CN103298827A - 环状酯肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有式(I)的结构的环状酯肽或其衍生物，并涉及它们的用途，如作为激肽释放酶7和人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的抑制物。

Description

环状酯肽
发明领域
本发明涉及环状酯肽或其衍生物。
发明背景
激肽释放酶7是表现出胰凝乳蛋白酶样活性的激肽释放酶基因家族的S1丝氨酸蛋白酶。人激肽释放酶7(hK7、KLK7或角质层胰凝乳蛋白酶(stratum corneum chymotryptic enzyme)(SCCE)，Swissprot P49862)在皮肤生理学中起着重要的作用(1，2，3)。其主要表达于皮肤中且已经报道了在皮肤生理学中起着重要作用。在脱鳞片过程中，hK7参与角质化鳞状上皮中胞内内聚结构的降解。脱鳞片过程是充分调节的并与角化细胞的从头产生微妙地平衡以维持角质层的恒定厚度，皮肤的最外层关键地参与了皮肤屏障功能。在这点上，报道了hK7能剪切角化桥粒蛋白质(corneodesmosomal protein)角膜锁链蛋白和桥粒胶蛋白1(4，5，6)。这两种角化桥粒蛋白(corneodesmosomes)的降解对脱鳞片是需要的。此外，最近已经显示两种脂质加工酶(lipid processing enzyme)β-葡糖脑苷脂酶和酸性鞘磷脂酶可以由hK7降解(7)。两种脂质加工酶都与它们的底物葡糖神经酰胺和鞘磷脂共分泌并将这些极性脂质前体加工成它们的多种非极性产物如神经酰胺，其随后掺入到胞外片层膜中。片层膜构造对功能性皮肤屏障是关键的。最后，hK7在体外已经显示出活化白细胞介素-1β(IL-1β)前体成其活性形式(8)。因为角质形成细胞表达IL-1β，但并非为特异的IL-1β转化酶的活性形式(ICE或胱天蛋白酶1)，所以认为人表皮中IL-1β活化通过另一蛋白酶，潜在的候选物hK7来发生。
最近的研究将hK7增加的活性与炎性皮肤疾病如遗传过敏性皮炎、银屑病或内瑟顿综合征(Netherton’s syndrome)联系起来。这可能引起角化桥粒的非控制性降解而导致错误调节的脱鳞片、引起脂质加工酶增强的降解而导致受干扰的片层膜构造或者促炎细胞因子IL-1β的非控制性活化。最后结果可能是受损的皮肤屏障功能和炎症(也参见WO-A-2004/108139)。
由于hK7活性受几种水平控制的事实，所以多种因素可以是在炎性皮肤疾病中造成增加的hK7活性的原因。首先，表达的蛋白酶的量可以通过遗传因素影响。最近描述了这种遗传联系，在hK7基因中3’-UTR的多态性(9)。作者假设在激肽释放酶7基因的3’-UTR中插入所述4个碱基对稳定了hK7mRNA并导致hK7的过量表达。第二，由于hK7以酶原通过片层体分泌到角质层胞外区且不能自活化，所以其需要通过另一蛋白酶如hK5来活化(5)。这种活化酶的非控制性活性可以导致hK7的过度活化。第三，活化的hK7能通过天然抑制物如LEKTI、ALP或抑弹性蛋白酶蛋白来抑制(10，11)。这类抑制物的减少表达或缺少可能导致hK7增强的活性。最近发现，在编码LEKTI的spink5基因中的突变是内瑟顿综合征的原因(12)，且该基因中的单点突变(single point mutation)与遗传过敏性皮炎相关(13，14)。最后，控制hK7活性的另一水平是pH。hK7具有中性到稍微碱性pH最适度(2)且在皮肤中存在从最内层到最外层的从中性到酸性的pH梯度。环境因素如肥皂可以导致关于hK7的pH最适度的角质层的最外层中pH增加，从而增加hK7活性。
hK7增加的活性与包括炎性和过度增生的(hyperpoliferative)皮肤疾病在内的具有受损的皮肤屏障的皮肤疾病相关的假设通过以下研究支持：首先，内瑟顿综合征患者显示了丝氨酸蛋白酶活性的表型依赖性增加、角化桥粒减少、脂质加工酶β-葡糖脑苷脂酶和酸性鞘磷脂酶减少以及受损的屏障功能(15，16)。第二，过量表达人激肽释放酶7的转基因小鼠显示出与在患遗传过敏性皮炎的患者中发现的皮肤表型相似的皮肤表型(17，18，19)。第三，描述了在遗传过敏性皮炎和银屑病患者的皮肤中升高的hK7水平(17，20)。此外，K7增加的活性以及因此上皮屏障功能异常也可以在其它上皮疾病如炎性肠病(inflammatory bowel disease)和节段性回肠炎(Crohn’s disease)的病理学中起重要作用。
因此，认为hK7是用于治疗涉及具有上皮功能异常如炎症和/或过度增生的疾病以及瘙痒性皮肤疾病如遗传过敏性皮炎、银屑病、内瑟顿综合征或者其它瘙痒皮肤病如结节性痒疹、老年人的非特异性痒病(unspecifieditch of the elderly)以及其它具有上皮屏障功能异常的疾病如炎性肠病和节段性回肠炎的潜在靶，并且需要其特异的调节物(激动物或抑制物)。
人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE，也称为人白细胞弹性蛋白酶，HLE)属于丝氨酸蛋白酶的胰凝乳蛋白酶家族。它的催化活性最优地大约pH7，且催化位点包含形成所谓的催化三联体的3个氢键氨基酸残基：His57、Asp102和Ser195(在胰凝乳蛋白酶中的编号)。所述酶包含218个氨基酸残基和4个二硫键的单肽链。它显示出与其它弹性蛋白溶解性(elastinolytic)或非弹性蛋白溶解性(nonelastinolytic)丝氨酸蛋白酶30％到40％的序列同一性。HNE优先地剪切在P1位置处具有Val的氧化的胰岛素B链，但是它也水解在P1位置处具有Ala、Ser或Cys的键。
HNE定位于多形核白细胞(PMNL)的嗜天青颗粒中，其中HNE的浓度相当高(3μg的酶/106个细胞)。主要生理功能是消化细菌和免疫复合物以及参与宿主防御过程。HNE帮助嗜中性粒细胞对趋化因子做出反应的从血液到多种组织如呼吸道的迁移。HNE也参与创伤愈合、组织修复和PMNL的凋亡。
除弹性蛋白(肺结缔组织、动脉、皮肤和韧带的高度灵活和高度疏水组分)外，HNE剪切许多具有重要生物学功能的蛋白质，包括胶原蛋白的不同类型、膜蛋白质和软骨蛋白聚糖。HNE也通过活化原胶原酶、前基质溶素(prostromelysin)、前明胶酶(progelatinase)来间接促进胞外基质蛋白质的分解。HNE失活许多内源蛋白酶抑制物如α2-抗纤溶酶、α1-抗胰凝乳蛋白酶、抗凝血酶、和金属蛋白酶的组织抑制物。
胞外弹性蛋白酶活性在肺系统中通过α1-蛋白酶抑制物(α1PI)密切地控制，负责保护下呼吸道免受促弹性组织离解的损伤，而分泌的白细胞蛋白酶抑制物主要保护上呼吸道。在许多肺病理生理状态如肺气肿、慢性支气管炎和囊性纤维化中，内源弹性蛋白酶抑制物在调节HNE活性中是效率低的。
认为HNE是与炎性疾病如肺气肿、成人性呼吸窘迫综合征(ARDS)、慢性支气管炎、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肺动脉高压和其它炎性疾病以及早产新生儿中支气管肺发育异常(bronchopulmonary dysplasia)相关的组织损伤的首要来源。HNE涉及通常与呼吸道炎性疾病相关的增加的和异常的呼吸道分泌物的发病机理。因此，来自患慢性支气管炎和囊性纤维化患者的支气管肺泡灌洗(bronchoalveolar lavage)(BAL)液具有增加的HNE活性。此外，已经提出，过量的弹性蛋白酶不仅对这些慢性炎性疾病也对急性炎性疾病如ARDS和败血性休克起作用。
因此，认为HNE是用于治疗涉及HNE活性的疾病如炎性疾病例如肺气肿、成人性呼吸窘迫综合征(ARDS)、慢性支气管炎、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肺动脉高压和其它炎性疾病以及早产新生儿中支气管肺发育异常的疾病，以及涉及具有增加的和异常的呼吸道分泌物和急性炎性疾病的疾病的潜在靶。因此，需要特异的HNE的调节物(激动物或抑制物)。
治疗可分别通过局部的或全身的应用如乳膏剂、软膏剂和栓剂或者经口的或皮下的或者静脉内的应用或通过吸入。
软骨霉状菌属(Chondromyces)是多囊菌科(Polyangiaceae)中的属，所述软骨霉状菌属属于δ-变形杆菌(Delta-proteobacteria)中的粘球菌目(Myxococcales)。粘球菌目的细菌，也称为粘细菌(myxobacteria)是具有两种区别于大多数其它细菌的表征的革兰氏阴性杆状细菌。它们使用活性滑行机制(active gliding mechanism)在固体表面群集，且当饥饿时，它们聚集以形成子实体(Kaiser(2003))。本发明已经鉴定了由软骨霉状菌属产生的能特异地调节激肽释放酶7的环状酯肽。
发明概述
本发明一方面涉及具有式(I)：
Figure GPA00001102397000051
的结构的环状酯肽或其衍生物，
其中，发现酯键在A7的羧基基团和A2的羟基基团之间，其中X和A1是各自独立地任选的，且其中X是任一化学残基，其中A1是不为天冬氨酸的标准氨基酸或者是所述标准氨基酸的衍生物，其中A2是苏氨酸或丝氨酸，其中A3是非碱性标准氨基酸或其非碱性衍生物，其中A4是Ahp、脱氢AHP、脯氨酸或它们的衍生物，其中A5是异亮氨酸或缬氨酸，其中A6是酪氨酸或其衍生物和其中A7是亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸。
备选地，本发明的环状酯肽或其衍生物可根据式(I’)：
Figure GPA00001102397000052
进行描述，
其中X和A1如权利要求中所定义，且其中
R2是H或甲基
R3是非碱性氨基酸或其非碱性衍生物的侧链
R5是氨基酸异亮氨酸或缬氨酸的侧链
R6是酪氨酸或其衍生物的侧链
R7是氨基酸亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸的侧链
Y是氢或者甲基基团，
且其中Ahp可以被脱氢AHP、Ahp-I、Ahp-II、脯氨酸或它们的衍生物取代。
本发明也涉及此种环状酯肽或其衍生物的可药用盐。
在本发明的环状酯肽中，X可以是H或酰基残基，例如CH3CH2CH(CH3)CO、(CH3)2CHCH2CO或者(CH3)2CHCO。
在本发明的环状酯肽中，A1可以是谷氨酰胺、谷氨酸或它们的衍生物，如谷氨酸腈或者谷氨酸酯。
在本发明的环状酯肽中，A2可以是苏氨酸或其衍生物。
在本发明的环状酯肽中，A3可以是亮氨酸。
在本发明的环状酯肽中，A6可以是酪氨酸。
在本发明环状酯肽的一些实施方案中，A4可以是Ahp衍生物3-氨基-哌啶-2-酮、Ahp-I或Ahp-II。
在本发明环状酯肽或其衍生物的一些实施方案中，X是(CH3)2CHCO，A1是谷氨酰胺、谷氨酸或它们的衍生物，A2是苏氨酸，A3是亮氨酸，A4是Ahp或其衍生物，A5是异亮氨酸或缬氨酸，A6是酪氨酸或其衍生物和A7是异亮氨酸或缬氨酸。
在本发明环状酯肽或其衍生物的其它实施方案中，X是CH3CH2CH(CH3)CO，A1是谷氨酰胺、谷氨酸或它们的衍生物，A2是苏氨酸，A3是亮氨酸，A4是Ahp或其衍生物，A5是异亮氨酸，A6是酪氨酸或其衍生物和A7是异亮氨酸。
又在本发明环状酯肽或其衍生物的其它实施方案中，X是CH3CH2CH(CH3)CO，A1是谷氨酰胺、谷氨酸或它们的衍生物，A2是苏氨酸，A3是亮氨酸，A4是脱氢AHP或其衍生物，A5是异亮氨酸，A6是酪氨酸或其衍生物和A7是异亮氨酸。
在本发明环状酯肽或其衍生物的另外的实施方案中，X是(CH3)2CHCH2CO，A1是谷氨酰胺、谷氨酸或它们的衍生物，A2是苏氨酸，A3是亮氨酸，A4是脱氢AHP、Ahp或它们的衍生物，A5是异亮氨酸，A6是酪氨酸或其衍生物和A7是异亮氨酸。
此外，本发明也涉及具有式(I)
的结构的环状酯肽或其衍生物，
其中，发现酯键在A7的羧基基团和A2的羟基基团之间，其中X是(CH3)2CHCH2CO，其中A1是谷氨酰胺、谷氨酸或它们的衍生物，其中A2是苏氨酸，其中A3是亮氨酸，其中A4是Ahp、脯氨酸或它们的衍生物，其中A5是苯丙氨酸，其中A6是酪氨酸或其衍生物和其中A7是缬氨酸。
在其特别的实施方案中，X是(CH3)2CH CH2CO，A1是谷氨酰胺、谷氨酸或它们的衍生物，A2是苏氨酸，A3是亮氨酸，A4是Ahp或其衍生物，A5是苯丙氨酸，A6是酪氨酸或其衍生物和A7是缬氨酸。
在其另外的实施方案中，X是(CH3)2CH CH2CO，A1是谷氨酰胺、谷氨酸或它们的衍生物，A2是苏氨酸，A3是亮氨酸，A4是脯氨酸或其衍生物，A5是苯丙氨酸，A6是酪氨酸或其衍生物和A7是缬氨酸。在这些实施方案中，A5和A6之间酰胺键的氮原子可以被甲基取代。
在本发明的环状酯肽或其衍生物中，A1、A2、A3、A5、A6和A7可以是L-氨基酸。此外，A4可以是3S，6R Ahp。
本发明也涉及上述酯肽和其衍生物作为药物的用途。例如用于治疗癌症，特别是卵巢癌，或用于治疗炎症和/或过度增生和瘙痒性皮肤疾病如疤痕疙瘩、肥厚型瘢痕、痤疮、遗传过敏性皮炎、银屑病、脓疱型银屑病、酒渣鼻、内瑟顿综合征或其它瘙痒性皮肤病如结节性痒疹、老年人的非特异性痒病以及其它具有上皮屏障功能异常的疾病如衰老的皮肤(agedskin)、炎性肠病和节段性回肠炎以及胰腺炎、或者癌症特别是卵巢癌、囊性纤维化(CF)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肺纤维化、成人型呼吸窘迫综合征、慢性支气管炎、遗传性肺气肿(hereditary emphysema)、类风湿性关节炎、IBD、银屑病、气喘。
在本发明的一个实施方案中，涉及上述酯肽和其衍生物作为药物用于治疗炎症和/或过度增生以及瘙痒性皮肤疾病如疤痕疙瘩、肥厚性瘢痕、痤疮、遗传过敏性皮炎、银屑病、脓疱型银屑病、酒渣鼻、内瑟顿综合征或者其它瘙痒性皮肤病如结节性痒疹、老年人的非特异性痒病以及其它具有上皮屏障功能异常的疾病如衰老的皮肤、炎性肠病和节段性回肠炎以及胰腺炎、或癌症特别是卵巢癌的用途。
在本发明的另一实施方案中，涉及上述酯肽和其衍生物作为药物治疗囊性纤维化(CF)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肺纤维化、成人型呼吸窘迫综合征、慢性支气管炎、遗传性肺气肿、类风湿性关节炎、IBD、银屑病、哮喘的用途。
又在本发明的另一实施方案中，涉及上述酯肽和其衍生物作为药物治疗炎症和/或过度增生以及瘙痒性皮肤疾病如疤痕疙瘩、肥厚性瘢痕、痤疮、遗传过敏性皮炎、银屑病、脓疱型银屑病、酒渣鼻、内瑟顿综合征或者其它瘙痒性皮肤病如结节性痒疹、老年人的非特异性痒病的用途。
本发明也包括用于产生本发明环状酯肽或其衍生物的方法，例如通过在合适的培养基中培养软骨霉状菌属菌株、其变体或其突变体，并任选地化学衍生所产生的环状酯肽，或者通过在异源微生物宿主菌株中表达软骨霉状菌属菌株、其变体或其突变体的生物合成基因，和任选地化学衍生所产生的环状酯肽。
本发明的这些方法可以使用菌株藏红花软骨霉状菌(Chondromycescrocatus)(DSM 19329)或粗柄软骨霉状菌(Chondromyces robustus)(DSM 19330)或者尖软骨霉状菌(Chondromyces apiculatus)(DSM21595)来进行。
因此，本发明也涉及保藏在保藏号DSM 19329或DSM 19330或者DSM 21595下的分离的软骨霉状菌属微生物，并涉及由这些分离的软骨霉状菌属微生物产生的环状酯肽或其衍生物。
附图描述
图1：式(II)化合物的1H-NMR谱(600MHz，d6-DMSO)
图2：式(II)化合物的13C-NMR谱(150MHz，d6-DMSO)
图3：式(VIII)化合物的1H-NMR谱(600MHz，d6-DMSO)
图4：式(VIII)化合物的13C-NMR谱(150MHz，d6-DMSO)
图5：根据式(II)的环状酯肽的衍生物的1H-NMR谱，其中Alp已经转化为3-氨基-哌啶-2-酮(实施例4)。
图6：根据实施例5的环状酯肽的衍生物的1H NMR谱。(500MHz，d6-DMSO)
图7：根据实施例19的环状酯肽的衍生物的1H-NMR谱。(500MHz，d6-DMSO)
图8：根据实施例21的环状酯肽的衍生物的1H-NMR谱。(500MHz，d6-DMSO)
图9：根据实施例26的环状酯肽的衍生物的1H NMR谱。(500MHz，d6-DMSO)
图10：根据实施例32的环状酯肽的衍生物的1H-NMR谱。(500MHz，d6-DMSO)
图11：根据实施例44的环状酯肽的衍生物的1H-NMR谱。(500MHz，d6-DMSO)
图12：根据实施例45的环状酯肽的衍生物的1H-NMR谱。(500MHz，d6-DMSO)
发明详述
如上面本文中和权利要求中所述，本发明一方面涉及具有式(I)：
Figure GPA00001102397000091
结构的环状酯肽或其衍生物，
其中，发现酯键在A7的羧基基团和A2的羟基基团之间，其中X和A1是各自独立地任选的，且其中X是任一化学残基，其中A1是不为天冬氨酸的标准氨基酸，其中A2是苏氨酸或丝氨酸，其中A3是非碱性标准氨基酸或其非碱性衍生物，其中A4是Ahp、脱氢AHP、脯氨酸或它们的衍生物，其中A5是异亮氨酸或缬氨酸，其中A6是酪氨酸或其衍生物和其中A7是亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸。
备选地，本发明的环状酯肽或其衍生物可根据式(I’)：
Figure GPA00001102397000101
进行描述，
其中X和A1如权利要求中所定义，且其中
R2是氨基酸苏氨酸或丝氨酸的侧链
R3是非碱性氨基酸或其非碱性衍生物的侧链
R5是氨基酸异亮氨酸或缬氨酸的侧链
R6是酪氨酸或其衍生物的侧链
R7是氨基酸亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸的侧链
Y是氢或者甲基基团，
且其中Ahp可以被脱氢AHP、Ahp-I、Ahp-II、脯氨酸或它们的衍生物取代。
本发明也涉及此种环状酯肽或其衍生物的可药用盐。
在本发明的环状酯肽中，A5和A6之间酰胺键的氮原子可以被甲基取代。
在本发明的环状酯肽中，X可以是H或酰基残基，例如CH3CH2CH(CH3)CO、(CH3)2CHCH2CO或者(CH3)2CHCO。
在本发明的环状酯肽中，A1可以是谷氨酰胺、谷氨酸或它们的衍生物。
在本发明的环状酯肽中，A2可以是苏氨酸。
在本发明的环状酯肽中，A3可以是亮氨酸。
在本发明的环状酯肽中，A6可以是酪氨酸或其衍生物。
在本发明环状酯肽的一些实施方案中，A4可以是Ahp衍生物3-氨基-哌啶-2-酮、Ahp-I或Ahp-II。
在本发明环状酯肽或其衍生物的一些实施方案中，X是(CH3)2CHCO，A1是谷氨酰胺、谷氨酸或它们的衍生物，A2是苏氨酸，A3是亮氨酸，A4是Ahp或其衍生物，A5是异亮氨酸或缬氨酸，A6是酪氨酸或其衍生物和A7是异亮氨酸或缬氨酸。
在本发明环状酯肽或其衍生物的其它实施方案中，X是CH3CH2CH(CH3)CO，A1是谷氨酰胺、谷氨酸或它们的衍生物，A2是苏氨酸，A3是亮氨酸，A4是Ahp或其衍生物，A5是异亮氨酸，A6是酪氨酸或其衍生物和A7是异亮氨酸。
又在本发明环状酯肽或其衍生物的其它实施方案中，X是CH3CH2CH(CH3)CO，A1是谷氨酰胺、谷氨酸或它们的衍生物，A2是苏氨酸，A3是亮氨酸，A4是脱氢AHP或其衍生物，A5是异亮氨酸，A6是酪氨酸或其衍生物和A7是异亮氨酸。
在本发明环状酯肽或其衍生物的另外的实施方案中，X是(CH3)2CHCH2CO，A1是谷氨酰胺、谷氨酸或它们的衍生物，A2是苏氨酸，A3是亮氨酸，A4是脱氢AHP或其衍生物，A5是异亮氨酸，A6是酪氨酸或其衍生物和A7是异亮氨酸。
此外，本发明也涉及具有式(I)
Figure GPA00001102397000111
的结构的环状酯肽或其衍生物，
其中，发现酯键在A7的羧基基团和A2的羟基基团之间，其中X是(CH3)2CHCH2CO，其中A1是谷氨酰胺、谷氨酸或它们的衍生物，其中A2是苏氨酸，其中A3是亮氨酸，其中A4是Ahp或脯氨酸或者它们的衍生物，其中A5是苯丙氨酸，其中A6是酪氨酸或其衍生物和其中A7是缬氨酸。
在其特别的实施方案中，X是(CH3)2CH CH2CO，A1是谷氨酰胺、谷氨酸或它们的衍生物，A2是苏氨酸，A3是亮氨酸，A4是Ahp或其衍生物，A5是苯丙氨酸，A6是酪氨酸或其衍生物和A7是缬氨酸。
在其另外的实施方案中，X是(CH3)2CH CH2CO，A1是谷氨酰胺、谷氨酸或它们的衍生物，A2是苏氨酸，A3是亮氨酸，A4是脯氨酸或其衍生物，A5是苯丙氨酸，A6是酪氨酸或其衍生物和A7是缬氨酸。在这些实施方案中，A5和A6之间酰胺键的氮原子可以被甲基取代。
在本发明的环状酯肽或其衍生物中，A1、A2、A3、A5、A6和A7可以是L-氨基酸。此外，A4可以是3S，6R Ahp。
A5代表异亮氨酸、苯丙氨酸或缬氨酸。A5特别地是异亮氨酸或缬氨酸，且优选地是异亮氨酸。
在另一实施方案中，A5可以是苯丙氨酸，特别当A4不是Ahp时，且剩余的变量如权利要求1中所定义。
在另一实施方案中，A4是5-羟脯氨酸和A5是异亮氨酸，且剩余的变量如权利要求1中所定义。
在另一实施方案中，A4是Ahp和A5是异亮氨酸，且剩余的变量如权利要求1中所定义。
在另一实施方案中，A4是Ahp-I和A5是异亮氨酸，且剩余的变量如权利要求1中所定义。
