JPH1036284A

JPH1036284A - プロテアソーム阻害剤

Info

Publication number: JPH1036284A
Application number: JP8214209A
Authority: JP
Inventors: Shinichi Kojima; 深一小島; Akira Ito; 彰伊藤; Hiroshi Nakayama; 宏中山
Original assignee: Sumitomo Pharmaceuticals Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Pharmaceuticals Co Ltd
Priority date: 1996-07-24
Filing date: 1996-07-24
Publication date: 1998-02-10

Abstract

(57)【要約】（修正有）【解決手段】下記式（Ｉ）〔式中、Ｒ^１は、アシル基、又はアミノ基の保護基を表
し、Ｒ^２は、水素原子又は水酸基を表し、Ｒ^３は、ｎ−
プロピル基、イソプロプル基、ｎ−ブチル基、イソブチ
ル基又はｓｅｃ−ブチル基を表し、Ｒ^４は、アルデヒド
基、又は保護されたアルデヒド基を表わす。〕で表され
る化合物よりなるプロテアソーム阻害剤、およびこれを
有効成分とする自己免疫疾患治療剤、炎症性腸炎疾患治
療剤、喘息治療剤。【効果】上記のプロテアソーム阻害剤を用いれば、自己
免疫疾患、炎症、神経細胞変性疾患等を抑制することが
できる。従って、この製剤は、自己免疫疾患、炎症、神
経細胞変性等にかかわる疾患（例えば、慢性関節炎リウ
マチ、炎症性腸炎疾患、喘息、アルツハイマー病等）の
治療に有効である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本件発明は、プロテアソーム
阻害剤、およびそれを含有することを特徴とする自己免
疫疾患、炎症性腸炎疾患、喘息などの治療剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】プロテアソームは、最初、沈降係数２０
Ｓの触媒ユニットとして発見され、多機能性プロテアー
ゼと呼ばれていたが、現在ではプロテアソームの名前が
定着している。プロテアソームの構造は、特徴的な構造
を持つ巨大な多成分複合体である。例えば、２６Ｓプロ
テアソームは、触媒ユニットである２０Ｓプロテアソー
ム（円筒型分子）の両端にＵ字型の調整ユニットが会合
した分子量約２００万のダンベル型分子であり、真核生
物のＡＴＰ依存性プロテアーゼであることが明らかにさ
れている（組織培養, 22, 75-105 (1996))。近年、プロ
テアソームが、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１等の炎症性サイト
カインの転写調節因子ＮＦ−ｋＢの活性化に重要な役割
を担っていることが明らかになってきている（Vito J.
Palombella, et al., Cell, 78, 773-785 (1994)、Dimi
trisThanos, et al., Cell, 80, 529-532 (1995))。こ
のように、プロテアソームが細胞の増殖や免疫系をはじ
めとする生命現象と深く関連している多くの蛋白質の分
解制御に重要な役割を果たしていることが明確になって
きた。

【０００３】一方で、このプロテアソームに対する阻害
剤の研究も進められており、例えば、有効なプロテアソ
ーム阻害剤として、Ｚ−ＩＥ（ＯＢｕ^t) ＡＬ−Ｈ（以
後、ＰＳＩと略す）が作られ、ＮＦ−ｋＢの活性化を阻
害することが見出されている。また、Ｚ−ＬＬＬ−Ｈが
作られ、内在性抗原のプロセッシングや前駆体ＮＦ−ｋ
Ｂの成熟型への転換を阻害するとともに、ＮＧＦ（nerv
e growth factor)と同等以上の神経突起伸長効果を有す
ることが認められている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、新規
なプロテアソーム阻害剤を提供するとともに、それを有
効成分として含有する、自己免疫疾患治療剤、炎症性腸
疾患治療剤、および喘息治療剤を提供するものである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、プロテア
ソーム阻害剤を探索する目的で微生物代謝産物をスクリ
ーニングして来たが、ある種のカビ（ＦＥＲＭＰ−１
５７３７) の代謝産物の一つである、トリペプチド誘導
体が特異的にプロテアソームを阻害することを見出し
た。このトリペプチド誘導体は、構造解析研究の結果、
特開平１−２７９８９９号公報及びテトラヘドロン、４
７巻、８５２９〜８５３４頁（１９９１年）に記載の抗
腫瘍ペプチド（フェルタマイドＢ）と同一化合物である
ことが明らかとなった。さらに、本発明者らは、本化合
物の機能を評価し、プロテアソーム阻害活性以外にも、
ＴＮＦ−α阻害活性（自己免疫疾患の抑制機能を果た
す）、神経細胞突起伸展活性（神経の損傷に係わる神経
変性疾患を治癒すると考えられる）、神経細胞死の抑制
活性（神経細胞死を伴う神経変性疾患を治癒すると考え
られる）等があることを明らかにするとともに、これら
の事実に基づき更に研究を重ねて、本発明を完成するに
至った。特に、本発明のトリペプチド化合物は、公知
のプロテアソーム阻害剤と比較して、薬剤の有効濃度範
囲が広く、より有効性が高いものであることが明らかと
なった。

