DE3789371T2 - Aryloxy- und Arylacyloxymethyl-Ketone als Thiolprotease-Hemmungsstoffe. - Google Patents

Aryloxy- und Arylacyloxymethyl-Ketone als Thiolprotease-Hemmungsstoffe.

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Description

  • Die Erfindung betrifft im allgemeinen Inhibitoren von Thiol (Cystein) Proteasen und im besonderen Inhibitoren von Cathepsin B (Cat-B).
  • Proteasen sind eine signifikante Klasse von Enzymen, die wichtig sind in der normalen Physiologie, sie stehen jedoch auch in Verbindung mit einer Anzahl von Krankheitszuständen, die umfassen jedoch nicht beschränkt sind auf Entzündung, Metastase, Gewebsschädigung als Folge eines myokardialen Infarktes, Knochenresorption und Muskelschwund bei dystrophischen Krankheiten.
  • Cathepsin B ist eine Cystein Protease die im normalen Proteinabbau involviert ist und befindet sich als solche in den Lysosomen der Zellen. Es ist im wesentlichen allgegenwärtig in seiner Gewebsverteilung. In extrazellulären oder zell-oberflächen Formen, besitzen Cathepsin B oder Cathepsin B ähnliche Enzyme eine behauptete Beteiligung an verschiedenen der oben angegebenen Zustände.
  • In den letzten Jahren haben Untersucher über eine Anzahl von synthetischen Protease Inhibitoren berichtet: Rasnick, in US-A- 4,518,528 und in Anal. Biochem. 149, 461-465 (1985) offenbart a- Amino-fluoromethylketone als irreversible Inhibitoren von Serin- oder Cysteinproteasen; Shaw, et al., in Biochemistry 16, 5857 (1977), Biochem. Biophys. Res. Commun. 89, 1354 (1979) und J. Biol. Chem. 256, 1923 (1981) offenbaren Peptidyl Diazomethylketone als irreversible Inhibitoren von Thiol Proteasen; und Hanada, et al., Agric. Biol. Chem. 42,529, (1978) und Biochem.J., 201, 189 (1982) offenbaren Epoxysuccinyl Peptide als Inhibitoren von Thiol Proteasen. Eine beschränkte Anzahl von Peptidyl Acetyloxy-Methyl Ketonen wurde als Enzyminhibitoren beschrieben: McMurray und Dyckes in Biochemistry 25, 2298 (1986) offenbaren ein Acetyloxymethyl Keton als reversiblen Inhibitor des Serin Protease Trypsins und Larsen und Shaw in J. Med. Chem. 19, 1284 (1976) offenbaren Acetyloxy- Methylketone als reversible Inhibitoren des Serin Protease Chymotripsins. EP-A-195212 beschreibt Peptidyl-Methylketone die eine elektronentziehende Gruppe oder eine austretende Gruppe am C- Terminus enthalten als Inhibitoren von Cystein Protease.
  • Eine Übersicht dieses Standes der Technik zeigt, daß eine Notwendigkeit für potente und spezifische Thiol Protease Inhibitoren besteht. Im besonderen besteht eine Notwendigkeit für chemisch stabile Inhibitoren die die Wahrscheinlichkeit von nichtspezifischen Reaktionen mit Plasma oder zellulären Bestandteilen gering halten.
  • Diese Erfindung betrifft Verbindungen der Formel
  • oder ein optisches Isomeres hiervon oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon worin
  • n = 0 oder 1 ist
  • m = 0, 1 oder 2 ist
  • X für Wasserstoff oder eine N-Schutzgruppe ausgewählt aus Trifluoroacetyl, Acetyl, Isobutyloxycarbonyl, Methoxycarbonyl, Phenylsulfonyl, Methoxysuccinyl, Hydroxysuccinyl, Benzoyl, p- Methoxycarbonyl-benzoyl (p-CH&sub3;OCO-C&sub6;H&sub4;CO-), p- Phenylsulfonamidocarbonyl-benzoyl (p-C&sub6;H&sub5;SO&sub2;NHCO-C&sub6;H&sub4;CO-), Boc, CBZ oder Tosyl steht; jedes Symbol Y unabhängig voneinander den Rest einer natürlichen Aminosäure bedeutet, der aus Alanyl, Arginyl, Asparaginyl, Aspartyl, Cysteinyl, Glutamyl, Glutaminyl, Glycyl, Histidyl, Leucyl, Isoleucyl, Lysyl, Methionyl, Phenylalanyl, Seryl, Tyrosyl, Threonyl, Tryptophanyl, Valyl oder Prolyl ausgewählt ist, wobei dieser Rest eine gegebenenfalls durch eine O-Schutzgruppe, eine S-Schutzgruppe oder eine N-Schutzgruppe geschützte Seitenkette besitzt;
  • R für Wasserstoff oder eine Seitenkette eines vorher erwähnten natürlichen Aminosäurerestes mit Ausnahme von Prolyl steht, wobei die vorher erwähnte Seitenkette gegebenenfalls durch eine O- Schutzgruppe, eine S-Schutzgruppe oder eine N-Schutzgruppe geschützt ist;
  • R' gegebenfalls substituiertes Phenyl oder 1-Naphthyl oder unsubstituiertes 2-Naphthyl oder 9-Anthracyl bedeutet.
  • Die Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung sind verwendbar zur Hemmung von Thiol Proteasen, zur Behandlung oder Vorbeugung von Gewebeschäden bei Myokardinfarkten, zur Behandlung von Entzündung, zur Behandlung oder Vorbeugung von Knochenresorption, zur Verzögerung oder Vorbeugung einer Gewebsschädigung bei dystrophischen Krankheiten und einer Förderung der Gewichtszunahme von Pflanzen und Tieren, wie Geflügel, Rindern oder Schweinen.
  • Ein anderer Aspekt der Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend einen therapeutisch wirksamen Anteil einer Verbindung der Formel I, vermischt mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft chemische Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel I.
    • Definitionen
  • Für den Zweck der vorliegenden Erfindung besitzen die nachfolgenden Bezeichnungen die in der Folge angegebenen Bedeutungen.
  • "Alkyl" bedeutet einen verzweigten oder unverzweigten, gesättigten aliphatischen Kohlenwasserstoffrest, der die angegebene Zahl von Kohlenstoffatomen oder falls keine Kohlenstoffzahl angegeben ist bis zu 8 Kohlenstoffatomen enthält. Die Vorsilbe "Alk"- gibt ebenfalls an, daß der Alkylteil dieses Restes bis zu 8 Kohlenstoffatome besitzt, falls nicht anders angegeben. Beispiele von Alkylresten umfassen Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n- Butyl, tert.Butyl, n-Pentyl, n-Hexyl und ähnliche. Die Bezeichnungen "niedriges Alkyl" und "Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen" sind Synonyme und werden abwechselnd verwendet.
  • Abkürzungen werden wie folgt verwendet:
  • "Ac" bedeutet Acetyl.
  • "Boc" bedeutet t-Butyloxycarbonyl.
  • "CBZ" bedeutet Benzyloxycarbonyl.
  • "DCC" bedeutet N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid.
  • "EDCI" bedeutet N-Ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid.
  • "NMM" bedeutet N-Methylmorpholin.
  • "Tosyl" bedeutet 4-Toluolsulfonyl.
  • "α-Aminosäuren" wie sie hier verwendet werden, umfassen natürlich vorkommende Aminosäuren und deren optische Isomere. Typische natürliche Aminosäuren sind Glycin, Alanin, Serin, Threonin, Valin, Leucin, Isoleucin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Lysin, Ornithin, Histidin, Arginin, Cystein, Methionin, Phenylalanin, o-, m- und p-Tyrosin, Tryptophan, Glutamin, Asparagin, Prolin und Hydroxyprolin. Ein Aminosäurerest ist ein Aminosäureradikal -NHCH(R)C(O)- worin R eine Aminosäure-Seitenkette bedeutet, mit Ausnahme der Reste von Prolin und Hydroxyprolin der Formeln-N (CH&sub2;-CH&sub2;-CH&sub2;)CHC(O)- bzw. -N(CH&sub2;CHOHCH&sub2;)CHC(O)- Eine Aminosäure-Seitenkette ist ein Radikal das sich am α-Kohlenstoffatom einer α-Aminosäure, wie sie hier definiert ist, befindet, worin das Radikal entweder Wasserstoff (Seitenkette von Glycin) oder Methyl (Seitenkette von Alanin) ist oder ein Radikal bedeutet das an das α- Kohlenstoffatom mittels einer Methylen (-CH&sub2;-), Methin (-CH-) oder Phenyl-Gruppe gebunden ist. Ein hydrophober Aminosäure-Rest oder eine Seitenkette sind solche, worin die Seitenkette beim physiologischen pH ungeladen ist.
  • "Halo" bedeutet Brom, Chlor oder Fluor.
  • "Wahlweise" oder "gegebenenfalls" bedeutet, daß das nachfolgend beschriebene Ereignis oder die Umstände eintreten oder nicht eintreten können, und die Beschreibung Fälle enthält, worin solche Ereignisse und Umstände eintreten und Fälle worin diese nicht eintreten. Beispielsweise bedeutet "gegebenenfalls substituiertes Phenyl", daß das Phenyl-Radikal substituiert sein kann oder nicht und die Beschreibung sowohl unsubstituierte Phenyl-Radikale als auch Phenyl-Radikale umfaßt die eine Substitution besitzen.
  • "Gegebenenfalls substituiertes Aryl" bedeutet gegebenenfalls substituiertes Phenyl oder 2-Naphthyl; oder unsubstituiertes 2- Naphthyl oder 9-Anthracyl.
  • "Gegebenenfalls substituiertes Phenyl" bedeutet unsubstituiertes Phenyl; und ein Phenyl das 1 bis 5 Fluor- Substituenten besitzt; und Phenyl das 1 bis 3 Substituenten besitzt, wobei die Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe die aus niedrigem Alkyl, niedrigem Alkoxy, Nitro, Halo, Acetyl, Benzoyl, Hydroxy, Amino, Methylamino, Dimethylamino, Diethylamino, Methylthio, Cyano, Trifluoromethyl, Phenylsulfonamidocarbonyl (-CONHSO&sub2;-C&sub6;H&sub5;), -COOH, -CONH&sub2;, -COOR², NHCOR² worin R² niedriges Alkyl bedeutet, besteht; und 2,3,5,6- Tetramethyl-4-carboxy-phenyl [-C&sub6;H&sub5;-(CH&sub3;)&sub4;-COOH].
  • "Gegebenenfalls substituiertes 1-Naphthyl" umfaßt unsubstituiertes 1-Naphthyl; und 1-Naphthyl substituiert in Stellung 2 durch niedriges Alkyl, niedriges Alkoxy oder Trifluoromethyl.
  • "Gegebenenfalls geschützter α-Aminosäure Rest" bedeutet einen α-Aminosäure Rest mit einer gegebenenfalls geschützten α-Aminosäure Seitenkette.
  • "Gegebenenfalls geschützte α-Aminosäure Seitenkette" umfaßt eine ungeschützte α-Aminosäure Seitenkette wie das H in Glycin, das CH&sub3; in Alanin und das CH&sub2;OH in Serin; oder falls die Seitenkette Heteroatome enthält wie Sauerstoff, Schwefel oder Stickstoff können die Heteroatome in der Seitenkette gegebenenfalls geschützt sein durch eine O-, S- oder N-Schutzgruppe.