在另一实施方案中，A4是Ahp-II和A5是异亮氨酸，且剩余的变量如权利要求1中所定义。
在另一实施方案中，A4是Ahp、A5和A7是异亮氨酸，且剩余的变量如权利要求1中所定义。
在另一实施方案中，A4是Ahp-I、A5和A7是异亮氨酸，且剩余的变量如权利要求1中所定义。
在另一实施方案中，A4是Ahp-II、A5和A7是异亮氨酸，且剩余的变量如权利要求1中所定义。
在另一实施方案中，A4是5-羟脯氨酸、A5和A7是异亮氨酸，且剩余的变量如权利要求1中所定义。
如本文中所用，A1是谷氨酰胺、谷氨酸、鸟氨酸或谷氨酰胺衍生物例如，如谷氨酸腈、谷氨酸酯例如C1-12烷基酯(如谷氨酸甲酯)或者如C6-24芳基酯(如谷氨酸苯酯或谷氨酸苄酯)。
本发明也涉及上述酯肽和其衍生物作为药物的用途。例如用于治疗癌症，特别是卵巢癌，或用于治疗炎症和/或过度增生和瘙痒性皮肤疾病如疤痕疙瘩、肥厚型瘢痕、痤疮、遗传过敏性皮炎、银屑病、内瑟顿综合征或其它瘙痒性皮肤病如结节性痒疹、老年人的非特异性痒病以及其它具有上皮屏障功能异常的疾病如炎性肠病和节段性回肠炎以及胰腺炎。
在本发明的一个实施方案中，涉及上述酯肽和其衍生物作为药物用于治疗炎症和/或过度增生以及瘙痒性皮肤疾病如疤痕疙瘩、肥厚性瘢痕、痤疮、遗传过敏性皮炎、银屑病、脓疱性银屑病、酒渣鼻、内瑟顿综合征或者其它瘙痒性皮肤病如结节性痒疹、老年人的非特异性痒病以及其它具有上皮屏障功能异常的疾病如衰老的皮肤、炎性肠病和节段性回肠炎以及胰腺炎、或癌症特别是卵巢癌的用途。
在本发明的另一实施方案中，涉及上述酯肽和其衍生物作为药物治疗囊性纤维化(CF)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肺纤维化、成人型呼吸窘迫综合征、慢性支气管炎、遗传性肺气肿、类风湿性关节炎、IBD、银屑病、哮喘的用途。
又在本发明的另一实施方案中，涉及上述酯肽和其衍生物作为药物治疗炎症和/或过度增生以及瘙痒性皮肤疾病如疤痕疙瘩、肥厚性瘢痕、痤疮、遗传过敏性皮炎、银屑病、脓疱性银屑病、酒渣鼻、内瑟顿综合征或者其它瘙痒性皮肤病如结节性痒疹、老年人的非特异性痒病的用途。
本发明也包括用于产生本发明环状酯肽或其衍生物的方法，例如通过在合适的培养基中培养软骨霉状菌属菌株、其变体或其突变体，和任选地化学衍生所产生的环状酯肽，或者通过在异源微生物宿主菌株中表达软骨霉状菌属菌株、其变体或其突变体的生物合成基因，和任选地化学衍生所产生的环状酯肽。
本发明的这些方法可以使用菌株藏红花软骨霉状菌(DSM 19329)或粗柄软骨霉状菌(DSM 19330)或者尖软骨霉状菌(DSM 21595)来进行。
因此，本发明也涉及保藏在保藏号DSM 19329或DSM 19330或者DSM 21595下的分离的软骨霉状菌属微生物，并涉及由这些分离的软骨霉状菌属微生物产生的环状酯肽或其衍生物。
本发明提供了：
具有式(I)：
Figure GPA00001102397000141
的结构的环状酯肽或其衍生物
其中，酯键在A7的羧基基团和A2的羟基基团之间形成，
其中X和A1是各自独立地任选的，
且其中
X是H或氨基基团修饰部分且可以一般地选自芳基羰基残基或选自酰基残基，
A1是谷氨酰胺、鸟氨酸、谷氨酸或它们的衍生物；
A2是苏氨酸或丝氨酸，
A3是亮氨酸，
A4是Ahp、3-氨基-哌啶-2-酮、脱氢AHP、Ahp-I、Ahp-II、脯氨酸、5-羟脯氨酸或它们的衍生物，其中稠合的点(与A3和A5稠合的点)在脯氨酸和5-羟脯氨酸的氮原子和羧基氧处(借助于用键替换氢原子)，
其中Ahp、3-氨基-哌啶-2-酮、脱氢AHP、Ahp-I、Ahp-II如下所定义，且其中稠合的点(与A3和A5稠合的点)在所述化合物的氮原子处(借助于用键替换氢原子)：
3-氨基-6-羟基-哌啶-2-酮(Ahp)
Figure GPA00001102397000152
Figure GPA00001102397000153
3-氨基-3，4-二氢-1H-吡啶-2-酮(脱氢-AHP)
Figure GPA00001102397000154
3-氨基-哌啶-2-酮
其中X是O或键，且R是有机部分或是如权利要求3中所定义的基团，
A5是异亮氨酸、苯丙氨酸或缬氨酸，
A6是酪氨酸、N-Me-酪氨酸或它们的衍生物，
A7是亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸，
或者它们的可药用盐。
权利要求1的酯肽，其中X是CH3CH2CH(CH3)CO、(CH3)2CHCH2CO、(CH3)2CHCO、CH3CO或苯基-CO。
权利要求1的酯肽，其中A5和A6之间酰胺键的氮原子被甲基取代且酪氨酸的OH基团是OR，其中R选自氢、(C1-12)烷基、(C2-12)烯基、(C2-12)炔基、卤代(C1-12)烷基、卤代(C2-12)烯基、卤代(C2-12)炔基、(C1-12)烷氧羰基、(C1-12)烷氧基-羰基(C1-12)烷基、(C1-12)烷基氨基羰基，所述基团未被取代或者被芳基、芳基烷基、芳基烯基或芳基炔基、杂环基和杂环基烷基进一步取代。
权利要求1的酯肽，其中A4是Ahp衍生物3-氨基-哌啶-2-酮、Ahp-I或Ahp-II，其中R选自(C1-12)烷基、(C2-12)烯基、(C2-12)炔基、卤代(C1-12)烷基、(C1-12)烷氧基(C1-12)烷基、(C1-12)烷氧基(C1-12)烷氧基(C1-12)烷基、羟基(C1-12)烷基、苯基和苯基(C1-6)烷基。
权利要求1的酯肽，其中酰基残基X是CH3CH2CH(CH3)CO
或(CH3)2CHCO，
A1是谷氨酰胺、谷氨酸或它们的衍生物，
A2是苏氨酸，
A3是亮氨酸，
A4是Ahp、3-氨基-哌啶-2-酮、脯氨酸、5-羟脯氨酸或它们的衍生物，
A5是异亮氨酸，
A6是酪氨酸、N-Me-酪氨酸或它们的衍生物，
A7是异亮氨酸或缬氨酸，优选地是异亮氨酸。
任一前述权利要求的酯肽，其中A4是Ahp、Ahp-I、3-氨基-哌啶-2-酮、脯氨酸或5-羟脯氨酸，优选地是Ahp、Ahp-I、3-氨基-哌啶-2-酮或5-羟脯氨酸，也优选地是Ahp、Ahp-I或5-羟脯氨酸，更优选地是Ahp。
权利要求1的酯肽，所述酯肽是根据式A或式B的化合物，
Figure GPA00001102397000161
其中X和A1如权利要求1中所定义，且其中
R2是氨基酸苏氨酸或丝氨酸的侧链，
R3是亮氨酸的侧链，
R5是氨基酸异亮氨酸或缬氨酸的侧链，特别地R5代表异亮氨酸，
R6是任选地衍生的酪氨酸的侧链，特别是如在权利要求3中所定义，在其羟基基团上任选地衍生的酪氨酸的侧链，
R7是氨基酸亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸的侧链，特别地R7代表异亮氨酸，
Y是氢或者甲基，且Y特别地是甲基。
任一前述权利要求的环状酯肽，其中A1、A2、A3、A5、A6和A7是L-氨基酸。
任一前述权利要求的环状酯肽，其中A4是3S，6R Ahp。
任一前述权利要求的环状酯肽，其中A1是如在本说明书任一实施例中所述的谷氨酰胺、鸟氨酸或谷氨酰胺衍生物，且例如选自谷氨酸腈、谷氨酸酯如C1-12烷基酯(如，谷氨酸甲酯)或者如C6-24芳基酯(如谷氨酸苯基酯或谷氨酸苄基酯)。
包含与可药用载体和/或成分结合的任一前述权利要求的环状酯肽的药物组合物。
任一前述权利要求的环状酯肽作为药物的用途，特别是如在用于治疗患者的方法中所述的用途，如权利要求13-15，和如在所述方法权利要求中所述的所述酯肽在制备用于治疗疾病和病症的药物中的用途。
治疗患炎症和/或过度增生以及瘙痒性皮肤疾病如疤痕疙瘩、肥厚性瘢痕、痤疮、遗传过敏性皮炎、银屑病、脓疱性银屑病、酒渣鼻、内瑟顿综合征或者其它瘙痒性皮肤病如结节性痒疹、老年人的非特异性痒病以及其它具有上皮屏障功能异常的疾病如衰老的皮肤、炎性肠病和节段性回肠炎以及胰腺炎、或癌症特别是卵巢癌、囊性纤维化(CF)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肺纤维化、成人型呼吸窘迫综合征、慢性支气管炎、遗传性肺气肿、类风湿性关节炎、IBD、银屑病、哮喘的受试者的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的任一权利要求1-10的环状酯肽或其衍生物。
根据权利要求13的治疗受试者的方法，其中受试者患疤痕疙瘩、肥厚性瘢痕、痤疮、遗传过敏性皮炎、银屑病、脓疱性银屑病、酒渣鼻、内瑟顿综合征或者其它瘙痒性皮肤病如结节性痒疹、老年人的非特异性痒病以及其它具有上皮屏障功能异常的疾病如衰老的皮肤、炎性肠病和节段性回肠炎以及胰腺炎、或癌症特别是卵巢癌。
根据权利要求14的治疗受试者的方法，其中受试者患疤痕疙瘩、肥厚性瘢痕、痤疮、遗传过敏性皮炎、银屑病、脓疱性银屑病、酒渣鼻、内瑟顿综合征或者其它瘙痒性皮肤病如结节性痒疹、老年人的非特异性痒病以及其它具有上皮屏障功能异常的疾病如衰老的皮肤。
根据权利要求13的治疗受试者的方法，其中受试者患囊性纤维化(CF)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肺纤维化、成人型呼吸窘迫综合征、慢性支气管炎、遗传性肺气肿、类风湿性关节炎、IBD、银屑病、哮喘。
任一权利要求1-10的产生环状酯肽或其衍生物的方法，包括在合适的培养基中培养软骨霉状菌属菌株、其变体或其突变体，并任选地化学衍生所产生的环状酯肽。
产生任一权利要求1-10的环状酯肽或其衍生物的方法，包括在异源微生物宿主菌株中表达软骨霉状菌属菌株、其变体或其突变体的生物合成基因，和任选地化学衍生所产生的环状酯肽。
权利要求17或18的方法，其中菌株是藏红花软骨霉状菌(DSM 19329)或粗柄软骨霉状菌(DSM 19330)或者尖软骨霉状菌(DSM 21595)。
产生任一权利要求1-10的环状酯肽或其衍生物的保藏在保藏号DSM19329或DSM 19330或者DSM 21595下的分离的软骨霉状菌属微生物。
通过权利要求20的分离的软骨霉状菌属微生物产生或者通过根据权利要求17-18的方法获得的环状酯肽或其衍生物。
制备根据权利要求1的环状酯肽或其衍生物的衍生物的方法，其备选地包括
a)通过在温度-78℃和150℃之间、用有机酸或无机酸或者路易斯酸处理其中A4是
Figure GPA00001102397000191
的化合物来制备其中A4是
Figure GPA00001102397000192
的根据权利要求1的环状酯肽或其衍生物的衍生物；
b)通过在温度-50℃和100℃之间、在溶剂中存在催化剂下，用分子氢或其源处理其中A4是
Figure GPA00001102397000193
的化合物来制备其中A4是
Figure GPA00001102397000194
的根据权利要求1的环状酯肽或其衍生物的衍生物；
c)通过在温度-78℃和150℃之间、在还原剂存在下，用有机酸或无机酸或者路易斯酸处理其中A4是
Figure GPA00001102397000195
的化合物来制备其中A4是
Figure GPA00001102397000201
的根据权利要求1的环状酯肽或其衍生物的衍生物；或
d)通过在温度-78℃和150℃之间、用取代的或未取代的烷醇和有机酸或者无机酸或路易斯酸处理其中A4是
Figure GPA00001102397000202
的化合物来制备其中A4是
Figure GPA00001102397000203
的根据权利要求1的环状酯肽或其衍生物的衍生物；
e)通过在温度-78℃和150℃之间、用取代的或未取代的烷醇和有机酸或者无机酸或路易斯酸在溶剂中或者无溶剂地处理其中A1是Gln或Asn且A4是
Figure GPA00001102397000204
其中R优选地是H、烷基、取代的烷基的化合物来制备其中A1是
Figure GPA00001102397000211
其中n＝1、2；且A4是
Figure GPA00001102397000212
其中R优选地是H、烷基、取代的烷基的化合物；
f)通过在温度-78℃和150℃之间、用脱水剂在溶剂中或者无溶剂地处理其中A1是Gln或Asn且A4是
Figure GPA00001102397000213
的化合物来制备其中A1是
Figure GPA00001102397000214
其中R优选地是H、OH、O-烷基、取代的O-烷基、O-酰基的化合物；
g)通过在温度-78℃和150℃之间、用烷化剂或酰化剂在溶剂中或者无溶剂地处理其中A4是
Figure GPA00001102397000221
且A6是Tyr的化合物来制备其中A4是
Figure GPA00001102397000222
且A6是
Figure GPA00001102397000223
其中R优选地是烷基、取代的烷基、酰基、烷氧基羰基的化合物。
环状酯肽或其衍生物或者它们的可药用盐，特别地和基本上如在说明书和/或工作实施例中所述。
本发明的环状酯肽的特定实施方案是：
Figure GPA00001102397000224
式(II))    式(III)
Figure GPA00001102397000231
式(IV)    式(V)
Figure GPA00001102397000232
式(VI)    式(VII)
Figure GPA00001102397000233
式(XI)    式(XII)
式(XIII)  式(XIV)
Figure GPA00001102397000241
式(XVII)
式(II)-(VII)、(XI)-(XIV)和(XVII)的环状酯肽可以通过本发明的藏红花软骨霉状菌菌株(DSM 19329)产生。
本发明的环状酯肽的其它特定实施方案是：
Figure GPA00001102397000242
Figure GPA00001102397000243
式(VIII)式(IX)
Figure GPA00001102397000244
式(X)
式(VIII)-(X)的环状酯肽可以通过本发明的粗柄软骨霉状菌(DSM19330)产生。
本发明的环状酯肽的其它特定实施方案是：
式(XV)    式(XVI)
式(XV)-(XVI)的环状酯肽可以通过本发明的尖软骨霉状菌(DSM21595)产生。
缩写列表
Ahp     3-氨基-6-羟基-2-哌啶酮
DSMZ    德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von
        Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)
hK7     人激肽释放酶7
HPLC    高效/压液相色谱
HTS     高通量筛查(High Throughput Screening)
IC      中间培养
ID      鉴定
MB      粘细菌
MC      主培养
PC      预培养
pO2     培养液中氧的分压(100％＝用空气饱和)
rpm     每分钟转数
SCCE    角质层胰凝乳蛋白酶
SPEX    固相提取
vvm     通气速率(每培养体积和每分钟的空气体积)
“化学残基”可以是任一有机化学部分或无机化学部分。表述“化学残基”包括但不限于取代的或未取代的脂族基如C1-C3烷基、C1-C6烷基或C1-C12烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的芳烷基、取代的或未取代的杂芳基或者卤素。例如，如在权利要求中所定义，化学残基可以是下文中描述的任一化学基团。
表述“化学残基”包括但不限于氨基酸、肽、多肽、蛋白质等。
无机化学部分的例子例如是卤素，如Br或Cl。
“脂族基”是可以含有碳原子、氢原子、卤素原子、氧原子、氮原子或其它原子的任一组合，且任选地含有一个或多个不饱和单元如双键和/或三键的非芳族部分。脂族基可以是直链的、分支状的、环状的且优选地含有大约1个和大约24个之间的碳原子，更一般地大约1个和大约12个之间的碳原子。除脂族烃基团外，脂族基包括如聚烷氧基烷基，例如聚亚烷基二醇(polyalkylene glycol)、多胺和聚亚胺。可以将这类脂族基进一步地取代。
如本文中所用的术语“C1-C3烷基”、“C1-C6烷基”或“C1-C12烷基”，指分别含有1个和3个之间的、1个和12个之间的或1个和6个之间的碳原子的饱和的、直链或支链烃基团。C1-C3烷基基团的例子包括甲基基团、乙基基团、丙基基团和异丙基基团；C1-C6烷基基团的例子包括但不限于甲基基团、乙基基团、丙基基团、异丙基基团、正丁基基团、叔丁基基团、仲丁基基团、正戊基基团、新戊基基团和正己基基团；C1-C12烷基的例子包括但不限于乙基基团、丙基基团、异丙基基团、己基基团、庚基基团、辛基基团、壬基基团、癸基基团、十一烷基基团、十二烷基基团等。
如本文中所用的术语“取代的烷基”，指由1个、2个、3个或更多个脂族取代基取代的烷基如C1-C12烷基基团或C1-C6烷基基团。
合适的脂族取代基包括但不限于--F、-Cl、--Br、--I、--OH、受保护的羟基、脂族醚、芳香醚、氧代、--NO2、--CN、用卤素任选地取代的--C1-C12-烷基(如全卤烷基)、用卤素任选地取代的C2-C12-烯基、用卤素任选地取代的--C2-C12-炔基、--NH2、受保护的氨基、--NH--C1-C12-烷基、--NH--C2-C12-烯基、--NH--C2-C12-烯基、--NH--C3-C12-环烷基、--NH-芳基、--NH-杂芳基、--NH-杂环基烷基、-二烷氨基、-二芳氨基、-二杂芳氨基、--O--C1-C12-烷基、--O--C2-C12-烯基、--O--C2-C12-炔基、--O--C3-C12-环烷基、--O-芳基、--O-杂芳基、--O-杂环基烷基、--C(O)--C1-C12-烷基、--C(O)--C2-C12-烯基、--C(O)--C2-C12-炔基、--C(O)--C3-C12-环烷基、--C(O)-芳基、--C(O)-杂芳基、--C(O)-杂环基烷基、--CONH2、--CONH--C1-C12-烷基、--CONH--C2-C12-烯基、--CONH--C2-C12-炔基、--CONH--C3-C12-环烷基、--CONH-芳基、--CONH-杂芳基、--CONH-杂环基烷基、--CO2--C1-C12-烷基、--CO2--C2-C12-烯基、--CO2--C2-C12-炔基、--CO2--C3-C12-环烷基、--CO2-芳基、--CO2-杂芳基、--CO2-杂环基烷基、--OCO2--C1-C12-烷基、--OCO2--C2-C12-烯基、--OCO2--C2-C12-炔基、--OCO2--C3-C12-环烷基、--OCO2-芳基、--OCO2-杂芳基、--OCO2-杂环基烷基、--OCONH2、--OCONH--C1-C12-烷基、--OCONH--C2-C12-烯基、--OCONH--C2-C12-炔基、--OCONH--C3-C12-环烷基、--OCONH-芳基、--OCONH-杂芳基、--OCONH-杂环基烷基、--N HC(O)--C1-C12-烷基、--NHC(O)--C2-C12-烯基、--NHC(O)--C2-C12-炔基、--NHC(O)--C3-C12-环烷基、--NHC(O)-芳基、--NHC(O)-杂芳基、--NHC(O)-杂环基烷基、--NHCO2--C1-C12-烷基、--NHCO2--C2-C12-烯基、--NHCO2--C2-C12-炔基、--NHCO2--C3-C12-环烷基、--NHCO2-芳基、--NHCO2-杂芳基、--NHCO2-杂环基烷基、--NHC(O)NH2、NHC(O)NH--C1-C12-烷基、--NHC(O)NH--C2-C12-烯基、--NHC(O)NH--C2-C12-炔基、--NHC(O)NH--C3-C12-环烷基、--NHC(O)NH-芳基、--NHC(O)NH-杂芳基、--NHC(O)NH-杂环基烷基、NHC(S)NR2、NHC(S)NH--C1-C12-烷基、--NHC(S)NH--C2-C12-烯基、--NHC(S)NH--C2-C12-炔基、--NHC(S)NH--C3-C12-环烷基、--NHC(S)NH-芳基、--NHC(S)NR-杂芳基、--NHC(S)NH-杂环基烷基、--NHC(NH)NH2、NHC(NH)NH--C1-C12-烷基、--NHC(NH)NH--C2-C12-烯基、--NHC(NH)NH--C2-C12-炔基、--NHC(NH)NH--C3-C12-环烷基、--NHC(NH)NH-芳基、--NHC(NH)NH-杂芳基、--NHC(NH)NH-杂环基烷基、NHC(NH)--C1-C12-烷基、--NHC(NH)--C2-C12-烯基、--NHC(NH)--C2-C12-炔基、--NHC(NH)--C3-C12-环烷基、--NHC(NH)-芳基、--NHC(NH)-杂芳基、--NHC(NH)-杂环基烷基、--C(NR)NH--C1-C12-烷基、--C(NH)NH--C2-C12-烯基、--C(NR)NH--C2-C12-炔基、--C(NH)NH--C3-C12-环烷基、--C(NH)NH-芳基、--C(NH)NH-杂芳基、--C(NH)NH-杂环基烷基、--S(O)--C1-C12-烷基、--S(O)--C2-C12-烯基、--S(O)--C2-C12-炔基、--S(O)--C3-C12-环烷基、--S(O)-芳基、--S(O)-杂芳基、--S(O)-杂环基烷基-SO2NH2、--SO2NH--C1-C12-烷基、--SO2NH--C2-C12-烯基、--SO2NH--C2-C12-炔基、--SO2NH--C3-C12-环烷基、--SO2NH-芳基、--SO2NH-杂芳基、--SO2NH-杂环基烷基、--NHSO2--C1-C12-烷基、--NHSO2--C2-C12-烯基、--NHSO2--C2-C12-炔基、--NHSO2--C3-C12-环烷基、--NHSO2-芳基、--NHSO2-杂芳基、--NHSO2-杂环基烷基、--CH2NH2、--CH2SO2CH3、-芳基、-芳烷基、-杂芳基、-杂芳烷基、-杂环基烷基、--C3-C12-环烷基、聚烷氧烷基、聚烷氧基、-甲氧甲氧基、-甲氧乙氧基、--SH、--S--C1-C12-烷基、--S--C2-C12-烯基、--S--C2-C12-炔基、--S--C3-C12-环烷基、--S-芳基、--S-杂芳基、-S-杂环基烷基或甲硫甲基。应当理解，可以将芳基、杂芳基、烷基等进一步取代。
