JP2799581B2

JP2799581B2 - 化合物ｔａｎ―１１４０およびその製造法

Info

Publication number: JP2799581B2
Application number: JP1224489A
Authority: JP
Inventors: 清一谷田; 重利坪谷; 正之瀧澤
Original assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1989-01-20
Filing date: 1989-01-20
Publication date: 1998-09-17
Anticipated expiration: 2013-09-17
Also published as: JPH02193940A

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は自己免疫疾患および移植臓器に対する拒絶反
応の治療剤として有用な新規化合物TAN−1140（以下「T
AN−1140」と略称することもある）およびその製造法に
関する。

従来の技術免疫調節作用を有する化合物は、微生物菌体，微生物
培養液，植物体などの天然物中から単離され、あるいは
化合物合成によって製造されている。本発明におけるTA
N−1140はセスキテルペン系化合物に属し、同一分子式
を有する化合物は数多くあるが［J.S.Glasby著,Encyclo
paedia of the terpenoids,John Wiley＆Sons,Chichest
er,1982］、上記のような生物活性については報告がみ
あたらない。

発明が解決しようとする課題自己免疫疾患は、例えば全身性エリテマトーデス，慢
性関節リウマチ，多発性硬化症，悪性貧血等，広範な疾
患を含み、自己抗体を生成する。この疾患に対して様々
な薬剤が治療薬として用いられているが、満足すべき効
果を発揮するものは今のところ得られていない。

一方、臓器移植の分野では、移植臓器の生着を助ける
ために拒絶反応防止剤が使用される。最近、従来からの
アザチオプリンとプレドニソロンの併用療法に代って、
サイクロスポリンＡが多用され、高い評価を得ている。
しかし、同時にサイクロスポリンＡの使用に伴う腎障害
の多発や自己反応性リンパ球の生成が新たな問題となっ
てきている［薬局，第39巻,35頁,49頁（1988）；サイエ
ンス（Sience）241巻,1655頁（1988）参照］。

これらの問題を解決するために、当分野では免疫調節
作用を有する新規な化合物あるいはそれらの化合物を合
成するための中間原料が求められている。

課題を解決するための手段本発明者らは、かかる現状に鑑みて、新たな観点から
免疫調節物質の検索を重ねた。その結果、土壌から分離
された多数の微生物中、ある種の微生物がマウス脾細胞
のコンカナバリンＡ（以下Con Aと略称）応答性を抑制
するとともにアロ抗原刺激による混合リンパ球反応をも
抑制する化合物を培地中に蓄積し得ることを知り、この
化合物を単離し、物理化学的および生物学的性質から、
当該化合物が新規化合物であることを確かめ、これをTA
N−1140と称することにした。また該微生物がミロセシ
ウム（Myrothecium）属に属することも明らかになり、
本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究を重
ね、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は（１）TAN−1140および（２）ミロ
セシウム属に属するTAN−1140生産菌を培地に培養し、
培養物中にTAN−1140を生成蓄積せしめ、これを採取す
ることを特徴とするTAN−1140の製造法を提供するもの
である。

本発明方法で使用されるTAN−1140を生産する菌とし
ては、ミロセシウム属に属し、TAN−1140を産生する能
力を有する微生物であればいずれのものでもよい。その
例としては、京都府の土壌より分離されたIT−121株が
挙げられ、本菌株の菌学的性質は下記のとおりである。

IT−121株は、バレイショ・ブドウ糖寒天培地上で旺
盛な生育を示し、24℃,2週間の培養で集落の直径は７〜
8cmに達する。集落はうすく広がり、羊毛状で、中央部
は白色ないし淡黄色を呈する。分生子は、散在または白
色の周辺部を伴った灰緑色の分生子座に形成される。裏
面は表面と同色を呈し、可溶性色素の産生は見られな
い。本菌は、麦芽エキス寒天培地上でも、バレイショ・
ブドウ糖寒天培地上とほぼ同様の発育性状を示す。