【０００６】即ち、本発明の要旨は、（１）一般式（１）

【０００７】

【化２】

【０００８】〔式中、Ｒ¹は、アシル基、又はアミノ基
の保護基を表し、Ｒ²は、水素原子又は水酸基を表し、
Ｒ³は、ｎ−プロピル基、イソプロプル基、ｎ−ブチル
基、イソブチル基又はｓｅｃ−ブチル基を表し、Ｒ
⁴は、アルデヒド基、又は保護されたアルデヒド基を表
わす。〕で表される化合物よりなるプロテアソーム阻害
剤、（２）一般式（１）において、下記により規定される
ものである前記（１）記載のプロテアソーム阻害剤、Ｒ¹＝アシル基、又はアミノ基の保護基Ｒ²＝水素原子Ｒ³＝イソブチル基Ｒ⁴＝アルデヒド基（３）前記（１）又は（２）において記載の一般式
（１）で表される化合物を有効成分とする自己免疫疾患
治療剤、（４）自己免疫疾患が慢性関節炎リウマチである前記
（３）記載の治療剤、（５）前記（１）又は（２）において記載の一般式
（１）で表される化合物を有効成分とする炎症性腸炎疾
患治療剤、（６）前記（１）又は（２）において記載の一般式
（１）で表される化合物を有効成分とする喘息治療剤、
に関する。

【０００９】

【発明の実施の形態】以下に、本発明を詳細に説明す
る。本発明のプロテアソーム阻害剤は、一般式（１）で
表される化合物よりなるものである。

【００１０】

【化３】

【００１１】〔式中、Ｒ¹は、アシル基、又はアミノ基
の保護基を表し、Ｒ²は、水素原子又は水酸基を表し、
Ｒ³は、ｎ−プロピル基、イソプロプル基、ｎ−ブチル
基、又はｓｅｃ−ブチル基を表し、Ｒ⁴は、アルデヒド
基、又は保護されたアルデヒド基を表わす。〕

【００１２】ここで、Ｒ¹におけるアシル基とは、置換
されていてもよい、脂肪族アシル基又は芳香族アシル基
を表し、脂肪族アシル基とは、炭素数２から３０の直鎖
状、分枝状あるいは環状のものを表し、具体的には、ア
セチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル
基、バレリル基、ドデカノイル基などが挙げられる。芳
香族アシル基としては、ベンゾイル基、ベンジルカルボ
ニル基、フエネチイルカルボニル基、ナフチイルカルボ
ニル基、ナフチイルメチイルカルボニル基等が挙げられ
る。ここで、置換基としては、一つまたはそれ以上のも
ので置換されていてよいが、具体的には水酸基、アミノ
基、ニトロ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、メト
キシ基，エトキシ基等のアルコキシ基などが挙げられ
る。

【００１３】Ｒ¹におけるアミノ基の保護基としては、
通常使用されるものを用いることができるが、好ましく
は、ベンジルオキシカルボニル基（カルボベンゾキシ
基）、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル基、ｔ−ブ
チルオキシカルボニル基等が挙げられる。なお、Ｒ¹の
好適なものとしては、ベンジルオキシカルボニル基（カ
ルボベンゾキシ基）、−ＣＯＣＨ₂−ＣＨ（ＯＨ）−
（ＣＨ₂）₈−ＣＨ₃、アセチル基、４−フェニルブチ
リイル基等が挙げられる。

【００１４】本発明における一般式（１）のトリペプチ
ド化合物は、そのＰ３部位が公知のトリペプチドからな
るプロテアソーム阻害剤ではロイシン残基であるのに対
し、アスパラギン残基であるという構造上の特徴を有す
る。

【００１５】一般式（１）において、好適な化合物とし
て下記により規定されるものが挙げられる。Ｒ¹＝アシル基、又はアミノ基の保護基Ｒ²＝水素原子Ｒ³＝イソブチル基Ｒ⁴＝アルデヒド基なかでも、Ｒ¹がベンジルオキシカルボニル基（カルボ
ベンゾキシ基）、−ＣＯＣＨ₂−ＣＨ（ＯＨ）−（ＣＨ
₂）₈−ＣＨ₃、４−フェニルブチリイル基などが好ま
しい。即ち、カルボベンゾキシ−Ｌ−アスパラギニル−
Ｌ−グルタミニル−ロイシナール、３−（Ｒ）−ヒドロ
キシドデカノイル−Ｌ−アスパラギニル−Ｌ−グルタミ
ニル−ロイシナールなどが好適例として挙げられる。