如本文中所用，术语“C2-C12烯基”或“C2-C6烯基”表示通过移去单个氢原子，衍生自含有来自具有至少一个碳-碳双键的2个到12个或2个到6个碳原子的烃部分的单价基团。烯基基团包括但不限于如乙烯基、丙烯基、丁烯基、1-甲基-2-丁烯-1-基、链二烯等。
如本文中所用，术语“取代的烯基”指由1个、2个、3个或多个脂族取代基取代的如前所定义的“C2-C12烯基”或“C2-C6烯基”基团。
如本文中所用，术语“C2-C12炔基”或“C2-C6炔基”表示通过移去单个氢原子，衍生自含有来自具有至少一个碳-碳三键的2个到12个或2个到6个碳原子的烃部分的单价基团。代表性的炔基基团包括但不限于如乙炔基、1-丙炔基、1-丁炔基等。
如本文中所用，术语“取代的炔基”指由1个、2个、3个或多个脂族取代基取代的如前所定义的“C2-C12炔基”或“C2-C6炔基”基团。
如本文中所用，术语“C1-C6烷氧基”指通过氧原子结合于母分子部分的如前所述的C1-C6烷基基团。C1-C6烷氧基的例子包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基、新戊氧基和正己氧基。
如本文中所用术语“卤”和“卤素”指选自氟、氯、溴和碘的原子。
如本文中所用术语“芳基”指具有1个或2个芳族环的单环或二环碳环环系统，包括但不限于苯基、萘基、四氢萘基、2，3二氢化茚基、茚基等。
如本文中所用术语“取代的芳基”指由1个、2个、3个或更多芳族取代基取代的如前所定义的芳基基团。
芳族取代基包括但不限于--F、--Cl、--Br、--I、--OH、受保护的羟基、脂族醚、芳族醚、氧合、--NO2、--CN、用卤素任选地取代的--C1-C12-烷基(如全卤烷基)、用卤素任选地取代的C2-C12-烯基、用卤素任选地取代的--C2-C12-炔基、--NH2、受保护的氨基、--NH--C1-C12-烷基、--NH--C2-C12-烯基、--NH--C2-C12-烯基、--NH--C3-C12-环烷基、--NH-芳基、--NH-杂芳基、--NH-杂环基烷基、-二烷氨基、-二芳氨基、-二杂芳氨基、--O--C1-C12-烷基、--O--C2-C12-烯基、--O--C2-C12-炔基、--O--C3-C12-环烷基、--O-芳基、--O-杂芳基、--O-杂环基烷基、--C(O)--C1-C12-烷基、--C(O)--C2-C12-烯基、--C(O)--C2-C12-炔基、--C(O)--C3-C12-环烷基、--C(O)-芳基、--C(O)-杂芳基、--C(O)-杂环基烷基、--CONH2、--CONH--C1-C12-烷基、--CONH--C2-C12-烯基、--CONH--C2-C12-炔基、--CONH--C3-C12-环烷基、--CONH-芳基、--CONH-杂芳基、--CONH-杂环基烷基、--CO2--C1-C12-烷基、--CO2--C2-C12-烯基、--CO2--C2-C12-炔基、--CO2--C3-C12-环烷基、--CO2-芳基、--CO2-杂芳基、--CO2-杂环基烷基、--OCO2--C1-C12-烷基、--OCO2--C2-C12-烯基、--OCO2--C2-C12-炔基、--OCO2-C3-C12-环烷基、--OCO2-芳基、--OCO2-杂芳基、--OCO2-杂环基烷基、--OCONH2、--OCONH--C1-C12-烷基、--OCONH--C2-C12-烯基、--OCONH--C2-C12-炔基、--OCONH--C3-C12-环烷基、--OCONH-芳基、--OCONH-杂芳基、--OCONH-杂环基烷基、--NHC(O)--C1-C12-烷基、--NHC(O)--C2-C12-烯基、--NHC(O)--C2-C12-炔基、--NHC(O)--C3-C12-环烷基、--NHC(O)-芳基、--NHC(O)-杂芳基、--NHC(O)-杂环基烷基、--NHCO2--C1-C12-烷基、--NHCO2--C2-C12-烯基、--NHCO2--C2-C12-炔基、--NHCO2--C3-C12-环烷基、--NHCO2-芳基、--NHCO2-杂芳基、--NHCO2-杂环基烷基、--NHC(O)NH2、NHC(O)NH--C1-C12-烷基、--NHC(O)NH--C2-C12-烯基、--NHC(O)NH--C2-C12-炔基、--NHC(O)NH--C3-C12-环烷基、--NHC(O)NH-芳基、--NHC(O)NH-杂芳基、--NHC(O)NH-杂环基烷基、NHC(S)NH2、NHC(S)NH--C1-C12-烷基、--NHC(S)NH--C2-C12-烯基、--NHC(S)NH--C2-C12-炔基、--NHC(S)NH--C3-C12-环烷基、--NHC(S)NH-芳基、--NHC(S)NH-杂芳基、--NHC(S)NH-杂环基烷基、--NHC(NH)NH2、NHC(NH)NH--C1-C12-烷基、--NHC(NH)NH--C2-C12-烯基、--NHC(NH)NH--C2-C12-炔基、--NHC(NH)NH--C3-C12-环烷基、--NHC(NH)NH-芳基、--NHC(NH)NH-杂芳基、--NHC(NH)NH-杂环基烷基、NHC(NH)--C1-C12-烷基、--NHC(NH)--C2-C12-烯基、--NHC(NH)--C2-C12-炔基、--NHC(NH)--C3-C12-环烷基、--NHC(NH)-芳基、--NHC(NH)-杂芳基、--NHC(NH)-杂环基烷基、--C(NH)NH--C1-C12-烷基、--C(NH)NH--C2-C12-烯基、--C(NH)NH--C2-C12-炔基、--C(NH)NH--C3-C12-环烷基、--C(NH)NH-芳基、--C(NH)NH-杂芳基、--C(NH)NH-杂环基烷基、--S(O)--C1-C12-烷基、--S(O)--C2-C12-烯基、--S(O)--C2-C12-炔基、--S(O)--C3-C12-环烷基、--S(O)-芳基、--S(O)-杂芳基、--S(O)-杂环基烷基-SO2NH2、--SO2NH--C1-C12-烷基、--SO2NH--C2-C12-烯基、--SO2NH--C2-C12-炔基、--SO2NH--C3-C12-环烷基、--SO2NH-芳基、--SO2NH-杂芳基、--SO2NH-杂环基烷基、--NHSO2--C1-C12-烷基、--NHSO2--C2-C12-烯基、--NHSO2--C2-C12-炔基、--NHSO2--C3-C12-环烷基、--NHSO2-芳基、--NHSO2-杂芳基、--NHSO2-杂环基烷基、--CH2NH2、--CH2SO2CH3、-芳基、-芳烷基、-杂芳基、-杂芳烷基、-杂环基烷基、--C3-C12-环烷基、聚烷氧烷基、聚烷氧基、-甲氧甲氧基、-甲氧乙氧基、--SH、--S--C1-C12-烷基、--S--C2-C12-烯基、--S--C2-C12-炔基、--S--C3-C12-环烷基、--S-芳基、--S-杂芳基、--S-杂环基烷基或甲硫甲基。应当理解，可以将芳基、杂芳基、烷基等进一步取代。
如本文中所用，术语“芳烷基”指通过C1-C3烷基或C1-C6烷基残基结合于母化合物的芳基基团。例子包括但不限于苄基、苯乙基等。
如本文中所用，术语“取代的芳烷基”指由1个、2个、3个或更多芳族取代基取代的如前所定义的芳烷基基团。
如本文所用，术语“杂芳基”指这样的单环、双环或三环芳族基团或环，所述单环、双环或三环芳族基团或环具有5个到10个环原子，其中至少一个环原子选自S、O和N；0个、1个或2个环原子是独立地选自S、O和N的额外杂原子；且剩余的环原子是碳，其中在环内含有的任一N或S可以是任选地氧化的。杂芳基包括但不限于吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、噻唑基、噁唑基、异噁唑基、噻二唑基、噁二唑基、噻吩基、呋喃基、喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、喹喔啉基等。杂芳环可以通过碳原子或杂原子与化学结构键合。
如本文中所述，术语“取代的杂芳基”指由1个、2个、3个或4个芳族取代基取代的如前所定义的杂芳基基团。
如本文中所述，术语“C3-C12-环烷基”表示通过移去单个氢原子，衍生自单环或双环饱和碳环环化合物的单价基团。例子包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、二环[2.2.1]庚基和二环[2.2.2]辛基。
如本文中所用，术语“取代的C3-C12-环烷基”指由1个、2个、3个或更多个脂族取代基取代的如前所定义的C3-C12-环烷基基团。
如本文中所用，术语“杂环基烷基”指非芳族5元、6元或7元环或者双环或三环稠合系统，其中(i)每一环含有独立地选自氧、硫和氮的1个到3个之间的杂原子，(ii)每一5元环具有0个到1个双键和每一6元环具有0个到2个双键，(iii)氮杂原子和硫杂原子可以任选地是氧化的，(iv)氮杂原子可以任选地是季铵化的，(iv)任一上述环可以与苯环稠合，和(v)剩余的环原子是可以任选地氧合取代的碳原子。代表性的杂环基烷基基团包括但不限于[1，3]二氧戊环、吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基、噁唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、噻唑烷基、异噻唑烷基、喹喔啉基、哒嗪酮基和四氢呋喃基。
如本文中所用，术语“取代的杂环基烷基”指由1个、2个、3个或多个脂族取代基取代的如前所定义的杂环基烷基基团。
如本文中所用，术语“杂芳烷基”指通过C1-C3烷基残基或C1-C6烷基残基结合于母化合物的杂芳基基团。例子包括但不限于吡啶基甲基、嘧啶基乙基等。
如本文中所用，术语“取代的杂芳烷基”指由独立的替换1个、2个或3个或者多个芳族取代基取代的如前所定义的杂芳烷基基团。
如本文中所用，术语“C1-C3-烷氨基”指通过氮原子结合于母分子部分的如前所定义的1个或2个C1-C3-烷基基团。C1-C3-烷氨基的例子包括但不限于甲氨基、二甲氨基、乙氨基、二乙氨基和丙氨基。
术语“烷氨基”指具有结构-NH(C1-C12烷基)的基团，其中C1-C12烷基如前所定义。
术语“二烷氨基”指具有结构--N(C1-C12烷基)(C1-C12烷基)的基团，其中C1-C12烷基如前所定义。二烷氨基的例子包括但不限于二甲氨基、二乙氨基、甲基乙基氨基、哌啶子基等。
术语“烷氧羰基”代表通过羰基基团结合于母分子部分如烷氧基基团的酯基团，例如甲氧基羰基、乙氧基羰基等。
如本文中所用，术语“醛基”指式--CHO的群体。
如本文中所用，术语“羧基”指式--COOH的群体。
如本文中所用，术语“酰胺基”指式--C(O)NH(C1-C12烷基)或--C(O)N(C1-C12烷基)(C1-C12烷基)、--C(O)NH2、NHC(O)(C1-C12烷基)、N(C1-C12烷基)C(O)(C1-C12烷基)等的群体。
如本文中所用，术语“羟基保护基团”指本领域已知的不稳地化学部分以保护羟基基团抵抗合成过程期间不期望的反应。在所述合成过程后，如本文中所述的羟基保护基团可以选择性地移除。本领域已知的羟基保护基团一般地描述于T.H.Greene和P.G.M.Wuts，Protective Groups inOrganic Synthesis，等3版，John Wiley & Sons，纽约(1999)中。羟基保护基团的例子包括苄氧羰基、4-硝基苄氧羰基、4-溴苄氧羰基、4-甲氧基苄氧羰基、甲氧基羰基、叔丁氧羰基、异丙氧羰基、二苯基甲氧基羰基、2，2，2-三氯乙氧基羰基、2-(三甲基硅烷)乙氧基羰基、2-呋喃甲基氧基羰基、烯丙氧羰基、乙酰基、甲酰基、氯乙酰基、三氟乙酰基、甲氧乙酰基、苯氧乙酰基、苯甲酰基、甲基、叔丁基、2，2，2-三氯乙基、2-三甲基硅烷基乙基、1，1-二甲基-2-丙烯基、3-甲基-3-丁烯基、烯丙基、苄基、对甲氧苄基二苯基甲基、三苯基甲基、四氢呋喃基、甲氧基甲基、甲硫基甲基、苄氧甲基、2，2，2-三氯乙氧甲基、2-(三甲基硅烷)乙氧甲基、甲磺酰基、对甲苯磺酰基、三甲基硅烷基、三乙基硅烷基、三异丙基硅烷基等。用于本发明的优选的羟基保护基团是乙酰基(Ac或--C(O)CH3)、苯甲酰基(Bn或--C(O)C6H5)和三甲基硅烷基(TMS或--Si(CH3)3)。
如本文中所用，术语“受保护的羟基”指如上所定义的用羟基保护基团保护的羟基基团，其中所述羟基保护基团包括如苯甲酰基基团、乙酰基基团、三甲基硅烷基基团、三乙基硅烷基基团、甲氧甲基基团。
如本文中所用，术语“氨基保护基团”指本领域已知的不稳定化学部分以保护氨基基团抵抗合成过程期间不期望的反应。在所述合成过程后，如本文中所述的氨基保护基团可以选择性地移除。本领域已知的氨基保护基团一般地描述于T.H.Greene和P.G.M.Wuts，Protective Groups inOrganic Synthesis，等3版，John Wiley & Sons，纽约(1999)中。氨基保护基团的例子包括但不限于叔丁氧羰基、9-芴基甲氧基羰基、苄氧羰基等。
如本文中所用，术语“受保护的氨基”指如上所定义的用氨基保护基团保护的氨基基团。
术语“酰基”包括衍生自酸的残基，其中所述酸包括但不限于羧酸、氨基甲酸、碳酸、磺酸和亚磷酸。例子包括脂肪族羰基、芳族羰基、脂肪族磺酰基、芳族亚磺酰基、脂肪族亚磺酰基、芳族磺酰基、脂肪族氨磺酰基、芳族氨磺酰基、芳族磷酰基和脂肪族磷酰基。
“氨基酸”是具有通式NH2CHRCOOH的含有氨基和羧基官能团二者的分子。术语氨基酸包括标准氨基酸和非标准氨基酸。
“标准氨基酸”是丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
“不为天冬氨酸的标准氨基酸”选自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。在谷氨酰胺或谷氨酸的情况下，“它们的衍生物”是如腈或酯，例如谷氨酰胺腈、谷氨酸酯。
“非标准氨基酸”是不为标准氨基酸中之一的氨基酸(含有氨基和羧基官能团二者的分子)。它们的例子是硒代半胱氨酸(在UGA密码子处掺入到一些蛋白质中)、吡咯赖氨酸(由一些产甲烷细菌在酶中使用以产生甲烷并用密码子UAG编码)、羊毛硫氨酸、2-氨基异丁酸、脱氢丙氨酸、3-氨基-6-羟基-2-哌啶酮、γ-氨基丁酸、鸟氨酸、瓜氨酸、高胱氨酸、多巴胺、或羟脯氨酸。
“非碱性标准氨基酸”是丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
“Ahp”(3-氨基-6-羟基-哌啶-2-酮)是例如在蓝细菌(cyanobacteria)中发现的非标准氨基酸。“Ahp衍生物”包括但不限于3-氨基-3，4-二氢-1H-吡啶-2-酮(脱氢AHP)、3-氨基-哌啶-2-酮和AHP的醚衍生物和酯衍生物。优选的Ahp衍生物是3-氨基-哌啶-2-酮或如下所描述的Ahp-I或者Ahp-II，其中R选自(C1-12)烷基、(C2-12)烯基、(C2-12)炔基、卤代(C1-12)烷基、(C1-12)烷氧基(C1-12)烷基、(C1-12)烷氧基(C1-12)烷氧基(C1-12)烷基、羟基(C1-12)烷基、苯基和苯基(C1-6)烷基。
非标准氨基酸的这个家族的不同成员是：
Figure GPA00001102397000351
3-氨基-6-羟基-哌啶-2-酮(Ahp)
Figure GPA00001102397000352
Figure GPA00001102397000353
3-氨基-3，4-二氢-1H-吡啶-2-酮(脱氢-AHP)
Figure GPA00001102397000354
3-氨基-哌啶-2-酮
脯氨酸衍生物包括如5-羟脯氨酸。
“氨基酸衍生物”包括但不限于O-烷基、O-芳基、O-酰基、S-烷基、S-芳基、S-S-烷基、烷氧羰基、O-羰基-烷氧基、碳酸酯、O-羰基-芳氧基、O-羰基-烷氨基、O-羰基-芳基氨基、N-烷基、N-二烷基、N-三烷基铵、N-酰基、N-羰基-烷氧基、N-羰基-芳氧基、N-羰基-烷氨基、N-羰基-芳基氨基、N-磺酰烷基或N-磺酰芳基。
“非碱性标准氨基酸衍生物”包括但不限于O-烷基、O-芳基、O-酰基、S-烷基、S-芳基、S-S-烷基、烷氧羰基、O-羰基-烷氧基、碳酸酯、O-羰基-芳氧基、O-羰基-烷氨基、O-羰基-芳基氨基、N-烷基、N-二烷基、N-三烷基铵、N-酰基、N-羰基-烷氧基、N-羰基-芳氧基、N-羰基-烷氨基、N-羰基-芳基氨基、N-磺酰烷基或N-磺酰芳基。
“酪氨酸衍生物”包括但不限于-O-烷基、O-芳基、O-杂芳基、O-酰基、O-PO3H和O-SO3H以及卤化物，在邻位或间位。
酪氨酸的OH基团可以是OR，其中R R选自氢、(C1-12)烷基、(C2-12)烯基、(C2-12)炔基、卤代(C1-12)烷基、卤代(C2-12)烯基、卤代(C2-12)炔基、(C1-12)烷氧羰基、(C1-12)烷氧基-羰基(C1-12)烷基、(C1-12)烷基氨基羰基，所述基团未被取代或者被芳基、芳基烷基、芳基烯基或芳基炔基、杂环基和杂环基烷基进一步取代。
“酯肽衍生物”包括但不限于如本文中所述的修饰的酯肽和那些在以下的实施例中特别地描述的酯肽。所述衍生物可以使用本领域熟知的方法制备。
本发明进一步涉及本发明化合物的可药用盐和衍生物以及涉及获得此类化合物的方法。获得化合物的一种方法是通过在合适的条件下，培养本发明的软骨霉状菌属菌株或其突变体或者其变体，优选地使用下文中描述的发酵方法。
具有至少一个盐形成基团的本发明化合物的“盐”可以以本身已知的方式制备。例如，具有酸基团的本发明化合物的盐可以，如通过用金属化合物例如合适的有机羧酸的碱金属盐如2-乙基己酸的钠盐、用有机碱金属化合物或碱土金属化合物例如相应的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐如氢氧化钠或者氢氧化钾、碳酸盐或碳酸氢盐、用相应的钙化合物或者用氨或合适的有机胺处理化合物来形成，优选地使用化学计算的量或仅少量过量的盐形成剂。本发明化合物的酸加成盐以常规方式，如通过用酸或合适的阴离子交换剂处理化合物来获得。含有酸性和碱性盐形成基团如游离的羧基基团和游离的氨基基团的本发明化合物的内盐可以如通过例如用弱碱中和盐如酸加成盐到等电点或者通过用离子交换剂处理来形成。
盐可以以常规方式转化为游离化合物；金属盐和铵盐可以如通过用合适的酸和酸加成盐处理、如通过用合适的碱试剂处理来转化。
根据本发明可获得的异构体的混合物可以以本身已知的方式分离成分别的异构体；非对应异构体可以如通过在多相溶剂混合物间分配、重结晶和/或例如在硅胶上的层析分离或者通过如在反向柱上的中压液相层析来分离，且消旋物可以如通过用光学纯盐形成试剂的盐的形成来分离以及如通过分级结晶(fractional crystallisation)的方法或通过在光学活性柱材料上的层析来如此地获得非对应异构体混合物的分离。
中间物和终产物可以根据标准方法，如使用层析法、分配法、(重结晶)结晶等来加工和/或纯化。
本发明的环状酯肽可以抑制胰凝乳蛋白酶样蛋白酶。胰凝乳蛋白酶样蛋白酶的例子是弹性蛋白酶和激肽释放酶7。特别地，本发明的环状酯肽是激肽释放酶7的极好的抑制物。
“抑制物”是以小于100μM，如50μM、30μM、20μM或10μM的测量IC50抑制酶促反应的环状酯肽。特别优选地是具有针对人激肽释放酶7的小于30μM的IC50的环状酯肽，例如具有小于10μM、1μM、100nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM或更少的IC50的环状酯肽。例如，实施例5、19和33的化合物分别显示0.009μM、0.007μM、0.005μM的IC50值。可以使用能购自Biosyntan(Berlin，德国)的荧光-猝灭底物Ac-Glu-Asp(EDANS)-Lys-Pro-Ile-Leu-Phe^Arg-Leu-Gly-Lys(DABCYL)-Glu-NH2(其中^指可切键(scissile bond)，由MS分析鉴定)来测量针对人激肽释放酶的IC50。酶促反应在pH5.6含有150mM NaCl和0.05％(w/v)CHAPS的50mM柠檬酸钠缓冲液中进行。对于IC50值的确定，测定在384孔板中室温进行。所有最终测定体积是30μl。将测试化合物溶解于90％(v/v)DMSO/水中并在水(含有0.05％(w/v)CHAPS)中稀释至3倍于期望的测定浓度。11个最终化合物浓度是：0.3nM、1nM、3nM、10nM、30nM、100nM、300nM、1μM、3μM、10μM和30μM。对于每一测定，将10μl水/CHAPS(±测试化合物)加入到每孔，然后加入10μl蛋白酶溶液(用1.5×测定缓冲液稀释)。最终测定溶液中的蛋白酶浓度是0.2nM(根据由Bradford方法确定的酶浓度)。室温孵育1小时后，反应通过添加10μl底物溶液(底物溶解于1.5×测定缓冲液，终浓度是2μM)来开始。化合物对酶活性的影响获自线性进展曲线并通过两个读数来确定，第一个在添加底物后(t＝0分钟)直接获得和第二个在1小时后(t＝60分钟)。使用非线性回归分析软件(Xlfit，4.0版；ID Business Solution Ltd.，Guildford，Surrey，UK)，通过对抑制物浓度绘制的抑制百分数来计算IC50值。