  • Eine "O-,S- oder N-Schutzgruppe" ist ein Radikal das an ein Sauerstoff-, Schwefel- bzw. Stickstoffatom gebunden ist, wobei das Radikal dazu dient die Sauerstoff, Schwefel oder Stickstoff Funktionen gegen unerwünschte Reaktionen zu schützen und/oder die Eigenschaften derjenigen Moleküle, an die sie gebunden sind, zu modifizieren (beispielsweise Löslichkeit, Lipophilizität, Bioverfügbarkeit, usw.). Solche Schutzgruppen sind aus dem Stand der Technik wohl bekannt und viele sind beschrieben in "The Peptides" E.Gross und J.Meienhofer, Eds., Band 3, Academic Press, NY (1981) und "Chemistry of the Amino Acids" J.P.Greenstein und M.Winitz, Band 2, J.Wiley and Sons, NY (1961).
  • "N-Schutzgruppen" für Amino Funktionen von Aminosäuren, am N- Terminal des Peptids oder an einer Seitenkette einer Aminosäure sind aus dem Stand der Technik wohl bekannt. Eine beispielhafte Darstellung von bekannten Amino N-Schutzgruppen befindet sich in "The Peptides" E.Gross und J.Meienhofer Eds., Academic Press, NY (1981), Band 3, Kapitel 1; "Protective Groups in Organic Synthesis" T.W. Greene, J. Wiley and Sons, NY (1981), Kapitel 7; und "Chemistry of the Amino Acids" J.P. Greenstein und M. Winitz, J. Wiley and Sons, NY (1961) Band 2, Seiten 885-924; andere (weniger wohlbekannte) N-Schutzgruppen umfassen die Methoxysuccinylgruppe (CH&sub3;OCOCH&sub2;CH&sub2;CO-), die Hydroxysuccinylgruppe (HOOCCH&sub2;CH&sub2;CO-), die p- Methoxycarbonyl-benzoylgruppe (p-CH&sub3;OCO-C&sub6;H&sub4;CO-), die p-Phenylsulfonamidocarbonyl-benzoylgruppe (p-C&sub6;H&sub5;SO&sub2;NH-CO-C&sub6;H&sub4;CO-) und die 2-(1- Adamantyl)-ethoxycarbonylgruppe.
  • Im allgemeinen können diese N-Schutzgruppen in fünf Klassen untergeteilt werden: N-Acyl, N-Alkoxycarbonyl, N- Arylmethoxycarbonyl, N-Arylmethyl und N-Arylsulfonyl Schutzgruppen. Eine N-Acyl Schutzgruppe ist ein niedriges Alkylcarbonyl Radikal, ein Trifluoroacetyl Radikal, ein Methoxysuccinyl Radikal (CH&sub3;OCOCH&sub2;CH&sub2;CO-), ein Hydroxysuccinyl Radikal (HOOCCH&sub2;CHCO-) oder ein Phenylcarbonyl (benzoyl) Radikal gegebenenfalls im Phenyl Ring substituert durch p-Methoxycarbonyl, p-Phenylsulfonamido-carbonyl- (p-C&sub6;H&sub5;SO&sub2;NHCO-), p-Methoxy oder p-Nitro. Eine N-Alkoxycarbonyl Schutzgruppe ist ein niedriges Alkoxycarbonyl Radikal oder ein 2-(1- Adamantyl)-ethoxycarbonyl Radikal. Eine N-Arylmethoxycarbonyl Schutzgruppe ist ein 9-Fluorenmethoxycarbonyl Radikal(Fmoc) oder ein Benzyloxycarbonyl Radikal das gegebenenfalls am aromatischen Ring durch p-Methoxy, p-Nitro, p-Chlor oder o-(N,N-Dimethyl-carboxamido-) substituiert sein kann. Eine N-Arylmethyl Schutzgruppe ist ein Benzyl Radikal das gegebenenfalls im aromatischen Ring durch p- Methoxy, p-Nitro oder p-Chlor substituiert sein kann. Eine N- Arylsulfonyl Schutzgruppe ist ein Phenylsulfonyl Radikal, das gegebenenfalls im aromatischen Ring durch p-Methyl ("tosyl") oder p- Methoxy substituiert sein kann.
  • "N-Schutzgruppen" für Guanidino Funktionen in Arginin Aminosäuren Seitenketten sind aus dem Stand der Technik bekannt und sind, wie bereits besprochen, beschrieben in "The Peptides" Band 3, Seiten 60-70 und "Chemistry of the Amino Acids" Band 2, Seiten 1068- 1077. Diese umfassen die Nitro, p-Toluolsulfonyl, p- Methoxyphenylsulfonyl, CBZ und Boc N-Schutzgruppen.
  • "N-Schutzguppen" für Imidazol Funktionen in Histidin Aminosäure Seitenketten sind aus dem Stand der Technik bekannt und sind, wie bereits besprochen, beschrieben in "The Peptides", Band 3, Seiten 70-80 und "Chemistry of the Amino Acids", Band 2, Seiten 1060-1068. Diese umfassen Benzyl, Triphenylmethyl (Trityl), 2,4- Dinitrophenyl, p-Toluolsulfonyl, Benzoyl und CBZ N-Schutzgruppen.
  • "N-Schutzgruppen" für Indol Funktionen in Tryptophan Aminosäure Seitenketten sind aus dem Stand der Technik bekannt und sind, wie bereits besprochen, beschrieben in "The Peptides" Band 3, Seiten 82-84. Diese umfassen die Formyl und CBZ N-Schutzgruppen.
  • "O-Schutzgruppen" für Hydroxyl Funktionen in Aminosäure Seitenketten sind aus dem Stand der Technik bekannt und sind, wie bereits besprochen, beschrieben in "The Peptides", Band 3, Seiten 169-201 und "Chemistry of Amino Acids" band 2, Seiten 1050-1056. Für aliphatische Hydroxyl Funktionen umfassen geeignete O-Schutzgruppen die Benzyl, tert.-Butyl und Methyl Gruppen. Für aromatische Hydroxyl Funktionen umfassen geeignete O-Schutzgruppen die Benzyl, tert.- Butyl, Methyl, CBZ und Tosyl Gruppen.
  • "O-Schutzgruppen" für Carboxyl Funktionen in Aminosäure Seitenketten sind aus dem Stand der Technik bekannt und sind, wie bereits besprochen, beschrieben in "The Peptides", Band 3, Seiten 101-135 und umfassen Methyl, Ethyl, tert.-Butyl und Benzyl Gruppen.
  • "S-Schutzgruppen" für Thiol Funktionen in Aminosäure Seitenketten sind aus dem Stand der Technik bekannt und sind, wie bereits besprochen, beschrieben in "The Peptides", Band 3, Seiten 137-167 und "Chemistry of the Amino Acids", Seiten 1077-1092. Diese umfassen Methyl, tert.-Butyl, Benzyl, p-Methoxyphenylmethyl, Ethylaminocarbonyl und CBZ Gruppen.
  • "Pharmazeutisch annehmbare Salze" umfassen sowohl basische als auch sauere Additionssalze.
  • "Pharmazeutisch annehmbare Säureadditionssalze" bezieht sich auf diejenigen Salze, die die biologischen Wirksamkeiten und Eigenschaften der freien Basen behalten und die biologisch und auch anders nicht unerwünscht sind und die gebildet werden durch Umsetzung mit anorganischen Säuren wie Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure und ähnlichen und organischen Säuren wie Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Brenztraubensäure, Oxalsäure, Maleinsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Fumarsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Benzoesäure, Zimtsäure, Mandelsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, p- Toluol-sulfonsäure, Salicylsäure und ähnlichen.
  • "Pharmazeutisch annehmbare Basenadditionssalze" umfaßt diejenigen, die von anorganischen Basen abstammen wie Natrium, Kalium, Lithium, Ammonium, Calzium, Magnesium, Eisen, Zink, Kupfer, Mangan, Aluminium Salze und ähnliche: Besonders bevorzugt sind die Ammonium, Kalium, Natrium, Calzium und Magnesium Salze. Salze die von pharmazeutisch annehmbaren, organischen, nicht-toxischen Basen abstammen umfassen Salze von primären, sekundären und tertiären Aminen, substituierten Aminen inbegriffen natürlich auftretenden substituierten Aminen, cyclischen Aminen und basischen Ionenaustausch-Harzen wie Isopropylamin, Trimethylamin, Diethylamin, Triethylamin, Tripropylarnin, Ethanolamin, 2-Dimethylaminoethanol, 2- Diethylaminoethanol, Trimethamin, Dicyclohexylamin, Lysin, Arginin, Histidin, Caffein, Procain, Hydrabamin, Cholin, Betain, Ethylendiamin, Glukosamin, Methylglukamin, Theobromin, Purine, Piperazin, Piperidin, N-Ethylpiperidin, Polyamin Harze und ähnliche. Besonders bevorzugte organische, nicht-toxische Basen sind Isopropylamin, Diethylamin, Ethanolamin, Trimethamin, Dicyclohexylamin, Cholin und Caffein.
  • Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können einzelne Stereoisomere, Racemate oder Diastereomerengemische sein. Falls nicht anders angegeben, befinden sich alle asymmetrischen Kohlenstoffatome der hier beschriebenen Verbindungen in der (S)- Konfiguration wie in den natürlichen L-Aminosäuren. Der Umfang der vorliegenden Erfindung soll aber nicht als auf die (S) optischen Isomere beschränkt betrachtet werden, sondern er umfaßt alle optischen Isomere der Verbindungen und deren Mischungen.
  • Die hier verwendete Nomenklatur ist so, daß die beanspruchten Verbindungen und Zwischenverbindungen als Ketone benannt sind, die von den analogen Carbonsäuren abstammen, insbesondere als substituierte Methylketone die von analogen Carbonsäuren abstammen. Beispielsweise würde die Zwischenverbindung (3), worin X für Benzoyl steht, m = 0 ist, R Methyl bedeutet und Z für Br steht "N-Benzoyl-L- alanin-bromomethylketon" genannt werden nachdem sie von der analogen Carbonsäure (2) abstammt (worin X Benzoyl und m = 0 ist und R Methyl bedeutet) die "N-Benzoyl-L-alanin" genannt wird. In ähnlicher Weise wird die Verbindung der Formel I, worin X für CBZ steht, m 1 ist, Y L-Phenylalanin bedeutet, R Methyl, n = 0 und R' Pentafluorophenyl ist "N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alaninpentafluoro-phenoxymethylketon" genannt und die Verbindung der Formel I, worin X für CBZ steht, in = 1, Y L-Phenylalanyl, R Methyl, n = 1 und R' 2,6-bis(trifluoromethyl)phenyl bedeutet "N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin-2,6- bis(trifluoromethyl)benzoyloxymethylketon" genannt. Diese beiden Verbindungen stammen von der Carbonsäure "N-Benzyloxycarbonyl-L- phenylalanyl-L-alanin" ab.
  • Innerhalb des weitesten Umfanges der Erfindung befinden sich verschiedene bevorzugte Ausführungsformen.