【００１６】本発明における一般式（１）で表される化
合物を製造するには、常法により合成することができ
る。また、３−（Ｒ）−ヒドロキシドデカノイル−Ｌ−
アスパラギニル−Ｌ−グルタミニル−ロイシナールは、
Emericella variecolor の培養物から単離・精製して得
ることもできる。本明細書において、該化合物を＃１２
４０−ＰＩＡ１と表示する。

【００１７】以下にEmericella variecolor （エメリセ
ラ・バリエカラー）の培養により＃１２４０−ＰＩＡ１
を一例として本発明の化合物を製造する方法について述
べる。Emericella variecolor としては、例えばEmeric
ella variecolor ＃１２４０株を使用することができ
る。この株は、米国内で採集された土壌試料より分離さ
れたもので工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲ
ＭＰ−１５７３７として寄託されている。本菌株の菌
学的性質を以下に述べる。

【００１８】（ａ）形態的性質本菌株は、麦芽エキス寒天培地、ポテト・グルコース寒
天培地、オートミール寒天培地等で良好に生育し、２７
℃、１０〜２０日間の培養でテレオモルフとしての子の
う果およびアナモルフとしての分生子果の形成が認めら
れる。子のう果は表在性から一部潜在性でコロニー表面
に散在し、灰紫色から灰オリーブ色、直径約１５０〜２
５０μｍであり、その外側は直径約１５〜２０μｍの厚
壁細胞で覆われている。子のう胞子はレンズ形、赤紫色
で胞子本体の直径２．５〜３μｍ、厚さ２〜２．５μ
ｍ、レンズ面は滑面、赤道面に２枚の隆起を生じ、各隆
起からは長さ２．５〜３μｍの７〜８個の突起を生じる
ため胞子全体としては特徴ある星形の外観を呈す。分生
子頭は放射状、緑色からオリーブ色の外観を呈し、分生
子柄は長さ６０〜１５０μｍ、頂のうは亜球状からフラ
スコ状、フィアライドは１〜２列、分生子は球形から亜
球形で直径２〜２．５μｍ、表面は平滑である。

【００１９】（ｂ）培養的性質各種培地上で２７℃、１４日間培養した本菌株の観察結
果を表１に示す。

【００２０】

【表１】

【００２１】（ｃ）生理学的性質最適生育条件：ｐＨ６〜８（麦芽エキスブロス）、
温度２５〜３０℃（ポテト・グルコース寒天培地）生育の範囲：ｐＨ２〜９（麦芽エキスブロス）、温
度９〜３７℃（ポテト・グルコース寒天培地）

【００２２】以上の菌学的性質は、文献（堀江：日菌報
２１，４８３−４９３，１９８０）記載の不整子のう菌
類Emericella variecolor の性質とよく一致する。

【００２３】本発明化合物の＃１２４０−ＰＩＡ１は、
後述の製造例１に示した方法によりEmericella varieco
lor の培養液から単離・精製して得ることができる。得
られた＃１２４０−ＰＩＡ１について構造解析を実施し
た結果、本化合物は公知のフェルタマイドＢ（（Ｒ）−
ヒドロキシドデカノイル−Ｌ−アスパラギニル−Ｌ−グ
ルタミニル−ロイシナール；シゲモリ他、テトラヘドロ
ン、４７巻、８５２９〜８５３４頁、１９９１年）と同
定されている。

【００２４】本発明のプロテアソーム阻害剤は、前記の
一般式（１）で表される化合物よりなるものであり、本
明細書において、プロテアソーム阻害剤の有するプロテ
アソーム阻害作用とは、プロテアソームの蛋白質（高分
子量）分解活性、およびペプチド（低分子量）分解活性
を言う。

【００２５】また、本発明における一般式（１）で表さ
れる化合物は、プロテアソームの阻害作用を有すること
から、プロテアソームに起因すると考えられる種々の疾
患の治療剤として用いることができる。プロテアソーム
に起因すると考えられている種々の疾患としては、自己
免疫疾患、炎症、神経細胞変性疾患等が挙げられ、より
具体的には、特に慢性関節炎リウマチ、炎症性腸炎疾
患、喘息、アルツハイマー病等を挙げることができる。
さらに、本発明における一般式（１）で表される化合物
は、ＴＮＦ−αに対する阻害活性、神経細胞突起伸展活
性、神経細胞死の抑制活性を有している。従って、本発
明における自己免疫疾患、炎症、神経細胞変性疾患等の
抑制作用は、プロテアソーム阻害活性と共に、これらの
ＴＮＦ−αに対する阻害活性、神経細胞突起伸展活性、
神経細胞死の抑制活性等によっても確認することができ
る。