因此，可以使用环状酯肽治疗或预防的“疾病”和“病症”是已知的与胰凝乳蛋白酶样蛋白酶相关的疾病。更优选地是已知的与弹性蛋白酶或激肽释放酶7活性相关的疾病。同等优选地是已知的与人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶相关的疾病。因此，可以使用本发明的环状酯肽治疗或预防的疾病和病症包括疼痛、急性炎症、慢性炎症、关节炎、关节发炎、滑囊炎、骨关节炎、类风湿性关节炎、少年类风湿性关节炎、脓毒性关节炎、纤维肌痛综合征、全身性红斑狼疮、静脉内炎、肌腱炎、皮疹、银屑病、痤疮、湿疹、面部脂溢性湿疹、手部湿疹、脸部湿疹或颈部湿疹、包皮感染、脚癣、瘘感染、感染的局部溃疡、新生儿肚脐感染、皱纹、瘢痕、瘢痕疙瘩、疖、疣和过敏性痒病、痔、创伤、创伤感染、烧伤创面、霉菌感染和免疫疾病包括自身免疫疾病。使用本发明的环状酯肽治疗和预防的优选的疾病包括慢性阻塞性肺疾病(包括肺气肿和慢性支气管炎)、慢性和急性间质性肺炎、特发性间质性肺炎(IIP)、弥漫性全细支气管炎、囊性肺纤维化、急性肺损伤(ALI)/急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、支气管扩张、哮喘、胰腺炎、肾炎、肝炎(肝衰竭)、慢性类风湿性关节炎、关节硬化、骨关节炎、银屑病、牙周病、动脉粥样硬化、器官移植排斥、由缺血/再灌注引起的组织损伤、休克、败血病、血液凝血病包括弥散性血管内凝血(DIC)和深静脉内血栓、结膜炎、角膜炎、角膜溃疡、节段性回肠炎、全身性红斑狼疮。使用本发明的环状酯肽治疗和预防的更优选的疾病和病症是包括但不限于炎症和/或过度增生和瘙痒性皮肤疾病如疤痕疙瘩、肥厚性瘢痕、痤疮、遗传过敏性皮炎、银屑病、内瑟顿综合征或其它瘙痒性皮肤病例如结节性痒疹、老年人的非特异性痒病以及其它具有上皮屏障功能异常的疾病如炎性肠炎和节段性回肠炎、囊性纤维化(CF)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肺纤维化、成人型呼吸窘迫综合征、慢性支气管炎、遗传性肺气肿、类风湿性关节炎、IBD、银屑病、哮喘的“上皮功能异常”或“上皮疾病”。在另一优选的实施方案中，本发明的环状酯肽可以用于治疗癌症，特别是卵巢癌。
因此，使用本发明的环状酯肽可以优选地治疗和预防的疾病和病症包括炎症和/或过度增生和瘙痒性皮肤疾病如疤痕疙瘩、肥厚性瘢痕、痤疮、遗传过敏性皮炎、银屑病、脓疱性银屑病、酒渣鼻、内瑟顿综合征或其它瘙痒性皮肤病例如结节性痒疹、老年人的非特异性痒病以及其它具有上皮屏障功能异常的疾病如衰老的皮肤、炎性肠炎和节段性回肠炎以及胰腺炎，或癌症特别是卵巢癌、囊性纤维化(CF)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肺纤维化、成人型呼吸窘迫综合征、慢性支气管炎、遗传性肺气肿、类风湿性关节炎、IBD、银屑病和哮喘。
因此，使用本发明的环状酯肽可以更优选地治疗和预防的疾病和病症包括疤痕疙瘩、肥厚性瘢痕、痤疮、遗传过敏性皮炎、银屑病、脓疱性银屑病、酒渣鼻、内瑟顿综合征或其它瘙痒性皮肤病例如结节性痒疹、老年人的非特异性痒病以及其它具有上皮屏障功能异常的疾病如衰老的皮肤、炎性肠炎和节段性回肠炎以及胰腺炎，或癌症特别是卵巢癌。
因此，使用本发明的环状酯肽可以同等优选地治疗和预防的疾病和病症包括囊性纤维化(CF)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肺纤维化、成人型呼吸窘迫综合征、慢性支气管炎、遗传性肺气肿、类风湿性关节炎、IBD、银屑病和哮喘。
使用本发明的环状酯肽可以甚至更优选地治疗和预防的疾病和病症包括疤痕疙瘩、肥厚性瘢痕、痤疮、遗传过敏性皮炎、银屑病、脓疱性银屑病、酒渣鼻、内瑟顿综合征或其它瘙痒性皮肤病例如结节性痒疹、老年人的非特异性痒病以及其它具有上皮屏障功能异常的疾病如衰老的皮肤。
人激肽释放酶7(hK7)是定位于人皮肤中的具有丝氨酸蛋白酶活性的酶。最先将其描述为角质层胰凝乳蛋白酶(SCCE)并可能通过剪切角质层的蛋白质(如，角膜锁链蛋白和斑珠蛋白)在角质层的脱鳞片中起作用。角质层是表皮的屏障形成的最外层且由高度有组织的脂质围绕的角质化上皮组成。它通过表皮分化连续地形成且在正常表皮中，角质层的恒定厚度通过角质形成细胞的增殖和脱鳞片之间的平衡来维持。在炎性皮肤疾病中SCCE的增强表达可以是病原学显著的(Hansson等人(2002))。发现在表皮角质形成细胞中表达人激肽释放酶7的转基因小鼠发展为具有增加的表皮厚度、过度角化、皮肤炎症和严重瘙痒的病理学皮肤改变。已经报道了在角质层胰凝乳蛋白酶基因的3’UTR插入的4bp(AACC)与遗传过敏性皮炎之间的遗传相关性(Vasilopoulos等人(2004))，提出该酶在遗传过敏性皮炎的发展中可能具有重要的作用。遗传过敏性皮炎是影响15％-20％的儿童的具有受损的皮肤屏障的疾病。
激肽释放酶7是显示胰凝乳蛋白酶样活性的激肽释放酶基因家族的S1丝氨酸蛋白酶。激肽释放酶7(hK7、KLK7或角质层胰凝乳蛋白酶(SCCE)，Swissprot P49862)在皮肤生理学中起着重要的作用(1，2，3)。其主要表达于皮肤中且已经报道了在皮肤生理学中起着重要作用。在脱鳞片过程中，hK7参与角质化鳞状上皮中胞内内聚结构的降解。脱鳞片过程是充分调节的并与角化细胞的从头产生微妙地平衡以维持角质层的恒定厚度，皮肤的最外层关键地参与了皮肤屏障功能。在这点上，报道了hK7能剪切角化桥粒蛋白质角膜锁链蛋白和桥粒胶蛋白1(4，5，6)。这两种角化桥粒的降解对脱鳞片是需要的。此外，最近已经显示两种脂质加工酶β-葡糖脑苷脂酶和酸性鞘磷脂酶可以由hK7降解(7)。两种脂质加工酶都与它们的底物葡糖神经酰胺和鞘磷脂共分泌并将这些极性脂质前体加工成它们的多种非极性产物如神经酰胺，其随后掺入到胞外片层膜中。片层膜构造对功能性皮肤屏障是关键的。最后，hK7在体外已经显示出使白细胞介素-1β(IL-1β)前体活化成其活性形式(8)。因为角质形成细胞表达IL-1β，但并非为特异的IL-1β转化酶的活性形式(ICE或胱天蛋白酶1)，所以认为人表皮中IL-1β活化通过另一蛋白酶，潜在的候选物hK7来发生。
最近的研究将hK7增加的活性与炎性皮肤疾病如遗传过敏性皮炎、银屑病或内瑟顿综合征联系起来。这可能引起角化桥粒的非控制性降解而导致错误调节的脱鳞片、引起脂质加工酶增强的降解而导致受干扰的片层膜构造或者促炎细胞因子IL-1β的非控制性活化。最后结果可能是受损的皮肤屏障功能和炎症(也参见WO-A-2004/108139)。
由于hK7活性受几种水平控制的事实，所以多种因素可以是在炎性皮肤疾病中造成增加的hK7活性的原因。首先，表达的蛋白酶的量可以通过遗传因素影响。最近描述了这种遗传联系，在hK7基因中3’-UTR的多态性(9)。作者假设在激肽释放酶7基因的3’-UTR中插入所述4个碱基对稳定了hK7mRNA并导致hK7的过量表达。第二，由于hK7以酶原通过片层体分泌到角质层胞外区且不能自活化，所以其需要通过另一蛋白酶如hK5来活化(5)。这种激活酶的非控制性活性可以导致hK7的过度活化。第三，活化的hK7能通过天然抑制物如LEKTI、ALP或抑弹性蛋白酶蛋白来抑制(10，11)。这类抑制物的减少表达或缺少可能导致hK7增强的活性。最近发现，在编码LEKTI的spink5基因中的突变是内瑟顿综合征的原因(12)，且该基因中的单点突变与遗传过敏性皮炎相关(13，14)。最后，控制hK7活性的另一水平是pH。hK7具有中性到稍微碱性pH最适度(2)且在皮肤中存在从最内层到最外层的从中性到酸性的pH梯度。环境因素如肥皂可以导致关于hK7的pH最适度的角质层的最外层中pH增加，从而增加hK7活性。
hK7增加的活性与包括炎症和过度增生皮肤疾病的具有受损的皮肤屏障的皮肤疾病相关的假设通过以下研究支持：首先，内瑟顿综合征患者显示了丝氨酸蛋白酶活性的表型依赖性增加、角化桥粒减少、脂质加工酶β-葡糖脑苷脂酶和酸性鞘磷脂酶减少以及受损的屏障功能(15，16)。第二，过量表达人激肽释放酶7的转基因小鼠显示出与在患遗传过敏性皮炎的患者中发现的皮肤表型相似的皮肤表型(17，18，19)。第三，描述了在遗传过敏性皮炎和银屑病患者的皮肤中升高的hK7水平(17，20)。此外，K7增加的活性以及因此上皮屏障功能异常也可以在其它上皮疾病如炎性肠病和节段性回肠炎的病理学中起重要作用。
因此，认为hK7是治疗涉及具有上皮功能异常如炎症和/或过度增生疾病以及瘙痒性皮肤疾病如疤痕疙瘩、肥厚性瘢痕、痤疮、遗传过敏性皮炎、银屑病、脓疱性银屑、酒渣鼻、内瑟顿综合征或者其它瘙痒皮肤病如结节性痒疹、老年人的非特异性痒病以及其它具有上皮屏障功能异常的疾病如衰老的皮肤、炎性肠病和节段性回肠炎以及胰腺炎、或癌症特别是卵巢癌的潜在靶，并且需要其特异的调节物(激动物或抑制物)。
人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE，也称为人白细胞弹性蛋白酶，HLE)属于丝氨酸蛋白酶的胰凝乳蛋白酶家族。它的催化活性最优地大约为pH7，且催化位点包含形成所谓的催化三联体的3个氢键氨基酸残基：His57、Asp102和Ser195(在胰凝乳蛋白酶中的编号)。所述酶包含218个氨基酸残基和4个二硫键的单肽链。它显示出与其它弹性蛋白溶解性或非弹性蛋白溶解性丝氨酸蛋白酶30％到40％的序列同一性。HNE优先地剪切在P1位置处具有Val的氧化的胰岛素B链，但是它也水解在P1位置处具有Ala、Ser或Cys的键。
HNE定位于多形核白细胞(PMNL)的嗜天青颗粒中，其中HNE的浓度相当高(3μg的酶/106个细胞)。主要生理功能是消化细菌和免疫复合物以及参与宿主防御过程。HNE帮助嗜中性粒细胞对趋化因子做出反应的从血液到多种组织如呼吸道的迁移。HNE也参与创伤愈合、组织修复和PMNL的凋亡。
除弹性蛋白(肺结缔组织、动脉、皮肤和韧带的高度灵活和高度疏水组分)外，HNE剪切许多具有重要生物学功能的蛋白质，包括胶原蛋白的不同类型、膜蛋白质和软骨蛋白聚糖。HNE也通过活化原胶原酶、前基质溶素、前明胶酶来间接促进胞外基质蛋白质的分解。HNE失活许多内源蛋白酶抑制物如α2-抗纤溶酶、α1-抗胰凝乳蛋白酶、抗凝血酶、和金属蛋白酶的组织抑制物。
胞外弹性蛋白酶活性在肺系统中通过α1-蛋白酶抑制物(α1PI)密切地控制，负责保护下呼吸道免于促弹性组织离解的损伤，而分泌的白细胞蛋白酶抑制物主要保护上呼吸道。在许多肺病理生理状态如肺气肿、慢性支气管炎和囊性纤维化中，内源弹性蛋白酶抑制物在调节HNE活性中是效率低的。
认为HNE是与炎性疾病如肺气肿、成人性呼吸窘迫综合征(ARDS)、慢性支气管炎、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肺动脉高压和其它炎性疾病以及早产新生儿中支气管肺发育异常相关的组织损伤的首要来源。HNE涉及通常与呼吸道炎性疾病相关的增加的和异常的呼吸道分泌物的发病机理。因此，来自患慢性支气管炎和囊性纤维化患者的支气管肺泡灌洗(BAL)液具有增加的HNE活性。此外，已经提出，过量的弹性蛋白酶不仅对这些慢性炎性疾病也对急性炎性疾病如ARDS和败血性休克起作用。
因此，认为HNE是用于治疗涉及具有HNE活性的疾病如炎性疾病例如肺气肿、成人性呼吸窘迫综合征(ARDS)、慢性支气管炎、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肺动脉高压和其它炎性疾病以及早产新生儿中支气管肺发育异常的疾病，以及涉及具有增加的和异常的呼吸道分泌物和急性炎性疾病的疾病的潜在靶。因此，需要特异的HNE的调节物(激动物或抑制物)。
治疗可分别通过局部的或全身的应用如乳膏剂、软膏剂和栓剂或者经口的或皮下的或者静脉内的应用或借助吸入。
在一个方面中，根据本发明的酯肽通过培养2007年4月24日保藏在DSMZ的藏红花软骨霉状菌菌株(DSM 19329)来获得或通过培养2007年4月24日保藏在DSMZ的粗柄软骨霉状菌菌株(DSM 19330)来获得或者通过培养2008年6月23日保藏在DSMZ的尖软骨霉状菌菌株(DSM21595)来获得。
菌株的保藏根据国际承认的用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约的条款进行。基于颁布的专利，保藏的菌株将是不能取消的且无限制和无条件地向公众公开。保藏的菌株仅方便地提供给本领域的技术人员，且并非承认保藏对实施是必需的。
应当理解，本发明不限于特定的菌株藏红花软骨霉状菌和粗柄软骨霉状菌以及尖软骨霉状菌的培养。相反地，本发明考虑了其它能产生酯肽的生物，如菌株的突变体或变体的培养，所述菌株的突变体或变体可以通过已知的方法如X射线照射、紫外线照射、用化学诱变剂处理、噬菌体暴露、抗生素选择等从所述生物衍生。
本发明的酯肽可以是由多种微生物生物合成的。可以合成本发明化合物的微生物包括但不限于粘球菌目的细菌，也称作粘细菌。属于粘球菌属的成员的非限制性例子包括软骨霉状菌属、堆囊菌属(Sorangium)、多囊菌属(Polyangium)、Byssophaga、单囊菌属(Haploangium)、Jahnia、侏囊菌属(Nannocystis)、Koffleria、粘球菌属(Myxococcus)、珊瑚球菌属(Corallococcus)、孢囊杆菌属(Cystobacter)、原囊粘菌属(Archangium)、标桩菌属(Stigmatella)、Hyalangium、蜂窝囊菌属(Melittangium)、Pyxicoccus。粘细菌的分类学是复杂的且参考文献是Garrity GM，Bell JY，Lilburn TG(2004)Taxonomic outline of theprokaryotes，Bergey’s manual of systematic bacteriology，第二版，2004年5月发表5.0。(http://141.150.157.80/bergeysoutline/main.htm)。
通过接种藏红花软骨霉状菌或粗柄软骨霉状菌或者尖软骨霉状菌的培养物，在受控条件下，结构式(I-XVII)的化合物通过合适的培养基的需氧发酵产生。合适的培养基优选地是含水的并含有可同化的碳、氮和无机盐的源。
合适的培养基非限制性地包括在以下的实施例1和2中提及的生长培养基。发酵在温度范围为大约10℃到大约40℃进行大约3天到20天；但是对于最佳的结果，优选地是在大约30℃进行发酵。营养培养基在发酵期间的pH可以是大约6.0到大约9.0。
用产生酯肽的微生物接种的培养基可以在需氧条件下使用如旋转摇床或搅拌釜发酵罐进行孵育。通气可以在孵育期间通过注入空气、氧气或合适的气体混合物到接种培养基中来实现。一旦已经积累了足够量的酯肽化合物，可以将它们浓缩并以常规的和通常的方式，如通过提取和层析方法、沉淀或结晶和/或以本文中公开的方式从培养物中分离。作为提取的例子，可以将培养物与合适的有机溶剂如正丁醇、乙酸乙酯、环己烷、正己烷、甲苯、醋酸正丁酯或4-甲基-2-戊酮混合并搅拌，在有机层中的酯肽化合物可以在减压下通过除去溶剂来回收。所得的残留物可以用如水、乙醇、甲醇或它们的混合物来任选地重构，并用合适的有机溶剂如己烷、四氯化碳、二氯甲烷或它们的混合物来再提取。在除去溶剂后，可将化合物如通过层析方法来进一步纯化。作为层析的例子，可以应用固定相如硅胶或氧化铝，使用有机洗脱溶剂或者它们的混合物，其中所述的有机洗脱溶剂包括醚、酮、酯、卤代烃或醇；或者在具有多种官能团的经修饰的硅胶上并用有机溶剂或它们的含水混合物如乙腈、甲醇或四氢呋喃在不同pH洗脱的反向层析。另一例子是分配层析，例如以固体-液体模式或以液体-液体模式。也可以应用如使用Sephadex LH-20(Sigma-Aldrich)并用不同溶剂优选地用醇洗脱的大小排阻层析。
如在本领域是通常的，生产以及回收和纯化过程可以通过多种分析方法监测，所述分析方法包括生物测定法、TLC、HPLC或它们的组合，并应用不同的检测方法，对于TLC一般地是UV光、碘蒸气或喷雾染色试剂，对于HPLC一般地是UV光、质量敏感型方法或光散射法。例如，HPLC技术由使用具有功能化硅胶的反向柱来代表，并应用为极性水可混溶剂和特定pH的水的线性梯度混合物的洗脱液，以及使用不同波长的UV光和质量敏感型检测器的检测方法。
由微生物生物合成的酯肽任选地经受随机的和/或定向的化学修饰以形成为衍生物或结构类似物的化合物。具有类似的功能活性的这类衍生物或结构类似物在本发明的范围内。酯肽可以任选地使用本领域熟知的和本文中所述的方法进行修饰。
例如，本发明酯肽的衍生物可以通过衍生式
Figure GPA00001102397000451
的环状酯肽来制备，
其包括
a)通过在温度-78℃和150℃之间、优选地在-30℃和室温之间、用有机酸或无机酸如三氟乙酸、硫酸、盐酸或路易斯酸如醚合三氟化硼在溶剂例如二氯甲烷、THP中或没有溶剂地处理其中A4是
的化合物来制备其中A4是
Figure GPA00001102397000462
的化合物。
b)通过在温度-50℃和100℃之间，优选地在室温、在催化剂如钯存在下在溶剂例如2-丙醇中，使用分子氢或其源如环己烯、甲酸铵处理其中A4是
Figure GPA00001102397000463
的化合物来制备其中A4是
Figure GPA00001102397000464
的化合物。
c)通过在温度-78℃和150℃之间、优选地在-50℃和室温之间、用有机酸或无机酸如硫酸、盐酸或路易斯酸如醚合三氟化硼在还原剂如三乙基硅烷存在下在溶剂如二氯甲烷、THF中或没有溶剂地处理其中A4是
Figure GPA00001102397000471
的化合物来制备其中A4是
Figure GPA00001102397000472
的化合物。
d)通过在温度-78℃和150℃之间、优选地在-30℃和50℃之间、用取代的或未取代的烷醇和有机酸或无机酸如三氟乙酸、硫酸、盐酸或路易斯酸如金属盐在溶剂例如取代的和未取代的烷醇、THF、二氯甲烷，优选地取代的和未取代的烷醇中或者没有溶剂地处理其中A4是
Figure GPA00001102397000473
的化合物来制备其中A4是
Figure GPA00001102397000474
的化合物。
e)-通过在温度-78℃和150℃之间、优选地在-30℃和室温之间、用取代的或未取代的烷醇和有机酸或无机酸如三氟乙酸、硫酸、盐酸或路易斯酸如醚合三氟化硼在溶剂例如取代的和未取代的烷醇、THF、二氯甲烷，优选地取代的和未取代的烷醇中或者没有溶剂地处理其中A1是Gln或Asn且A4是
其中R优选地是H、烷基、取代的烷基的化合物来制备其中A1是
其中n＝1、2且A4是
Figure GPA00001102397000483
其中R优选地是H、烷基、取代的烷基的化合物。
f)通过在温度-78℃和150℃之间、优选地在-30℃和室温之间、用脱水剂如三氟乙酸酐在碱如二异丙基乙基胺(DIPEA)存在下在溶剂例如二氯甲烷中或没有溶剂地处理其中A1是Gln或Asn且A4是
Figure GPA00001102397000484
的化合物来制备其中A1是
Figure GPA00001102397000491
其中n＝1、2且A4是
Figure GPA00001102397000492
其中R优选地是H、OH、O-烷基、取代的O-烷基、O-酰基的化合物。
g)通过在温度-78℃和150℃之间，优选地在-30℃和室温之间，优选地通过超声促进，使用烷化剂如碘代甲烷、苄基溴、炔丙基溴(proargylbromide)或酰化剂如氯甲酸乙酯或烷基异氰酸酯或者芳基异氰酸酯在碱如碳酸钠存在下在溶剂例如DMF中或没有溶剂地处理其中A4是
Figure GPA00001102397000493
且A6是Tyr的化合物来制备其中A4是
Figure GPA00001102397000494
且A6是
Figure GPA00001102397000501
其中R优选地是烷基、取代的烷基、酰基、烷氧羰基的化合物。
除非另外说明，在说明书和权利要求中使用的所有表达成分的性质、属性如分子量、反应条件、IC50等的数字应当理解为在所有例子中由术语“大约”修饰。因此，除非相反地说明，在本说明书和附属的权利要求中列出的数字参数是近似值。至少，并不期望限制与权利要求的范围等同原则的申请，每一数字参数应当至少按照有效数字的数和通过应用普通的四舍五入法(rounding technique)来理解。尽管本发明广范围显示的数字范围和参数是近似值，但是在实施例、表和图中所设定的数字值是尽可能精确地报道的。任一数字值可固有地含有由在实验、测试测量、统计分析等中的变量导致的某些误差。