  • Es ist allgemein bevorzugt, daß m 1 oder 2 bedeutet. Falls m für 1 steht, bedeutet Y (die Aminosäure) vorzugsweise eine natürliche Aminosäure und besonders bevorzugt einen hydrophoben Aminosäure Rest wie L-Phenylalanyl, L-Leucyl und L-Alanyl. Es ist besonders bevorzugt, wenn m 1 ist, daß Y für L-Phenylalanyl oder L- Leucyl steht. Falls m für 2 steht sind die beiden Aminosäuren Y vorzugsweise unabhängig voneinander ausgewählt aus hydrophoben Aminosäure Resten. Besonders bevorzugte Aminosäuresequenzen sind, falls m für 2 steht, Glycyl-L-phenylalanyl, L-Leucyl-L-Leucyl, L- insbesondere bevorzugt, daß m für 1 steht und Y L-Phenylalanyl bedeutet.
  • Die bevorzugten, gegebenenfalls geschützten α-Aminosäure Seitenketten (R) sind:
  • Wasserstoff;
  • niedriges Alkyl;
  • -(CH&sub2;)aWR³ worin a für 1 oder 2 steht und W Sauerstoff oder Schwefel bedeutet und R³ Methyl oder Benzyl ist;
  • -CH(CH&sub3;)OCH&sub2;Ph;
  • -(CH&sub2;)bNHR&sup4; worin b 3 oder 4 bedeutet und R&sup4; für H, Ac, Boc oder CBZ steht;
  • -(CH&sub2;)cC(O)R&sup5; worin c 1 oder 2 bedeutet und R&sup5; für Amino, Methoxy oder Benzyloxy steht und
  • -(CH&sub2;)dR&sup6; worin d 0, 1 oder 2 bedeutet und R&sup6; für Phenyl steht oder worin d 1 bedeutet und R&sup6; für Phenyl steht, das monosubstituiert ist durch Methoxy oder Benzyloxy.
  • Die bevorzugteren R Radikale sind die Seitenketten von: Glycin (d.i.Wasserstoff); Alanin (d.i.Methyl); Methionin(d.i.2(Methylthio)ethyl); Phenyl-alanin (d.i.Benzyl); O-Benzylserin (d.i.Benzyloxymethyl); S-Benzylcystein (d.i.Benzylthiomethyl); O-Benzylthreonin (d.i.1-(Benzyloxy)-ethyl) und Lysin (d.i.4-Amino-bu-tyl).
  • Es ist insbesondere bevorzugt, daß R Wasserstoff, Methyl, Benzyloxymethyl oder 4-Aminobutyl bedeutet.
  • Es ist bevorzugt, daß X in der Formel I Wasserstoff oder eine Amino N-Schutzgruppe bedeutet ausgewählt aus der Liste: Trifluoroacetyl, Acetyl, Methoxysuccinyl, Hydroxysuccinyl, Benzoyl, p-Methoxycarbonyl-benzoyl (p-CH&sub3;OCO-C&sub6;H&sub4;CO-), p-Phenylsulfonamidocarbonyl-benzoyl (p-C&sub6;H&sub5;SO&sub2;NHCO-C&sub6;H&sub4;CO-), Boc, Isobutyloxycarbonyl, Methoxycarbonyl, CBZ, Phenylsulfonyl und Tosyl. Es ist besonders bevorzugt, daß X für Wasserstoff, Acetyl, Methoxysuccinyl, Hydroxysuccinyl, Benzoyl, p-Methoxycarbonylbenzoyl-(p-CH&sub3;OCO-C&sub6;H&sub5;CO-), p-Phenylsulfonamidocarbonyl-benzoyl (p-C&sub6;H&sub5;SO-NHCO-C&sub6;H&sub4;CO-), Boc, CBZ, oder Tosyl steht. Es ist besonders bevorzugt, daß X für CBZ, Methoxysuccinyl, Hydroxysuccinyl, p- Methoxycarbonyl-benzoyl (p-CH&sub3;OCO-C&sub6;H&sub4;-CO-) oder p-Phenylsulfonamidocarbonyl-benzoyl (p-C&sub6;H&sub5;SO&sub2;NHCO-C&sub6;H&sub4;CO-) steht.
  • Falls n 1 bedeutet so ist es bevorzugt, daß R' ausgewählt ist aus:
  • Phenyl:
  • Phenyl substituiert in Stellung 4 durch Acetylamino, Acetyl, Benzoyl, Halo, Amino, Methylamino, Dimethylainino, Diethylainino, Hydroxy, Methoxy, Ethoxy, Methylthio, Cyano, Nitro, Phenylsulfonamidocarbonyl, Trifluoromethyl, Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl oder tert-Butyl;
  • Phenyl disubstituiert in den Stellungen 3,5 durch Hydroxy oder Trifluoromethyl;
  • Phenyl disubstituiert in den Stellungen 2,6 durch Methyl, Trifluoromethyl, Methoxy, Fluor oder Chlor;
  • Pentafluorophenyl;
  • 2,4,6-Trimethyl-oder 2,4,6-Triisopropyl-phenyl;
  • 2,6-Dimethyl-4-methoxycarbonyl-phenyl;
  • 2,6-Dimethyl-4-phenylsulfonamidocarbonyl-phenyl;
  • 2,3,5,6-Tetramethyl-4-carboxy-phenyl (-C&sub6;(CH&sub3;)&sub4;-COOH);
  • 1-Naphthyl gegebenenfalls in Stellung 2 substituiert durch Methyl, Methoxy oder Ethoxy;
  • 2-Naphthyl; und 9-Anthracyl.
  • Falls n = 1 ist es besonders bevorzugt wenn R' ausgewählt ist aus:
  • 2,6-Dimethyl-4-methoxycarbonyl-phenyl;
  • 2,6-Dimethyl-4-phenylsulfonamidocarbonyl-phenyl;
  • 2,6-bis(trifluoromethyl)-phenyl;
  • 2,4,6-Trimethylphenyl;
  • 2,3,5,6-Tetramethyl-4-carboxy-phenyl;
  • 2-methyl-1-naphthyl; und
  • 9-Anthracyl.
  • Falls n = 1 ist es besonders bevorzugt wenn R' für 2,6- bis(trifluoromethyl)phenyl, 2,4,6-Trimethylphenyl oder 2,3,5,6-Tetramethyl-4-carboxy-phenyl steht.
  • Falls in der Formel I n für 0 steht ist es bevorzugt wenn R' ausgewählt ist aus:
  • Phenyl;
  • Phenyl substituiert durch 1 oder 2 Fluoratome;
  • 2,3,5,6- oder 2,3,4,6-Tetrafluorophenyl;
  • Pentafluorophenyl;
  • Phenyl disubstituiert in den Stellungen 2,6 durch Methyl, Methoxy, Chlor, Isopropyl oder Phenyl;
  • 3,5-bis(Trifluoromethyl)phenyl; und Phenyl monosubstituiert in der 2 oder 4 Stellung durch Cyano, Methoxy, Hydroxy, Acetoxy, Nitro, Acetamido oder C(O)Q (worin Q Amino, H oder niedriges Alkoxy bedeutet).
  • Falls n für O steht so ist es stärker bevorzugt wenn R' ausgewählt ist aus:
  • 2,3,5,6- oder 2,3,4,6-Tetrafluorphenyl; Pentafluorophenyl; und
  • Phenyl monosubstituiert in Stellung 2 durch Nitro, Acetamido oder CONH&sub2;.
  • Falls n für 0 steht, so ist es besonders bevorzugt wenn R' Pentafluorphenyl bedeutet.
  • Innerhalb der gesamten Erfindung sind die gegenwärtig spezifisch bevorzugten Verbindungen die folgenden:
  • N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alaninpentafluorophenoxymethylketon;
  • N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-O-benzyl-L-threoninpentafluorophenoxymethylketon;
  • N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin- 2-carbamoyl-phenoxymethylketon;
  • N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin- 4-nitrophenoxymethylketon;
  • N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin- 2,6-bis(trifluoromethyl)benzoyloxymethylketon;
  • N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-alanin- 2,4,6-triinethylbenzoyloxymethylketon;
  • N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-O-benzyl- L-serin-2,4,6-trimethylbenzoyloxymethylketon;
  • N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-S-benzyl- L-cystein-2,6-bis(trifluoromethyl)benzoyloxymethylketon;
  • N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylanyl-O-benzyl- L-threonin-2,4,6-trimethylbenzoyloxymethylketon;
  • N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin- 2-methyl-1-naphthoyloxymethylketon;
  • N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-glycin- 2,4,6-trimethylbenzoyloxymethylketon;
  • N-Methoxysuccinyl-L-phenylalanyl-L-alanin- 2,4,6-trimethylbenzoyloxymethylketon;
  • N-Hydroxysuccinyl-L-phenylalanyl-L-alanin- 2,4,6-trimethylbenzoyloxymethylketon;
  • N-(4-Phenylsulfonamidocarbonyl-benzoyl)-L-phenylalanyl-L-alanin-2,4,6-trimethylbenzoyloxymethylketon;
  • N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-lysin-2,4,6- trimethylbenzoyloxymethylketon, hydrochlorid; und
  • N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin- 2,3,5,6- tetramethyl-4-carboxy-benzoyloxymethylketon.
  • Während der breiteste Umfang der Erfindung individuelle R und S Stereoisomere als auch ein Gemisch von Stereoisomeren umfaßt, ist die bevorzugte Chiralität aller asymmetrischen Kohlenstoffatome S (d.i., L) wie in den natürlichen Aminosäuren.
    • VERWENDBARKEIT UND VERABREICHUNG
  • Cathepsin B Hemmer besitzen mehrere pharmazeutische Anwendungsmöglichkeiten, die nachfolgend besprochen werden und die auf therapeutischen Wirkungen der Hemmung des Enzyms beruhen, die sich in Krankheitszuständen ausdrücken.
    • Gewebsschädigung beim Myocardinfarkt
  • Neuere Studien haben gezeigt, daß Peptidyl Epoxid Hemmer von Cathepsin B wirksam sind bei der Verminderung der Schädigung von, durch Myocardinfarkt geschädigtem, Gewebe. (Tsuchida et al., Biol.Chem.Hoppe-Seyler 367 : 39 (1986); Toyooka et al., Arzneim- Forschung/Drug Res.36(I): 190-193 (1986); Toyooka et al., Arzneim- Forsch./Drug Res.36(I): 671-675 (1986). Der Hemmer war wirksam falls er vor und bis zu 3 Stunden nach der koronaren Unterbindung beim Kaninchen verabreicht wurde.
    • Hemmung der Knochenresorption
  • Sowohl Cathepsin B als auch die Collagenase sind bei der Knochenresorption involviert. Delaisse et al., (Biochem. Biophys. Res. Commun.125 : 441-447 (1984) und Biochem.J.192 : 365-368 (1980)) zeigen, daß die Sekretion von Cathepsin B korreliert mit dem Hormon induzierten Calziumverlust, Hydroxyprolinverlust und der Knochenresorption bei der gezüchteten embrionalen Mäusecalvaria und daß diese Resorption gehemmt wird durch einen Cathepsin B Hemmer. Falls sie in vivo Ratten verabreicht werden, bewirken Cathepsin B Hemmer einen Abfall der Serum Calzium und Hydroxyprolin Spiegel.