【００２６】本発明のプロテアソーム阻害剤は、自己免
疫疾患、炎症、神経細胞変性疾患等に由来する慢性関節
炎リウマチ、炎症性腸炎疾患、喘息、アルツハイマー病
等の治療剤として経口的又は非経口的に投与することが
できる。すなわち、通常用いられる投与形態、例えば錠
剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤等として経口投与するこ
とができ、あるいは液剤、乳剤、懸濁液剤、リポソーム
剤などとして筋肉内注射又は皮下注射することができ、
また、坐剤として直腸投与することもできる。このよう
な剤形は、医薬として許容される通常の担体、賦型剤、
結合剤、安定剤、緩衝剤、溶解補助剤、等張剤等と本発
明の有効成分を配合することにより製造することができ
る。投与量、投与回数は、患者の症状、症歴、年齢、体
重、投与形態等によって異なるが、例えば成人に経口投
与する場合、通常、１日当たり５〜５００mg、好ましく
は１０〜１００mgの範囲で適宜調節して、１回又は数回
に分けて投与することができる。

【００２７】

【実施例】以下、製造例および実施例により本発明をさ
らに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例などに
よりなんら限定されるものではない。

【００２８】製造例１３−（Ｒ）−ヒドロキシドデカノイル−Ｌ−アスパラギ
ニル−Ｌ−グルタミニル−ロイシナール（＃１２４０−
ＰＩＡ１）の製造（１）エメリセラ・バリエカラー＃１２４０株をグルコ
ース３％、可溶性デンプン２％、大豆粉２％、ポリペプ
トン０．３％、肉エキス０．３％、酵母エキス０．３
％、リン酸１カリ０．０５％の組成からなる液体培地１
００ｍｌを入れた５００ｍｌ容の坂口フラスコ３３本お
よび同様の液体培地４００ｍｌを入れた２リットル容の
坂口フラスコ８本に接種し、２７℃で７日間浸透培養し
た。

【００２９】（２）得られた培養液６．５リットルを４
℃、１００００ｒｐｍで２０分間高速遠心し、培養上清
６リットルを得た。この上清液をダイヤイオンＨＰ−２
０（三菱化学工業社製）０．５リットルを充填したカラ
ムに通液し吸着させた。溶出液としてメタノール水溶液
を使用しメタノール濃度を段階的に増加させ溶出させ
た。８０％メタノールおよび１００％メタノールで溶出
させた画分を集め減圧濃縮し５９０ｍｇの黄色粉末を得
た。この粉末に１．５リットルの水および１．５リット
ルの酢酸エチルエステルを加え抽出した。酢酸エチルエ
ステル抽出液を減圧濃縮し１９０ｍｇの黄色粉末を得
た。この粉末を１０ｍｌのメタノールに溶解し、クロロ
ホルム−メタノール（３：１）の混合溶媒で平衡化させ
たシリカゲル（メルク社製）３００ｍｌを充填したカラ
ムに吸着させた後に、同一の混合溶媒を用いて溶出させ
た。プロテアソーム阻害活性画分を集め減圧濃縮し白色
粉末を得た。この粉末を少量のジメチルスルフォキシド
に溶解し、２０％メタノールで平衡化させた逆相系高速
液体クロマト用ＯＤＳカラム（山村化学社製、直径２０
ｍｍ、長さ２５０ｍｍ）に通液吸着させた後に、流速１
０ｍｌ／ｍｉｎでメタノール濃度を増加させ溶出させ
た。プロテアソーム阻害活性画分を集め減圧濃縮し３５
ｍｇの白色粉末を得た。この粉末を少量のジメチルスル
フォキシドに溶解し、２０％アセトニトリルで平衡化さ
せた逆相系高速液体クロマト用ＯＤＳカラム（山村化学
社製、直径２０ｍｍ、長さ２５０ｍｍ）に通液吸着させ
た後に、流速１０ｍｌ／ｍｉｎでアセトニトリル濃度を
増加させ溶出させた。プロテアソーム阻害活性画分を集
め減圧濃縮し、３−（Ｒ）−ヒドロキシドデカノイル−
Ｌ−アスパラギニル−Ｌ−グルタミニル−ロイシナール
の白色粉末９ｍｇを得た。なお、本実験におけるプロテ
アソーム阻害活性画分の取得は、実施例１に記載の方法
によりプロテアソーム阻害活性を検出することにより行
った。

【００３０】得られた３−（Ｒ）−ヒドロキシドデカノ
イル−Ｌ−アスパラギニル−Ｌ−グルタミニル−ロイシ
ナール（＃１２４０−ＰＩＡ１）の構造解析データを以
下に示す。（１）質量分析値：陽イオンＦＡＢＭＳスペクトル：ｍ／ｚ５５６（Ｍ＋
Ｈ）⁺ 陰イオンＦＡＢＭＳスペクトル：ｍ／ｚ５５４（Ｍ＋
Ｈ）^- （２）高分解能ＦＡＢＭＳ：（Ｍ＋Ｈ）ｍ／ｚ実測値：５５６．３７００Ｃ₂₇Ｈ₅₀Ｎ₅Ｏ₇として計算値：５５６．３７１３（３）〔α〕_D ²⁵ −２１．５° （ｃ＝０．２９、メ
タノール溶液）