IT−121株は12〜32℃の温度範囲で生育することがで
き、最適生育温度は20〜30℃である。また本菌はpH4〜1
0の範囲で良好に生育する。

IT−121株の分生子座は良く発達し、等径あるいは細
長い細胞（直径４〜６μｍ）の層からなっている。周縁
菌糸は分枝するものもあり、通常いぼ状で隔壁があり、
大きさは８〜20×1.5〜3.5μｍである。分生子柄は無色
で、滑面あるいはいぼ状を呈し、大きさは９〜20×1.5
〜３μｍで、隔壁を有し、くり返し分岐する。通常、そ
れぞれの分枝部で２〜４本の分枝を生じ、各分枝の先端
にフィアライドが形成される。フィアライドは無色，滑
面あるいはいぼ状の円柱形ないしは長楕円形またはとっ
くり状を呈し、大きさは８〜20×1.5〜３μｍで、２〜
４本が輪生し、互いに密着し、平行した層を形成する。
また、分生子は紡錘形で、表面の縦方向にややねじれた
溝がある。大きさは７〜12×2.5〜4.5μｍで、先端はと
がり基部は裁断状で、多くは分生子座上に黒緑色の粘塊
となって集合する。

なおIT−121株には厚膜胞子の形成は認められず、ま
た種々の寒天培地上で有性生殖形態は観察されなかっ
た。

以上の諸性質をもとに、IT−121株を既知菌株と比較
したところ、本菌がM.トルヒ著,C.M.I マイコロジカル
・ペーパーズ（C.M.I Mycological Papers）130巻,18頁
（1972）に記載されているミロセシウム・シンクトム
［Myrothecium cinctum（corda）Sacc.］に極めて良く
一致した。従って本菌をミロセシウム・シンクトムと同
種を考えミロセシウム・シンクトム（Myrothecium cinc
tum）IT−121と命名した。

IT−121株は昭和63（1988）年12月23日に財団法人発
酵研究所（IFO）に受託番号IFO 32178として、また本
菌は平成１（1989）年１月17日に通商産業省工業技術院
微生物工業技術研究所（FRI）にブタペスト条約に基づ
き受託番号FERM BP−2246としてそれぞれ寄託されてい
る。

ミロセシウム属に属するTAN−1140の生産菌は、他の
微生物の場合と同様に、たとえば紫外線、エックス線、
放射線等の照射、単胞子分離、種々の変異処理、その他
の手段で変異させることができ、このような変異株ある
いは自然に得られる突然変異株であっても、上記した分
類学的性状との比較において実質的に別種とするに足ら
ず、しかも当該化合物を生産する性質を有するものはす
べて本発明方法に利用し得る。

当該化合物生産菌の培養に用いられる培地は該菌が利
用し得る栄養源を含むものなら、液状でも固状でもよい
が、大量に処理するときには液体培地を用いるのがより
適当である。培地には、当該化合物生産菌が同化し得る
炭素源、窒素源、無機物質、微量栄養素が適宜配合され
る。炭素源としては、たとえばブドウ糖、乳糖、ショ
糖、麦芽糖、デキストリン、澱粉、グリセリン、マンニ
トール、ソルビトール、油脂類（例、大豆油、ラード
油、チキン油など）、ｎ−パラフィンその他が、窒素源
としては、たとえば肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母、
大豆粉、コーン・スティープ・リカー、ペプトン、棉実
粉、廃糖密、尿素、アンモニウム塩類（例、硫酸アンモ
ニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸ア
ンモニウムなど）その他が用いられる。さらにナトリウ
ム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどを含む塩
類、鉄、マンガン、亜鉛、コバルト、ニッケルなどの金
属塩類、リン酸、ホウ酸などの塩類や酢酸、プロピオン
酸などの有機酸の塩類が適宜用いられる。その他、アミ
ノ酸（例、グルタミン酸、アスパラギン酸、アラニン、
リジン、メチオニン、プロリンなど）、ペプチド（例、
ジペプチド、トリペプチドなど）、ビタミン類（例、
B₁、B₂、ニコチン酸、B₁₂、Ｃなど）、核酸類（例、プ
リン、ピリミジン、その誘導体など）等を含有させても
よい。もちろん、培地のpHを調節する目的で無機または
有機の酸もしくはアルカリ類、緩衝剤等を加え、あるい
は消泡の目的で油脂類、界面活性剤等の適量を添加して
差し支えない。液体培養に際しては、培地のpHは中性付
近、特にpH約６〜８が好ましい。培養温度は約24℃〜30
℃、培養時間は約48時間〜144時間が好ましい。

