JPH07112995A

JPH07112995A - 化合物ｔａｎ−１７１１，その製造法および用途

Info

Publication number: JPH07112995A
Application number: JP5259749A
Authority: JP
Inventors: Yukimasa Nozaki; 幸正野崎; Yasunori Funahashi; 康昇舟橋; Naofumi Ishii; 尚書石井
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1993-10-18
Filing date: 1993-10-18
Publication date: 1995-05-02

Abstract

(57)【要約】【目的】コラゲナーゼ阻害活性、チロシン・カイネー
ス阻害活性及び細胞増殖阻害活性を有する新規化合物Ｔ
ＡＮ−１７１１、その製造法並びに該化合物を含有する
コラゲナーゼ阻害剤及びチロシン・カイネース阻害剤を
提供する。【構成】アスペルギルス属に属する微生物の培養によ
り得られる新規化合物ＴＡＮ−１７１１またはその塩；
アスペルギルス属に属し、化合物ＴＡＮ−１７１１を生
産する能力を有する微生物を培地に培養し、化合物ＴＡ
Ｎ−１７１１を生成蓄積せしめ、これを採取することを
特徴とする化合物ＴＡＮ−１７１１またはその塩の製造
法；及び化合物ＴＡＮ−１７１１またはその塩を含有し
てなるカラゲナーゼ阻害剤及びチロシン・カイネース阻
害剤。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はコラゲナーゼ阻害活性、
チロシン・カイネース阻害活性および細胞増殖阻害活性
を有する新規化合物ＴＡＮ−１７１１(以下、単にＴＡ
Ｎ−１７１１と称することもある)、その製造法および
用途に関する。

【０００２】

【従来の技術】コラゲナーゼは結合組織に存在するコラ
ーゲンを分解する酵素であるが、このうちＩ型コラゲナ
ーゼ(ＭＭＰ１)は主として間質に存在するＩ型コラーゲ
ンを、ＩＶ型コラゲナーゼ(ＭＭＰ２および９)は主とし
て基底膜に存在するＩＶ型コラーゲンを分解することが
知られている。[トレンズ・イン・ジェネティクス(Ｔre
nds in Ｇenetics)、６、１２１(１９９０)／トレン
ズ・イン・バイオテクノロジー(Ｔrends in Ｂiotech
nology)、１０、２００(１９９２)]。一方、種々の病態
においてコラゲナーゼが異常に亢進していることが知ら
れているが、特に癌細胞の浸潤、転移過程や癌増殖に伴
う血管新生においてはＩＶ型コラゲナーゼが重要な役割
を果たしていると考えられている[キャンサー・アンド
・メタスタシス・レビューズ(Ｃancer and Ｍetastas
is Ｒeviews)、９、２８９(１９９０); セル(Ｃell)、
６４、３２７(１９９１)]。

【０００３】低分子性のコラゲナーゼ阻害剤として、コ
ラーゲン基質の分解部位のアナログである数多くの合成
ペプチドが報告されている[プログレス・イン・メディ
シナル・ケミストリー(Ｐrogress in Ｍedicinal Ｃ
hemistry)、２９、２７１(１９９２)]。さらに、微生物
由来のヒドロキサム酸残基含有阻害剤として、アクチノ
ニン(Ａctinonin)[ジャーナル・オブ・アンティビオテ
ィクス(Ｊ.Ａntibiotics)、４０、１７５７(１９８
７)]、ＹＬ−０１８６９Ｐ物質[特許公開公報平３−
１５７３７２]、ＢＥ−１６６２７類[特許公開公報平
３−２２３３００]、マトリスタチン(Ｍatristatin)類
[ジャーナル・オブ・アンティビオティクス(Ｊ.Ａntibi
otics)、４５、１７２３(１９９２)]がある。また、ミ
ノサイクリン[ジャーナル・オブ・ナショナル・キャン
サー・インスティテュート(Ｊ.ＮＣＩ)、７５、５１７
(１９８５)]、アンスラサイクリン[バイオケミカ・エト
・バイオフィジカ・アクタ(Ｂiochimica et ＢioＰhy
sica Ａcta)、１０３５、２１８(１９９０)]、没食子
酸[特許公開公報平４−２９０８１９]、ＳＣ４４４６
３[キャンサー・リサーチ(Ｃancer Ｒesearch)、４
８、３３０７(１９８８)]なども報告されている。

【０００４】一般に、増殖因子やサイトカインによる増
殖刺激は、細胞内ドメインにチロシン・カイネース活性
を有する各々の特異的受容体(レセプター)や内在性のチ
ロシン・カイネースを介して細胞核に伝達されることが
判っている[プログレス・イン・ヌクレイック・アシッ
ド・リサーチ(Ｐrogress in Ｎucleic Ａcid Ｒese
arch)、４４、２０５(１９９３); セル(Ｃell)、６４、
２８１(１９９１)]。また、一部のヒト癌でこれらのチ
ロシン・カイネース活性が異常に亢進していることが報
告されている[サイエンス(Ｓcience)、２４４、７０７
(１９８９); サイエンス(Ｓcience)、２５４、１１４６
(１９９１)]。これまでに報告されたチロシン・カイネ
ース阻害剤として、微生物由来のものではゲニシュタイ
ン(Ｇenistein)、アーブスタチン(Ｅrbstatin)、ラベン
ドゥスチン(Ｌavendustin)、ハービマイシン(Ｈerbimyc
in)などが、植物由来のものではピィセアタノール(Ｐic
eatannol)、エモディン(Ｅmodin)、デスマール(Ｄesma
l)などが、合成化合物としてはティルフォスチン(Ｔyrp
hostin)類、シンナマイド(Ｃinnamide)類、フラボノイ
ド(Ｆlavonoid)類など[ジャーナル・ナチュラル・ブロ
ダクツ(Ｊ.Ｎatural Ｐroducts)、５５、１５２９(１
９９２); アニュアル・レポーツ・イン・メディシナル
・ケミストリー(Ａnual Ｒeports in Ｍedicinal
Ｃhemistry)、２７、１６９(１９９２)]が知られてい
る。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】コラゲナーゼ阻害作用
を有する新規物質を見出すことができれば、従来にない
抗腫瘍作用、転移抑制作用等を有する新しいタイプの抗
癌剤を開発でき、また該新規物質を中間原料としてさら
にコラゲナーゼ阻害作用を示す新規物質の開発が期待さ
れる。