    • Metastasis
  • Cathepsin B wurde mit malignen Tumoren in Verbindung gebracht und steht ferner in Verbindung mit dem Metastasierungsvorgang. Das Enzym wurde von vielen verschiedenen Tumortypen charakterisiert. Einige neuerliche, von verschiedenen Laboratorien durchgeführte, Studien haben die spezielle Quelle dieser Aktivität untersucht. Sloane und Mitarbeiter haben in ihren Studien über Nagertumoren gezeigt, daß die Cathepsin B ähnliche Aktivität von lebensfähigen Tumorzellen stammt, nicht von Wirts Makrophagen oder nekrotischen Tumorzellen (Ryan et al., Cancer Res.45 : 3636(1985) und Sloane & Honn, Cancer Metastasis Rev. 3 : 249 (1984)) und ferner, daß Cathepsin B ähnliche Enzyme mit der Plasmamembran einiger neoplastischer Zellen in Verbindung stehen (Pietras et al., J.Biol.Chem. 256 : 8536 (1984) und Sloane & Honn, Cancer Metastasis Rev. 3 : 249 (1984).
  • In anderen Tumorsystemen scheinen die Cathepsin B ähnlichen Enzyme mit Wirts Leukozyten, insbesondere Macrophagen in Verbindung zu stehen. Ihre Freisetzung und die Möglichkeit ihren Anteil zu erhöhen wird durch Tumorzellen stimuliert (Baici et al., in: Tumour Progresion and Markers, Seiten 47-50 (1982).
  • Nachdem der Abbau von Kollagen ein Schlüsselschritt bei der Metastase ist (Liotta et al., Ann. Rev. Biochem. 55 : 1037-1057 (1986)) ist es bemerkenswert, daß Cathepsin B in der Lage ist latente Kollagenase zu aktivieren. (Baici et al., in: Tumour Progression and Narkers, Seiten 47-50 (1982)), als auch Kollagen selbst in den nicht-schraubenförmigen Regionen zu spalten. Entzündung.
  • Der Beweis, daß Cathepsin B und andere Thiol Proteasen eine Rolle bei der Entzündung spielen ist zwar umständlich zu erbringen jedoch zwingend. Kominami et al. (J.Biochem.98 : 87 (1985) haben gezeigt, daß die Konzentration von Cathepsin B in Ratten Macrophagen 30-40fach höher ist als in Lymphocyten oder Neutrophilen. Der Enzymspiegel ist in Enzündungsmakrophagen mehr als 6fach erhöht.
  • Calpaine (d.i. Calzium aktivierte neutrale Proteasen) sind Thiol Proteasen mit einer Homologie der aktiven Stellen zu Cathepsin B (Sakihama et al. Proc.Natl.Acad.Sci. (USA) 82 : 6075-6079 (1985); Ohno et al., Nature 312 : 566-570 (1984)). Pontremoli & Melloni (Ann.Rev.Biochem:55 : 455-481 (1986) deuten an, daß Calpaine eine wichtige Rolle bei der Aktivierung von Neutrophilen und Plättchen spielen.
  • Die Rolle von Cathepsin B bei anderen entzündlichen Prozessen wird nahegelegt durch seine erhöhten Spiegel im osteoarthritischen Knorpel (Bayliss & Ali, Biochem.J., 171 : 149 (1978) und in der Zahnfleischentzündungs Flüssigkeit (Eisenhauer et al., J.Dent. Res. 62 : 917 (1983).
    • Muskuläre Dystrophie
  • Muskelschwund bei Duchenne muskulärer Dystrophie ist hauptsächlich bedingt durch beschleunigten Protein Katabolismus (Kar, Biochemical Medicine 27 : 361-366 (1982)) wobei sowohl Serin Proteasen als auch Cathepsin B beteiligt sind (Sanada et al., J.Biochem.83 : 27-33). Hudecki et al. (J. Clin. Invest. 67 : 969-974 (1981) haben gezeigt, daß intraperitoneal (i.p.) Leupeptin (ein natürlicher Cathepsin B Hemmer) Plasma Kreatinin Phosphokinase ( ein Kennzeichen für Gewebsschädigung) signifikant reduziert und bei dystrophischen Hühnern die Richtungsfähigkeit verbessern kann. Sher et al. (Proc.Natl.Acad.Sci. (USA) 78 : 7742-7744 (1981) haben in ähnlicher Weise gezeigt, daß i.p. Leupeptin den Eintritt einer muskulären Dystrophie in einem genetischen Mäusemodell verhindert oder hinauszögert.
    • Förderung der Gewichtszunahme in der Landwirtschaft
  • Die Hemmung des normalen lysosomalen Cathepsin B kann den Proteinumsatz verlangsamen und hierbei als Förderer der Gewichtszunahme wirken. Neuere Patente (U.S.Pat.No. 4,510,130 und EP 144,993; Platt & Stracher, Genetic Diagnostics Corp. (Chem. Abstract. 103 : 5442a und 70350h) beruhen auf einer Wachstumszunahme, die beobachtet wurde, als Leupeptin Hamstern, Hühnern, Mäusen und Erbsen verabreicht wurde.
    • Verabreichung
  • Die Verabreichung der Wirkstoffe und der hier beschriebenen Salze kann mittels jeder anerkannten Verabreichungsmethode für Agentien, die die erwünschte therapeutische Wirkung besitzen, erfolgen. Diese Methoden umfassen orale, parenterale, topische und andere systemische oder Aerosolformen.
  • Abhängig von der beabsichtigten Art der Verabreichung, kann sich die Zusammensetzung in festen, halbfesten oder flüssigen Dosierungsformen wie beispielsweise Tabletten, Suppositorien, Pillen, Kapseln, Pulvern, Flüssigkeiten, Suspensionen oder ähnlichen befinden, vorzugsweise in Einheitsdosisformen die geeignet sind für eine einzige Verabreichung von genauen Dosierungen. Die Zusammensetzungen enthalten einen üblichen pharmazeutischen Träger oder Zusatz und einen Wirkstoff der Formel I oder dessen pharmazeutisch annehmbaren Salze und können noch zusätzlich andere medizinische Agentien, pharmazeutische Agentien, Träger, Zusätze usw. enthalten.
  • Für die orale Verabreichung wird eine pharmazeutisch annehmbare, nicht-toxische Zusammensetzung bereitet durch Einfügung von üblicherweise verwendeten Zusätzen wie beispielsweise Mannitol, Laktose, Stärke, Magnesiumstearat, Natrium Saccharin, Talk, Zellulose, Glukose, Saccharose, Magnesiumcarbonat und ähnlichen in pharmazeutischer Beschaffenheit. Solche Zusammensetzungen besitzen die Form von Lösungen, Suspensionen, Tabletten, Pillen, Kapseln, Pulvern, Retardformen und ähnlichen. Solche Zusammensetzungen können 10%-95%, vorzugsweise 25-70% des Wirkstoffes enthalten.
  • Parenterale Verabreichung ist allgemein gekennzeichnet durch Injektion, entweder subkutan, intramuskulär oder intravenös. Injektionsformen können auf übliche Weise hergestellt werden, entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen, feste Formen die geeignet sind für Lösung oder Suspension in Flüssigkeiten vor der Injektion, oder als Emulsionen. Geeignete Zusätze sind beispielsweise Wasser, Saline, Dextrose, Glyzerin, Ethanol und ähnliche. Falls erwünscht können die zu verabreichenden pharmazeutischen Zusammensetzungen noch zusätzlich kleine Anteile von nicht-toxischen Hilfsstoffen wie Befeuchtungs- oder Emulgierungsmittel, pH Pufferungs-Agentien und ähnliche, wie beispielsweise Natriumacetat, Sorbitanmonolaurat, Triethanolaminoleat usw. enthalten.
  • Zur systemischen Verabreichung mittels Suppositorien umfassen die üblichen Bindemittel und Träger beispielsweise Polyalkylenglykole oder Triglyzeride. Solche Suppositorien können aus Gemischen enthaltend Wirkstoffe in einem Anteil von 0.5%-10%, vorzugsweise von 1-2% hergestellt werden.
  • Der Anteil des verabreichten Wirkstoffes ist abhängig vom zu behandelnden Patienten, der Schwere der Beschwerden, der Art der Verabreichung und der Beurteilung durch den verschreibenden Arzt. Eine wirksame Dosis für ein menschliches Wesen bewegt sich jedoch in einer Größenordnung von ca. 0.01 bis ca. 25 mg/kg/Tag, vorzugsweise von ca. 0.1 bis ca. 10 mg/kg/Tag und besonders bevorzugt von ca. 0.75 bis ca. 3 mg/kg/Tag.
    • METHODEN DER HERSTELLUNG
  • Die Verbindungen der Formel I werden hergestellt indem man eine Aufeinanderfolge von Reaktionen durchführt, die in den Reaktionsschemata I, 11 und 111 dargestellt sind. Im allgemeinen umfaßt die erste Stufe dieses Verfahrens die Herstellung von N- geschützten Aminosäure oder Peptid (2) mit einer ungeschützten C- terminalen Carboxylgruppe, jedoch mit geschützten Aminosäure Seitenketten Funktionen. Methoden zur Synthese solcher Peptidylderivate sind im Stand der Technik gut beschrieben. Die N- geschützten Aminosäure oder Peptid (2), die in einigen Fällen auf dem Markt zugänglich sind, werden anschließend mittels Hydrochlorierung oder Hydrobromierung einer Diazomethylketon Zwischenverbindung in die analogen N-geschützten Aminosäure- oder Peptidyl-chloromethyl oder bromomethylketone (3) übergeführt. Eine Austauschreaktion wobei die Chloromethyl- oder Bromomethylketone (3) durch einen aromatischen Alkohol oder eine Carbonsäure ersetzt werden, ergibt Verbindungen gemäß der Erfindung worin X eine N-Schutzgruppe bedeutet. Die Anwendung von üblichen Peptidyl Entschützungs-verfahren benötigt zusätzliche Verbindungen gemäß der Erfindung, beispielsweise diejenigen Verbindungen der Formel I worin X für Wasserstoff steht. Einzelne Stufen des gesamten synthetischen Verfahrensablaufes sind nachfolgend im Detail beschrieben.
  • Die Isolierung und Reinigung der hier beschriebenen Verbindungen und Zwischenverbindungen kann, falls erwünscht, mit Hilfe jedes geeigneten Trennungs- und Reinigungsverfahrens wie beispielsweise Filtration, Extraktion, Kristallisation, Kolonnenchromatographie, Dünnschichtchromatographie, oder Dickschichtchromatographie oder mittels einer Kombination dieser Methoden durchgeführt werden. Spezifische Darstellungen von Trennungs- und Isolationsverfahren sind aus den Beispielen ersichtlich. Andere äquivalente Trennungs- und Isolationsverfahren können selbstverständlich ebenfalls verwendet werden.
  • Die Salze können ebenfalls auf an sich bekannte Weise isoliert werden. Beispielsweise können die Reaktionsgemische zur Trockne eingedampft und die Salze anschließend auf an sich bekannte Weise gereinigt werden.
  • Die Verbindungen der Formel I in Form der freien Basen können in ihre Säureadditionssalze übergeführt werden durch Behandlung mit einem stöchiometrischen Überschuß einer geeigneten organischen oder anorganischen Säure wie beispielsweise Essigsäure, Oxalsäure, Maleinsäure, Phosphorsäure, Brenztraubensäure, Chlorwasserstoffsäure oder Schwefelsäure und ähnlichen. Üblicherweise wird die freie Base in einem polaren organischen Lösungsmittel wie Ethanol oder Methanol gelöst und die Säure hinzugefügt. Die Temperatur wird zwischen 0ºC und 100ºC gehalten. Das gebildete Säureadditionssalz fällt spontan aus oder kann mit Hilfe eines weniger polaren Lösungsmittels ausgefällt werden.
