обозначает ОК, где К выбирают из группы, включающей водород, Ц-С^алкил, С₂-С1₂алкенил, С₂-С1₂алкинил, галоген(С1-С1₂)алкил, галоген(С₂-С1₂)алкенил, галоген(С₂-С1₂)алкинил, С₁-С₁₂алкоксикарбонил, С1-С12алкоксикарбонил(С1-С12)алкил, С1-С12алкиламинокарбонил, незамещенный или дополнительно замещенный арилом, арилалкилом, арилалкенилом или арилалкинилом, гетероциклилом и гетероциклилалкилом.
3. Циклический депсипептид по любому из предшествующих пунктов, где Α₁ обозначает глутаминовую кислоту или ее производное и указанный депсипептид выбирают из нитрила глутамина, сложного эфира глутаминовой кислоты, такого как С1-С1₂алкиловый эфир (например, метиловый эфир глутаминовой кислоты) или С₆-С₂₄ариловый эфир (например, фениловый или бензиловый эфир глутаминовой кислоты).
4. Депсипептид по п.1, который обозначает соединение формулы А или В где Χ и Α1 имеют значения, определенные в п.1, и где

К2 обозначает боковую цепь треонина,

К3 обозначает боковую цепь лейцина,

К5 обозначает боковую цепь изолейцина,

К6 обозначает боковую цепь тирозина, необязательно модифицированного, прежде всего необязательно модифицированного по гидроксильной группе, по п.2,

К7 обозначает боковую цепь изолейцина или валина, прежде всего К7 обозначает боковую цепь изолейцина,

Υ обозначает водород или метил, прежде всего Υ обозначает метил.
5. Циклический депсипептид по п.4, где Χ обозначает (СН3)2СНСО.
6. Циклический депсипептид по п.4, где К7 обозначает боковую цепь изолейцина.
7. Циклический депсипептид по любому из предшествующих пунктов, где Αμ Α₂, Α₃, Α₅, Α₆ и А₇обозначают Б-аминокислоты.

Α1ρ.
8. Циклический депсипептид по любому из предшествующих пунктов, где А₄ обозначает (38,6К)

9. Циклический депсипептид по любому из предшествующих пунктов, выбранный из

Формула (II)

Формула (IV)

Формула (III)

Формула (XIV)

Формула (V)

Пример 46

- 46 017735

Пример 47 где Я выбирают из следующих групп:

Пример К 6 1-октил 7 2,2,2-трифторэтил 8 2-пропил 9 бензил 10 ЭТИЛ И 1-бутил 12 изобутил 13 2-метоксиэтил 14 2-гидроксиэтил 15 2-(2-гидроксиэтокси)этил 16 2-(2-метоксиэтокси)этил 17 метил 18 пропаргил

где Я и Я2 выбирают из следующих групп:

Пример К, К2 19 1-пропил 20 метил

где Я1 выбирают из следующих групп:

- 47 017735 где Я3 выбирают из следующих групп:

Пример КЗ 27 изобутил 28 2-метоксиэтил 29 ЭТИЛ 30 31 1-октил

где Я1 и Я4 выбирают из следующих групп:

Пример К1 К4 33 н трет-бутоксикарбонилметил 34 пропокси трет-бутоксикарбонилметил 35 пропокси 1-(Е)-пент- 2-енил 36 пропокси 1-(Е)-4,4,4-трифторбут-2-енил 37 пропокси метил

Пример К1 К4 38 пропокси 3 -метилбут-2-енил 39 пропокси бензил 40 пропокси аллил 41 пропокси пропаргил

10. Фармацевтическая композиция, обладающая ингибирующей активностью калликреин-7, включающая терапевтически эффективное количество циклического депсипептида по любому из предшествующих пунктов в смеси с фармацевтически приемлемым носителем и/или ингредиентом.
11. Применение циклического депсипептида по любому из пп.1-9 для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения воспалительных и/или гиперпролиферативных и зудящих кожных заболеваний, таких как келоидные рубцы, гипертрофические рубцы, угри, атопический дерматит, псориаз, пустулезный псориаз, розовые угри, синдром Незертона, или от других зудящих дерматозов, таких как узелковая почесуха, неспецифический зуд у людей пожилого возраста, а также других заболеваний с дисфункцией эпителиального барьера, таких как старческая кожа, воспалительное заболевание