【０００６】

【課題を解決するための手段】このような事情に鑑み、
本発明者らは強力で副作用の少ないＩＶ型コラゲナーゼ
阻害剤を微生物代謝産物の中に求め、後記する方法で鋭
意探索した結果、ＴＡＮ−１７１１と命名した新規化合
物を培養液中より単離することに成功し、これがコラゲ
ナーゼ阻害作用、チロシン・カイネース阻害作用および
細胞増殖阻害作用を有することを見出した。これらの知
見に基づき、さらに検討した結果、本発明を完成するに
至った。

【０００７】すなわち、本発明は、１．次の物理化学的性状を有する化合物ＴＡＮ−１７１
１; (１)分子式: Ｃ₁₈Ｈ₁₄Ｏ₈ (２)紫外部吸収スペクトル: メタノール中、極大値: ２４５±３nm(ε２５,４００±３,０００)、３
０７±３nm (ε２１,７００±２,０００)、３６５±３nm(ε１３,８
００±２,０００) (３)赤外部吸収スペクトル: ＫＢr錠剤、波数、cm^-1 ３３９０、１６３０、１５９０、１４４０、１３４０、
１２９０、１２１０、１１１０、９３０ (４)¹³Ｃ核磁気共鳴スペクトル: ７５ＭＨz、重ジメチ
ルスルフォキシド中、 δppm; １９４.７(ＣＨ)、１９０.１(ＣＨ)、１５１.６
(Ｑ)、１５１.５(Ｑ)、１５０.１(Ｑ)、１４２.３
(Ｑ)、１４０.８(Ｑ)、１３６.４(Ｑ)、１３２.６
(Ｑ)、１２７.６(Ｑ)、１２４.９(Ｑ)、１２２.８
(Ｑ)、１１８.７(Ｑ)、１１７.２(Ｑ)、１１２.６
(Ｑ)、１０９.０(ＣＨ)、１２.７(ＣＨ₃)、１１.０(Ｃ
Ｈ₃)。 (５)性質: 酸性脂溶性またはその塩、２．アスペルギルス属に属し、上記１記載の化合物ＴＡ
Ｎ−１７１１を生産する能力を有する微生物を培地に培
養し、化合物ＴＡＮ−１７１１を生成蓄積せしめ、これ
を採取することを特徴とする化合物ＴＡＮ−１７１１ま
たはその塩の製造法、３．微生物がアスペルギルスエスピーＦＬ−３６８３
１株ＩＦＯ３２５５５; ＦＥＲＭＰ−１３８９７
である上記２記載の製造法、４．上記１記載の化合物ＴＡＮ−１７１１またはその塩
を含有してなるコラゲナーゼ阻害剤、および５．上記１記載の化合物ＴＡＮ−１７１１またはその塩
を含有してなるチロシン・カイネース阻害剤に関する。

【０００８】化合物ＴＡＮ−１７１１はアスペルギルス
(Ａspergillus)属に属する糸状菌によって生産される
が、例えば、ＴＡＮ−１７１１は福井県の土壌から新た
に分離された一菌株ＦＬ−３６８３１によって生産する
ことができる。ＴＡＮ−１７１１生産菌株は以下の性質
を示す。 (a)形態的特徴本菌株ＦＬ−３６８３１は麦芽エキス寒天培地、バレイ
ショ・ブドウ糖寒天培地に良好に生育し、分生子を豊富
に形成する。ツァペック寒天培地に中程度に生育し、分
生子を形成する。菌糸は透明で、隔壁を有している。分
生子柄は気生菌糸から生じ、その表面は滑面で、大きさ
は１００〜１５０×５.０〜７.０μm、やや湾曲し、先
端は肥大して頂のうとなる。頂のうは半球形で、直径１
５〜２０μm、上部１／２より円筒形のメトレを生じ、
その上に瓶型の２〜４本のフィアライド(Ｐhialides)を
着生する。メトレの大きさは３.５〜４.５×１.５〜２.
０μm、フィアライドの表面は滑面で、５〜６×１.０〜
２.０μmである。分生子頭は円筒形ないし緩い放射状
で、８０〜１２０×４５〜７０μmである。分生子は球
形〜亜球形、その表面は平滑、大きさは２.０〜２.５×
１.０〜２.０μmで連鎖を形成する。また、調べた寒天
培地上では菌核の形成は認められなかった。

【０００９】(b)寒天培地上の性状１) 麦芽エキス寒天培地生育は良好で、２４℃、２週間後のコロニーの直径は、
４０〜４５mmであった。表面は大きく盛り上がった羊毛
状の菌糸体よりなり、中央部は陥没し、凹凸状を呈する
が周辺部は薄くなっている。外縁は不規則である。気生
菌糸の発達、分生子の形成は良好である。中央部は灰白
色を呈し、中間部から周辺部は暗黄褐色を呈し、中間部
に多数の褐色の水滴が見られる。裏面は暗褐色ないし暗
黄褐色を呈する。淡黄褐色の可溶性色素の生成が認めら
れる。２) バレイショ・ブドウ糖寒天培地生育は良好で、２４℃、２週間後のコロニーの直径は、
３５〜４０mmであった。表面は盛り上がった羊毛状の菌
糸体よりなり、外縁はやや不規則である。気生菌糸の発
達、分生子の形成は良好である。中央部は黄褐色、中央
部から中間部にかけて暗灰褐色ないし黄褐色を呈し、周
辺部は淡黄白色を呈する。中央部に水滴が認められる。
裏面は暗褐色ないし暗黄褐色を呈する。淡黄色の可溶性
色素の生成が認められる。