  • Die Säureadditionssalze der Verbindungen der Formel I können in die entsprechenden freien Basen durch Behandlung mit einem stöchiometrischen Überschuß einer geeigneten Base wie Kaliumkarbonat oder Natriumhydroxyd, üblicherweise in Anwesenheit eines wäßrigen Lösungsmittels, bei einer Temperatur zwischen ca. 0ºC und 100ºC übergeführt werden. Die freie Base wird auf an sich bekannte Weise isoliert beispielsweise durch Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel.
  • Salze der Verbindungen der Formel I können untereinander ausgetauscht werden unter Ausnützung der unterschiedlichen Löslichkeiten der Salze, der Flüchtigkeiten oder Säuregrade der Säuren oder durch Behandlung mit entsprechend geladenen Ionenaustauschharzen. Beispielsweise kann der Austausch bewerkstelligt werden durch Umsetzung eines Salzes der Verbindungen der Formel I mit einem geringen stöchiometrischen Überschuß einer Säure mit einem niedrigeren pKa als dem der Säurekomponente des Ausgangssalzes. Diese Konversion wird bei einer Temperatur zwischen ca. 0ºC und dem Siedepunkt des als Medium für die Umsetzung verwendeten Lösungsmittels durchgeführt.
  • Die Salzderivate der Verbindungen der Formel I werden hergestellt durch Behandlung der entsprechenden freien Säuren der Verbindungen der Formel I mit zumindest einem molaren Äquivalent einer pharmazeutisch annehmbaren Base. Repräsentative pharmazeutisch annehmbare Basen sind Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniumhydroxid, Calziumhydroxid, Trimethylamin, Lysin, Caffein und ähnliche. Die Reaktion wird in Wasser durchgeführt, allein oder zusammen mit einem inerten, mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel bei einer Temperatur von ca. 0ºC bis ca. 100ºC, vorzugsweise bei Raumtemperatur. Typische inerte, mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel umfassen Methanol, Ethanol oder Dioxan. Das Molverhältnis der Verbindungen der Formel I zur verwendeten Base wird so ausgewählt, daß es das erwünschte Verhältnis für jedes einzelne Salz ergibt.
  • Die Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung können hergestellt werden ausgehend von L-Aminosäuren, D-Aminosäuren oder deren racemischen Gemischen. Einzelne Enantiomere (Stereoisomere) der Formel I werden hergestellt unter Verwendung von L-Aminosäuren und/oder D-Aminosäuren als Ausgangsverbindungen. Falls m = 0, werden Racemate der Formel I erhalten unter Verwendung von racemischen Gemischen von Aminosäuren. Falls m 1 oder 2 bedeutet, werden Gemische von Diastereomeren der Formel I erhalten unter Verwendung von racemischen Gemischen von Aminosäuren. Bei Verwendung einer Kombination von racemischen Aminosäuren und L- und/ oder D- Aminosäuren erhält man ebenfalls Gemische von Diastereomeren der Formel I. Falls erwünscht, können Gemische von Diastereomeren der Formel I in reine Stereoisomere auf an sich bekannte Weise aufgetrennt werden, beispielsweise durch fraktionierte Kristallisation oder Chromatographie. Im allgemeinen werden L-Aminosäuren verwendet wobei man einzelne Enantiomere der Formel I erhält, worin alle asymmetrischen Kohlenstoffatome die (5)-Konfiguration besitzen.
    • REAKTIONSSCHEMA I STUFE A
  • i) N-Hydroxysuccinimid, DCC
    • STUFE B
  • (i) Isobutyloxycarbonylchlorid,
  • (3a) Z ist Cl, X ≠ H
  • (3b) Z ist Br, X ≠ H STUFE C-1
    • Stufe A
  • Sich jetzt dem Reaktionsschema I zuwendend: N-geschützte Ausgangsverbindungen (1), worin m 1 bedeutet sind im allgemeinen im Handel erhältlich oder können unter Verwendung üblicher Methoden des N-Schutzes und falls notwendig des Schutzes jedweder Heteroatom Funktionen einer Aminosäure Seitenkette hergestellt werden. Diese Methoden sind Fachleuten bekannt und wurden oben und in "The Peptides", Band 3; "Chemistry of the Amino Acids" Band 2; und "Protective Groups in Organic Synthesis" wie oben besprochen beschrieben. Falls m 2 bedeutet, sind N-geschützte Ausgangsverbindungen (1) in einigen Fällen im Handel erhältlich oder können ansonsten unter Verwendung üblicher synthetischer Peptid Verfahrensweisen (wie unten beschrieben) hergestellt werden, ein Beispiel hiervon wird hier als Stufe A beschrieben. Die Ausgangsverbindungen (i) und (ii) sind im Handel erhältlich mit Ausnahme einiger Beispiele von Aminosäuren (ii) mit ungeschützten Heteroatomen in der Seitenkette. Diese Ausnahmen von (ii) können von Fachleuten auf diesem Gebiet ohne weiteres hergestellt werden unter Verwendung von Verfahren die sich auf den Schutz von Aminosäure Seitenketten beziehen die in "The Peptides", Band 3; und "Chemistry of the Amino Acids", Band 2, wie oben besprochen, offenbart sind. Zwischenverbindungen (2) können, falls sie nicht im Handel erhältlich sind, ohne weiteres unter Verwendung von üblichen synthetischen Peptid Herstellungsverfahren, die üblicherweise Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt sind, hergestellt werden (beispielsweise wie beschrieben in "The Practice of Peptide Synthesis" M. Bodanszky, Springer Verlag, NY (1984); und "The Peptides", E.Gross, J.Meienhofer, Eds. Bände 1 und 3, Academic Press, NY (1979)). Praktische synthetische Wege von (1) nach (2) umfassen (a) die Bildung eines aktiven Esters, gefolgt von einer Kupplung mit einer Aminosäure; und (b) die Kupplung einer N- geschützten Aminosäure mit einem Aminosäureester (via dem gemischten Carbonsäureanhydrid oder unter Verwendung von N,N'- Dialkylcarbodiimid), gefolgt von der alkalischen Hydrolyse der C- terminalen Estergruppe. Geeignete aktive Ester zur Verwendung im Verfahren (a) umfassen N-Hydroxysuccinimidester, 4-Nitrophenylester, Pentafluorophenylester, 1-Hydroxybenzotriazolester und ähnliche. Ein Beispiel des Verfahrens (a), das die Bildung eines aktiven Esters des N-Hydroxysuccinimids gefolgt von einer Umsetzung mit einer Aminosäure betrifft, wird in der Stufe A des Schemas I gezeigt. In ähnlicher Weise können, wie aus dem Stand der Technik wohlbekannt, Zwischenverbindungen (2) enthaltend zwei Aminosäure Reste (m = 1), wie in Stufe A beschrieben, wieder umgesetzt werden, wobei Zwischenverbindungen (2) erhalten werden die drei Aminosäure Reste (m = 2) enthalten. Andererseits werden Zwischenverbindungen (2) die drei Aminosäure Reste (m = 2) enthalten, durch Umsetzung eines aktiven Esters einer N-geschützten Aminosäure mit einem im Handel erhältlichen Dipeptid hergestellt. Wie es jedem Fachmann klar sein wird hängt das bevorzugte Herstellungsverfahren jeder einzelnen Zwischenverbindung (2) von Überlegungen betreffend der kommerziellen Zugänglichkeit von Ausgangsverbindungen, der Kupplungsverfahren, der Schutzverfahren und der Entschützungsverfahren ab.
  • Die Stufe A betrifft die Bildung eines aktiven Esters gefolgt von der Kupplung mit einer Aminosäure. Gemäß diesem Verfahren werden eine N-geschützte Aminosäure oder Peptid mit einem geeigneten aktivierenden Alkohol, vorzugsweise N-Hydroxysuccinimid (oder alternativ beispielsweise 1-Hydroxybenzotriazol) behandelt, gefolgt von der Zugabe von Dialkylcarbodiimid, vorzugsweise DCC (oder alternativ N-Ethyl-N-dimethylaminopropyl-carbodiimid), wobei der aktive Ester erhalten wird. Besonders bevorzugt wird diese Umsetzung bei 0ºC während ca. 2 Stunden, gefolgt von einer Umsetzung bei Raumtemperatur über Nacht durchgeführt. Sie kann jedoch bei jeder Temperatur zwischen -20ºC und 100ºC, vorzugsweise -10ºC bis 40ºC während eines gesamten Zeitabschnittes im Ausmaß von 2 Stunden bis zu 2 Tagen, vorzugsweise jedoch während 4 bis 24 Stunden durchgeführt werden. Für die Umsetzung geeignete Lösungsmittel sind polare aprotische Lösungsmittel wie Dimethylformamid (DMF), Dioxan, Dimethoxyethan (DME), Ethylacetat, oder Tetrahydrofuran (THF). Bevorzugte Lösungsmittel sind THF oder Dioxan, wobei THF am meisten bevorzugt wird.
  • Die aus einem aktiven Ester bestehende Zwischenverbindung (nicht gezeigt) kann mit Hilfe von üblichen Methoden, wie Filtration des Reaktionsgemisches gefolgt vom Verdampfen des Filtrats isoliert werden. Der Rückstand (aktivierter Ester) kann anschließend gegebenenfalls durch extraktive Aufarbeitung gereinigt werden.
  • Der aktive Ester, der in einigen Fällen im Handel erhältlich ist, wird mit einem Gemisch bestehend aus Aminosäure (ii) und tertiärem Amin in einem wäßrigen, polaren Lösungsmittel wie wäßrigem Dioxan, wäßrigem THF, wäßrigem DMF, vorzugsweise in wäßrigem Dioxan oder THF (und besonders bevorzugt in 1 : 1 Dioxan/ Wasser) umgesetzt. Beispiele von tertiären Aminen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Triethylamin, N-Methylmorpholin, Triethylendiamin, wobei Triethylamin bevorzugt wird. Geeignete Temperaturen für diese Umsetzung umfassen Bereiche von -20ºC bis 80ºC, vorzugsweise bewegen sich die Temperaturen im Bereich von -10ºC bis 50ºC und besonders bevorzugt ist die Raumtemperatur. Im allgemeinen läßt man die Umsetzung über Nacht ablaufen, sie kann jedoch in einem zeitlichen Bereich von 10 Minuten bis zu mehr als 2 Tagen, besonders bevorzugt von 2 Stunden bis ca. 24 Stunden stattfinden.
  • Das N-geschützte Peptid der Formel (2) wird anschließend auf übliche Weise isoliert, beispielsweise durch Ansäuern gefolgt von extraktiver Aufarbeitung. Ein detailliertes Beispiel der Stufe A befindet sich in der Präparation 1. Verfahren, die im Handel erhältliche aktive Ester verwenden, werden in den Präparationen 2(a) und 2(b) beschrieben. Ein Beispiel der Synthese von (2) durch Kupplung einer N-geschützten Aminosäure mit einem Aminosäureester (unter Verwendung von N,N'-Dialkylcarbodiimid) gefolgt von einer alkalischen Hydrolyse der C-terminalen Estergruppe (Reaktionsschema wird nicht gezeigt) wird in der Präparation 3 dargestellt.