培養の経過に伴って生産されるTAN−1140の力価はマ
ウス脾細胞のCon A応答性の抑制を指標とする液体希釈
法に従って定量される。通常、約３〜６日間の培養でTA
N−1140の生産量は最高に達する。

培養物から目的とする化合物TAN−1140を採取するに
は、TAN−1140が中性で脂溶性を示す化合物であるか
ら、この性質を利用する一般的手段で採取することがで
きる。

培養物中TAN−1140は菌体および液中に含まれるの
で、培養液をpH2ないし10、好ましくはpH2.5ないし９に
調整後、水と混和しない有機溶媒、たとえばジクロロメ
タン、酢酸エチル、メチルイソブチルケトンあるいはイ
ソブタノールなどを加え、活性物質を抽出する方法が用
いられる。また、培養液中に水と混和する有機溶媒、た
とえばアセトンあるいはメタノールなどを加え、撹拌、
抽出し、不溶物を去後、抽出液中の有機溶媒を減圧下
留去し、得られた水溶液を前記抽出法に付す方法も利用
される。抽出液中の活性物質は吸着性樹脂たとえばアン
バーライトXAD−II（ローム・アンド・ハース社製、米
国）、ダイアイオンHP−20またはSP−207（三菱化成社
製）などを用いたクロマトグラフィー法に付す方法が有
利に用いられる。なお、吸着性樹脂を用いたカラムから
目的の活性物質を溶出するには、水または含水溶媒、た
とえば含水メタノール、含水アセトンなどが有利に用い
られる。かくして得られた抽出液あるいは溶出液を減圧
下濃縮すると、TAN−1140を含有する粗物質が得られ
る。

粗物質をさらに精製し、純粋なTAN−1140を得るには
種々のクロマトグラフィー法が有利に用いられる。担体
としてはシリカゲル、結晶セルロース、セファデックス
LH−20（ファルマシア社製、スウェーデン）などが用い
られ、これらは通常カラムクロマトグラフィー法で行わ
れる。カラムから活性物質を溶出するには適当な有機溶
媒たとえばｎ−ヘキサン、クロロフォルム、トルエン、
酢酸エチル、ジクロロエタン、アセトン、メタノールな
どの単独あるいは混合溶媒が用いられる。溶出液を濃縮
し、冷所で放置するか、濃縮残渣を適当な結晶化溶媒た
とえば石油ベンジン、ｎ−ヘキサン、ジエチルエーテル
あるいはこれらの混合液で溶解し、冷所で放置すると、
TAN−1140の結晶が得られる。

後述する実施例２で得られたTAN−1140の物理化学的
性質を下記に示す。

１）外観：無色結晶２）融点:81.5〜83℃ ３）比施光度：▲［α］²² _D▼＋54.4゜（c0.49,エタノール中）４）マススペクトル（EIMS）:m/z 218（M⁺）５）元素分析値：（％）計算値;C,82.52:H,10.16;O,7.33 実測値;C,82.69;H,10.39 ６）分子式:C₁₅H₂₂O ７）紫外部吸収スペクトル：メタノール中 λ_max246±3nm（ε9000±1000）８）赤外部吸収スペクトル:KBr中（cm^-1）主な吸収波数を示す（第１図）。

3430,2960,2875,1665,1605,1440,1385,1290,1270,90
5,885 ９）¹³C−核磁気共鳴スペクトル:75MHz,重クロロフォル
ム中、δppm（第２図）。

199.94（Ｑ）， 168.43（Ｑ）, 145.74（Ｑ）， 127.66（CH）， 113.73（CH₂）, 52.88（CH）， 52.83（Ｑ）， 43.21（CH₂）, 39.44（CH）， 38.65（CH₂）, 31.94（CH₂）, 24.02（CH₃）， 23.92（CH₂）, 20.95（CH₃）, 16.74（CH₃）．（ただし、Q:四級炭素,CH:メチン,CH₂:メチレン,CH₃:メ
チルを表わす） 10）¹H−核磁気共鳴スペクトル:300MHz,重クロロフォル
ム中、δppm 下記のシグナルを示す。