【００１０】３) ツァペック寒天培地生育は普通で、２４℃、２週間後のコロニーの直径は、
３４〜３９mmであった。表面は大きく盛り上がったビロ
ード状の菌糸体よりなり、外縁はやや不規則に縁取られ
ている。気生菌糸の発達、分生子の形成は良好である。
中央部は灰白色を呈し、中間部から周辺部にかけて淡黄
褐色ないし黄褐色を呈する。全体に多数の淡褐色の水滴
が認められる。裏面は暗褐色ないし暗黄褐色を呈する。
淡黄色の可溶性色素の生成が認められる。４) オートミル寒天培地生育は普通で、２４℃、２週間後のコロニーの直径は、
５０〜５２mmであった。表面は粉状からビロード状の菌
糸体よりなり、同心円状に拡がり、周辺は薄くなってい
る。外縁は波状で不規則に縁取られている。気生菌糸の
発達、分生子の形成は良好である。中央部は黄褐色でわ
ずかに灰白色のまじりを呈する。中間部は淡黄褐色、周
辺部は灰白色を呈する。裏面は褐色ないし淡黄褐色を呈
する。可溶性色素の生成は認められない。

【００１１】(c)生理学的性状本菌株の生育条件をバレイショ・ブドウ糖寒天培地で調
べると、pＨ３〜pＨ１２のいずれでも生育は良好、生育
温度範囲は１０℃〜４０℃で、２４〜２８℃が至適温度
である。４３℃では生育しない。

【００１２】以上の諸性質を、ディー・マロチ(Ｄ.Ｍal
loch)著、宇田川俊一訳「かびの分離・培養と同定」(昭和
５８年、医歯薬出版株式会社)５１頁記載の同定検索表
と照合すると、本菌は、胞子は１細胞からなり、コロニ
ー、分生子および他の器官は無色または明色で、分生子
柄は頂のうを備え、瓶状のフィアライドを形成すること
から、アスペルギルス属(Ａspergillus)に属することが
明らかであり、本菌をアスペルギルス・エスピー（Ａsp
ergillus sp.）ＦＬ−３６８３１と同定した。本菌株
は、平成５年３月５日に財団法人発酵研究所(ＩＦＯ)に
受託番号ＩＦＯ３２５５５として、また平成５年１０月
７日に工業技術院生命工業技術研究所(ＮＩＤＨ)に、受
託番号ＦＥＲＭＰ−１３８９７としてそれぞれ寄託
されている。

【００１３】本発明の化合物は、これらの菌株に限ら
ず、遺伝子操作技術を含め、自体公知の方法により、そ
れらから誘導される本化合物の生産能を有する変異株を
はじめ、当該生産能を有する微生物を培地中で培養し、
本化合物を培地中に生成蓄積せしめ、それを採取するこ
とにより製造できる。本発明の化合物生産菌の培養に用
いる培地は、該菌が利用し得る栄養源を含むものなら液
状でも固状でもよいが、大量に処理するときに液体培地
を用いるのがより適当である。培地には、当該化合物生
産菌が同化し得る炭素源、窒素源、無機物質、微量栄養
源を適宜配合する。炭素源としては、例えばブドウ糖、
乳糖、ショ糖、麦芽糖、デキストリン、澱粉、グリセリ
ン、マンニトール、ソルビトール、油脂類(例、大豆
油、ラード油、チキン油など)、n−パラフィンなどが、
窒素源としては、例えば、肉エキス、酵母エキス、乾燥
酵母、大豆粉、コーン・スティープ・リカー、ペプト
ン、綿実粉、廃糖蜜、尿素、アンモニウム塩類(例、硫
酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウ
ム、酢酸アンモニウムなど)などを用いる。

【００１４】さらに、ナトリウム、カリウム、カルシウ
ム、マグネシウムなどを含む塩類、鉄、マンガン、亜
鉛、コバルト、ニッケルなどの金属塩類、リン酸、ホウ
酸などの塩類や酢酸、プロピオン酸などの有機酸の塩類
を適宜用いてもよい。その他、アミノ酸(例、グルタミ
ン酸、アスパラギン酸、アラニン、リジン、メチオニ
ン、プロリンなど)、ペプチド(例、ジペプチド、トリペ
プチドなど)、ビタミン類(例、Ｂ₁、Ｂ₂、ニコチン酸、
Ｂ₁₂、Ｃなど)、核酸類(例、プリン、ピリミジン、その
誘導体など)などを含有させてもよい。もちろん、培地
のpＨを調節する目的で無機または有機の酸またはアル
カリ類、緩衝剤などを加え、あるいは消泡の目的で油脂
類、界面活性剤などの適量を添加して差し支えない。液
体培養に際しては、培地のpＨは中性付近、特にpＨ６〜
８が好ましい。培養温度は約２０℃〜３０℃、培養時間
は約４８時間から１６８時間が好ましい。