除非另外定义，本文中所用的所有技术的和科学的术语具有与由本发明所属领域普通技术人员通常的理解相同的含义。尽管与本文中所述的那些相似或等同的方法和材料可以用于本发明的实践或测试，但是合适的方法和材料描述如下。本文中提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献以其整体引入作为参考。在冲突的情况下，本说明书包括定义将用来限定。此外，材料、方法和实施例仅是说明性的并不意为限制。
实施例
实施例1
化合物的产生
实施例1.1  式(II)-(VII)、(XI)-(XIV)和(XVII)的化合物的产生
菌株：藏红花软骨霉状菌菌株分离自环境样品，核桃树的腐木，是在我们实验室分离的。
基于子实体的形态学以及基于16S-RNA基因的部分序列，已经将菌株明确地鉴定为藏红花软骨霉状菌。藏红花软骨霉状菌由DSMZ(DSMZ(2007))分组为生物危险群体1。软骨霉状菌属是多囊菌科中的属，所述软骨霉状菌属属于δ-变形杆菌内的粘球菌目。粘球菌目的细菌，也称为粘细菌是具有两个区别于大多数其它细菌的特征的革兰氏阴性杆状细菌。它们使用活性滑行机制在固体表面群集，且当饥饿时，它们聚集以形成子实体(Kaiser(2003))。
已经将本发明的藏红花软骨霉状菌株保藏在DSMZ，在保藏号19329下。
本发明的藏红花软骨霉状菌株作为纯培养物是不能生存的且在没有伴菌株(companion strain)的情况下是不能维持的。通过在琼脂板(LB培养基)上划线分离一份发酵共培养物可将伴菌株以纯培养物形式获得并保存。相似的观察由Reichenbach组(Jacobi等人(1996)、Jacobi等人(1997))实施。基于本发明藏红花软骨霉状菌株的伴菌株的16S-rRNA基因的部分DNA序列，最接近的匹配物是来自α-变形杆菌内的根瘤菌目(Rhizobiales)的Bosea Thiooxidans。研究的16S-rRNA的424bp序列片段具有与来自基因库的序列AF508112(B.thiooxidans)大约98％的同一性(至少8个核苷酸交换)。B.Thiooxidans分离自收集自印度加尔各答附近不同农田的土壤样品。在一些有机底物存在时，它能氧化还原无机硫化合物并在1996年被描述为新物种和新属(Das等人(1996))。来源于所有5种所描述的Bosea物种的部分16S-RNA序列的进化系统树表明分离自藏红花软骨霉状菌的Bosea伴菌株的独立的位置。
培养：根据以下方法进行100L发酵罐培养：
通过接种来自本发明的藏红花软骨霉状菌株的液体培养物的5ml(＝10％)到在200-ml带挡板的摇瓶中的50ml培养基MD1(采用Bode等人2003，参见表6)中来开始预培养。在旋转摇床上30℃和120转/分钟孵育11天后，通过接种来自预培养物的每个10ml(＝10％)到在500-ml带挡板的摇瓶中的5×100ml的培养基MD1中来开始第一次中间培养。在旋转摇床上30℃和120转/分钟孵育7天后，通过接种来自第一次中间培养物的每个25ml(＝5％)到在2-L不带挡板的摇瓶中的19×500ml的培养基MD1中来开始第二次中间培养。在旋转摇床上30℃和150转/分钟孵育6天后，将全部第二次中间培养物(9.5升＝9.5％)用于接种100升的生产培养基POL1。(采用Kunze等人1995，参见表7)
这种100-L主培养在物100-L刻度钢制槽式发酵罐中进行。温度控制在30℃，通气是20升/分钟(＝0.2vvm)且搅拌速度是50转/分钟。在发酵罐容器内维持0.5巴的稍微超压力。通过受控制地添加3N H2SO4或3NNaOH来维持培养pH在6.9-7.1。在大约1天的滞后期后，氧消耗加速大约4天，这表明培养物的指数生长。在最后2天期间，氧消耗稍微降低表明培养物的静止期。7天后，收获了具有滴度为5.3mg/l的根据式II的环状酯肽的培养物。
提取：将全部发酵培养液转移至1600升钢制容器内并沉降1小时。通过经纸滤器过滤从底部部分收获湿的细胞沉淀(200g)。通过每次用10升乙酸乙酯混合(turaxing)细胞沉淀30分钟，将细胞沉淀提取3次。然后，将残留水从溶剂相分开。将溶剂相用5升水洗并然后蒸发以获得称为‘细胞提取物’的干的提取物。培养物滤液用200升乙酸乙酯提取。2小时接触时间包括1小时的混合后，将有机相分开，用20升水洗并最后蒸发以获得称为‘培养物滤液提取物’的干的提取物。
化合物分离：将培养物滤液提取物(4.4g)溶解于80mL甲醇中。通过离心将可溶成分除去并将上清液蒸发至干产生3.3g提取物。将提取物溶解于7.5mL MeOH、3mL DMSO和0.5mL二氯甲烷中并使用0.01％甲酸(溶剂A)和含有0.1％甲酸的乙腈(溶剂B)作为溶剂通过反相层析(Waters Sunfire RP1810μm，30x150mm)来纯化。流速是50mL/分钟。梯度显示于表1中。材料在7次层析运行中进行纯化。来自每一运行收集的级分用HPLC分析，将含有根据本发明的环状酯肽的级分合并并在真空中蒸发至干。层析产生了134mg具有纯度＞97％和80mg具有纯度90％的根据式(II)的环状酯肽。
表1
用于纯化根据式(II)的环状酯肽的HPLC梯度
  时间(分钟)  溶剂A(％)  溶剂B(％)
  0.0   90   10
1.0 90 10
  23.0   50   50
  23.1   0   100
  27.0   0   100
  27.1   90   10
  30.0   90   10
表2
用于正相分离的梯度
  时间(分钟)   环已烷(％)   乙酸乙酯(％)   甲醇(％)
  0   75   25   0
  10   75   25   0
  33   25   75   0
  56   20   70   10
  79   0   50   50
  93   0   50   50
将细胞提取物(6.67g)溶解于二氯甲烷/甲醇4∶1中。将溶液过滤并将滤液吸附于硅藻(2g硅藻/1g提取物，
Figure GPA00001102397000531
International SorbentTechnology公司，Hengoed Mid Glam，英国)上，然后蒸发。将固体残留物装载于预填充的硅胶柱(4×18cm，90g硅胶40-63)上并用梯度的环己烷、乙酸乙酯和甲醇洗脱。梯度显示于表2中，流速是28ml/分钟。收集了28ml的级分体积。根据在UV-示踪中可见的峰合并级分，产生了12种合并的级分(pooled fraction)(A-L)。含有酯肽的级分(H-J)进一步使用反向层析进行纯化。层析方法和操作程序与所述的用于培养物滤液的纯化方法相同。已经分离了总共46.1mg根据式(II)的环状酯肽、17.9mg根据式(III)的环状酯肽和6.1mg根据式(VI)和(VII)的酯肽的1∶1混合物。化合物(VI)和(VII)的结构的确定基于高分辨MS和化合物(VI)和(VII)的混合物的1H-NMR数据与化合物(II)的1H-NMR数据的比较。
在细胞提取物中，也已经发现了较低浓度的其它根据式(II)的环状酯肽。在这些其它环状酯肽中，它们是根据式(IV)、(V)和(XI)-(XV)以及(XVII)的环状酯肽。
化合物的表征：
式(II)的化合物的物理数据
IR(KBr沉淀)：3337、3297、3062、2966、2936、2877、1736、1659、1533、1519、1464、1445、1410、1385、1368、1249、1232、1205、989、832cm-1
FT-MS(9.4T APEX-III)：951.5165；对C46H72N8O12+Na的计算值：951.5162
1H NMR(600MHz，d6-DMSO)δH：.-0.10(3H，d，J＝7.0Hz)、0.65(4H，m)、0.78(3H，d，J＝7.0Hz)、0.82(3H，t，J＝7.2Hz)、0.85(3H，d，J＝7.0Hz)、0.89(3H，d，J＝7.0Hz)、1.02(1H，m)、1.03(6H，2×d，J＝7.0Hz)、1.10(1H，m)、1.21(3H，d，J＝7.0Hz)、1.25(1H，m)、1.40(1H，m)、1.52(1H，m)、1.76(6H，m)、1.84(1H，m)、1.93(1H，m)、2.15(2H，m)、2.48(1H，m)、2.59(1H，m)、2.69(1H，m)、2.72(3H，s)、3.17(1H，m)、4.32(2H，m)、4.44(2H，m)、4.64(1H，d，J＝9.5Hz)、4.71(1H，m)、4.94(1H，s)、5.06(1H，m)、5.49(1H，m)、6.08(1H，d，J＝2.2Hz)、6.65(2H，d，J＝8.4)、6.74(1H，s)、7.00(2H，d，J＝8.4Hz)、7.27(1H，s)、7.36(1H，d，J＝9.5Hz)、7.66(1H，d，J＝10.2Hz)、7.74(1H，d，J＝8.8Hz)、8.02(1H，d，J＝8.1Hz)、8.43(1H，d，J＝8.1Hz)、9.19(1H，s)。
13C NMR(150MHz)d6-DMSOδC：10.35，CH3；11.22，CH3；13.79，CH3；16.00，CH3；17.63，CH3；19.49，2×CH3；20.83，CH3；21.72，CH2；23.30，CH3；23.70，CH2；24.16，CH；24.41，CH2；27.35，CH2；29.74，CH2；30.07，CH3；31.44，CH2；33.13，CH；33.19，CH2；33.68，CH；37.39，CH；39.05，CH2；48.75，CH；50.59，CH；52.01，CH；54.11，CH；54.65，CH；55.24，CH；60.60，CH；71.86CH；73.89，CH；115.28，2×CH；127.31，Cq；130.35，2×CH；156.25，Cq；169.09，Cq；169.25，Cq；169.34，Cq；169.74，Cq；170.60，Cq；172.41，Cq；172.52，Cq；173.78，Cq；176.32，Cq
式(III)的化合物的物理数据
FT-MS(9.4T APEX-III)：测定值：965.5318；对C47H74N8O12+Na的计算值：965.5318
1H NMR(600MHz)d6-DMSOδH：-0.10(3H，d，J＝7.0Hz)、0.64(4H，m)、0.78(3H，d，J＝7.0Hz)、0.82(3H，t，J＝7.0Hz)、0.83(3H，t，J＝7.3Hz)、0.85(3H，d，J＝7.0Hz)、0.89(3H，d，J＝7.0Hz)、1.01(3H，d，J＝7.1Hz)、1.04(1H，m)、1.10(1H，m)、1.21(3H，d，J＝7.0Hz)、1.25(1H，m)、1.32(1H，m)、1.40(1H，m)、1.53(2H，m)、1.77(6H，m)、1.84(1H，m)、1.92(1H，m)、2.12(1H，m)、2.16(1H，m)、2.28(1H，m)、2.59(1H，m)、2.68(1H，m)、2.72(3H，s)、3.17(1H，m)、4.32(1H，m)、4.38(1H，m)、4.43(1H，d，J＝10.2Hz)、4.46(1H，m)、4.63(1H，d，J＝9.5Hz)、4.71(1H，m)、4.94(1H，m)、5.06(1H，m)、5.49(1H，m)、6.11(1H，s，宽)、6.65(2H，d，J＝8.8Hz)、6.73(1H，s)、7.00(2H，d，J＝8.8Hz)、7.27(1H，s)、7.37(1H，d，J＝9.5Hz)、7.66(1H，d，J＝10.2Hz)、7.75(1H，d，J＝9.7Hz)、8.07(1H，d，J＝8.1Hz)、8.45(1H，d，J＝8.8Hz)、9.24(1H，宽)
式(IV)的化合物的物理数据
FT-MS(9.4T APEX-III)：测定值：947.5196；对C47H72N8O11+Na的计算值：947.5213
1H NMR(600MHz)d6-DMSOδH：0.08(3H，d，J＝7.0Hz)、0.68(3H，t，J＝7.2Hz)、0.71(3H，d，J＝7.0Hz)、0.78(3H，d，J＝7.0Hz)、0.83(3H，t，J＝7.3Hz)、0.84(1H，m)、0.87(3H，t，J＝7.2Hz)、0.88(3H，d，J＝7.0Hz)、0.99(3H，d，J＝7.1Hz)、1.08(1H，m)、1.17(3H，d，J＝6.7Hz)、1.18(1H，m)、1.31(2H，m)、1.43(1H，m)、1.51(1H，m)、1.54(1H，m)、1.76(2H，m)、1.90(1H，m)、1.94(1H，m)、2.01(1H，m)、2.10(1H，m)、2.16(1H，m)、2.26(1H，m)、2.46(2H，m)、2.73(1H，m)、2.74(3H，s)、3.19(1H，m)、4.34(1H，m)、4.36(1H，m)、4.51(1H，m)、4.55(1H，m)、4.66(1H，d，J＝10.0Hz)、4.79(1H，d，J＝11.0Hz)、5.19(1H，m)、5.28(1H，m)、5.44(1H，m)、6.25(1H，d，J＝7.3Hz)、6.33(1H，d，J＝8.8Hz)、6.68(2H，d，J＝8.8Hz)、6.75(1H，s)、7.04(2H，d，J＝8.8Hz)、7.28(1H，s)、7.32(1H，d，J＝8.8Hz)、7.91(1H，d，J＝9.5Hz)、8.05(1H，d，J＝8.1Hz)、8.57(1H，d，J＝8.9Hz)、9.38(1H，宽)
式(V)的化合物的物理数据
FT-MS(9.4T APEX-III)：测定值：933.5053；对C46H70N8O11+Na的计算值：953.5056
1H NMR(600MHz)d6-DMSOδH：0.08(3H，d，J＝7.0Hz)、0.68(3H，t，J＝7.2Hz)、0.71(3H，d，J＝7.0Hz)、0.79(3H，d，J＝7.0Hz)、0.83(1H，m)、0.88(3H，t，J＝7.2Hz)、0.89(3H，d，J＝7.0Hz)、1.01(3H，d，J＝7.0Hz)、1.03(3H，d，J＝7.0Hz)1.08(1H，m)、1.17(3H，d，J＝6.7Hz)、1.20(1H，m)、1.31(1H，m)、1.42(1H，m)、1.54(1H，m)、1.74(2H，m)、1.91(2H，m)、2.02(1H，m)、2.10(1H，m)、2.15(1H，m)、2.46(3H，m)、2.75(3H，s)、2.76(1H，m)、3.19(1H，m)、4.32(1H，m)、4.34(1H，m)、4.51(1H，m)、4.55(1H，m)、4.66(1H，d，J＝9.5Hz)、4.79(1H，d，J＝11.0Hz)、5.19(1H，m)、5.28(1H，m)、5.43(1H，m)、6.25(1H，d，J＝7.0Hz)、6.33(1H，d，J＝8.5Hz)、6.68(2H，d，J＝8.8Hz)、6.75(1H，s)、7.04(2H，d，J＝8.8Hz)、7.28(1H，s)、7.31(1H，d，J＝8.8Hz)、7.90(1H，d，J＝9.5Hz)、7.99(1H，d，J＝8.1Hz)、8.52(1H，d，J＝8.8Hz)、9.30(1H，宽)
式(XI)的化合物的物理数据
ESI-MS：正电荷模式：m/z＝951.5(M+Na)，负电荷模式：m/z＝927.5(M-H)；单种同位素的MW 928.5，C46H72N8O12
1H NMR(600MHz)d6-DMSOδH：-0.11(3H，d，J＝6.6Hz)、0.64(4H，m)、0.77(3H，d，J＝6.6Hz)、0.83(3H，m)、0.85(3H，m)、0.87(3H，m)、0.89(3H，m)、1.01(3H，m)、1.10(1H，m)、1.21(3H，d，J＝5.9Hz)、1.32(1H，m)、1.40(1H，m)、1.52(2H，m)、1.75(5H，m)、1.84(1H，m)、1.91(1H，m)、2.05(1H，m)、2.15(2H，m)、2.27(1H，m)、2.59(1H，m)、2.68(1H，m)、2.73(3H，s)、3.16(1H，m)、4.31(1H，m)、4.37(1H，m)、4.43(1H，m)、4.45(1H，m)、4.63(1H，d，J＝8.8Hz)、4.69(1H，m)、4.94(1H，m)、5.05(1H，m)、5.50(1H，m)、6.15(1H，s，宽)、6.65(2H，d，J＝8.1Hz)、6.75(1H，s)、7.00(2H，d，J＝8.1Hz)、7.29(1H，s)、7.37(1H，d，J＝9.5Hz)、7.64(1H，d，J＝9.5Hz)、7.78(1H，d，J＝8.8Hz)、8.09(1H，d，J＝8.1Hz)、8.49(1H，d，J＝9.5Hz)，(酪氨酸的OH不可见)
式(XII)的化合物的物理数据
ESI-MS：正电荷模式：m/z＝923.5(M+Na)，负电荷模式：m/z＝899.5(M-H)；单种同位素的MW 900.5，C44H68N8O12
1H NMR(500MHz)d6-DMSOδH：-0.11(3H，d，J＝6.4Hz)、0.63(4H，m)、0.75(3H，d，J＝6.4Hz)、0.83(6H，d，J＝7.0Hz)、0.87(3H，d，J＝6.4Hz)、1.03(1H，m)、1.10(1H，m)、1.20(3H，d，J＝6.4Hz)、1.25(1H，m)、1.38(1H，m)、1.50(1H，m)、1.73(1H，m)、1.75(2H，m)、1.77(1H，m)、1.79(3H，m)、1.85(3H，s)、1.85(1H，m)、2.12(1H，m)、2.16(1H，m)、2.55(1H，m)、2.67(1H，m)、2.70(3H，s)、3.13(1H，m)、4.30(1H，m)、4.40(1H，m)、4.43(2H，m)、4.59(1H，d，J＝9.5hz)、4.71(1H，m)、4.92(1H，m)、5.02(1H，m)、5.46(1H，m)、6.08(1H，s，宽)、6.62(2H，d，J＝8.5Hz)、6.71(1H，s)、6.97(2H，d，J＝8.5Hz)、7.22(1H，s)、7.34(1H，d，J＝9.2Hz)、7.64(1H，d，J＝9.5Hz)、7.93(1H，d，J＝9.2Hz)、8.06(1H，d，J＝7.6Hz)、8.39(1H，d，J＝8.5Hz)、9.06(1H，s，宽)
式(XIII)的化合物的物理数据
FT-MS(9.4T APEX-III)：测定值：961.5039；对C49H70N8O12+Na的计算值：985.5005
1H NMR(500MHz)d6-DMSOδH：-0.12(3H，d，J＝6.4Hz)、0.62(4H，m)、0.75(3H，d，J＝6.4Hz)、0.81(4H，m)、0.87(3H，d，J＝6.4Hz)、1.08(1H，m)、1.20(3H，m)、1.22(3H，m)、1.38(1H，m)、1.46(1H，m)、1.50(1H，m)、1.71(1H，m)、1.73(2H，m)、1.76(2H，m)、1.82(1H，m)、1.94(1H，m)、2.01(1H，m)、2.23(2H，m)、2.56(1H，m)、2.66(1H，m)、2.69(3H，s)、3.13(1H，m)、4.30(1H，m)、4.41(2H，m)、4.55(1H，m)、4.65(1H，d，J＝9.5Hz)、4.70(1H，m)、4.92(1H，m)、5.04(1H，m)、5.48(1H，m)、6.09(1H，s，宽)、6.64(2H，d，J＝8.5Hz)、6.81(1H，s)、6.97(2H，d，J＝8.5Hz)、7.33(1H，s)、7.35(1H，d，J＝9.2Hz)、7.46(2H，t，J＝7.3Hz)、7.53(1H，t，J＝7.3Hz)、7.66(1H，d，J＝9.5Hz)、7.88(2H，d，J＝7.3Hz)、7.95(1H，d，J＝9.5Hz)、8.46(1H，d，J＝8.5Hz)、8.71(1H，d，J＝7.3Hz)；(酪氨酸的OH不可见)
式(XIV)的化合物的物理数据
ESI-MS：正电荷模式：m/z＝927.5(M+H)，负电荷模式：m/z＝925.5(M-H)；单种同位素的MW 926.5，C47H74N8O11
1H NMR(500MHz)d6-DMSOδH：0.00(1H，m)、0.48(3H，t，J＝7.5Hz)、0.70(3H，d，J＝7.0Hz)、0.73(3H，t，J＝7.0Hz)、0.76(3H，d，J＝7.3Hz)、0.79(3H，t，J＝7.3Hz)、0.83(6H，d，J＝6.4Hz)、0.89(1H，m)、0.95(1H，m)、0.98(3H，d，J＝7.0Hz)、1.04(3H，d，J＝6.1Hz)、1.09(1H，m)、1.17(1H，m)、1.28(1H，m)、1.31(1H，m)、1.36(1H，m)、1.38(1H，m)、1.55(1H，m)、1.61(1H，m)、1.68(1H，m)、1.79(1H，m)、1.82(1H，m)、1.95(2H，m)、2.15(3H，m)、2.25(1H，m)、2.66(3H，s)、2.76(1H，m)、3.14(1H，m)、3.40(1H，m)、3.42(1H，m)、4.33(1H，m)、4.36(1H，m)、4.45(2H，m)、4.55(2H，m)、4.69(1H，m)、5.06(1H，m)、6.63(2H，d，J＝8.2Hz)、6.71(1H，s，宽)、7.01(2H，d，J＝8.2Hz)、7.27(1H，s，宽)、7.36(1H，d，J＝9.5Hz)、8.00(1H，d，J＝9.5Hz)、8.17(1H，d，J＝4.00Hz)、8.22(1H，d，J＝7.3Hz)、8.53(1H，d，J＝9.5Hz)、9.14(1H，s，宽)