1.18（ｄ）,1.56−2.04（m,メチレン３個分）,1.79
（ｓ）,2.05（ｄ）,2.18（ｍ）,2.38（dd）2.61（ｍ）,
4.89（ｓ）,5.88（ｓ）．（ただし、d:ダブレット,m:マルティプレット,s:シング
レット,dd;ダブルダブレットを示す） 11）薄層クロマトグラフィー：担体；シリカゲル60F₂₅₄（メルク社製，西独）溶媒系;1）ｎ−ヘキサン：酢酸エチル（4:1） 2）クロロフォルム Rf値;1）0.49 2）0.41 検出法;UV吸収 12）構造式；上記物理化学的性状および核磁気共鳴スペ
クトルの解析によりTAN−1140の化学構造は下記式であ
る。

作用次にTAN−1140の生物活性について述べる。

まず、マウス脾細胞の幼若化反応に対する抑制作用を
第１表に示す。

測定法： BALB/cマウス脾細胞１×10⁵/ml,Con A（シグマ社製，
米国）１μg/mlまたは大腸菌由来リポポリサッカライド
（以下LPSと略称；ディフコ社製，米国）10μg/ml,5μ
Ｍ２−メルカプトエタノール,2mM Ｌ−グルタミン,3
0μg/mlゲンタマイシン（フロー・ラボラトリーズ社
製，スコットランド）,10％牛胎児血清（ウィッタカー
・エム・エー・バイオプロタグツ社製，米国）を含むPR
MI1640培地（ウィッタカー・エム・エー・バイオプロダ
グツ社製，米国）にTAN−1140を適宜加え、37℃,5％炭
酸ガス下で３日間培養した後、MTT還元法［多田ら，ジ
ャーナル・オブ・イミュノロジカル・メソード（Journa
l of Immunological Method）第96巻,157頁，（198
6）］でリンパ球の幼若化反応を測定した。

次に、TAN−1140のマウス混合リンパ球反応に対する
抑制作用を第２表に示す。

測定法： C3H/Heマウス脾細胞を応答細胞とし、DBA/2マウス脾
細胞をあらかじめマイトマイシンＣ（協和発酵製）25μ
g/mlで37℃,5％炭酸ガス下、30分間静置したものを刺激
細胞とした。両者を第１表と同じRPMI1640培地に懸濁
し、それぞれ2.5×10⁶/mlの細胞濃度になるように混合
し、TAN−1140を適宜加え、37℃,5％炭酸ガス下で５日
間培養した後、MTT還元法で応答細胞の増殖を測定し
た。

さらに、TAN−1140のマウス・インターロイキン２
（以下「IL−２」と略称）産生に及ぼす影響を調べた。
BALB/cマウス脾細胞を第１表と同じRPMI1640倍地に３×
10⁶/mlの細胞濃度になるように懸濁し、これにCon A 1
μg/mlおよび適宜の濃度のTAN−1140を加え、37℃,5％
炭酸ガス下で18時間培養した。次に、この培養上清のIL
−２をIL−２依存性のマウスＴ細胞株CTLL−２（ATCC
TIB214）の増殖を指標として測定した。その結果、TAN
−1140は10μg/mlの濃度でIL−２産生を約50％抑制し
た。

なお、TAN−1140の作用を構造上類似のテルペンヒネ
ソール（Hinesol）［吉岡，木村，ケミカル・アンド・
ファーマシューティカル・ブリチン（Chemical and Pha
rmaceutical Bulletin）第17巻 856頁（1969）］を用
いて第１表と同様の試験を行った結果、本化合物は10μ
g/mlでCon AおよびLPS刺激に対する応答性に全く影響を
及ぼさなかった。

また、TAN−1140をマウスの腹腔内に100mg/kgで投与
したが、死亡例は認められなかった。

以上の物理化学的性状および生物学的性状から明らか
なように、TAN−1140は新規化合物であり、リンパ球機
能抑制作用を示すので、前記にあげた自己免疫疾患治療
用もしくは臓器移植の拒絶反応防止用医薬，さらには動
物薬として有用な物質である。

実施例以下に実施例を挙げて、本発明をさらに具体的に説明
するが、これによって本発明が限定されるものではな
い。なお、培地におけるパーセント（％）は、とくに断
りのない限り重量／容量パーセントを表わす。