【００１５】培養の経過に伴って生産されるＴＡＮ−１
７１１の定量はルイス肺癌腫(Ｌewis lung carcinom
a)の腫瘍塊抽出液から硫安塩析、ゼラチン・フアィニテ
ィ・クロマトグラフィーで部分精製した酵素(ＩＶ型コ
ラゲナーゼ、ＭＭＰ９)標品を用いて、ヒト胎盤由来の
ＩＶ型コラーゲンのトリチウム標識化合物(デュポン社
製、０.０１４ＧＢq／mg)を基質として、ステットラー
−スティーブンソンらの方法[Ｓtetler−Ｓtevenson e
t al.、Ｊ.Ｂiol.Ｃhem., ２６４、１３５３(１９８
９)]に従って行った。通常、４〜６日の培養でＴＡＮ−
１７１１の生産量は最高に達する。

【００１６】培養物から目的とする化合物ＴＡＮ−１７
１１を採取する方法を以下に述べる。該化合物は酸性で
脂溶性を示すため、この性質を利用する一般的手段を採
用すればよい。培養物中ＴＡＮ−１７１１は菌体および
濾液中に含まれるので、まず培養液をpＨ２〜７、好ま
しくはpＨ２.５〜４に調製後、水と混和しない有機溶
媒、例えばクロロホルム、酢酸エチル、メチルイソブチ
ルケトンあるいはブタノールなどを加え、１０分〜２０
時間、好ましくは２０分〜４時間撹拌混和し、濾過助剤
を加えて濾過、あるいは遠心分離によって菌体を除去す
る。得られた有機溶媒層を水で洗浄後、濃縮することに
よって、あるいは得られた有機層から適当な塩基性塩、
例えば重曹、炭酸ナトリウムなどの水溶液により水層へ
転溶して有機層と分離後、水層をpＨ２〜７、好ましく
はpＨ２.５〜４に調製し、水と混和しない前述の有機溶
媒で抽出後、抽出液を濃縮するとＴＡＮ−１７１１を含
有する粗物質が得られる。粗物質をさらに精製し、純粋
なＴＡＮ−１７１１を得るには種々のクロマトグラフィ
ー法が有利に用いられる。担体としてはシリカゲル、結
晶セルロース、セファデックスＬＨ−２０(ファルマシ
ア社製、スウェーデン)などが用いられ、これらは通常
カラムクロマトグラフィー法で行なわれる。担体から活
性物質を溶出するには適当な有機溶媒、例えばn−ヘキ
サン、クロロホルム、トルエン、酢酸エチル、ジクロロ
エタン、アセトン、メタノールなどの単独あるいは混合
溶媒が用いられる。

【００１７】また、分取用高速液体クロマトグラフィー
(ＨＰＬＣ)によってもＴＡＮ−１７１１を精製すること
ができる。担体としてはオクタデシルシラン(ＯＤＳ)系
およびシリカゲル系のものが有利に用いられる。例えば
ＯＤＳの場合、メタノールあるいはアセトニトリルと塩
類含有水溶液の混合溶液が有利に用いられる。溶出液を
濃縮、あるいは水溶液の場合は水と混和しない適当な有
機溶媒で抽出し、濃縮すると粗粉末が得られる。粗粉末
を適当な溶媒、例えば石油ベンジン、石油エーテる、n
−ヘキサン、トルエン、ジエチルエーテル、クロロホル
ム、酢酸エチル、エタノール、メタノールあるいはこれ
らの混合液で溶解し、冷所で放置粉末化するとＴＡＮ−
１７１１の精製粉末が得られる。ＴＡＮ−１７１１はそ
の物理化学的性状より、新規化合物である。本発明の化
合物は自体公知の方法によりナトリウム塩、カリウム塩
などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩
などのアルカリ土類金属塩、あるいはエチルアミン塩、
トリエチルアミン塩などの生理学的に許容される有機ア
ミン類との塩などの塩としても得ることができる。

【００１８】次に、ＴＡＮ−１７１１の生物活性につい
て説明する。試験例１ＩＶ型およびＩ型コラゲナーゼ阻害活性試験 [方法]ＩＶ型コラゲナーゼ阻害活性測定法分子量９２キロダルトンのＩＶ型コラゲナーゼ(ＭＭＰ
９)の調製は、エフ・ウメニシ（Ｆ.Ｕmenishi）らの方
法[ジャーナル・オブ・バイオケミストリー(Ｊ.Ｂioche
m), １１０、１８９(１９９１)]を改変して行った。す
なわち、Ｃ５７ＢＬ／６マウス(雌、５週令、チャール
ズリバー社)の腹部皮下に形成せしめたルイス肺癌腫瘍
塊を取り出し、ハサミで細切りした後、５mＭ、ＣaＣl₂
を含む５０mＭトリス塩酸緩衝液(pＨ７.４)[緩衝液Ａ]
を腫瘍塊１gにつき３ml加え、ポリトロンホモジナイザ
ーで氷中にて３０秒間３回ホモジナイズし、１５,００
０×gで１０分間遠心し、上澄液を回収する。硫酸アン
モニウム濃度が２５％〜６０％の間に沈澱してくる画分
を緩衝液Ａにて一晩透析し、１５,０００×gで１０分間
遠心し上澄液を回収する。この液を緩衝液Ａに１Ｍ、食
塩水と０.０１％ブリッジ３５を含む新たな緩衝液[緩衝
液Ｂ]で４時間透析後、１５,０００×gで１０分間遠心
して得た上澄液をゼラチン・セルロファイン(チッソ社)
に吸着させる。緩衝液Ｂで十分洗浄した後、１０％ＤＭ
ＳＯを含む緩衝液ＢでＩＶ型コラゲナーゼを溶出した。