【００３１】（４）¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル：重ジメチ
ルスルフォキシド（ｄ₆−ＤＭＳＯ）中、５００ＭＨｚ
で測定したスペクトルを図２に示す。（５）¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトル：重ジメチルスルフォキ
シド（ｄ₆−ＤＭＳＯ）中、１２５ＭＨｚで測定したス
ペクトルを図３に示す。

【００３２】製造例２カルボベンゾキシ−Ｌ−アスパラギニル−Ｌ−グルタミ
ニル−ロイシナールの製造ａ）Ｂｏｃ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−ｏｌの調製Ｌ−ロイシノール５．０ｇ（４２．７ｍｍｏｌ）をジメ
チルホルムアミド３０ｍｌに溶解し、氷冷下に１−ヒド
ロキシベンゾトリアゾール７．８４ｇ（５１．２ｍｍｏ
ｌ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）−カルボジイミド９．８２ｇ（５１．２ｍｍｏｌ）
を加えた。次いで、Ｂｏｃ−Ｇｌｎ−ＯＨ１１．６０
ｇ（４６．９ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド溶液５
０ｍｌを滴下して加えた後、氷冷下で３０分、室温で
１．５時間攪拌した。反応液を濃縮したのち酢酸エチル
で抽出し、１Ｎ−塩酸、飽和重曹水、飽和食塩水で洗浄
後、硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤を濾去後、濾
液を濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（シリカゲ
ル５００ｇ、クロロホルム−メタノール１５：１）によ
って精製して表題化合物８．８６ｇを得た。¹ Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ、ＣＤ₃ＯＤ）δ４．０２
〜３．９５（２Ｈ，ｍ），δ３．４７〜３．４４（２
Ｈ，ｍ），δ１．４５（９Ｈ，ｓ），δ０．９１（６
Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），ＳＩ−ＭＳｍ／ｅ３４６
（Ｍ＋Ｈ⁺)

【００３３】ｂ）Ｚ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−ｏｌの
調製（ａ）の化合物１ｇ（２．９０ｍｍｏｌ）をアセトニト
リル２０ｍｌに懸濁し、氷冷下メタンスルホン酸２．２
２ｇ（２３．２ｍｍｏｌ）を滴下したのち、室温で２時
間攪拌した。再び氷冷し、ジメチルホルムアミド２０ｍ
ｌを滴下し、さらにトリエチルアミン２．０５ｇ（２
０．３ｍｍｏｌ）を滴下した。続いて、１−ヒドロキシ
ベンゾトリアゾール５４８ｍｇ（４．０６ｍｍｏｌ）、
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カ
ルボジイミド７７８ｍｇ（４．０６ｍｍｏｌ）を加え、
さらにＺ−Ａｓｎ−ＯＨ９２６ｍｇ（３．４８ｍｍｏ
ｌ）のジメチルホルムアミド溶液１０ｍｌを滴下して加
えた後、氷冷下で３０分、室温で２時間攪拌した。反応
液に水１５０ｍｌを加えて攪拌した後、濃縮し、逆相ク
ロマトグラフィー（カラム：ＹＭＣ−ＯＤＳ３０ｍｍ
φ×２５０ｍｍ、１５〜３０μｍ；流速：７ｍｌ／ｍ
ｌ；検出波長：２２０ｎｍ；溶出液：（Ａ）水−０．１
％トリフルオロ酢酸、（Ｂ）アセトニトリル−０．１％
トリフルオロ酢酸；グラジェント：（Ｂ）０％→（６０
分）２０％→（２４０分）３５％）によって精製して表
題化合物４０１ｍｇを得た。¹ Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ₆)δ７．３
８〜７．２５（５Ｈ，ｍ），δ７．２３（１Ｈ，ｂ
ｓ），δ７．０２（１Ｈ，ｂｓ），δ６．７４（１Ｈ，
ｂｓ），δ５．０１（２Ｈ，ｓ），δ４．０８〜３．９
３（３Ｈ，ｍ），δ３．３２〜３．１５（２Ｈ，ｍ），
δ０．８６（６Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．５，１０．９Ｈｚ）
ＳＩ−ＭＳｍ／ｅ４９４（Ｍ＋Ｈ⁺)