式(XVII)的化合物的物理数据
ESI-MS：正电荷模式：m/z＝985.4(M+Na)，负电荷模式：m/z＝961.5(M-H)；单种同位素的MW 962.5，C45H70N8O13S
1H NMR(600MHz)d6-DMSOδH：)..δH：没有确定化学位移(两个非对映异构体的混合物)，通过与其它相关化合物如化合物(II)比较来进行结构确定
实施例1.2：式(VIII、IX、X)的化合物的产生
菌株：粗柄软骨霉状菌菌株分离自粪样品。基于子实体的形态学以及基于16S-RNA基因的部分序列，已经将本发明的粗柄软骨霉状菌菌株鉴定为粗柄软骨霉状菌。粗柄软骨霉状菌由DSMZ(DSMZ(2007))分组为生物危险群体1。软骨霉状菌属是多囊菌科中的属，所述软骨霉状菌属属于δ-变形杆菌内的粘球菌目。粘球菌目的细菌，也称为粘细菌是具有两个区别于大多数其它细菌的特征的革兰氏阴性杆状细菌。它们使用活性滑行机制在固体表面群集，且当饥饿时，它们聚集以形成子实体(Kaiser(2003))。
已经将本发明的粗柄软骨霉状菌菌株保藏于DSMZ，保藏号为19330。
培养：根据以下方法进行100L发酵罐培养：通过每次接种来自本发明的粗柄软骨霉状菌菌株的液体培养物的20ml(＝20％)到500-ml带挡板的摇瓶中的6×100ml培养基MD1(采用Bode等人2003)中来开始预培养。在旋转摇床上30℃和120转/分钟孵育1天后，通过接种来自预培养物的每个100ml(＝25％)到在2-L带挡板的摇瓶中的6×400ml的培养基MD1中来开始第一次中间培养。在旋转播床上30℃和120转/分钟孵育3天后，通过接种来自第一次中间培养物的3升(＝20％)到含有15升培养基MD1的20-L钢制槽式发酵罐中来开始第二次中间培养。温度控制在30℃，通气是20升/分钟(＝1.0vvm)且搅拌速度是80转/分钟。在发酵罐容器内维持0.5巴的稍微超压力。虽然不存在pH控制，培养物的pH仅稍微地从开始的pH6.95减少到第7天时的pH6.88。7天后，将全部第二次中间培养物(18升＝20％)用于接种90升的生产培养基POL1(采用Kunze等人1995)(开始体积＝108升)。主培养在100-L刻度钢制槽式发酵罐中进行。温度控制在30℃，通气是30升/分钟(＝0.3vvm)且搅拌速度是开始时为50转/分钟和4天后80转/分钟。在发酵罐容器内维持0.5巴的稍微超压力。通过受控制地添加2N H2SO4或1.5N NaOH来维持培养物pH在6.8-7.2。在14天后，收获具有滴度为3mg/l的培养物。
提取：将全部发酵培养液转移至1600升钢制容器内并沉降1小时。通过经纸滤器过滤从底部部分收获湿的细胞沉淀(大约200g)。通过每次用10升乙酸乙酯混合细胞沉淀30分钟，将细胞沉淀提取3次。然后，将残留水从溶剂相分开。将溶剂相用5升水洗并然后蒸发以获得11.9g称为‘细胞提取物’的干的提取物。培养物滤液用200升乙酸乙酯提取。2小时接触时间后，其中包括1小时的混合，将有机相分开，用20升水洗并最后蒸发以获得12.5g称为‘培养物滤液提取物’的干的提取物。
化合物分离：将每一提取物(来自菌丝体和培养物滤液)溶解于二氯甲烷/甲醇4∶1中。将溶液过滤并将滤液吸附于硅藻(2g硅藻/1g提取物，
Figure GPA00001102397000611
International Sorbent Technology公司，Hengoed Mid Glam，英国)上，然后蒸发。将固体残留物装载于预填充的硅胶柱(4×18cm，100g硅胶40-63)上并用梯度的环己烷、乙酸乙酯和甲醇洗脱。梯度显示于表4中，流速是28ml/分钟。收集了28ml的级分体积。根据在UV-示踪中可见的峰合并级分。含有本发明环状酯肽的级分进一步使用0.01％甲酸(溶剂A)和含有0.1％甲酸的乙腈(溶剂B)作为溶剂使用反向层析(Waters Sunfire RP1810μm，30×150mm)进行纯化。流速是50mL/分钟。梯度显示于表5中。为了注入，将物质溶解于MeOH/DMSO 1∶1(浓度200mg/mL)中。用HPLC分析收集的级分，将含有本发明环状酯肽的级分合并并在真空中蒸发至干。提取物的层析产生了52mg纯的(＞97％)根据式(VIII)的环状酯肽。总共85mg根据式(VIII)的纯环状酯肽可以分离自合并的提取物。
在细胞提取物中，也已经发现了较低浓度的根据式(VIII)的其它环状酯肽。在这些其它环状酯肽中，它们是根据式(IX)和(X)的环状酯肽。
表4
用于正向分离的梯度
  时间(分钟)   环己烷(％)   乙酸乙酯(％)   甲醇(％)
  0   75   25   0
  10   75   25   0
  33   25   75   0
  56   20   70   10
  79   0   50   50
  93   0   50   50
表5
用于纯化根据式(VIII)的环状酯肽的HPLC梯度
  时间(分钟)  溶剂A(％)  溶剂B(％)
  0.0   75   25
  1.0   75   25
  23.0   55   45
  23.1   0   100
  27.0   0   100
  27.1   75   25
  30.0   75   25
培养基(用50mM HEPES调整到pH 7.0)
表6
MD1(预培养用培养基)
  底物   浓度[g/L]
  酪胨   3
  CaCl2×2H2O   0.5
  MgSO4×7H2O   2
  D(+)-无水葡萄糖   1
  氰钴胺素   0.5mg
  消泡剂B   0.2mL
  铁草铵溶剂[100ng/mL]   1mL
表7
POL1(生产用培养基)
  底物   浓度[g/L]
  马铃薯蛋白质   4
  可溶性淀粉   3
  CaCl2×2H2O   0.5
  MgSO4×7H2O   2
  氰钴胺素   0.25mg
  HEPES   12
  标准痕量元素溶液1901   1mL
  XAD16   35
化合物的表征：
式(VIII)的化合物的物理数据
FT-MS(9.4T APEX-III)：测定值：985.5007；对C49H70N8O12+Na的计算值：985.5005。
1H NMR(600MHz)d6-DMSOδH：0.74(6H，d，J＝7.0Hz)、0.85(3H，d，J＝7.0Hz)、0.88(3H，d，J＝7.0Hz)、0.89(6H，d，J＝7.0Hz)、1.18(3H，d，J＝6.7Hz)、1.32(1H，m)、1.46(1H，m)、1.57(2H，m)、1.72(3H，m)、1.81(1H，m)、1.88(1H，m)、1.98(1H，m)、2.02(2H，m)、2.11(3H，m)、2.42(1H，m)、2.73(1H，m)、2.77(3H，s)、2.87(1H，m)、3.12(1H，m)、3.64(1H，m)、4.23(1H，m)、4.40(1H，m)、4.58(1H，d，J＝9.5Hz)、4.75(2H，m)、4.93(1H，m)、5.07(1H，s)、5.40(1H，m)、6.03(1H，s)、6.74(1H，s)、6.79(2H，d，J＝8.4Hz)、6.84(2H，d，J＝7.8Hz)、7.02(2H，d，J＝8.4Hz)、7.10(1H，d，J＝9.3Hz)、7.14(1H，t，J＝7.8Hz)、7.19(2H，t，J＝7.8Hz)、7.26(1H，s)、7.42(1H，d，J＝9.8Hz)、7.89(1H，d，J＝9.2Hz)、8.03(1H，d，J＝7.9Hz)、8.38(1H，d，J＝8.9Hz)、9.40(1H，s)
13C NMR(150MHz)d6-DMSOδC：17.13，CH3；17.63，CH3；19.32，CH3；20.90，CH3；21.64，CH2；22.34，CH3；22.34，CH3；23.32，CH3；24.10，CH；25.63，CH；27.63，CH2；29.30，CH2；30.37，CH3；30.86，CH；31.52，CH2；32.83，CH2；35.33，CH2；38.98，CH2；44.42，CH2；48.52，CH；50.19，CH；50.24，CH；51.99，CH；54.62，CH；55.63，CH；60.90，CH；71.86CH；73.70，CH；115.32，2xCH；126.21，CH；127.50，Cq；127.74，2xCH；129.42，2xCH；130.43，2xCH；136.72，Cq；156.23，Cq；168.93，Cq；169.18，Cq；169.18，Cq；170.18，Cq；170.39，Cq；171.72，Cq；171.96，Cq；172.50，Cq；173.82，Cq
式(IX)的化合物的物理数据
FT-MS(9.4T APEX-III)：测定值：969.5058；对C49H70N8O11+Na的计算值；969.5056。
1H NMR(600MHz)d6-DMSOδH：)：0.53(3H，d，J＝6.6Hz)、0.73(3H，d，J＝6.6Hz)、0.74(3H，d，J＝6.6Hz)、0.81(3H，d，J＝6.6Hz)、0.86(6H，d，J＝6.6Hz)、1.08(3H，d，J＝6.5Hz)、1.20(1H，m)、1.33(3H，m)、1.52(1H，m)、1.64(1H，m)、1.80(2H，m)、2.01(1H，m)、2.04(2H，m)、2.15(4H，m)、2.25(1H，m)、2.30(1H，m)、2.74(3H，s)、2.83(1H，m)、3.12(1H，m)、3.32(1H，m)、3.38(1H，m)、4.14(1H，m)、4.27(1H，m)、4.40(1H，m)、4.59(1H，m)、4.61(1H，m)、4.94(1H，m)、4.99(1H，m)、5.10(1H，m)、6.42(2H，d，J＝8.8Hz)、6.75(1H，s)、7.04(2H，d，J＝8.8Hz)、7.10(1H，t，J＝7.3Hz)、7.15(2H，t，J＝7.3Hz)、7.23(2H，d，J＝7.3Hz)、7.30(1H，s)、7.41(1H，d，J＝9.5Hz)、8.05(1H，d，J＝9.5Hz)、8.23(1H，d，J＝8.1Hz)、8.47(1H，d，J＝4.4Hz)、8.71(1H，d，J＝10.2Hz)。(酪氨酸的羟基基团的质子的信号不可见)
式(X)的化合物的物理数据
FT-MS(9.4T APEX-III)：测定值：955.4896；对C48H68N8O11+Na的计算值：955.4900。
1H NMR(600MHz)d6-DMSO δH：)..δH：没有指定化学位移(旋转异构体的混合物)，基于NMR数据(缺失N-甲基基团)与化合物(IX)的NMR数据的比较来确定结构。
实施例1.3：式(XV-XVI)的化合物的产生
菌株：尖软骨霉状菌菌株分离自土壤样品。基于16S-RNA基因的部分序列，已经将本发明的软骨霉状菌属菌株鉴定为尖软骨霉状菌。尖软骨霉状菌由DSMZ(DSMZ(2007))分组为生物危险群体1。软骨霉状菌属是多囊菌科中的属，所述软骨霉状菌属属于δ-变形杆菌内的粘球菌目。粘球菌目的细菌，也称为粘细菌是具有两个区别于大多数其它细菌的特征的革兰氏阴性杆状细菌。它们使用活性滑行机制在固体表面群集，且当饥饿时，它们聚集以形成子实体(Kaiser(2003))。
已经将本发明的粗柄软骨霉状菌菌株保藏于DSMZ，保藏号为21595。
培养：
通过每次接种来自本发明的尖软骨霉状菌菌株的液体培养物的20ml(＝20％)到500-ml带挡板的摇瓶中的10×100ml培养基MD1(采用Bode等人2003)中来开始预培养。在旋转摇床上30℃和120转/分钟孵育6天后，将具有1L的总体积的培养物转移至装有5L培养基MD1的50L袋中。在BioWave 200SPS反应器(Wave Biotec AG，瑞士)中孵育7天后，向袋中加入40L培养基M7/14以开始生产。19天后收获培养物。
提取：
对于收获，将Wave袋的液面上部中的气体用真空除去，并将袋悬挂以允许树脂和细胞沉淀。沉淀1小时后，将43升上清液除去并丢弃。将残留的含有细胞和树脂的7升冷冻过夜。融化后，通过经纸滤器的过滤获得细胞和树脂。丢弃滤液。将细胞/树脂沉淀(湿重大约3kg)转移至金属容器中并用15升乙酸乙酯提取两次，其中在第一次提取期间混合5分钟。两批混合物都通过纸滤器分离，并然后将滤液合并。将有机溶剂相与水相分开后，将溶剂相用2升纯水洗，并然后蒸发至干。丢弃水相。
化合物分离：将提取物(5g)溶解于二氯甲烷/甲醇4∶1中。将溶液过滤并将滤液吸附于硅藻(2g硅藻/1g提取物，International SorbentTechnology公司，Hengoed Mid Glam，英国)上，然后蒸发。将固体残留物装载于预填充的硅胶柱(4×18cm，100g硅胶40-63)上并用梯度的环己烷、乙酸乙酯和甲醇洗脱。梯度显示于表2中，流速是28ml/分钟。收集了28ml的级分体积。根据在UV-示踪中可见的峰合并级分。将含有本发明环状酯肽的级分进一步使用0.01％甲酸(溶剂A)和含有0.1％甲酸的乙腈(溶剂B)作为溶剂使用反向层析(Waters Sunfire RP1810μm，30×150mm)进行纯化。流速是50mL/分钟。梯度显示于表1中。为了注入，将材料溶解于1.6mL MeOH/DMSO 1∶1中。用HPLC分析收集的级分，将含有本发明环状酯肽的级分合并，并在真空中蒸发至干。提取物的层析产生了7mg纯的根据式(XV)的环状酯肽和1.2g纯的根据式(XVI)的环状酯肽。
培养基
表8
MD1(预培养用培养基)
  底物   浓度[g/L]
  酪胨   3
  CaCl2×2H2O   0.5
  MgSO4×7H2O   2
  D(+)-无水葡萄糖   1
  氰钴胺素   0.5mg
  消泡剂B   0.2mL
  铁草铵溶剂[100ng/mL]   1mL
(用50mM HEPES调整到pH 7.0)
表9
M7/14(生产用培养基)
  底物   浓度[g/L]
  酵母提取物   1
  CaCl2×2H2O   1
  MgSO4×7H2O   1
  马铃薯淀粉   5
  HEPES   12
  马铃薯蛋白质   5
  D(+)-无水葡萄糖   2
  氰钴胺素   0.1mg
  消泡剂B   0.2mL
  铁草铵溶剂[100ng/mL]   3mL
  XAD-16树脂   35
(调整到pH 7.4)
化合物的表征：
式(XV)的化合物的物理数据
FT-MS(9.4T APEX-III)：测定值：1014.5272；对C50H73N9O12+Na的计算值：1014.5276。
1H NMR(600MHz)d6-DMSOδH：0.72(3H，d，J＝6.6Hz)、0.82(3H，d，J＝6.6Hz)、0.85(6H，d，J＝6.6Hz)、1.01(1H，m)、1.02(6H，d，J＝6.6Hz)、1.17(3H，d，J＝6.6Hz)、1.21(1H，m)、1.31(1H，m)、1.36(2H，m)、1.42(1H，m)、1.49(1H，m)、1.54(1H，m)、1.56(1H，m)、1.69(3H，m)、1.79(1H，m)、1.81(1H，m)、2.40(1H，m)、2.48(1H，m)、2.73(1H，m)、2.76(3H，s)、2.87(1H，m)、2.91(1H，m)、2.98(1H，m)、3.10(1H，m)、3.63(1H，m)、4.22(1H，m)、4.42(1H，td，J＝8.1，5.1Hz)、4.58(1H，m)、4.75(2H，m)、4.90(1H，m)、5.06(1H，m)、5.38(1H，m)、5.42(2H，宽)、5.96(1H，t，J＝5.5Hz)、6.06(1H，s，宽)、6.78(2H，d，J＝8.1Hz)、6.83(2H，d，J＝7.3Hz)、7.00(2H，d，J＝8.1Hz)、7.10(1H，d，J＝9.5Hz)、7.14(1H，t，J＝7.3Hz)、7.19(2H，t，J＝7.3Hz)、7.46(1H，d，J＝9.5Hz)、7.77(1H，d，J＝9.5Hz)、7.97(1H，d，J＝8.1Hz)、8.37(1H，d，J＝8.8Hz)、9.50(1H，s，宽)
式(XVI)化合物的物理数据
ESI-MS：正电荷模式：m/z＝1004.4(M+Na)，负电荷模式：m/z＝976.5(M-H)；单种同位素的MW 977.5，C49H71N9O12
1H NMR(600MHz)d6-DMSOδH：0.72(6H，d，J＝6.6Hz)、0.85(3H，d，J＝6.6Hz)、0.87(3H，d，J＝6.6Hz)、1.01(6H，d，J＝6.6Hz)、1.17(3H，d，J＝6.6Hz)、1.30(1H，m)、1.35(2H，m)、1.43(1H，m)、1.48(1H，m)、1.56(1H，m)、1.57(1H，m)、1.69(1H，m)、1.71(2H，m)、1.79(1H，m)、2.08(1H，m)、2.41(1H，m)、2.48(1H，m)、2.77(3H，s)、2.87(1H，m)、2.92(1H，m)、2.98(1H，m)、3.09(1H，m)、3.63(1H，m)、4.22(1H，m)、4.42(1h，td，J＝8.1，5.1Hz)、4.57(1H，m)、4.74(1，m)、4.76(1H，m)、4.91(1H，m)、5.06(1H，s)、5.39(1H，m)、5.43(2H，s，宽)、5.96(1H，t，J＝5.5Hz)、6.07(1H，s，宽)、6.78(2H，d，J＝8.1Hz)、6.84(2H，d，J＝7.3Hz)、7.00(2H，d，J＝8.1Hz)、7.11(1H，d，J＝9.5Hz)、7.15(1H，t，J＝7.3Hz)、7.19(2H，t，J＝7.3Hz)、7.42(1H，d，J＝9.5Hz)、7.78(1H，d，J＝9.5Hz)、7.98(1H，d，J＝8.1Hz)、8.39(1H，d，J＝8.8Hz)、9.52(1H，s，宽)
实施例2：体外生物学活性的确定
本发明的化合物如包括式II-X的化合物，展示出药学活性并因此用作药物。如，发现本发明的化合物抑制激肽释放酶-7活性和HNE活性。如在以下测试法中确定的，本发明的化合物具有1nM到10μM之间的IC50值：
实施例2.1：体外对激肽释放酶-7的抑制活性
材料和缓冲液
荧光猝灭底物Ac-Glu-Asp(EDANS)-Lys-Pro-Ile-Leu-Phe^Arg-Leu-Gly-Lys(DABCYL)-Glu-NH2(其中^表明可切键，由MS分析鉴定)购自Biosyntan(Berlin，德国)并在-20℃、DMSO中以5mM储液保存。所有其它化学品都是分析级的。
酶促反应在含有150mM NaCl和0.05％(w/v)CHAPS的、pH5.6的50mM柠檬酸钠缓冲液中进行。
所有含有蛋白质和肽的溶液都在硅化管(Life Systems Design，Merenschwand，瑞士)中操作。借助CyBi-Well 96-通道移液器(CyBio AG，Jena，德国)将化合物溶液以及酶和底物溶液转移至384-孔板(黑色Cliniplate；目录号95040020Labsystems Oy，芬兰)。
用于FI测量的仪器
对于荧光强度(FI)测量，使用Ultra Evolution读数器(TECAN，Maennedorf，瑞士)。仪器装备了分别用于荧光激发和发射探测的350nm(20nm带宽)通带滤光片和500nm(25nm带宽)通带滤光片的组合。为了增加信号：背景比，使用了合适的分色镜。光学滤光片和分色镜购自TECAN。每次测量，通过3次闪光来激发每一孔中的荧光团。
IC50值的确定
对于IC50值的确定，在384-孔板中室温实施测试法。所有最终测试体积是30μl。将测试化合物溶解于90％(v/v)DMSO/水中，并在水(含有0.05％(w/v)CHAPS)中稀释成3倍于所期望的测定浓度。11个最终化合物浓度是：0.3nM、1nM、3nM、10nM、30nM、100nM、300nM、1μM、3μM、10μM和30μM。对于每一测试法，每孔加入10μl水/CHAPS(±测试化合物)，然后加入10μl蛋白酶溶液(用1.5×测试缓冲液稀释)。最终测试溶液中的蛋白酶浓度是0.2nM(根据由Bradford方法确定的酶浓度)。室温孵育1小时后，通过添加10μl底物溶液(稀释于1.5×测试缓冲液的底物，终浓度为2μM)来开始反应。化合物对酶促活性的影响获自线性进展曲线并通过两个读数来确定，第一个读数在添加底物后直接获取和第二个读数在1小时后获取。使用非线性回归分析软件(Xlfit，4.0版；ID Business Solution Ltd.，Guildford，Surrey，UK)，通过对抑制物浓度绘制的抑制百分数来计算IC50值。
环状酯肽抑制人激肽释放酶7具有如在表11中所示的IC50值。