- 48 017735 кишечника и болезнь Крона, а также панкреатит или рак, прежде всего рак яичников, муковисцидоз (МВ), хронического обструктивного заболевания легких (ХОЗЛ), фиброза легких, респираторного дистресс-синдрома взрослых, хронического бронхита, наследственной эмфиземы, ревматоидного артрита, воспалительного заболевания кишечника, псориаза или астмы.
12. Способ лечения субъекта, страдающего от воспалительных и/или гиперпролиферативных и зудящих кожных заболеваний, таких как келоидные рубцы, гипертрофические рубцы, угри, атопический дерматит, псориаз, пустулезный псориаз, розовые угри, синдром Незертона, или от других зудящих дерматозов, таких как узелковая почесуха, неспецифический зуд у людей пожилого возраста, а также других заболеваний с дисфункцией эпителиального барьера, таких как старческая кожа, воспалительное заболевание кишечника и болезнь Крона, а также панкреатит или рак, прежде всего рак яичников, муковисцидоз (МВ), хроническое обструктивное заболевание легких (ХОЗЛ), фиброз легких, респираторный дистресс-синдром взрослых, хронический бронхит, наследственная эмфизема, ревматоидный артрит, воспалительное заболевание кишечника, псориаз, астма, и указанный способ заключается во введении указанному субъекту терапевтически эффективного количества циклического депсипептида по любому из пп.19.
13. Способ лечения субъекта по п.12, где субъект страдает от келоидных рубцов, гипертрофических рубцов, угрей, атопического дерматита, псориаза, пустулезного псориаза, розовых угрей, синдрома Незертона или других зудящих дерматозов, таких как узелковая почесуха, неспецифический зуд у людей пожилого возраста, а также других заболеваний с дисфункцией эпителиального барьера, таких как старческая кожа, воспалительное заболевание кишечника и болезнь Крона, а также панкреатит или рак, прежде всего рак яичников.
14. Способ лечения субъекта по п.13, где субъект страдает от келоидных рубцов, гипертрофических рубцов, угрей, атопического дерматита, псориаза, пустулезного псориаза, розовых угрей, синдрома Незертона, или других зудящих дерматозов, таких как узелковая почесуха, неспецифический зуд у людей пожилого возраста, а также других заболеваний с дисфункцией эпителиального барьера, такой как старческая кожа.
15. Способ лечения субъекта по п.12, где субъект страдает от муковисцидоза (МВ), хронического обструктивного заболевания легких (ХОЗЛ), фиброза легких, респираторного дистресс-синдрома взрослых, хронического бронхита, наследственной эмфиземы, ревматоидного артрита, воспалительного заболевания кишечника, псориаза, астмы.
16. Применение циклического депсипептида по любому из пп.1-9 для лечения воспалительных и/или гиперпролиферативных и зудящих кожных заболеваний, таких как келоидные рубцы, гипертрофические рубцы, угри, атопический дерматит, псориаз, пустулезный псориаз, розовые угри, синдром Незертона, или других зудящих дерматозов, таких как узелковая почесуха, неспецифический зуд у людей пожилого возраста, а также других заболеваний с дисфункцией эпителиального барьера, таких как старческая кожа, воспалительное заболевание кишечника и болезнь Крона, а также панкреатит или рак, прежде всего рак яичников, муковисцидоз (МВ), хроническое обструктивное заболевание легких (ХОЗЛ), фиброз легких, респираторный дистресс-синдром взрослых, хронический бронхит, наследственная эмфизема, ревматоидный артрит, воспалительное заболевание кишечника, псориаз и астма.
17. Применение по п.16 для лечения келоидных рубцов, гипертрофических рубцов, угрей, атопического дерматита, псориаза, пустулезного псориаза, розовых угрей, синдрома Незертона или других зудящих дерматозов, таких как узелковая почесуха, неспецифический зуд у людей пожилого возраста, а также других заболеваний с дисфункцией эпителиального барьера, таких как старческая кожа, воспалительное заболевание кишечника и болезнь Крона, а также панкреатит или рак, прежде всего рак яичников.
18. Применение по п.17 для лечения келоидных рубцов, гипертрофических рубцов, угрей, атопического дерматита, псориаза, пустулезного псориаза, розовых угрей, синдрома Незертона или других зудящих дерматозов, таких как узелковая почесуха, неспецифический зуд у людей пожилого возраста, а также других заболеваний с дисфункцией эпителиального барьера, таких как старческая кожа.
19. Применение по п.16 для лечения муковисцидоза (МВ), хронического обструктивного заболевания легких (ХОЗЛ), фиброза легких, респираторного дистресс-синдрома взрослых, хронического бронхита, наследственной эмфиземы, ревматоидного артрита, воспалительного заболевания кишечника, псориаза, астмы.
20. Способ по пп.12-15, где лечение проводят местным или системным способом, в виде кремов, мазей и суппозиториев, или пероральным, или подкожным, или внутривенным способом или ингаляцией, соответственно.
21. Применение по пп.16-19, где лечение проводят местным или системным способом, в виде кремов, мазей и суппозиториев, или пероральным, или подкожным, или внутривенным способом или ингаляцией, соответственно.
22. Способ продуцирования циклического депсипептида или его производного по любому из пп.1-9, который заключается в культивировании штамма Сйопбготусез, его вариантов или мутантных форм в пригодной среде и, необязательно, химической модификации полученного таким образом циклического