【００１９】上記の方法で調製したコラゲナーゼ標品
(５００μg蛋白質／ml)０.５μl、１５mＭのp−アミノ
・フェニル・水銀・酢酸溶液５μlおよび５０mＭトリス
・塩酸−５mＭ塩化カルシウム緩衝液１４４.５μlから
成る反応液を３７℃、１時間保温することによりコラゲ
ナーゼを活性化した。次いで、化合物ＴＡＮ−１７１１
溶液１０μlおよびヒト胎盤由来トリチウム標識ＩＶ型
コラーゲン溶液(比活性４０,０００dpm／５μg)１０μl
を加え、３７℃、１時間反応した。氷冷下に、０.１％
ウシ血清アルブミン溶液１０μlと１０％トリクロロ酢
酸−０.５％タンニン酸溶液５０μlを加え、３０分間放
置後、３,０００回転／分、３０分間遠心し、上清を１
５０μl抜き取り、３mlのシンチレーターを加え、放射
活性を測定した。

【００２０】Ｉ型コラゲナーゼ阻害活性測定法Ｉ型コラゲナーゼの調製は以下のようにして行った。す
なわち、メディウム１９９[ホワイタッカー・バイオプ
ロダクツ(Ｗhittaker Ｂioproducts)社、米国]にウシ
胎児血清ＦＣＳ(Ｗhittaker Ｂioproducts社、米国)を
２０％およびヒト塩基性線維芽細胞増殖因子を２ng／ml
添加した培地でヒト臍帯静脈血管内皮(ＨＵＶＥ)細胞を
１×１０⁵個／mlとなるように懸濁し、３７℃、５％Ｃ
Ｏ₂に設定した炭酸ガスインキュベーターで一晩培養す
る。メディウム１９９に１０nＭのテトラデカノイルフ
ォルボール酢酸(ＴＰＡ)(シグマ社、米国)を添加した無
血清培地に交換し、さらに１７時間上記炭酸ガスインキ
ュベーターで培養した後、培地を抜き取り、１,０００
×gで５分間遠心し、上澄液を回収し、これをプロＩ型
コラゲナーゼとした。上述のプロＩ型コラゲナーゼにト
リプシン(シグマ社、米国)を１０μg／mlとなるよう加
え、３７℃で１０分間保温した後、トリプシンインヒビ
ター(和光純薬)を１０μg／mlとなるよう添加し、これ
をＩ型コラゲナーゼ溶液とした。Ｉ型コラゲナーゼ活性
測定は上述のＩ型コラゲナーゼを酵素源とし、コラゲノ
キット(コラーゲン技術研修会)を用いて行った。 [結果]化合物ＴＡＮ−１７１１はＩＶ型およびＩ型コラ
ゲナーゼに対し、それぞれ０.２５７および１０.７μg
／mlで５０％阻害を示した。

【００２１】試験例２ＥＧＦリセプター・チロシン・カイネース阻害活性試験 [方法]ＥＧＦリセプターの細胞内チロシン・カイネース
・ドメイン(６９キロダルトン)はギル(Ｇill)らの方法
[ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
(Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.)、２６４、１１３４６(１９８９)]に
準じて、バキュオ・ウィルス発現系を用いて、クローン
化した相補ＤＮＡ(cＤＮＡ)をＳf９昆虫細胞で高発現さ
せ調製した。活性はリビュクセン(Ｒijksen)らの方法
[メソッド・イン・エンザイモロジー(Ｍethods in Ｅ
nzymology)、２００、９８(１９９１)]に準じて、不動
化した合成ポリペプチド[ジャーナル・オブ・バイオロ
ジカル・ケミストリー(Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.)、２５９、２
０５１(１９８４)]を用いて、１０分間反応後、生成し
たリン酸化チロシンを抗リン酸化チロシン抗体と反応さ
せることにより測定した。 [結果]化合物ＴＡＮ−１７１１はＥＧＦリセプター・チ
ロシン・カイネースに対し、０.１８５μＭで５０％阻
害を示した。

【００２２】試験例３細胞増殖阻害試験 [方法]ＴＡＮ−１７１１の細胞増殖阻害作用はヒト臍帯
静脈血管内皮(ＨＵＶＥ)細胞およびヒーラ(ＨeＬa)細胞
を用い、モスマン(Ｍossmann)の方法[ジャーナル・オブ
・イミュノロジカル・メソッド(Ｊ.Ｉmmunolog.Ｍethod
s)、６５、５５(１９８３)]を改変した方法で測定し
た。すなわち、各々の細胞を３×１０⁴個／mlの濃度で
培地に懸濁し、あらかじめ種々の濃度のＴＡＮ−１７１
１を溶かしたリン酸緩衝化生理食塩水(phosphate−buff
ered saline、ＰＢＳ)を１０μl添加した９６穴平底プ
レート(ヌンク社)の各ウェルに０.１mlずつ分注した。
ＨＵＶＥ細胞にはメディウム１９９(Ｗhittaker Ｂiop
roducts社、米国)にウシ胎児血清(ＦＣＳ)(Ｗhittaker
Ｂioproducts社、米国)を２０％およびヒト塩基性線
維芽細胞増殖因子を１０ng／mlとなるよう添加した培
地、ＨeＬa細胞にはイーグルのミニマムエッセンシャル
メディウム(Ｗhittaker Ｂioproducts社、米国)にＦＣ
Ｓ(Ｗhittaker Ｂioproducts社、米国)を１０％添加し
た培地を用いた。上記プレートを３７℃、５％ＣＯ₂に
設定した炭酸ガスインキュベーターで３日間培養後、テ
トラゾリウム塩ＭＴＴ(シグマ社、米国)を５mg／mlとな
るようにＰＢＳに溶かした溶液を２５μl添加し、上記
炭酸ガスインキュベーター中にて保温した。４時間後に
０.０１Ｎの塩酸に１０％となるようにＳＤＳを加えた
溶液を各ウェルに０.１mlずつ加え、上記炭酸ガスイン
キュベーターにて一晩保温し、６２０nmでの吸光度をタ
イターテックマルチスキャン吸光度計(フロー社、米国)
を用いて測定した。ＰＢＳのみを１０μl加えた場合の
吸光度を対照として、各濃度でのＴＡＮ−１７１１の阻
害率(％)を算出した。