表10
  根据式(II)的环状酯肽  根据式(III)的环状酯肽
 酶   IC50μM  IC50μM
 人激肽释放酶7   0.001  0.0004
表11
  根据下述式的环状酯肽：   人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶IC50[μM]   人激肽释放酶7IC50[μM]
  式II   0.01   0.001
  式III   0.01   0.0004
  式IV   0.07   0.005
  式V   0.06   0.006
  式IX   0.01   0.001
  式X   0.2   0.02
  式XII   0.05   0.004
  式XIII   0.03   0.0007
  式XIV   2.7   0.2
  式XV   0.08   0.004
  实施例4   0.055   0.006
  实施例5   0.005   0.008
  实施例6   0.055   0.095
  实施例7   0.006   0.050
  实施例9   0.003   0.002
  实施例10   0.009   0.0035
  实施例11   0.012   0.006
  实施例12   0.006   0.0085
  实施例13   0.004   0.006
  实施例14   0.005   0.01
  实施例15   0.005   0.015
  实施例16   0.005   0.015
  实施例17   0.0075   0.003
  实施例18   0.0025   0.005
  实施例19   0.0135   0.0065
  实施例20   0.008   0.0015
  实施例21   0.009   0.0025
  实施例22   0.04   0.006
  实施例23   0.003   0.005
  实施例24   0.004   0.007
  实施例25   0.0025   0.00375
  实施例26   0.0045   0.00085
  实施例27   0.02   0.003
  实施例28   0.03   0.0025
  实施例29   0.025   0.003
  实施例30   4.55   1.05
  实施例31   0.3   0.2
  实施例32   0.03   0.1
  实施例33   0.035   0.0045
  实施例34   0.005   0.004
  实施例35   0.003   0.0085
  实施例36   0.0035   0.0085
  实施例37   0.0025   0.0045
  实施例38   0.0015   0.004
  实施例39   0.0035   0.0085
  实施例40   0.0025   0.0065
  实施例41   0.001   0.002
  实施例42   0.001   0.001
  实施例43   0.001   0.0002
  实施例44   0.009   0.0035
  实施例45   0.003   0.002
  实施例46   0.1   0.01
  实施例47   0.01   0.1
实施例2.2：体外对HNE的抑制活性
材料和缓冲液
人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(目录号SE563)购自Elastin ProductsCompany，Inc.(EPC，Owensville，美国)。将干粉(供应商声明的纯度＞95％)溶于20mM乙酸钠缓冲液、pH 5.0、50％(v/v)甘油中，并分成份冷冻于-80℃。
荧光猝灭底物(DABCYL-Ser-Glu-Val^Asn-Leu-Asp-Ala-Glu-Phe-EDANS，其中^表明可切键，由MS分析鉴定)购自Bachem AG(Bubendorf，瑞士)，并在-20℃、DMSO中以5mM储液保存。所有其它化学品都是分析级的。
酶促反应在含有500mM NaCl和0.05％(w/v)CHAPS的、pH 7.5的100mM Tris/HCl缓冲液中进行。
所有含有蛋白质和肽的溶液都在硅化管(Life Systems Design，Merenschwand，瑞士)中操作。
借助CyBi-Well 96-通道移液器(CyBio AG，Jena，德国)将化合物溶液以及酶和底物溶液转移至384-孔板(黑色Cliniplate；目录号95040020Labsystems Oy，芬兰)。
用于FI测量的仪器
对于荧光强度(FI)测量，使用Ultra Evolution读数器(TECAN，Maennedorf，瑞士)。仪器装备了分别用于荧光激发和发射探测的350nm(20nm带宽)通带滤光片和500nm(25nm带宽)通带滤光片的组合。为了增加信号：背景比，使用合适的分色镜。光学滤光片和分色镜购自TECAN。每次测量，通过3次闪光来激发每一孔中的荧光团。
环状酯肽抑制人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶具有如在表11中所示的IC50值。
此外，环状酯肽抑制人胰凝乳蛋白酶具有0.001μM到0.02μM的IC50。
用激肽释放酶7确定根据式(VIII)的环状酯肽的生物学活性。这种本发明的环状酯肽抑制人激肽释放酶7具有小于3nM的IC50。这种环状酯肽抑制人胰凝乳蛋白酶和人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶分别具有大约0.004μM和大约0.0025μM的IC50。
实施例3：体内对激肽释放酶-7的抑制活性的确定
A)对小鼠中皮肤屏障破坏的恢复的测试
方法：在用
Figure GPA00001102397000731
皮肤取样圆盘(skin sampling disk)反复地剥离皮肤的无毛SKH1小鼠组中来实现皮肤屏障破坏。当经表皮失水(TEWL)达到≥40mg/cm2/h时完成该步骤。TEWL用Tewameter TM210(CourageKhazaka，Cologne，DE)评估。屏障破坏后，立即应用10mM浓度的30μl测试化合物。将对照动物仅用溶剂(乙醇/丙二醇，3/7(v/v))进行类似的处理。在屏障破坏之前、在紧接着屏障破坏后即刻、和在屏障破坏后3小时测量TEWL。在每一动物中，使用下式：(1-[在3小时时的TEWL-基线TEWL]/[在剥离后即刻的TEWL-基线TEWL])×100％来计算恢复百分数。
结果：
与仅用溶剂处理的小鼠中的修复比较，测试化合物(根据式II的环状酯肽)的单一应用加速了57％的屏障修复(p＜0.05)，表12。
表12
 动物  在屏障破坏中％恢复平均值(SD值)，n：每组4只动物)
 用10mM测试化合物(根据式II的环状酯肽)处理  72.0(9.1)
 仅用溶剂处理  45.8(8.0)
B)在过敏性接触性皮炎(ACD)的鼠模型中对抗炎活性的测试
方法：第一天，将Crl:NMRI小鼠用50μl 2％噁唑酮在剃过毛的腹部上致敏，并在第8天，用10μl噁唑酮在右耳的内表面攻击。未攻击的左耳作为正常对照，且在第9天，从耳的重量(作为炎性肿胀的测量)的不同来评价皮炎。攻击后30分钟，将动物用10μl测试化合物或仅用溶剂局部地处理。治疗的功效计算为与仅用溶剂处理的动物比较而言抑制耳炎性肿胀的百分率。
结果：单一应用10mM测试化合物(根据式II的环状酯肽)抑制ACD中40％的炎性肿胀且在30mM浓度时达46％(p＜0.001，与溶剂处理的动物相比较而言)(表13/14)。
表13
 动物  Δ耳重量平均值(SD)，n：每组8只动物   炎性肿胀的％抑制平均值±SE
 用30mM测试化合物(根据式II的环状酯肽)处理  15.3(5.4)   46±7.5
 用10mM测试化合物(根据式II的环状酯肽)处理  17.0(4.8)   40±6.9
 仅用溶剂+处理  28.1(4.6)
+：二甲基乙酰胺/乙醇/丙酮(1/2/2)的混合物
表14
  炎性肿胀的％抑制   炎性肿胀的％抑制
  测试化合物的浓度   测试化合物的浓度
  根据下述式的化合物   30mM   10mM
  实施例9   38   42
  实施例10   25   22
  实施例23   40   48
  实施例25   38   39
  实施例43   55   42
C)在过敏性接触性皮炎(ACD)的猪模型中对抗炎活性的测试
诱发ACD前8天，将500μl 10％2，4-二硝基氟苯(DNFB，溶解于DMSO/丙酮/橄榄油[1/5/3，v/v/v])以分开的体积经表皮(epicutaneously)应用到两耳的基部和两腹股沟上(100μl/位点)用于致敏。用15μl DNFB(1.0％)在剃毛的背外侧的对侧测试位点(每一位点7cm2大小)引发攻击反应。对于处理，攻击后0.5小时和6小时，将测试化合物和安慰剂(仅溶剂)对侧地应用到每一动物的2个测试位点。攻击后24小时，当炎症达到峰值时，临床检查测试位点。将改变按0到4进行评分(表15)，允许对每一指定位点而言合并的最大得分为12。皮肤发红使用＊值反射测定地(reflectometrically)测量。
表15感染ACD的测试位点的临床症状的得分
  得分   红斑/强度   红斑/范围   硬结
  0   无   无   无
  1   几乎不可见   小斑   几乎不可触诊
  2   轻微的   大斑   轻微的变硬
  3   明显的   融合性的   明显的变硬
  4   严重(或青紫褪色)   同质发红   明显的和隆肿的变硬
结果：用1％测试化合物(根据式II的环状酯肽)的溶液处理感染ACD的测试位点两次抑制了30％的临床炎症改变(p＜0.01)和抑制了27％的可测量的皮肤发红(p＜0.05)(表16)
表16
  测试位点   临床得分(平均值，SD，n：8+)   A＊值(平均值，SD，n：8+)
  用1％测试化合物(根据式II的环状酯肽)处理   5.1(1.7)   8.6(1.4)
  用安慰剂(溶剂)处理   7.2(1.9)   12.0(2.5)
  相对于安慰剂处理的位点而言的抑制   29.9(11.7)   27.0(2.5)
+：在4只动物中，每只2个测试位点
实施例4：本发明环状酯肽的衍生化
a)一步法：向在-50℃、2mL二氯甲烷/乙腈(1∶1)中的20mg根据式(II)的环状酯肽和0.027mL三乙基硅烷的溶液中缓慢加入0.014mL醚合三氟化硼。反应混合物允许升温到-5℃并保持该温度额外的30分钟，倒入饱和的NaHCO3溶液中并用EtOAc提取。将有机层用硫酸钠干燥并将溶剂在真空中除去。通过HPLC(XTerra[5cm]；乙腈/碳酸铵缓冲液pH10梯度)纯化获得的残留物，提供了9.8mg根据式(II)的环状酯肽的衍生物，其中已经将Ahp转化为3-氨基-哌啶-2-酮。ESI MS：935.36[M+Na]+。
b)两步法：向在-50℃、300mL二氯甲烷/乙腈(1∶1)中的1g根据式(II)的环状酯肽的溶液中缓慢加入0.68mL醚合三氟化硼。反应混合物允许升温到-20℃。然后缓慢加入额外的0.68mL醚合三氟化硼，在该温度保持反应混合物直到不再观察到(HPLC)更多的起始材料。然后将反应混合物倒入饱和的NaHCO3溶液中，并用EtOAc提取。将有机层用硫酸钠干燥并将溶剂在真空中除去，提供了根据式(II)的环状酯肽的衍生物，其中已经将Ahp转化为3-氨基-3，4-二氢-1H-吡啶-2-酮。ESI MS：933.28[M+Na]+。
将粗制物质溶解于400mL 2-丙醇中，加入115mg Pd/C(10％)并将混合物在大气压力下氢化直到起始物质耗尽(HPLC)。获得的残留物通过层析(SiO2；cHex/EtOAc(1∶1)+10％MeOH)纯化，提供了684mg根据式(II)的环状酯肽的衍生物，其中已经将Ahp转化为3-氨基-哌啶-2-酮。
实施例5：本发明环状酯肽的衍生化
向在5mL 1-PrOH中的75mg(0.081mmol)根据式(II)的环状酯肽的溶液中加入30μL硫酸并将反应混合物室温搅拌48小时。对于加工，将反应混合物用二氯甲烷稀释并用饱和碳酸氢盐溶液洗。将有机层用硫酸钠干燥后，除去溶剂并将获得的残留物在硅胶(cHex/EtOAc(1∶1)+10％MeOH)上通过层析纯化。产率：65mg(83％)根据式(II)的环状酯肽的衍生物，其中已经将Ahp转化为3-氨基-6-丙氧基-哌啶-2-酮。ESI MS：993.37[M+Na]+。
相似地，用相应的醇处理，提供了以下的化合物：
Figure GPA00001102397000771
表17
  实施例 R   ESI MS[M+Na]+
  6 1-辛基   1063.41
  7 2，2，2-三氟乙基   1033.30
  8 2-丙基   993.43
  9 苄基   1041.16
  10 乙基   979.22
  11 1-丁基   1007.29
  12   异丁基   1007.35
  13   2-甲氧基乙基   1009.31
  14   2-羟乙基   995.28
  15   2-(2-羟乙氧基)乙基   1039.31
  16   2-(2-甲氧基乙氧基)乙基   1053.33
  17   甲基   965.27
  18   炔丙基   989.21
同时地，在相同的条件下获得了以下类型的化合物：
Figure GPA00001102397000781
表18
  实施例   R1，R2   ESI MS[M+Na]+
  19   1-丙基   1136.33
  20   甲基   980.21
实施例21：本发明环状酯肽的衍生化
将在2mL二氯甲烷中的25mg(0.027mmol)根据式(II)的环状酯肽的溶液冷却到0℃。然后加入DIPEA和三氟乙酸酐(TFAA)。将反应混合物缓慢升温到室温并额外搅拌4小时。对于加工，将反应混合物用二氯甲烷稀释并用盐酸和饱和碳酸氢盐溶液洗。用硫酸钠干燥后，除去溶剂并将获得的残留物在硅胶(cHex/EtOAc(1∶1)+10％MeOH)上通过层析纯化。产率：14mg(57％)根据式(II)的环状酯肽的衍生物，其中已经将A1的侧链中的酰胺转化为腈。ESI MS：933.30[M+Na]+。
相似地，获得了以下类型的化合物：
Figure GPA00001102397000791
表19
  实施例   R   ESI MS[M+Na]+
  22   H   917.30
  23   乙基   961.20
  24   1-丙基   975.29
  25   苄基   1023.14
实施例26：本发明环状酯肽的衍生化
将在2mL二氯甲烷(MC)中的25mg(0.027mmol)根据式(II)的环状酯肽的溶液冷却到0℃。然后缓慢加入24μL DIPEA和14μL氯甲酸己酯。反应混合物允许升温到室温并额外搅拌4小时。对于加工，将反应混合物用二氯甲烷稀释并用盐酸和饱和碳酸氢盐溶液洗，并用盐水洗。用硫酸钠干燥有机层后，除去溶剂并将获得的残留物在硅胶(cHex/EtOAc(1∶1)+10％MeOH)上通过层析纯化。产率：20mg(70％)根据式(II)的环状酯肽的衍生物，其中已经将A6的苯基部分转化为相应的碳酸己酯。ESI MS：1079.41[M+Na]+。
类似地，使用在实施例4中描述的化合物作为起始材料，获得了如下的化合物：
Figure GPA00001102397000801
表20
Figure GPA00001102397000802
实施例32：本发明环状酯肽的衍生化
向在2mL无水丙酮中的200mg(0.21mmol)根据实施例5的环状酯肽、57.5mg(0.41mmol)K2CO3的混合物中加入60.5mg(0.31mmol)(E)-3-苯基-2-丙烯基溴并用超声过夜处理(温度升至大约50℃)。对于加工，用二氯甲烷稀释反应混合物并用水洗。用硫酸钠干燥有机层后，除去溶剂并将获得的残留物通过HPLC(15cm Zorbax；乙腈/含水NH4OAc缓冲液：20→95％)纯化。产率：100mg(45％)根据实施例5的环状酯肽的衍生物，特征在于A6为O-((E)-3-苯基-2-丙烯-1-基)-L-酪氨酸。ESI MS：1109.37[M+Na]+。
类似地，用合适的烷化剂处理根据实施例4或5的环状酯肽，提供了如下的化合物：
表21
  实施例   R1   R2   ESI MS[M+Na]+
  33   H   叔丁氧羰基甲基   1049.33
  34   丙氧基   叔丁氧羰基甲基   1107.33
  35   丙氧基   1-(E)-戊-2-烯基   1061.36
  36   丙氧基   1-(E)-4，4，4-三氟-丁-2-烯基   1101.25
  37   丙氧基   甲基   1007.29
  38   丙氧基   3-甲基-丁-2-烯基   1061.36
  39   丙氧基   苄基   1083.38
  40   丙氧基   烯丙基   1033.37
  41   丙氧基   炔丙基   1031.25
实施例42：本发明环状酯肽的衍生化
向在2mL无水丙酮中的200mg(0.21mmol)根据实施例5的环状酯肽、46.5mg(0.31mmol)碘化钠和57.5mg(0.41mmol)K2CO3的混合物中加入44mg(0.31mmol)3-(氯甲基)-1，5-二甲基-1H-吡唑并用超声过夜处理(温度升至大约50℃)。对于加工，用二氯甲烷稀释反应混合物并用水洗。用硫酸钠干燥有机层后，除去溶剂并将获得的残留物通过HPLC(15cm Zorbax；乙腈/含水NH4OAc缓冲液：20→95％)纯化。产率：90mg(40.5％)根据实施例5的环状酯肽的衍生物，特征在于A6为O-(1，5-二甲基-1H-吡唑-3-基)甲基-L-酪氨酸。ESI MS：1101.39[M+Na]+。
实施例43：
类似地，用3-(氯甲基)-1，5-二甲基-1H-吡唑处理根据式(II)的环状酯肽的环状酯肽，提供了A6为O-(1，5-二甲基-1H-吡唑-3-基)甲基-L-酪氨酸特征的化合物。ESI MS：1059.19[M+Na]+。
实施例44：本发明环状酯肽的衍生化
Figure GPA00001102397000821
向在2mL二氯甲烷中的17mg(0.0165mmol)根据实施例33的环状酯肽的溶液中加入845μL三氟乙酸并在室温搅拌4小时。将反应混合物用甲苯稀释并将溶剂在真空中除去，提供了22.5mg相应的粗制酸。
将20mg上述酸、6.81mg(0.031mmol)8-氨基-3，6-二氧代辛酸叔丁酯和15.8mg(0.041mmol)HATU溶解于2mL无水DMF中并加入11μLDIEPA且室温搅拌过夜。对于加工，用EtOAc稀释反应混合物并用饱和NaHSO4和NaHCO3溶液洗，并用盐水洗。用硫酸钠干燥有机层后，除去溶剂并将获得的残留物通过HPLC(15cm Zorbax；乙腈/含水NH4OAc缓冲液：20→95％)纯化。产率：7mg(29％)的标题化合物。ESI MS：1194.32[M+Na]+。
8-氨基-3，6-二氧代辛酸叔丁酯
将在1mL无水DMF中的100mg(0.226mmol)8-(9-芴基甲氧基羰基氨基)-3，6-二氧代辛酸叔丁酯用哌啶(89.5μL；0.862mmol)室温处理3小时。将溶剂蒸发并用梯度cHex→EtOAc→EtOAc/MeOH(1∶1)+3％MeOH在硅胶上通过层析来纯化残留物。产率：12mg(24％)的标题化合物。ESIMS：220.08[M+H]+。
8-(9-芴基甲氧基羰基氨基)-3，6-二氧代辛酸叔丁酯
将150mg(0.389mmol)8-(9-芴基甲氧基羰基氨基)-3，6-二氧代辛酸、546mg(9.73mmol)异丁烯和4.3μL 95-98％H2SO4在室温搅拌3天。对于加工，将反应溶液用二氯甲烷稀释并用饱和碳酸氢盐溶液洗。用硫酸钠干燥后，将溶剂除去并将获得的残留物用cHex/EtOAc梯度在硅胶上通过层析来纯化，提供了145mg(84.4％)的标题化合物。ESI MS：464.12[M+Na]+。
实施例45：本发明环状酯肽的衍生化
Figure GPA00001102397000831
向在11ml甲苯/DMF(10∶1)中的101mg(0.1mmol)实施例41的化合物和40mg CuI的混合物中加入50L DIEPA和1mL 1M 1-叠氮基-2-[2-(2-叠氮基-乙氧基)-乙氧基]-乙烷的溶液并在45℃搅拌6小时。然后，用饱和NaH2PO4溶液洗反应混合物，用硫酸钠干燥，并将溶剂蒸发。获得的残留物通过层析(SiO2；cHex/EtOAc(1∶1)+20％MeOH)纯化，提供了14mg(11.7％)的标题化合物。ESI MS：1231.34[M+Na]+。
实施例46：本发明环状酯肽的衍生化
Figure GPA00001102397000841
将在25mL水中的25mg根据式(II)的酯肽的溶液室温搅拌。在这种溶液中，在HPLC分析中观察到了与根据式(II)的酯肽形成平衡的额外的峰。20天后，使用冻干法将溶液干燥并使用如实施例1中所述的反向层析将该额外的峰分离。这提供了0.75mg根据实施例46的环状酯肽，其中Ahp已经转化为5-羟脯氨酸。