【００３４】ｃ）Ｚ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−ａｌの
調製（ｂ）の化合物７５ｍｇ（０．１５ｍｍｏｌ）を乾燥し
たジメチルスルホキシド３ｍｌに溶解し、氷冷下、トリ
エチルアミン１０６μｌ（０．７６ｍｍｏｌ）および三
酸化硫黄−ピリジン錯体１２１ｍｇ（０．７６ｍｍｏ
ｌ）のジメチルスルホキシド溶液３ｍｌを加え、室温で
２０分攪拌した。反応液を氷水１０ｍｌに注いで濃縮
後、ゲル濾過クロマトグラフィー（カラム：セファデッ
クスＧ−１０，１５ｍｍφ×３３０ｍｍ）、ついで逆相
クロマトグラフィー（カラム：ＹＭＣ−ＯＤＳ３０ｍ
ｍφ×２５０ｍｍ，１５〜３０μｍ；流速：７ｍｌ／ｍ
ｌ；検出波長：２２０ｎｍ；溶出液：（Ａ）水−０．１
％トリフルオロ酢酸、（Ｂ）アセトニトリル−０．１％
トリフルオロ酢酸；グラジェント：（Ｂ）０％→（６０
分）１５％→（２４０分）３０％）によって精製して表
題化合物３．１ｍｇを得た。¹ Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ₆)δ９．４
３（１Ｈ，ｓ），δ８．３８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．３Ｈ
ｚ），δ７．４２〜７．２５（５Ｈ，ｍ），δ７．０６
（１Ｈ，ｂｓ），δ６．７８（１Ｈ，ｂｓ），δ５．０
１（２Ｈ，ｓ），δ４．１８〜３．９３（３Ｈ，ｍ），
δ０．８７（６Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．２，１０．３Ｈｚ）
ＳＩ−ＭＳｍ／ｅ４９２（Ｍ＋Ｈ⁺)

【００３５】実施例１＃１２４０−ＰＩＡ１、およびカルボベンゾキシ−Ｌ−
アスパラギニル−Ｌ−グルタミニル−ロイシナールのプ
ロテアソーム阻害活性プロテアソームはラット脳組織より公知の方法（コジマ
他、ＦＥＢＳ、３０４巻、５７〜６０頁、１９９２年）
により精製した酵素溶液を使用した。具体的にはラット
脳組織に５倍量の０．１ＭＨＥＰＥＳバッファー（ｐ
Ｈ７．２５）を加え、氷冷下ホモゲナイズ抽出した溶液
を４００００Ｇで冷却下３０分高速遠心し上清を酵素粗
精製液として得た。酵素粗精製液１３０ｍｌを２０ｍＭ
トリス塩酸バッファー（ｐＨ７．５）で平衡化した陰イ
オン交換樹脂ＥＭＤ−ＤＥＡＥを充填したカラムに通液
しプロテアソームを吸着させた。樹脂に吸着したプロテ
アソームを塩化ナトリウム濃度を増加させることにより
溶出させた。プロテアソームは塩化ナトリウム濃度約
０．５Ｍで溶出した。プロテアソーム阻害活性を測定す
るための基質としてＳｕｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−
Ｔｙｒ−ＭＣＡ（ペプチド研究所社製）を用いた。

【００３６】被験化合物として、製造例１で得られた＃
１２４０−ＰＩＡ１、および製造例２により合成したカ
ルボベンゾキシ−Ｌ−アスパラギニル−Ｌ−グルタミニ
ル−ロイシナールを用いた。１μｌのＤＭＳＯに溶解し
た各化合物に０．１ＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ
７．２５）で調製した２０μＭのＳｕｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅ
ｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＭＣＡ溶液５０μｌを添加した
後、プロテアソーム溶液５０μｌを加え３７℃で１時間
インキュベートした。遊離したアミノメチルクマリンの
蛍光強度をＥｘ３５５ｎｍ、Ｅｍ４６０ｎｍで測定し
た。化合物を添加しない場合の蛍光強度を１００として
プロテアソームの活性を５０％阻害する化合物の量（Ｉ
Ｃ₅₀）を算出した。その結果を表２に示す。

【００３７】

【表２】

【００３８】実施例２＃１２４０−ＰＩＡ１のＴＮＦ−α阻害作用ヒト血管内皮細胞ＨＵＶＥＣ細胞（クラボウ社製）を使
用し、ＴＮＦ−αで処理した際に発現するＥ−セレクチ
ンの発現量を測定することによりＴＮＦ−α阻害活性を
アッセイした。