- 49 017735 депсипептида.
23. Способ продуцирования циклического депсипептида или его производного по любому из пп.1-9, который заключается в экспрессии генов биосинтеза штамма Сйопбготусез, его вариантов или мутантных форм в гетерологическом микробном штамме-хозяине и, необязательно, химической модификации полученного таким образом циклического депсипептида.
24. Способ по п.22 или 23, где штамм обозначает Сйопбготусез сгосаШз (Ό8Μ 19329).
25. Выделенный штамм микроорганизма Сйопбготусез, продуцирующий циклический депсипептид или его производное по любому из пп.1-9, депонированный в коллекции Ώ8Μ под номером Ώ8Μ 19329.
26. Циклический депсипептид или его производное, продуцированный выделенным штаммом микроорганизма Сйопбготусез по п.25 или полученный способом по пп.22, 23.
27. Способ получения производного циклического депсипептида, характеризующийся формулой (Ι) по п.1, который включает обработку соединения

А₃ А—А—1₆

X—А~А;---О---Л₇ где А₁-А₃, А₅-А₇, X указаны в п.1, а А₄ обозначает органической или неорганической кислотой или кислотой Льюиса при температуре от -78 до 150°С, с получением соединения формулы (Ι) ^А} ^А~А—|б

X Ат— А:---О----А₇ ^{1 2 7} (О.

где А₄ обозначает

ΝΗ
28. Способ получения производного циклического депсипептида, характеризующийся формулой (Ι) по п.1, который включает обработку соединения где А₁-А₃, А₅-А₇, X указаны в п.1, а А₄ обозначает молекулярным водородом или его источником в присутствии катализатора в растворителе при температуре от -50 до 100°С, с получением соединения формулы (Ι) где А4 обозначает
29. Способ получения производного циклического депсипептида, характеризующийся формулой (Ι) по п.1, который включает обработку соединения где А₁-А₃, А₅-А₇, X указаны в п.1, а А₄ обозначает органической или неорганической кислотой или кислотой Льюиса в присутствии восстанавливающего агента при температуре от -78 до 150°С, с получением соединения формулы (Ι)

- 50 017735 где А₄ обозначает
30. Способ получения производного циклического депсипептида, характеризующийся формулой (Ι) по п.1, который включает обработку соединения где А₅-А₇, X указаны в п.1, а А₄ обозначает замещенным или незамещенным спиртом и органической или неорганической кислотой или кислотой Льюиса при температуре от -78 до 150°С, с получением соединения формулы (Ι) где А4 обозначает
31. Способ получения производного циклического депсипептида, характеризующийся формулой (Ι) по п.1, который включает обработку соединения где Аг-А^ А₅-А₇, X указаны в п.1, а А₁ обозначает О1п или Азп и А₄ обозначает где К предпочтительно обозначает Н, алкил, замещенный алкил, замещенным или незамещенным спиртом и органической или неорганической кислотой или кислотой Льюиса в присутствии или в отсутствие растворителя при температуре от -78 до 150°С, с получением соединения формулы (Ι) где А1 обозначает где п равно 2 и А₄ обозначает где К предпочтительно обозначает Н, алкил, замещенный алкил.
32. Способ получения производного циклического депсипептида, характеризующийся формулой (Ι)

- 51 017735 по п.1, который включает обработку соединения где А₂-А₃, А₅-А₇, X указаны в п.1, а А₁ обозначает С1п или Азп и А₄ обозначает дегидратирующим агентом в присутствии или отсутствие растворителя при температуре от -78 до 150°С, с получением соединения формулы (I) где А₁ обозначает где К предпочтительно обозначает Н, ОН, О-алкил, замещенный О-алкил, О-ацил.
33. Способ получения производного циклического депсипептида, характеризующийся формулой (I) по п.1, который включает обработку соединения где А₁-А₃, А₅, А₇, X указаны в п.1, а А₄ обозначает и А₆ обозначает Туг, алкилирующим агентом или ацилирующим агентом в присутствии или в отсутствие растворителя при температуре от -78 до 150°С, с получением соединения формулы (I) где А4 обозначает и А6 обозначает где К предпочтительно обозначает алкил, замещенный алкил, ацил, алкоксикарбонил.