    • Stufe B
  • Fortsetzend mit dem Reaktionsschema I, in der Stufe B werden die N-geschützten Aminosäure oder Peptid (2) in das entsprechende Chloromethylketon (3a) durch Chlorhydrierung oder Bromomethylketon (3b) durch Bromhydrierung einer Diazomethylketon Zwischenverbindung übergeführt. Die Chloro- und Bromomethylketone wurden, wie hier beschrieben, durch Modifizierung der von Thompson und Blout, Biochemistry 12, 44 (1973), Powers et al., Biochem. Biophys. Acta 485, 156 (1977) und Kettner und Shaw, Biochemistry 17, 4778 (1978) beschriebenen Verfahren für Chloromethylketone sowie das von Shaw und Ruscica in J. Biol. Chem.243, 6312 (1968) beschriebene Verfahren für N-Benzyloxycarbonyl-phenyl-alanin-bromomethylketon hergestellt. Die Umsetzung findet in drei Stufen statt, wie nachfolgend im Detail dargestellt wird: zuerst wird ein gemischtes Anhydrid
  • Zwischenprodukt gebildet (jedoch nicht isoliert); danach wird ein Diazomethyl Zwischenprodukt gebildet (das ebenfalls nicht isoliert wird) und schließlich wird ein Chloromethylketon (3a) oder ein Bromomethylketon (3b) gebildet und gereinigt.
  • (i) Eine Lösung der N-geschützten Aminosäure (1) oder des N- geschützten Peptids (1) in einem trockenen aprotischen Lösungsmittel umfassend, jedoch nicht beschränkt auf, Ethylether, THF, DME oder DMF wird mit einem "inerten" Gas wie Argon (oder alternativ mit Stickstoff) überdeckt und auf eine Temperatur von -40ºC bis 5ºC jedoch vorzugsweise auf -20ºC bis -5ºC abgekühlt. Diese Lösung wird ganz besonders bevorzugt in trockenem THF unter Argon hergestellt und auf -10ºC abgekühlt. Eine so hergestellte Lösung wird anschließend nacheinander mit einem tertiären Amin wie Triethylamin, N-Methylmorpholin, N-Methylpyridin oder Triethylendiamin vorzugsweise Triethylamin und einem Alkylchloroformat wie Isobutylchloroformat, Ethylchloroformat, sec.- Butylchloroformat oder tert.-Butylchloroformat vorzugsweise Isobutylchloroformat behandelt um in situ das gemischte Anhydrid als Zwischenverbindung (die nicht gezeigt wird) zu ergeben.
  • (ii) Das resultierende Gemisch wird bei der obigen Temperatur während 5 bis 60 Minuten, vorzugsweise 10 bis 30 Minuten und ganz besonders bevorzugt während 15 Minuten gerührt; danach wird das Gemisch mit ca. 1.5 bis 3 Äquivalenten einer Lösung von Diazomethan, vorzugsweise 0.2-0.4 molar in Ether und besonders bevorzugt 2 Äquivalenten einer 0.3 M Lösung behandelt. Das resultierende Reaktionsgemisch wird besonders bevorzugt bei -10ºC während weiterer 10 Minuten gerührt, danach während 4 Stunden auf Raumtemperatur erwärmen gelassen. Das Gemisch kann zweckmäßigerweise während weiterer 5 bis 60 Minuten, vorzugsweise während 5 bis 20 Minuten gerührt und danach auf eine Temperatur zwischen 10ºC und 50ºC, vorzugsweise 20ºC bis 30ºC während 1 bis 24 Stunden, vorzugsweise 2 bis- 6 Stunden erwärmt werden.
  • (iii) Zur Herstellung des Chloromethylketons wird das so bereitete Diazomethylketon mit einem Chlorwasserstoffsäure/Essigsäure Gemisch in einem Verhältnis von 1 : 1 bis 1 : 3 enthaltend ca. 10 bis ca. 32% Wasser, vorzugsweise jedoch in einem Verhältnis von 1 : 1 enthaltend ca. 32% Wasser behandelt. In ähnlicher Weise wird das Bromomethylketon durch Behandlung des Diazomethylketons mit einem Bromwasserstoffsäure/Essigsäure Gemisch in einem Verhältnis von 1 : 1 bis 1 : 3 enthaltend ca. 0 bis ca. 25% Wasser, vorzugsweise jedoch in einem Verhältnis von 1 : 2 enthaltend ca. 25% Wasser hergestellt. Das Chloromethylketon (3a) oder das Bromomethylketon (3b) wird durch extraktive Aufarbeitung isoliert und mittels Chromatographie oder Umkristallisation gereinigt. Detaillierte Verfahrensweisen für die Herstellung eines Chloromethylketons (3a) und eines Bromomethylketons (3b) sind in den Präparationen 5 und 4 angegeben.
    • Stufe C-1
  • Stufe C-1 (Reaktionsschema I) betrifft die Alkylierung von aromatischen Alkoholen (R'OH) mit einem Chloromethyl- (3a) oder Bromomethyl(3b)keton zwecks Bereitung von Aryloxymethylketonen IA. Dieses kann erreicht werden durch (a) Übernahme der Methoden von Ando et al. Bull. Chem. Soc. Jpn 55, 2504 (1982) in der Weise, daß ein aromatischer Alkohol mit Hilfe eines Chloro- oder Bromomethylketons in einem polaren aprotischen Lösungsmittel durch Einwirkung eines Fluoridsalzes, das unter bevorzugten Bedingungen von einem anorganischen Festkörper getragen wird, alkyliert wird. Eine alternative Methode (b) ist eine Modifikation der Verfahren von Stoochnoff et al. Tet. Lett., 21 (1973) und Allen und Gates, Org. Synth., Coll. Band 3 140 (1955) in der Weise, daß ein aromatischer Alkohol mit Hilfe eines Chloro- oder Bromomethylketons in einem polaren Lösungsmittel in Anwesenheit einer anorganischen Base und eines Iodid Salzes alkyliert wird. Es ist jedoch allgemein bevorzugt, daß das Bromomethylketon zusammen mit der Methode (b) verwendet wird um das erwünschte Aryloxymethylketon IA zu erhalten.
  • Dementsprechend wird gemäß der Methode (b) eine Lösung von Bromomethylketon und einem aromatischen Alkohol in einem trockenen, polaren Lösungsmittel umfassend, jedoch nicht beschränkt auf, THF, DMF, Dioxan oder Dimethylsulfoxid (DMSO) mit einer anorganischen Base wie Kaliumkarbonat, Natriumkarbonat, Natriummethoxid, Natriumethoxid oder Natriumhydrid und einem katalytischen Anteil eines Iodids wie Kaliumiodid, Natriumiodid oder Tetra-(nieder Alkyl)-ammoniumiodid behandelt und während 5 Minuten bis 24 Stunden jedoch vorzugsweise während 1 bis 8 Stunden unter Ausschluß von Feuchtigkeit gerührt. Diese Umsetzung wird besonders bevorzugt unter Verwendung von trockenem DMF, Kaliumkarbonat und Tetrabutylammoniumiodid während vier Stunden in einer Argonatmosphäre durchgeführt. Geeignete Temperaturbereiche für die Durchführung der Umsetzung betragen von 0ºC bis zur Rückflußtemperatur des Lösungsmittels, bevorzugt ist jedoch die Raumtemperatur (ungefähr 20ºC). Das Aryloxymethylketon wird mittels extraktiver Aufarbeitung isoliert und mit Hilfe von Umkristallisation und Chromatographie gereinigt. Detaillierte Vorgangsweisen sind in den Beispielen 1 bis 4 beschrieben. Die benötigten aromatischen Alkohole (Phenole) sind allgemein im Handel erhältlich oder werden auf an sich bekannte Weise hergestellt.
    • REAKTIONSSCHEMA II STUFE C-2 STUFE D STUFE E STUFE F STUFE C-2
  • In der Stufe C-2 (Reaktionsschema II) werden die Verbindungen gemäß der Erfindung der Formel IB erhalten durch eine Austauschreaktion einer aromatischen Carbonsäure (R'COOH) mit einem Peptidylchloromethyl- oder bromomethylketon (3) des Reaktionsschemas I. Das Verfahren beruht auf Methoden die beschrieben wurden von Clark und Miller in Tetrahedron Lett., 599 (1977) und J. Am. Chem. Soc., 99, 498 (1977) und von Clark in J. Chem. Soc. Chem. Commun., 798 (1978). Es ist im allgemeinen bevorzugt, daß in dieser Reaktion das Bromomethylketon verwendet wird anstelle des analogen Chloromethylketons. Die Reaktion wird in Gegenwart eines Fluorid Salzes wie beispielsweise Tetra-(nieder Alkyl)-ammonium-fluorid, KF, LiF, NaF, AgF oder CsF oder eines dieser Fluorid Salze durchgeführt die an Silika Gel, Aluminiumoxid, Diatomeenerde und ähnliche gebunden sind. Die bevorzugten Fluorid Salze sind Kaliumfluorid und Cäsiumfluorid wobei das Kaliumfluorid das am meisten bevorzugte ist. Alternative Methoden zur Bildung von Verbindungen IB umfassen die Umsetzung von Bromomethylketon mit einer aromatischen Carbonsäure in Gegenwart von 1,8-Diazobicyclo[5.4.0)undec-7-en (DBU) (Ono et al. Bull. Chem. Soc. Jpn., 51, 2401 (1978)) und die Umsetzung von Bromomethyl Keton mit dem Kaliumsalz einer aromatischen Carbonsäure in Gegenwart eines Crownethers wie 18-Crown-6 (Durst, Tetrahedron Lett., 2421 (1974); die Fluorid Salz unterstützte Umsetzung ist jedoch die am meisten bevorzugte Methode. Geeignete Lösungsmittel für die Umsetzung umfassen polare, aprotische Lösungsmittel wie N,N- Dimethylformamid (DMF), Dimethylsulfoxid (DMSO), Dioxan, Dimethoxyethan, Diethylenglykol-dimethylether (Diglyme) THF, Acetonitril und Aceton. Bevorzugte Lösungsmittel sind DMF und Dioxan wobei DMF das besonders bevorzugte ist. Geeignete Temperaturbereiche für die Reaktion betragen von 0ºC bis zur Rückflußtemperatur, der Temperaturbereich beträgt jedoch vorzugsweise von 10ºC bis 50ºC wobei die besonders bevorzugte Reaktionstemperatur die Raumtemperatur (ungefähr 20ºC) ist. Die Reaktion kann während einer Periode von 5 Minuten bis zu 2 Tagen stattfinden. Die bevorzugte Reaktionsdauer beträgt jedoch 15 Minuten bis zu 6 Stunden besonders bevorzugt 2 Stunden. Die Isolierung des Produktes erfolgt allgemein durch extraktive Aufarbeitung gegebenenfalls gefolgt von Reinigung durch Umkristallisation oder Chromatographie. Detaillierte Vorgangsweisen werden in den Beispielen 5 bis 9 dargestellt. Die benötigten aromatischen Carbonsäuren sind allgemein im Handel erhältlich oder werden mit Hilfe üblicher Methoden hergestellt; die Synthesen spezieller aromatischer Carbonsäuren (das Reaktionsschema wird nicht gezeigt) sind in den Präparationen 6 bis 12 dargestellt.