【００３９】ＨＵＶＥＣ細胞をトリプシン処理によりフ
ラスコから剥離し、細胞をヒト血管内皮細胞増殖用低血
清液体培地（クラボウ社製）で約４００００細胞／ｍｌ
に希釈した。細胞希釈液を組織培養用９６穴培養プレー
ト（Ｆａｌｃｏｎ社製）に１００μｌ／ウエルとなるよ
うにまき込んだ後、＃１２４０−ＰＩＡ１の溶液を最終
濃度０から２０μｇ／ｍｌになるように加え、ＣＯ₂イ
ンキュベーター内（５％ＣＯ₂）で３７℃で培養した。
１時間後、リコンビナントヒトＴＮＦ−α（ギブコ社
製）を３０ｐｇ／ｍｌになるように添加し４時間培養
後、細胞を０．１％グルタルアルデヒド溶液で固定し
た。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０添加ＰＢＳ（−）（以
下、Ｔ−ＰＢＳと略す）で一回洗浄後、ＰＢＳ（−）で
５０００倍に希釈したＥ−セレクチン抗体（Ｓｅｒｏｔ
ｅｃ社製）を５０μｌ／ウエルになるように添加したあ
と、３７℃で１．５時間反応を行った。反応後、Ｔ−Ｐ
ＢＳで１回洗浄を行った後、ＰＢＳ（−）で１０００倍
に希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体
（Kirkegaard & Perry Laboratories 社製）を５０μｌ
／ウエルとなるように添加した後、３７℃で１時間反応
を行った。反応後、Ｔ−ＰＢＳで２回洗浄を行った後、
3,3',5,5' −tetramethylbenzidine溶液（Kirkegaard &
Perry Laboratories 社製）を１００μｌ／ウエルとな
るように添加して、遮光下で１０分間反応させた後、１
Ｍリン酸溶液を１００μｌ／ウエルとなるように添加し
て反応を停止させた。各吸光度はマイクロプレートリー
ダーを用いて、波長５７０ｎｍで測定を行った。なお、
ＴＮＦ−α阻害活性は薬剤を添加しない場合のＥ−セレ
クチンの発現量を１００として換算した。その結果、＃
１２４０−ＰＩＡ１は濃度依存的にＴＮＦ−α阻害作用
を示し、最終濃度１０μｇ／ｍｌで５０％阻害を示し
た。

【００４０】実施例３＃１２４０−ＰＩＡ１の神経突起伸展作用神経突起伸展作用の活性測定にはラット褐色細胞ＰＣ１
２細胞（大日本製薬社製）を使用した。ラット褐色細胞
ＰＣ１２細胞を１０％非働化ウシ胎児血清（ギブコ社
製）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ギブコ社製）
に接種し、ラット尾腱コラーゲンで処理した７５ｃｍ²
培養フラスコ (ベクトンデッキンソン社製) を用いてＣ
Ｏ₂インキュベーター内（５％ＣＯ₂）で、３７℃で１
日から５日間間隔で継代培養した。

【００４１】次いで、ラット褐色細胞ＰＣ１２細胞をト
リプシン処理によりフラスコから剥離し、遠心し細胞を
集めた。細胞を１％非働化ウシ胎児血清（ギブコ社製）
を含むＲＰＭＩ−１６４０培地（ギブコ社製）で約１０
０００細胞／ｍｌに希釈した。細胞希釈液１００μｌを
ラット尾腱コラーゲンで処理した９６穴培養プレート
（岩城硝子社製）の穴に入れ、＃１２４０−ＰＩＡ１の
溶液を最終濃度０から１２５０ｎｇ／ｍｌになるように
加えＣＯ₂インキュベーター内（５％ＣＯ₂）で３７℃
で２日間培養した。比較対照として神経栄養因子ＮＧＦ
を用い最終濃度５０ｎｇ／ｍｌになるように細胞に加え
同様に培養した。２日後、位相差顕微鏡を用いて細胞の
形態を観察し神経突起伸展作用の活性測定を実施した。
判定基準として神経突起が細胞体の長さより長く、しか
もほとんどの細胞が神経突起を保有している場合を神経
突起が伸展したと見なした。その結果、＃１２４０−Ｐ
ＩＡ１は最終濃度５０ｎｇ／ｍｌ以上の濃度でＮＧＦ５
０ｎｇ／ｍｌとほぼ同等の強い神経突起伸展作用を示し
た。

【００４２】また、公知のカルボベンゾキシ−Ｌ−ロイ
シル−Ｌ−ロイシル−ロイシナール（ペプチド研究所社
製）について同様に実験を行ったところ、２００ｎｇ／
ｍｌ以上の濃度で細胞毒性が観察されたが、＃１２４０
−ＰＩＡ１の細胞毒性は弱く、１２５０ｎｇ／ｍｌ以上
の濃度で細胞毒性が観察された。以上のごとく、本発明
化合物の有効濃度範囲はより広いことが認められた（表
３）。