【００２３】[結果]化合物ＴＡＮ−１７１１はヒト臍帯
静脈血管内皮(ＨＵＶＥ)細胞およびヒーラ(ＨeＬa)細胞
の増殖をそれぞれ１３.５、１０.２μg／mlで５０％阻
害した。ＴＡＮ−１７１１について、マウスを用い、腹
腔内投与して急性毒性を調べたところ、２００mg／kgで
死亡例は認められなかった。以上の試験例に示すように
本発明の化合物ＴＡＮ−１７１１またはその塩は強い酵
素(例、コラゲナーゼ、チロシン・カイネース)阻害活性
および細胞増殖阻害活性を示し、低毒性な新規化合物で
ある。

【００２４】本発明のＴＡＮ−１７１１またはその塩を
有効成分とするコラゲナーゼまたはチロシン・カイネー
ス阻害剤は、哺乳動物(例、ラット、マウス、ウシ、ウ
マ、サル、ヒト等)に投与して、コラゲナーゼ阻害薬ま
たはチロシン・カイネース阻害薬として有用であり、例
えば、哺乳動物の腫瘍の治療あるいは転移防止に用いる
ことができる。該薬剤は、ＴＡＮ−１７１１またはその
塩を、自体公知の方法により、薬理学的に許容される担
体と混合することにより得られる。本剤は、非経口剤と
して、例えば注射剤、点滴剤、外用剤(例、経鼻投与製
剤、経皮製剤など)、坐剤(例、直腸坐剤、膣坐剤な
ど)、経口剤として、例えばカプセル剤、錠剤、シロッ
プ剤、散剤および顆粒剤またはそのほかの医薬組成物と
して経口的または非経口的に投与することができる。

【００２５】これらの製剤は、製剤工程において通常一
般に用いられる自体公知の方法により製造することがで
きる。例えば、本発明のＴＡＮ−１７１１またはその塩
は分散剤(例、ツイーン(Ｔween)８０(アトラスパウダー
社製、米国)、ＨＣＯ６０(日光ケミカルズ製)ポリエ
チレングリコール、カルボキシメチルセルロース、アル
ギン酸ナトリウムなど)、保存剤(例、メチルパラベン、
プロピルパラベン、ベンジルアルコール、クロロブタノ
ールなど)、等張化剤(例、塩化ナトリウム、グリセリ
ン、ソルビトール、ブドウ糖など)などと共に水性注射
剤に、あるいはオリーブ油、ゴマ油、ラッカセイ油、綿
実油、コーン油などの植物油、プロピレングリコールな
どに溶解、懸濁あるいは乳化して油性注射剤に成形し、
注射剤とすることができる。

【００２６】例えば、経口投与製剤にするには、自体公
知の方法に従い、本発明のＴＡＮ−１６０９またはその
塩を例えば賦形剤(例、乳糖、白糖、デンプンなど)、崩
壊剤(例、デンプン、炭酸カルシウムなど)、結合剤
(例、デンプン、アラビアゴム、カルボキシメチルセル
ロース、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセ
ルロースなど)または滑沢剤(例、タルク、ステアリン酸
マグネシウム、ポリエチレングリコール６０００など)
などを添加して圧縮成形し、次いで必要により、味のマ
スキング、直溶性あるいは持続性の目的のため自体公知
の方法でコーティングすることにより経口投与製剤とす
ることができる。そのコーティング剤としては、例えば
ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロー
ス、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピル
セルロース、ポリオキシエチレングリコール、ツイーン
８０、ブルロニックＦ６８、セルロースアセテートフタ
レート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレー
ト、ヒドロキシメチルセルロースアセテートサクシネー
ト、オイドラギット(ローム社製、西ドイツ、メタアク
リル酸・アクリル酸共重合)および酸化チタン、ベンガ
ラ等の色素が用いられる。

【００２７】例えば外用剤とするには、自体公知の方法
に従い、本発明のＴＡＮ−１７１１またはその塩を固
状、半固状または液状の外用投与剤とすることができ
る。例えば、上記固状のものとしては、ＴＡＮ−１７１
１またはその塩をそのまま、あるいは賦形剤(例、グリ
コール、マンニトール、デンプン、微結晶セルロースな
ど)、増粘剤(例、天然ゴム類、セルロース誘導体、アク
リル酸重合体など)などを添加、混合して粉状の組成物
とする。上記液状のものとしては、注射剤の場合とほと
んど同様で、油性あるいは水性懸濁剤とする。半固状の
場合は、水性または油性のゲル剤、あるいは軟膏状のも
のがよい。また、これらはいずれも、pＨ調節剤(例、炭
酸、リン酸、クエン酸、塩酸、水酸化ナトリウムな
ど)、防腐剤(例、パラオキシ安息香酸エステル類、クロ
ロブタノール、塩化ベンザルコニウムなど)などを加え
てもよい。

【００２８】例えば、坐剤とするには、自体公知の方法
に従い、本発明のＴＡＮ−１７１１またはその塩を油性
または水性の固状、半固状あるいは液状の坐剤とするこ
とができる。上記組成物に用いる油性基剤としては、例
えば高級脂肪酸のグリセリド[例、カカオ脂、ウイテプ
ゾル類(ダイナマイトノーベル社製)など]、中級脂肪酸
[例、ミグリオール類(ダイナマイトノーベル社製)な
ど]、あるいは植物油(例、ゴマ油、大豆油、綿実油な
ど)などが挙げられる。また、水性基剤としては、例え
ばポリエチレングリコール類、プロピレングリコール、
水性ゲル基剤としては、例えば天然ゴム類、セルロース
誘導体、ビニル重合体、アクリル酸重合体などが挙げら
れる。