    • Stufen D, E und F
  • Es wird neuerlich auf das Reaktionsschema 11 verwiesen, N-, O, oder S-Schutzgruppen auf den Verbindungen gemäß der Erfindung IA oder IB, wie oben hergestellt, können dann entfernt werden mit Hilfe üblicher Entschützungsverfahren, die den Fachleuten auf dem Gebiet der Peptidchemie bekannt sind und in "The Peptides" Band 3; "Protective Groups in Organic Synthesis" und "Chemistry of the Amino Acids", wie vorhergehend erwähnt, beschrieben werden. Durch geeignete Auswahl der Schutzgruppen und Beachtung von Entschützungsmethoden, können verschiedene Schutzgruppen selektiv entfernt werden; beispielsweise kann eine CBZ-Gruppe durch katalytische Hydrierung in Gegenwart einer Boc Gruppe selektiv entfernt werden. Zusätzlich kann eine Schutzgruppe durch eine andere mit Hilfe einer geeigneten Sequenz von Entschützungs- (beispielsweise Stufe D) und Schutzschritten (beispielsweise Stufe E) ausgetauscht werden wie dies einem Fachmann klar sein sollte. Ein Beispiel für die Entfernung einer Benzyloxycarbonyl (CBZ) N- Schutzgruppe durch Hydrierung in Anwesenheit eines Palladium-Kohle Katalysators wird in Stufe D des Schemas 11 gezeigt; Details werden im Beispiel 10 beschrieben.
  • Ein Beispiel der Zugabe verschiedener N-Schutzgruppen, in diesem Fall der N-Methoxysuccinyl Gruppe, wird in der Stufe E des Schemas 11 gezeigt; Details dieser Umsetzung und andere Beispiele sind in den Beispielen 11 und 12 enthalten.
  • Schließlich wird ein Beispiel einer selektiven Entfernung einer N-Schutzgruppe einer Seitenkette, in diesem Fall der N- Trifluoracetylgruppe einer Lysin Seitenkette, in Stufe F des Schemas 11 gezeigt; Details dieser Reaktion sind im Beispiel 13 angegeben.
    • GENERELLE VORBEREITUNGEN FÜR DIE LETZTE STUFE
  • Die vorhergehenden Diskussionen geben das beste Verfahren wider wie es gegenwärtig von den Erfindern betrachtet wird. Die Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung kann jedoch auch mit Hilfe eines anderen synthetischen Verfahrens hergestellt werden. Dementsprechend werden Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel:
  • worin n, m, X, Y, R und R' oben definiert sind hier offenbart, wobei diese Verfahren umfassen:
  • (1) Umsetzung einer Verbindung der Formel
  • worin X, Y, m und R die oben angegebene Bedeutung besitzen und Z eine austretende Gruppe ist (wie Halogen, Tosyloxy oder Methansulfonyloxy) mit einem aromatischen Alkohol oder einer aromatischen Carbonsäure die gegebenenfalls substituiert sind; oder
  • (2) Entfernung oder Zusatz einer Schutzgruppe X (wobei X eine N-Schutzgruppe ist) am Amino-Terminus einer Verbindung der Formel I; und/oder an irgendeinem O-, S-, oder N-Atom der Y oder R α- Aminosäure Seitenkette; und/oder an irgendeinem O-, S-, oder N-Atom der Gruppe R'; oder
  • (3) Kupplung einer Verbindung der Formel
  • X- (Y)m-OH
  • worin X und Y wie oben definiert sind und m für 1 oder 2 steht, mit einer Verbindung der Formel
  • worin Y, m, R, R' und n wie oben definiert sind; oder
  • (4) Acylierung einer Verbindung der Formel
  • worin X, Y, m und R wie oben definiert sind, zur Bildung der entsprechenden Verbindung der Formel I worin n = 1 ist; oder
  • (5) Umsetzung einer Verbindung der Formel
  • worin X, Y, m und R wie oben definiert sind, mit einer Verbindung der Formel
  • Z¹-R'
  • worin R' wie oben definiert ist und Z¹ eine austretende Gruppe (wie Halogen)ist, zur Bildung einer Verbindung der Formel I, worin n 0 ist; oder
  • (6) Umsetzung einer Verbindung der Formel
  • worin X, Y, m, R' und n wie oben definiert sind mit einer organo-metallischen Verbindung, worin der organische Teil R ist; oder
  • (7) Umsetzung einer Verbindung der Formel
  • worin X, Y, m und R wie oben definiert sind, mit einem aromatischen Alkohol oder einer aromatischen Carbonsäure, die gegebenenfalls substituiert sind; oder
  • (8) Umsetzung einer Verbindung der Formel
  • X-(Y)m-NH&sub2;
  • worin X und Y wie oben definiert sind und m für 1 oder 2 steht, mit einer Verbindung der Formel
  • worin R, R' und n wie oben definiert sind und Z² eine austretende Gruppe ist; oder wenn m 1 ist mit einer Verbindung der Formel
  • worin R, R', Z² und n wie oben definiert sind und R² eine gegebenenfalls geschützte α-Aminosäure-Seitenkette ist; oder (9) Entfernung eines Ketals, Thioketals oder Dithioketals einer Ketonfunktion in der Formel I; oder
  • (10) Oxydation einer Verbindung der Formel
  • worin X, Y, in, R, n und R' wie oben definiert sind; oder
  • (11) Überführung einer Verbindung der Formel I in ein pharmazeutisch annehmnbares Säureadditionssalz; oder
  • (12) Überführung einer Verbindung der Formel I, die eine Carboxylgruppe enthält in ein pharmazeutisch annehmbares Basenadditionssalz; oder
  • (13) Überführung eines Säureadditionssalzes einer Verbindung der Formel I in ein anderes Säureadditionssalz; oder
  • (14) Überführung eines Basenadditionssalzes einer Verbindung der Formel I in ein anderes Basenadditionssalz; oder
  • (15) Auflösung eines optischen Isomerengemisches einer Verbindung der Formel I; oder
  • (16) Isomerisierung eines Stereoisomers einer Verbindung der Formel I in ein anderes Stereoisomeres.
    • PRÄPARATIONEN UND BEISPIELE PRÄPARATION 1 N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin und andere Verbindungen der Formel (2)
  • Dicyclohexylcarbodiimid (50 mmol, 10.3 g) wurde einer Lösung von N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanin (Sigma, 50 mmol, 15.0 g) und N-Hydroxysuccinimid (Aldrich, 50 mmol, 5.75 g) in 400 ml wasserfreiem THF bei 0ºC zugesetzt. Das Gemisch wurde während 2 Stunden bei 0ºC gerührt und anschließend über Nacht bei Raumtemperatur. Das Gemisch wurde auf 0ºC abgekühlt, filtriert und das Filtrat am Rotationsverdampfer eingedampft. Das zurückbleibende Öl wurde in Ethylacetat gelöst, mit wäßriger NaHCO&sub3; (2·) und Salzsole gewaschen, getrocknet (MgSO&sub4;), am Rotationsverdampfer eingedampft und im Hochvakuum getrocknet, wobei 19.1 g (96%) N-CBZ-L-phenylalanin N- Hydroxysuccinimid ester als weißer Festkörper, Smpkt. 134-136ºC erhalten wurden. [Lit. Smpkt. 136-137ºC; G.R. Pettit, "Synthetic Peptides" Band 3, Seite 106, Elsevier/ North-Holland, NY (1975)). Danach wurde gemäß der Methode von Itoh [M. Itoh, Chem. Pharm. Bull., 20, 664 (1972), Triethylamin (36 mmol, 5.0 ml) einem Gemisch von L-Alanin (18 mmol, 1.60 g) in 200 ml von 1 : 1 Dioxan-Wasser zugesetzt. Feste Kohlendioxyd Stücke wurden unter Rühren zugesetzt bis ein pH Wert von 8 erreicht war. N-Benzyloxycarbonyl-L- phenylalanin N-Hydroxysuccinimid ester (18 mmol, 7.13 g) wurden dann unter Rühren bei Raumtemperatur zugesetzt. Nach 16-20 Stunden wurde das Gemisch durch stufenweise Zugabe von 1N HCl angesäuert und danach mit Ethylacetat verdünnt. Die organische Phase wurde abgetrennt, mit Wasser (2·) und Salzsole gewaschen, getrocknet (MgSO&sub4;), am Rotationsverdampfer eingedampft und im Hochvakuum getrocknet wobei 6.19 g (93%) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L- alanin als weißer Festkörper, Smpkt. 160-164ºC erhalten wurden (Lit. Smpkt. 165ºC; G. R. Pettit "Synthetic Peptides", Band 1, Seite 141 (1970)) In ähnlicher Weise wurden gemäß der in der Präparation 1 beschriebenen Methode folgende Verbindungen der Formel (2) hergestellt:
  • (a) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-glycin (Smpkt. 154- 155ºC) aus N-Benzyloxycarbonyl-L-phenyl-alanin und Glycin;
  • (b) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-O-benzyl-L-serin (Smpkt. 154-155ºC) aus N-Benzyloxy-carbonyl-L-phenylalanin und O-Benzyl-L-serin; und
  • (c) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-N'- trifluoroacetyl-L-lysin (Smpkt. 143-147ºC) aus N- Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanin und Nε-Tri-fluoroacetyl-L- lysin (A.T. Moore et al., J.Chem. Soc. (C), 2349-2359 (1966)).
    • PRÄPARATION 2(a) N-Benzyloxycarbonyl-L-prolyl-L-valin und andere Verbindungen der Formel (2)
  • L-Valin (30 mmol, 3.52 g) und Triethylamin (60 mmol, 8.36 ml) wurden in 275 ml von 1 : 1 Dioxan/Wasser kombiniert. Feste Kohlendioxyd Stücke wurden unter Rühren zugesetzt um einen pH Wert von 8.5 zu erreichen und danach wurde N-CBZ-L-prolin 4-Nitrophenyl ester (Sigma, 30 mmol, 11.11 g) der Lösung unter Rühren bei Raumtemperatur zugesetzt. Nach 20 Stunden wurde die klare gelbe Lösung durch stufenweise Zugabe von 1N HCl angesäuert, durch Rotationsverdampfung bei vermindertem Druck konzentriert und mit Ethylacetat verdünnt. Die organische Phase wurde abgetrennt, mit Wasser (2·) und Salzsole gewaschen, getrocknet (MgSO&sub4;) und am Rotationaverdampfer eingedampft, wobei ein öliger Rückstand erhalten wurde. Die Kristallisation dieses Rückstandes aus heißem Ethylacetat-Hexan ergab 7.15 g (68%) N-CBZ-L-prolyl-L-valin als ein weißen Festkörper, Smpkt. 132-134ºC, Lit. Smpkt. 134-136ºC; G. R. Pettit, "Synthetic Peptides", Band 1, 154 (1970).