【００４３】

【表３】

【００４４】実施例４＃１２４０−ＰＩＡ１による神経細胞死抑制作用（１）神経細胞の培養エスディー系ラット胎仔（妊娠２１日令）の上頚神経節
を摘出し、血管・脂肪組織を取り除いた後、１ｍｇ／ｍ
ｌのコラゲナーゼ含有Ｌ１５培地中で３７℃、３０分間
処理した。コラゲナーゼ含有Ｌ１５培地を除去し、新鮮
なＬ１５培地を加えた。この操作を３回繰り返すことで
コラゲナーゼを洗い去った後、ピペッティングにより単
細胞懸濁液を調製した。これをＡＭ１００培地（１０％
非働化ウシ胎仔血清、１００ｎｇ／ｍｌのＮＧＦを含む
ＭＥＭ（Gibco 社製））で約３０００細胞／１００μＬ
となるように希釈した。これをラット尾腱コラーゲンで
コートした９６穴培養プレート（コーニング社製）に、
約３０００細胞／ウェル／１００μＬとなるように播種
し、このプレートをＣＯ₂インキュベータ（５％Ｃ
Ｏ₂、３７℃）内に置き、６〜１０日間培養した。培地
交換は２〜３日毎に行った。

【００４５】（２）神経細胞死の惹起上述の培養後、培地をＡＭＯ培地（１０％非働化ウシ胎
仔血清、０ｎｇ／ｍｌのＮＧＦを含むＭＥＭ（Gibco 社
製））に交換し、同時に終濃度０．５％となるように抗
ＮＧＦ抗血清を添加した。

【００４６】（３）神経細胞死の抑制（２）の方法で神経細胞死を惹起すると同時に、培地に
＃１２４０−ＰＩＡ１を添加した。

【００４７】（４）神経細胞死抑制の検出神経細胞死の確認において生細胞の検出は、位相差顕微
鏡下での形態観察により行った。生細胞は、丸く、大き
く、明位相を示す細胞体及びよく発達した神経突起ネッ
トワークを有するのに対して、死細胞は萎縮した暗位相
細胞体を有し、神経突起ネットワークも崩壊している。
一方、培地からＮＧＦを除去すると同時に３００ｎｇ／
ｍｌの＃１２４０−ＰＩＡ１を添加した場合には、丸
く、大きく、明位相を示す細胞体及びよく発達した神経
突起ネットワークが保持され、細胞死が抑制されること
が示された。

【００４８】（５）神経細胞死抑制の用量依存性＃１２４０−ＰＩＡ１について乳酸脱水素酵素量を細胞
死の指標とする細胞死抑制活性の用量依存性を試験し
た。即ち、細胞質より培地中に漏出した乳酸脱水素酵素
量をジャーナルオブニューロサイエンスメソッド、
２０巻（１９８７年）、８３〜９０頁に記載されたチョ
イ等の方法〔乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）遊離法〕で定量
し、細胞死の指標とした。その結果、図１に示すように
＃１２４０−ＰＩＡ１が用量依存的に細胞死を抑制する
ことが示された。

【００４９】

【発明の効果】本発明のプロテアソーム阻害剤を用いれ
ば、自己免疫疾患、炎症、神経細胞変性疾患等を抑制す
ることができる。従って、本発明の製剤は、自己免疫疾
患、炎症、神経細胞変性等にかかわる疾患（例えば、慢
性関節炎リウマチ、炎症性腸炎疾患、喘息、アルツハイ
マー病等）の治療において有効に利用されうる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ＮＧＦ除去により惹起されるラット胎
仔の上頚神経節の神経細胞死に対する＃１２４０−ＰＩ
Ａ１の抑制効果の用量依存性を示す図である。

【図２】図２は、＃１２４０−ＰＩＡ１の¹Ｈ−ＮＭＲ
スペクトルを示す図である。

【図３】図３は、＃１２４０−ＰＩＡ１の¹³Ｃ−ＮＭＲ
スペクトルを示す図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ０７Ｋ 5/093 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＣＤＣ１２Ｐ 21/02 ＡＣＪ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:645）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】一般式（１）【化１】〔式中、Ｒ¹は、アシル基、又はアミノ基の保護基を表
し、Ｒ²は、水素原子又は水酸基を表し、Ｒ³は、ｎ−
プロピル基、イソプロプル基、ｎ−ブチル基、イソブチ
ル基又はｓｅｃ−ブチル基を表し、Ｒ⁴は、アルデヒド
基、又は保護されたアルデヒド基を表わす。〕で表され
る化合物よりなるプロテアソーム阻害剤。
【請求項２】一般式（１）において、下記により規定
されるものである請求項１記載のプロテアソーム阻害
剤。Ｒ¹＝アシル基、又はアミノ基の保護基Ｒ²＝水素原子Ｒ³＝イソブチル基Ｒ⁴＝アルデヒド基
【請求項３】請求項１又は２において記載の一般式
（１）で表される化合物を有効成分とする自己免疫疾患
治療剤。
【請求項４】自己免疫疾患が慢性関節炎リウマチであ
る請求項３記載の治療剤。
【請求項５】請求項１又は２において記載の一般式
（１）で表される化合物を有効成分とする炎症性腸炎疾
患治療剤。
【請求項６】請求項１又は２において記載の一般式
（１）で表される化合物を有効成分とする喘息治療剤。