ESI-MS：正电荷模式：m/z＝951.5(M+Na)，负电荷模式：m/z＝927.4(M-H)；单种同位素的MW 928.5，C46H72N8O12
1H NMR(600MHz)d6-DMSOδH：0.00(1H，m)、0.50(3H，t，J＝7.3Hz)、0.71(3H，m)、0.76(3H，t，J＝7.0Hz)、0.76(3H，d，J＝7.3Hz)、0.85(6H，d，J＝6.6Hz)、0.88(1H，m)、1.00(1H，m)、1.03(3H，d，J＝6.6Hz)、1.06(6H，d，J＝6.6Hz)、1.10(1H，m)、1.16(1H，m)、1.26(1H，m)、1.36(1H，m)、1.43(1H，m)、1.51(2H，m)、1.79(1H，m)、1.83(1H，m)、1.97(1H，m)、1.99(1H，m)、2.17(2H，t，J＝7.7Hz)、2.39(1H，m)、2.48(1H，m)、2.67(3H，s)、2.78(1H，m)、3.43(1H，m)、4.32(1H，m)、4.33(1H，m)、4.45(1H，m)、4.48(1H，m)、4.58(1H，m)、4.61(1H，m)、4.67(1H，m)、5.09(1H，m)、5.47(1H，m)、6.66(2H，d，J＝8.1Hz)、6.74(1H，s，宽)、7.03(2H，d，J＝8.1Hz)、7.31(1H，s，宽)、7.33(1H，d，J＝9.5Hz)、8.04(1H，d，J＝9.5Hz)、8.17(1H，d，J＝8.1Hz)、8.23(1H，d，J＝2.9Hz)、8.43(1H，d，J＝9.5Hz)、9.25(1H，s，宽)，(羟脯氨酸的OH基团不可见)。
实施例47：本发明环状酯肽的衍生化
Figure GPA00001102397000851
将在25mL 0.5N HCl中的100mg根据式(II)的酯肽的溶液在50℃搅拌24小时。对于加工，将反应混合物的pH用5N NaOH调整到pH7并用乙酸乙酯提取。将有机层用硫酸钠干燥并将溶剂在真空中除去。获得的残留物通过反相层析(与实施例1所述的相同条件)纯化，提供了17mg根据实施例47的环状酯肽，其中A1中的谷氨酰胺已经用谷氨酸替代。
ESI-MS：正电荷模式：m/z＝952.8(M+Na)，负电荷模式：m/z＝928.5(M-H)；单种同位素的MW 929.5，C46H71N7O13
1H NMR(600MHz，d6-DMSO)δH：.-0.11(3H，d，J＝6.6Hz)、0.64(4H，m)、0.77(3H，d，J＝6.6Hz)、0.81(3H，t，J＝7.3Hz)、0.84(3H，d，J＝6.6Hz)、0.88(3H，d，J＝6.6Hz)、1.02(6H，m)、1.05(1H，m)、1.10(1H，m)、1.19(3H，d，J＝5.9Hz)、1.24(1H，m)、1.40(1H，m)、1.51(1H，m)、1.75(1H，m)、1.78(5H，m)、1.85(2H，m)、2.10(2H，m)、2.45(1H，m)、2.60(1H，m)、2.67(1H，m)、2.71(3H，s)、3.20(1H，m)、4.28(1H，m)、4.29(1H，m)、4.44(2H，m)、4.63(1H，d，J＝9.5Hz)、4.69(1H，m)、4.93(1H，m)、5.04(1H，m)、5.47(1H，m)、6.24(1H，s，宽)、6.64(2H，d，J＝8.8)、6.99(2H，d，J＝8.8Hz)、7.37(1H，d，J＝9.5Hz)、7.69(1H，d，J＝9.5Hz)、7.80(1H，d，J＝9.5Hz)、8.51(1H，d，J＝8.8Hz)、8.57(1H，d，J＝5.1Hz)、酪氨酸和谷氨酸的OH基团不可见)
本发明也提供了
1.具有式(I)的结构的环状酯肽或其衍生物，
其中发现酯键在A7的羧基基团和A2的羟基基团之间，
其中X和A1是各自独立地任选的，
且其中
X是任一化学残基
A1是不为天冬氨酸的标准氨基酸，
A2是苏氨酸或丝氨酸，
A3是非碱性标准氨基酸或其非碱性衍生物
A4是Ahp、脱氢-AHP、脯氨酸或它们的衍生物，
A5是异亮氨酸或缬氨酸，
A6是酪氨酸或其衍生物，
A7是亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸，
或者环状酯肽或其衍生物的可药用盐。
2.权利要求1所述的环状酯肽或其衍生物，其中A5和A6之间酰胺键的氮原子被甲基取代。
3.权利要求1或2所述的环状酯肽或其衍生物，其中所述X是H或酰基残基。
4.权利要求1-3中任一项所述的环状酯肽或其衍生物，其中所述X是CH3CH2CH(CH3)CO、(CH3)2CHCH2CO或(CH3)2CHCO。
5.权利要求1-4中任一项所述的环状酯肽或其衍生物，其中所述A1是谷氨酰胺。
6.权利要求1-5中任一项所述的环状酯肽或其衍生物，其中所述A2是苏氨酸。
7.权利要求1-6中任一项所述的环状酯肽或其衍生物，其中所述A3是亮氨酸。
8.权利要求1-7中任一项所述的环状酯肽或其衍生物，其中所述A6是酪氨酸。
9.权利要求1-8中任一项所述的环状酯肽或其衍生物，其中所述A4是Ahp衍生物3-氨基-2哌啶酮。
10.权利要求1-4中任一项所述的环状酯肽或其衍生物，其中X是(CH3)2CHCO，A1是谷氨酰胺，
A2是苏氨酸，
A3是亮氨酸，
A4是AHP或其衍生物，
A5是异亮氨酸或缬氨酸，
A6是酪氨酸或其衍生物，
A7是异亮氨酸或缬氨酸。
11.权利要求1-4中任一项所述的环状酯肽或其衍生物，其中X是CH3CH2CH(CH3)CO
A1是谷氨酰胺，
A2是苏氨酸，
A3是亮氨酸，
A4是AHP或其衍生物，
A5是异亮氨酸，
A6是酪氨酸或其衍生物，
A7是异亮氨酸。
12.权利要求1-4中任一项所述的环状酯肽或其衍生物，其中X是CH3CH2CH(CH3)CO
A1是谷氨酰胺，
A2是苏氨酸，
A3是亮氨酸，
A4是AHP或其衍生物，
A5是异亮氨酸，
A6是酪氨酸或其衍生物，
A7是异亮氨酸。
13.权利要求1-4中任一项所述的环状酯肽或其衍生物，其中X是(CH3)2CHCH2CO，
A1是谷氨酰胺，
A2是苏氨酸，
A3是亮氨酸，
A4是AHP或其衍生物，
A5是异亮氨酸，
A6是酪氨酸或其衍生物，
A7是异亮氨酸。
14.具有式(I)结构的环状酯肽或其衍生物，
Figure GPA00001102397000881
其中发现酯键在A7的羧基基团和A2的羟基基团之间，
且其中
X是(CH3)2CHCH2CO
A1谷氨酰胺，
A2是苏氨酸，
A3是亮氨酸
A4是Ahp或脯氨酸或者它们的衍生物，
A5是苯丙氨酸，
A6是酪氨酸或其衍生物，
A7是缬氨酸，
或者环状酯肽或其衍生物的可药用盐。
15.权利要求14所述的环状酯肽或其衍生物，其中
X是(CH3)2CH CH2CO
A1谷氨酰胺，
A2是苏氨酸，
A3是亮氨酸
A4是Ahp或其衍生物，
A5是苯丙氨酸，
A6是酪氨酸或其衍生物，
A7是缬氨酸。
16.权利要求14所述的环状酯肽或其衍生物，其中
X是(CH3)2CH CH2CO
A1谷氨酰胺，
A2是苏氨酸，
A3是亮氨酸
A4是脯氨酸或其衍生物，
A5是苯丙氨酸，
A6是酪氨酸或其衍生物，
A7是缬氨酸。
17.权利要求14所述的环状酯肽或其衍生物，其中A5和A6之间酰胺键的所述氮原子被甲基取代。
18.权利要求1-17中任一项所述的环状酯肽或其衍生物，其中A1、A2、A3、A5、A6和A7是L-氨基酸。
19.权利要求1-18中任一项所述的环状酯肽或其衍生物，其中A4是3S，6R Ahp。
20.权利要求1-19中任一项所述的环状酯肽或其衍生物，其用作药物。
21.权利要求1-21中任一项所述的环状酯肽或其衍生物，用作药物用来治疗癌症特别是卵巢癌、或者用于治疗炎症和/或过度增生以及瘙痒性皮肤疾病如疤痕疙瘩、肥厚性瘢痕、痤疮、遗传过敏性皮炎、银屑病、脓疱型银屑病、酒渣鼻、内瑟顿综合征或者其它瘙痒性皮肤病如结节性痒疹、老年人的非特异性痒病以及其它具有上皮屏障功能异常的疾病如衰老的皮肤、炎性肠病和节段性回肠炎以及胰腺炎、或癌症特别是卵巢癌。
22.药物组合物，其包含权利要求1-19中任一项所述的环状酯肽或其衍生物。
23.治疗患有炎症和/或过度增生以及瘙痒性皮肤疾病如疤痕疙瘩、肥厚性瘢痕、痤疮、遗传过敏性皮炎、银屑病、脓疱型银屑病、酒渣鼻、内瑟顿综合征或者其它瘙痒性皮肤病如结节性痒疹、老年人的非特异性痒病以及其它具有上皮屏障功能异常的疾病如衰老的皮肤、炎性肠病和节段性回肠炎以及胰腺炎、或癌症特别是卵巢癌的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-20中任一项所述的环状酯肽或其衍生物。
24.用于产生权利要求1-19中任一项所述的环状酯肽或其衍生物的方法，所述方法包括在合适的培养基中培养软骨霉状菌属菌株、其变体或其突变体，和任选地化学衍生所产生的环状酯肽。
25.用于产生权利要求1-19中任一项所述的环状酯肽或其衍生物的方法，所述方法包括在异源微生物宿主菌株中表达软骨霉状菌属菌株、其变体或其突变体的生物合成基因，和任选地化学衍生所产生的环状酯肽。
26.权利要求24或25所述的方法，其中所述菌株是藏红花软骨霉状菌(DSM 19329)或粗柄软骨霉状菌(DSM 19330)。
27.产生权利要求1-19中任一项所述的环状酯肽或其衍生物的分离的软骨霉状菌属微生物，所述分离的软骨霉状菌属微生物在保藏号DSM19329或DSM 19330下保藏。
28.环状酯肽或其衍生物，其通过权利要求27所述的分离的软骨霉状菌属微生物产生或通过根据权利要求24-26所述的方法获得。
29.用于制备根据权利要求1所述的环状酯肽或其衍生物的衍生物的方法，所述方法备选地包括
a)通过在温度-78℃和150℃之间、用有机酸或无机酸或者路易斯酸处理其中A4是
的化合物来制备其中A4是
Figure GPA00001102397000912
的根据权利要求1所述的环状酯肽或其衍生物的衍生物；
b)通过在温度-50℃和100℃之间、在溶剂中存在催化剂下，用分子氢或其源处理其中A4是
Figure GPA00001102397000913
的化合物来制备其中A4是
Figure GPA00001102397000914
的根据权利要求1所述的环状酯肽或其衍生物的衍生物；
c)通过在温度-78℃和150℃之间、在还原剂存在下，用有机酸或无机酸或者路易斯酸处理其中A4是
Figure GPA00001102397000915
的化合物来制备其中A4是
的根据权利要求1所述的环状酯肽或其衍生物的衍生物；或
d)通过在温度-78℃和150℃之间、用取代的或未取代的烷醇和有机酸或者无机酸或路易斯酸处理其中A4是
Figure GPA00001102397000922
的化合物来制备其中A4是
的根据权利要求1所述的环状酯肽或其衍生物的衍生物；
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Claims (23)

1.具有式(I)结构的环状酯肽或其衍生物，
Figure FPA00001102396900011
其中在A7的羧基基团和A2的羟基基团之间形成酯键，
其中X和A1是各自独立地任选的，
且其中
X是H或氨基基团修饰部分且可以一般地选自芳基残基、羰基残基或选自酰基残基，
A1是谷氨酰胺、鸟氨酸、谷氨酸或它们的衍生物；
A2是苏氨酸或丝氨酸，
A3是亮氨酸，
A4是Ahp、3-氨基-哌啶-2-酮、脱氢-AHP、Ahp-I、Ahp-II、脯氨酸、5-羟基-脯氨酸或它们的衍生物，其中稠合的点(与A3和A5稠合的点)在脯氨酸和5-羟脯氨酸的氮原子和羧基氧处(借助于用键替换氢原子)，
其中Ah p、3-氨基-哌啶-2-酮、脱氢-AHP、Ahp-I和Ahp-II如下所定义，
且其中所述稠合的点(与A3和A5稠合的点)在所述化合物的氮原子处(借助于用键替换氢原子)：
Figure FPA00001102396900021
3-氨基-6-羟基-哌啶-2-酮(Ahp)
Figure FPA00001102396900022
Ahp-IX＝O或键Ahp-II3-氨基-3，4-二氢-1H-吡啶-2-酮(脱氢-AHP)3-氨基-哌啶-2-酮
其中X是O或键，且所述R是有机部分或者是如在权利要求3中所定义的基团，
A5是异亮氨酸、苯丙氨酸或缬氨酸，
A6是酪氨酸、N-Me-酪氨酸或它们的衍生物，
A7是亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸，
或者它们的可药用盐。
2.权利要求1所述的酯肽，其中X是CH3CH2CH(CH3)CO、(CH3)2CHCH2CO、(CH3)2CHCO、CH3CO或苯基-CO。
3.权利要求1所述的酯肽，其中A5和A6之间酰胺键的所述氮原子被甲基取代且所述酪氨酸的OH基团是OR，其中R选自氢、(C1-12)烷基、(C2-12)烯基、(C2-12)炔基、卤代(C1-12)烷基、卤代(C2-12)烯基、卤代(C2-12)炔基、(C1-12)烷氧羰基、(C1-12)烷氧基-羰基(C1-12)烷基、(C1-12)烷基氨基羰基，所述基团未被取代或者被芳基、芳基烷基、芳基烯基或芳基炔基、杂环基和杂环基烷基进一步取代。
4.权利要求1所述的酯肽，其中A4是Ahp衍生物3-氨基-哌啶-2-酮、Ahp-I或Ahp-II，其中R选自(C1-12)烷基、(C2-12)烯基、(C2-12)炔基、卤代(C1-12)烷基、(C1-12)烷氧基(C1-12)烷基、(C1-12)烷氧基(C1-12)烷氧基(C1-12)烷基、羟基(C1-12)烷基、苯基和苯基(C1-6)烷基。
5.权利要求1所述的酯肽，其中所述酰基残基X是CH3CH2CH(CH3)CO或(CH3)2CHCO，
A1是谷氨酰胺、谷氨酸或它们的衍生物，
A2是苏氨酸，
A3是亮氨酸，
A4是Ahp、3-氨基-哌啶-2-酮、脯氨酸、5-羟基-脯氨酸或它们的衍生物，
A5是异亮氨酸，
A6是酪氨酸、N-甲基-酪氨酸或它们的衍生物，
A7是异亮氨酸或缬氨酸，优选地是异亮氨酸。
6.任一前述权利要求所述的酯肽，其中所述A4是Ahp、Ahp-I、3-氨基-哌啶-2-酮、脯氨酸或5-羟基-脯氨酸，优选地是Ahp、Ahp-I、3-氨基-哌啶-2-酮或5-羟基-脯氨酸，也优选地是Ahp、Ahp-I或5-羟基-脯氨酸，更优选地是Ahp。
7.权利要求1所述的酯肽，其是根据式A或式B的化合物，
Figure FPA00001102396900041
其中X和A1是如权利要求1中所定义，且其中
R2是氨基酸苏氨酸或丝氨酸的侧链，
R3是亮氨酸的侧链，
R5是氨基酸异亮氨酸或缬氨酸的侧链，特别地所述R5代表异亮氨酸的侧链，
R6是任选地衍生的酪氨酸的侧链，特别是如权利要求3所定义的在其羟基基团任选地衍生的酪氨酸的侧链，
R7是氨基酸亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸的侧链，特别地R7代表异亮氨酸的侧链，
Y是氢或者甲基，且Y特别地是甲基。
8.任一前述权利要求所述的环状酯肽，其中A1、A2、A3、A5、A6和A7是L-氨基酸。
9.任一前述权利要求所述的环状酯肽，其中A4是3S，6R Ahp。
10.任一前述权利要求所述的环状酯肽，其中所述A1是如在说明书的任一实施例中描述的谷氨酰胺、鸟氨酸或谷氨酰胺衍生物，且所述A1如选自谷氨酸腈、谷氨酸酯例如C1-12烷基酯(如谷氨酸甲酯)或C6-24芳基酯(如谷氨酸苯酯或谷氨酸苄酯)。
11.药物组合物，其包含与可药用载体和/或成分组合的任一前述权利要求所述的环状酯肽。
12.任一前述权利要求所述的环状酯肽，其用作药物，特别是用在如权利要求13-15所述的治疗患者的方法中，以及所述环状酯肽在制备治疗如所述方法权利要求中所述的疾病和病症的药物中用途。
13.治疗患炎症和/或过度增生以及瘙痒性皮肤疾病如疤痕疙瘩、肥厚性瘢痕、痤疮、遗传过敏性皮炎、银屑病、脓疱型银屑病、酒渣鼻、内瑟顿综合征或者其它瘙痒性皮肤病如结节性痒疹、老年人的非特异性痒病以及其它具有上皮屏障功能异常的疾病如衰老的皮肤、炎性肠病和节段性回肠炎以及胰腺炎、或癌症特别是卵巢癌、囊性纤维化(CF)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肺纤维化、成人型呼吸窘迫综合征、慢性支气管炎、遗传性肺气肿、类风湿性关节炎、IBD、银屑病、哮喘的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-10中任一项所述的环状酯肽或其衍生物。
14.根据权利要求13所述的治疗受试者的方法，其中所述受试者患疤痕疙瘩、肥厚性瘢痕、痤疮、遗传过敏性皮炎、银屑病、脓疱型银屑病、酒渣鼻、内瑟顿综合征或者其它瘙痒性皮肤病如结节性痒疹、老年人的非特异性痒病以及其它具有上皮屏障功能异常的疾病如衰老的皮肤、炎性肠病和节段性回肠炎以及胰腺炎、或癌症特别是卵巢癌。
15.根据权利要求14所述的治疗受试者的方法，其中所述受试者患疤痕疙瘩、肥厚性瘢痕、痤疮、遗传过敏性皮炎、银屑病、脓疱型银屑病、酒渣鼻、内瑟顿综合征或者其它瘙痒性皮肤病如结节性痒疹、老年人的非特异性痒病以及其它具有上皮屏障功能异常的疾病如衰老的皮肤。
16.根据权利要求13所述的治疗受试者的方法，其中所述受试者患囊性纤维化(CF)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肺纤维化、成人型呼吸窘迫综合征、慢性支气管炎、遗传性肺气肿、类风湿性关节炎、IBD、银屑病、哮喘。
17.用于产生权利要求1-10中任一项所述的环状酯肽或其衍生物的方法，所述方法包括在合适的培养基中培养软骨霉状菌属(Chondromyce)菌株、其变体或其突变体，和任选地化学衍生所产生的环状酯肽。
18.用于产生权利要求1-10中任一项所述的环状酯肽或其衍生物的方法，所述方法包括在异源微生物宿主菌株中表达软骨霉状菌属菌株、其变体或其突变体的生物合成基因，和任选地化学衍生所产生的环状酯肽。
19.权利要求17或18所述的方法，其中所述菌株是藏红花软骨霉状菌(Chondromyces crocatus)(DSM 19329)或粗柄软骨霉状菌(Chondromycesrobustus)(DSM 19330)或者尖软骨霉状菌(Chondromyces apiculatus)(DSM21595)。
20.产生权利要求1-10中任一项所述的环状酯肽或其衍生物的分离的软骨霉状菌属微生物，所述分离的软骨霉状菌属微生物在保藏号DSM19329或DSM 19330或者DSM 21595下保藏。
21.环状酯肽或其衍生物，其由权利要求20所述的分离的软骨霉状菌属微生物产生或通过根据权利要求17-18所述的方法获得。
22.用于制备根据权利要求1所述的环状酯肽或其衍生物的衍生物的方法，所述方法备选地包括
a)通过在温度-78℃和150℃之间、用有机酸或无机酸或者路易斯酸处理其中A4是
的化合物来制备其中A4是
Figure FPA00001102396900062
的根据权利要求1所述的环状酯肽或其衍生物的衍生物；
b)通过在温度-50℃和100℃之间、在溶剂中存在催化剂下，用分子氢或其源处理其中A4是
Figure FPA00001102396900071
的化合物来制备其中A4是
Figure FPA00001102396900072
的根据权利要求1所述的环状酯肽或其衍生物的衍生物；
c)通过在温度-78℃和150℃之间、在还原剂存在下，用有机酸或无机酸或者路易斯酸处理其中A4是
Figure FPA00001102396900073
的化合物来制备其中A4是
的根据权利要求1所述的环状酯肽或其衍生物的衍生物；或
d)通过在温度-78℃和150℃之间、用取代的或未取代的烷醇和有机酸或者无机酸或路易斯酸处理其中A4是
Figure FPA00001102396900075
的化合物来制备其中A4是
Figure FPA00001102396900081
的根据权利要求1所述的环状酯肽或其衍生物的衍生物；
e)通过在温度-78℃和150℃之间、用取代的或未取代的烷醇和有机酸或者无机酸或路易斯酸在溶剂中或者无溶剂地处理其中A1是Gln或Asn且A4是
Figure FPA00001102396900082
其中R优选地是H、烷基、取代的烷基的化合物来制备其中A1是
Figure FPA00001102396900083
其中n＝1、2，且A4是
其中R优选地是H、烷基、取代的烷基的化合物；
f)通过在温度-78℃和150℃之间、用脱水剂在溶剂中或者无溶剂地处理其中A1是Gln或Asn且A4是
Figure FPA00001102396900091
的化合物来制备其中A1是
Figure FPA00001102396900092
其中R优选地是H、OH、O-烷基、取代的O-烷基、O-酰基的化合物；
g)通过在温度-78℃和150℃之间、用烷化剂或酰化剂在溶剂中或者无溶剂地处理其中A4是
Figure FPA00001102396900093
且A6是Tyr的化合物来制备其中A4是
Figure FPA00001102396900094
且A6是
Figure FPA00001102396900101
其中R优选地是烷基、取代的烷基、酰基、烷氧基羰基的化合物。
23.环状酯肽或其衍生物或者它们的可药用盐，其特别地和实质上如在说明书和/或工作实施例中所述。
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