【００２９】ＴＡＮ−１７１１またはその塩をヒトに用
いる場合の投与量は対象疾病の種類、程度、患者の年齢
などで変動し得るが、通常、ＴＡＮ−１７１１またはそ
の塩含量として、１日成人(体重５０kg)１人当たり約１
mgから４０mg、とりわけ約２mgから３０mgが疾患の治療
に用いられる事が好ましい。これらの製剤は、１日１〜
３回に分けて投与することができる。ＴＡＮ−１７１１
またはその塩を、注射剤として非経口的に皮下、静脈内
または筋肉内に投与する場合、その投与量は約０.５〜
５０mg／kg／日、好ましくは１〜５０mg／kg／日であ
る。

【００３０】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明を更に詳しく説
明するが、これによって本発明が限定されるものではな
い。なお、培地におけるパーセント(％)は、特に断りの
ない限り、重量／容量パーセントを表示する。また、溶
媒の混合比率は、特に断りのない限り、容量比を表示す
る。実施例１化合物ＴＡＮ−１７１１の製造法ポテト・デキストローズ・プロス(ディフコ社製、米国)
２４g、寒天２０gおよび水１リットルからなる斜面培地
上で、２８℃で、７日間培養したアスペルギルス・エス
ピーＦＬ−３６８３１株を２％ブドウ糖、３％麦芽
糖、１.５％生大豆粉、１.０％コーン・スティープ・リ
カー、０.５％ペプトン、０.３％酵母エキス、０.３％
塩化ナトリウムを含む４０mlの種培地(pＨ６.０)に接種
し、２００ml容三角フラスコ中で、２８℃、４８時間回
転振とう機上で培養し、種培養を得た。得られた種培養
液１mlを２００ml容フラスコ内の４０mlの１.０％ブド
ウ糖、４％デキストリン、０.５％生大豆粉、０.５％ペ
プトン、０.５％麦芽エキス、０.２％酵母エキス、０.
０５％硫酸第１鉄(７水和物)、０.０５％硫酸第１マグ
ネシウム(７水和物)、０.０５％硫酸第１マンガン(４水
和物)、０.１％リン酸２水素カリウム、０.５％炭酸カ
ルシウムを含む発酵培地(pＨ７.５)に移植し、２８℃、
５日間回転振とう機上で培養した。

【００３１】実施例２実施例１で得られた培養液(８リットル)をpＨ３.０に補
正し、酢酸エチル(８リットル)を加えて３０分間撹拌混
和した。混合物をハイフロースーパーセル(ジョンス−
マンビル社製、米国)を用いて濾過し、得られた有機溶
媒層を水(３リットル)で洗浄後、濃縮して油状物(３６.
８g)を得た。油状物をクロロホルム−メタノール−ギ酸
混合液(９８:２:１、５００ml)に溶解し、シリカゲル
(２５０g、シリカゲル６０、７０−２３０メッシュ、イ
ー・メルク社、独国)のカラムクロマトグラフィーに付
し、クロロホルム−メタノール−ギ酸混合液(９８:２:
１、１リットル、９５:５:１、２リットル、９０:１０:
１、２リットルおよび８０:２０:１、２リットル)で順
次溶出し、５００mlづつ分画した。画分４から１１を集
めて濃縮乾固し、粗粉末(７６０mg)を得た。得られた粗
粉末をメタノールで粉末化し、ＴＡＮ−１７１１の灰黄
色粉末(５８０mg)を得た。

【００３２】得られたＴＡＮ−１７１１の物理化学的性
状を以下に示す。 (１)外観: 灰黄色粉末 (２)分子量: m／z３５８(Ｍ⁺)、(ＥＩ−マススペクトル
より) (３)元素分析値: (％) (水分０.５モルとして) 実測値: Ｃ,５９.２５; Ｈ,４.０６計算値: Ｃ,５８.８６; Ｈ,４.１２ (４)分子式: Ｃ₁₈Ｈ₁₄Ｏ₈ (５)紫外部吸収(ＵＶ)スペクトル: メタノール中、(図
１) 極大値: ２４５nm(ε２５,４００)、３０７nm(ε２１,
７００)、３６５nm(ε１３,８００) (６)赤外部吸収(ＩＲ)スペクトル: ＫＢr錠剤中、(図
２) 主な吸収を示す(波数、cm^-1) ３３９０、１６３０、１５９０、１４４０、１３４０、
１２９０、１２１０、１１１０、９３０ (７)¹Ｈ核磁気共鳴(ＮＭＲ)スペクトル: ３００ＭＨz、
重ジメチルスルフォキシド中、(図３) δppm; １０.４２(１Ｈ,s)、９.４９(１Ｈ,s)、７.４７
(１Ｈ,s)、２.５８(３Ｈ,s)、２.０２(３Ｈ,s)。 (ただし、sは一重線を示す。)

【００３３】(８)¹³Ｃ核磁気共鳴(ＮＭＲ)スペクトル:
７５ＭＨz、重ジメチルスルフォキシド中、(図４) δppm; １９４.７(ＣＨ)、１９０.１(ＣＨ)、１５１.６
(Ｑ)、１５１.５(Ｑ)、１５０.１(Ｑ)、１４２.３
(Ｑ)、１４０.８(Ｑ)、１３６.４(Ｑ)、１３２.６
(Ｑ)、１２７.６(Ｑ)、１２４.９(Ｑ)、１２２.８
(Ｑ)、１１８.７(Ｑ)、１１７.２(Ｑ)、１１２.６
(Ｑ)、１０９.０(ＣＨ)、１２.７(ＣＨ₃)、１１.０(Ｃ
Ｈ₃)。(ただし、Ｑは４級炭素、ＣＨはメチン炭素、ＣＨ
₃はメチル炭素を示す。) (９)高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ）：担体；ＯＤＳ、ＹＭＣ−Ｐack Ａ−３１２移動相; ３５％アセトニトリル／０.０２Ｍリン酸緩衝
液(pＨ３.０) 流速; ２.０ml／min 検出法; ＵＶ吸収、２１４、２５４nm 溶出時間; ４.４min (１０)薄層クロマトグラフィー(ＴＬＣ): 担体; シリカゲル(Ｓilica gel)６０Ｆ２５４[イー・
メルク・エージー(Ｅ.Ｍerck ＡＧ.)] 展開溶媒: クロロホルム−メタノール−ギ酸(９:１:０.
２) Ｒf値; ０.４１ (１１)性質: 酸性脂溶性