実施例１バレイショ・ブドウ糖斜面寒天培地に培養したミロセ
シウム・シンクトムIT−121（IFO−32178、FERM BP−2
246）を200ml容三角フラスコ内のグルコース２％、可溶
性澱粉３％、生大豆粉１％、コーン・スティープ・リカ
ー１％、ペプトン0.5％、NaCl 0.3％、CaCO₃ 0.5％を含
む40mlの種培地（pH7.0）に接種し、28℃、48時間回転
振盪機上で培養し、前培養液を得た。得られた前培養液
の5mlを2000ml容坂口フラスコ内の500mlの種培地に移植
し、28℃、48時間往復振盪機上で培養し、種培養液を得
た。この種培養液500mlを種培地（上記種培地と同一組
成）30を含む50容ステンレス・スチール・タンクに
移植し、通気30／分、撹拌280回転／、分、内圧1kg/c
m²の条件で培養した。得られた培養液の５を200容
ステンレス・スチール・タンク内のグルコース0.5％、
デキストリン５％、脱脂大豆粉3.5、CaCO₃ 0.7％を含む
120の主培地（pH7.0）に移植し、28℃、通気120／
分、撹拌180回転／分、内圧1kg/cm²の条件で96時間培養
した。

実施例２培養液（190）を硫酸でpH3に調整後、酢酸エチル
（200）を加え、30分間撹拌した。撹拌後、ハイフロ
スーパーセルを加え過し、有機層を分離した。得られ
た有機層を、２％炭酸水素ナトリウム水溶液（50），
水（30）で順次洗浄後、濃縮乾固した。残渣をシリカ
ゲル60（70−230メッシュ,500g,メルク社製，西独）の
カラムクロマトグラフィーに付し、ｎ−ヘキサン：酢酸
エチル＝7:1（２）,n−ヘキサン：酢酸エチル＝4:1
（２）で順次溶出分画した。活性区分を集め、濃縮
し、濃縮液を再度シリカゲル60（500g）のカラムクロマ
トグラフィーに付した。クロロフォルム（３）で洗浄
後、クロロフォルム：メタノール＝19:1（1.5）で溶
出分画した。活性区分を濃縮し、濃縮液をさらにシリカ
ゲル60（500g）のカラムクロマトグラフィーに付した。
ｎ−ヘキサン（１）,n−ヘキサン：酢酸エチル＝95:5
（２）で洗浄後、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝92:8〜
85:15で順次溶出分画し、活性区分を濃縮乾固して、粗
生成物0.86gと2.53gを得た。前者はシリカゲル60（43
g）のカラムクロマトグラフィーに付し、ｎ−ヘキサ
ン：酢酸エチル＝95:5（100ml）で洗浄後、ｎ−ヘキサ
ン：酢酸エチル＝93:7で溶出分画した。後者もシリカゲ
ル60（90g）のカラムクロマトグラフィーに付し、ｎ−
ヘキサン：酢酸エチル＝95:5（300ml）で洗浄後、ｎ−
ヘキサン：酢酸エチル＝93:7で溶出分画した。両者の活
性区分を集め濃縮乾固し、石油ベンジン−エーテルから
結晶化を行ない、TAN−1140の無色結晶（290mg）が得ら
れた。

発明の効果本発明のTAN−1140は、免疫調節作用を有する新規な
化合物であり、医薬、動物薬として有用である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、前記実施例で得られた化合物TAN−1140の赤
外部吸収スペクトル（KBr法）を、第２図は¹³C−核磁気
共鳴スペクトル（重クロロフォルム中、75MHz）をそれ
ぞれ示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 7/26 Ｃ１２Ｒ 1:645） (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C07C 49/653 C12P 7/26 A61K 31/12 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】下記式で示される化合物TAN−1140
【請求項２】ミロセシウム属（Myrothecium）に属し、
請求項１記載の化合物TAN−1140を生産し得る能力を有
する微生物を培地に培養し、培養物中に請求項１記載の
化合物TAN−1140を生成蓄積せしめ、これを採取するこ
とを特徴とする請求項１記載の化合物TAN−1140の製造
法。