【００３４】製剤例１実施例２によって得たＴＡＮ−１７１１を用いて、下記
に示す処方の全成分を混和し、ゼラチンカプセルに充填
し、カプセル１個当たり、３０mgのＴＡＮ−１７１１を
含有するカプセル剤を製造した。ＴＡＮ−１７１１３０mg 乳糖１００mg コーンスターチ４０mg ステアリン酸マグネシウム１０mg 合計１８０mg

【００３５】製剤例２実施例２によって得たＴＡＮ−１７１１とステアリン酸
マグネシウムを可溶性デンプンの水溶液で顆粒化し、乾
燥後、乳糖およびコーンスターチと混合した。混合物を
圧縮成型し、下記に示す処方の錠剤を製造した。ＴＡＮ−１７１１３０mg 乳糖６５mg コーンスターチ３０ｍｇ可溶性デンプン３５ｍｇステアリン酸マグネシウム２０mg 合計１８０mg

【００３６】製剤例３実施例２で得たＴＡＮ−１７１１(５００mg)をメタノー
ル(４０ml)に溶解し、炭酸ナトリウム(１６３mg，１.１
当量)、水(３０ml)を加え、室温にて１０分間撹拌し
た。その後、メタノールを除去し、凍結乾燥するとＴＡ
Ｎ−１７１１ナトリウム塩(５５０mg)が得られた。得ら
れたＴＡＮ−１７１１ナトリウム塩を３０％(w／v)ポリ
エチレングリコール４００を含む生理食塩水に溶解して
ＴＡＮ−１７１１ナトリウム塩の０.０５％溶液を調製
し、滅菌濾過して、バイアルに３０mlずつ分注した。バ
イアル１個当たり、１５mgのＴＡＮ−１７１１ナトリウ
ム塩を含有する静注剤を製造した。

【００３７】

【発明の効果】本発明によれば、コラゲナーゼ阻害活
性、チロシン・カイネース阻害活性および細胞増殖阻害
活性を有する新規化合物ＴＡＮ−１７１１またはその
塩、その製造法並びにそれを含有してなるコラゲナーゼ
阻害剤およびチロシン・カイネース阻害剤が提供され
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】化合物ＴＡＮ−１７１１の紫外線吸収（Ｕ
Ｖ）スペクトルである。

【図２】化合物ＴＡＮ−１７１１の赤外線吸収（Ｉ
Ｒ）スペクトルである。

【図３】化合物ＴＡＮ−１７１１の¹Ｈ核磁気共鳴
（ＮＭＲ）スペクトルである。

【図４】化合物ＴＡＮ−１７１１の¹³Ｃ核磁気共鳴
（ＮＭＲ）スペクトルである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 1/02 ＺＣ１２Ｒ 1:66）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】次の物理化学的性状を有する化合物ＴＡ
Ｎ−１７１１; (１)分子式: Ｃ₁₈Ｈ₁₄Ｏ₈ (２)紫外部吸収スペクトル: メタノール中、極大値: ２４５±３nm(ε２５,４００±３,０００)、３
０７±３nm (ε２１,７００±２,０００)、３６５±３nm(ε１３,８
００±２,０００) (３)赤外部吸収スペクトル: ＫＢr錠剤、波数、cm^-1 ３３９０、１６３０、１５９０、１４４０、１３４０、
１２９０、１２１０、１１１０、９３０ (４)¹³Ｃ核磁気共鳴スペクトル: ７５ＭＨz、重ジメチ
ルスルフォキシド中、δppm; １９４.７(ＣＨ)、１９０.
１(ＣＨ)、１５１.６(Ｑ)、１５１.５(Ｑ)、１５０.１
(Ｑ)、１４２.３(Ｑ)、１４０.８(Ｑ)、１３６.４
(Ｑ)、１３２.６(Ｑ)、１２７.６(Ｑ)、１２４.９
(Ｑ)、１２２.８(Ｑ)、１１８.７(Ｑ)、１１７.２
(Ｑ)、１１２.６(Ｑ)、１０９.０(ＣＨ)、１２.７(ＣＨ
₃)、１１.０(ＣＨ₃)。 (５)性質: 酸性脂溶性またはその塩。
【請求項２】アスペルギルス属に属し、請求項１記載
の化合物ＴＡＮ−１７１１を生産する能力を有する微生
物を培地に培養し、化合物ＴＡＮ−１７１１を生成蓄積
せしめ、これを採取することを特徴とする化合物ＴＡＮ
−１７１１またはその塩の製造法。
【請求項３】微生物がアスペルギルスエスピーＦＬ
−３６８３１株ＩＦＯ３２５５５; ＦＥＲＭＰ−
１３８９７である請求項２記載の製造法。
【請求項４】請求項１記載の化合物ＴＡＮ−１７１１
またはその塩を含有してなるコラゲナーゼ阻害剤。
【請求項５】請求項１記載の化合物ＴＡＮ−１７１１
またはその塩を含有してなるチロシン・カイネース阻害
剤。