  • In einer ähnlichen Weise wurden gemäß der in der Präparation 2(a) beschriebenen Methode die folgenden Verbindungen der Formel (2) hergestellt:
  • (a) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-O-benzyl-L-threonin (Smpkt. 153-156ºC) aus N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanin 4- nitrophenyl ester und O-Benzyl-L-threonin (erhalten durch Entschützung von im Handel zugänglichen N-Boc-O-benzyl-L-threonin durch Behandlung mit Trifluoressigsäure in Dichlormethan);
  • (b) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-S-benzyl-L-cystein (Smpkt. 137.5-139.5ºC) aus N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl 4- nitrophenyl ester und S-Benzylcystein;
  • (c) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-O-methyl-L-tyrosin (Smpkt. 176-178ºC) aus N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanin 4- nitrophenyl ester und O-Methyl-L-tyrosin; und
  • (d) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanin (Smpkt. 148-151ºC) aus N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanin 4-nitrophenyl ester und L-Phenylalanin.
    • Präparation 2(b) N-Benzyloxycarbonyl-D-phenylalanyl- L-prolyl-L-alanin und andere Verbindungen der Formel (2)
  • Triethylamin (9.0 mmol, 1.25 ml) wurde einer Mischung von L- Prolyl-L-alanin (Sigma, 4.5 mmol, 838 mg) in 80 ml 1 : 1 Dioxan/Wasser zugesetzt. Nach 15 Minuten wurden Stücke von festem Kohlendioxyd zu der Lösung hinzugefügt bis der pH Wert auf 8 reduziert war. N-CBZ- D-phenylalanin 4-nitrophenyl ester (Sigma, 4.5 mmol, 1.89 g) wurden anschließend zugesetzt und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur während vier Tagen gerührt. Die klare gelbe Lösung wurde durch stufenweise Zugabe von 1N HCl angesäuert und mit Ethylacetat verdünnt. Die organische Phase wurde danach abgetrennt, mit Wasser (3·) und Salzsole (2·) gewaschen, getrocknet (MgSO&sub4;) und am Rotationsverdampfer eingedampft, wobei ein öliger Rückstand erhalten wurde. Eine Lösung dieses Rückstandes in Ethylacetat wurde fraktioniert mit drei Lösungen von 80 mg NaHCO&sub3; in 10 ml Wasser extrahiert. Diese wäßrigen Extrakte wurden kombiniert, ange-säuert und mit Ethylacetat extrahiert. Die resultierende Ethylacetat Lösung wurde mit Salzsole gewaschen, getrocknet (MgSO&sub4;), eingedampft und im Hochvakuum getrocknet, wobei 1.45 g (69%) N-CBZ-D-phenylalanyl-L- valyl-L-alanin als viskoses Öl in genügender Reinheit für die nächste Stufe erhalten wurden.
  • Auf ähnliche Weise wurden mit Hilfe der in den Präparationen 1-2 beschriebenen Methoden via dem (hergestellten oder im Handel befindlichen) aktiven Ester von N-Hydroxysuccinimid oder dem (im Handel befindlichen) 4-Nitrophenyl ester die nachfolgenden Verbindungen der Formel (2) hergestellt:
  • (a) N-Acetyl-D, L-phenylalanyl-O-benzyl-L-serin aus N-Acetyl- D,L-phenylalanin 4-nitrophenyl ester und O-Benzyl-L-serin;
  • (b) N-Benzoyl-L-phenylalanyl-L-alanin aus N-Benzoyl-L- phenylalanin und L-Alanin;
  • (c) N-Boc-L-leucyl-L-methionin aus N-Boc-L-leucin 4- nitrophenyl ester und L-Methionin; und
  • (d) N-Tosyl-glycyl-L-phenylalanyl-L-alanin aus N-Tosyl-glycin und L-Phenylalanyl-L-alanin.
    • Präparation 3 N-Benzyloxycarbonyl-L-leucyl-L-phenylalanin und andere Verbindungen der Formel (2)
  • Zu einem Gemisch von N-Benzyloxycarbonyl-L-leucin (2.7 g, 10.2 mmol), L-Phenylalaninmethylesterhydrochlorid (2.2 g, 10.2 mmol) und Triethylamin (1.4 ml, 10.2 mmol) in trockenem THF (150 ml) wurde N-Ethyl-N'-dimethylaminopropyl-carbodiimid (EDCI) (2.2 g, 11.2 mmol) unter Rühren bei Raumtemperatur hinzugefügt. Nachdem das Gemisch über Nacht bei Raumtemperatur gerührt wurde, wurde es am Rotationsverdampfer eingedampft. Der Rückstand wurde mit Ethylacetat vermischt und anschließend nacheinander mit Wasser, 1N HCl und Salzsole gewaschen; die Lösung wurde getrocknet (MgSO&sub4;) und eingedampft wobei ein fester weißer Rückstand erhalten wurde. Umkristallisation (EtOAc-Hexan) ergab 2.9 g (66%) N- Benzyloxycarbonyl-L-leucyl-L-phenylalanin methyl ester, Smpkt. 91- 93ºC. Ein Gemisch dieses Esters (2.8 g, 6.6 mmol) in 2 : 1 Dioxan- Wasser (150 ml) wurde bei 0ºC mit einer 1N NaOH Lösung (7.3 mmol) behandelt. Nach Rühren der Lösung während 2-3 Stunden bei Raumtemperatur, wurde sie bei 0ºC durch Zugabe von 1N HCl angesäuert und danach am Rotationsverdampfer eingedampft. Der Rückstand wurde mit Ethylacetat vermischt und danach nacheinander mit Wasser, 1N HCl und Salzsole gewaschen; die Lösung wurde getrocknet (MgSO&sub4;) und eingedampft wobei 2. 7 g N-Benzyloxycarbonyl-L-leucyl-L-phenylalanin als weißer Festkörper, Smpkt. 120-122ºC erhalten wurden.
  • In einer ähnlichen Weise wurde die folgende Verbindung der Formel (2) hergestellt:
  • (a) N-Benzyloxycarbonyl-L-leucyl-L-leucin (Smpkt. 70-76ºC) aus N-Benzyloxycarbonyl-L-leucin und L-Leucin methyl ester hydrochlorid.
    • Präparation 4 N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alaninbromomethylketon und andere Verbindungen der Formel (3a)
  • N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin (5.0 g, 13.4 mmol) wurde in trockenem THF (25 ml) gelöst, mit Argon Gas überdeckt und in einem Eis/Aceton Bad (-10ºC) gekühlt. Die gerührte Lösung wurde mit N-Methylmorpholin (1.64 ml, 14.9 mmol) gefolgt von Isobutylchloroformat (1.84 ml, 14.2 mmol) während 5 Minuten behandelt. Die resultierende Suspension wurde während weiterer 15 Minuten bei -10ºC gerührt, mit Diazomethan in Ether (100 ml, ung. 0.3 M, hergestellt aus "Diazald" (Aldrich) gemäß den Anweisungen des Lieferanten) versetzt und während 4 Stunden auf Raumtemperatur erwärmt.
  • Eine 1 : 1 Lösung von HOAc und 50% HBr (26 ml) wurde tropfenweise dem Reaktionsgemisch zugesetzt. Nach Rühren während weiterer 15 Minuten, wurde das Reaktionsgemisch mit Hilfe von 500 ml EtOAc in einen Scheidetrichter übergeführt. Die wäßrige Schicht wurde verworfen; die organische Schicht wurde gewaschen in nacheinander mit Wasser (1·100 ml), gesättigter wäßriger NaCl Lösung (2·100 ml) und gesättigter Bicarbonat Lösung (1·100 ml), getrocknet (wasserfreies Na&sub2;SO&sub4;) und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde mit Ether/Hexan (1 : 2) digeriert um einen gebrochenweißen Festkörper (5.1 g, 84%) zu erhalten, geeignet für weitere Umsetzung. Ein umkristallisiertes Muster (EtOAc) hatte einen Smpkt. von 138-139ºC.
  • In einer ähnlichen Weise, wie in der Präparation 4 beschrieben, wurden die nachfolgenden Verbindungen der Formel (3a) hergestellt:
  • (a) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanin-bromomethylketon (Smpkt. 103-105ºC) aus N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanin.
  • (b) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-glycinbromomethylketon (Smpkt. 96.5-97.5ºC) aus N-Benzyloxycarbonyl-L- phenylalanyl-glycin;
  • (c) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-phenyl-alaninbromomethylketon (Smpkt. 175-176ºC) aus N-Benzyloxycarbonyl-L- phenylalanyl-L-phenylalanin;
  • (d) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-O-benzyl-L-serinbromomethylketon (Smpkt. 135-137ºC, Zers.) aus N-Benzyloxycarbonyl- L-phenylalanyl-O-benzyl-L-serin;
  • (e) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-S-benzyl-L-cysteinbromomethylketon (Smpkt. 122.5-123.5ºC, Zers.) aus N- Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-S-benzyl-L-cystein;
  • (f) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-O-benzyl-L-threoninbromomethylketon (Smpkt. 142.5-144ºC) aus N-Benzyloxycarbonyl-L- phenylalanyl-O-benzyl-L-threonin;
  • (g) N-Benzyloxycarbonyl-L-prolyl-L-valin-bromomethylketon (Smpkt. 88-91ºC) aus N-Benzyloxycarbonyl-L-prolyl-L-valin;
  • (h) N-Benzyloxycarbonyl-D-phenylalanyl-L-prolyl-L-alaninbromomethylketon (wachsartiger Festkörper) aus N-Benzyloxycarbonyl- D-phenylalanyl-L-prolyl-L-alanin;
  • (i) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-Nε-tri-fluoroacetyl-L- lysin-bromomethylketon (Smpkt. 177-177.5ºC) aus N-Benzyloxycarbonyl- L-phenylalanyl-Nε-trifluoroacetyl-L-lysin;
  • (j) N-Benzyloxycarbonyl-L-leucyl-L-leucin-bromo-methylketon (Smpkt. 93-99ºC) aus N-Benzyloxycarbonyl-L-leucyl-L-leucin,
  • (k) N-Benzyloxycarbonyl-L-leucyl-L-phenylalaninbromomethylketon (Smpkt. 127-129ºC) aus N-Benzyloxycarbonyl-L- leucyl-L-phenylalanin; und
  • (l) N-Benzyloxycarbonyl-L-leucin-bromomethylketon (ein Öl) aus N-Benzyloxycarbonyl-L-leucin.
    • Präparation 5 N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alaninchloromethylketon und andere Verbindungen der Formel (3)
  • Durch Ersatz der 1 : 1 Lösung von Essigsäure und 50% HBr in Präparation 4 durch eine 1 : 1 Lösung einer konzentrierten Chlorwasserstoffsäure und Eisessig wurde das N-Benzyloxycarbonyl-L- phenylalanyl-L-alanin-chloromethylketon (Smpkt. 153-154ºC) erhalten.
  • In einer ähnlichen Weise wurden mit Hilfe von in den Präparationen 4 und 5 beschriebenen Methoden die nachfolgenden Verbindungen erhalten:
  • (a) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-O-methyl-L-tyrosinbromomethylketon aus N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-O-methyl-L- tyrosin;
  • (b) N-Acetyl-D, L-phenylalanyl-O-benzyl-L-serinbromomethylketon aus N-Acetyl-D,L-phenylalanyl-O-benzyl-L-serin;
  • (c) N-Benzoyl-L-phenylalanyl-L-alanin-bromomethylketon aus N- Benzoyl-L-phenylalanyl-L-alanin;
  • (d) N-Boc-L-leucyl-L-methionin-bromomethylketon aus N-Boc-L- leucyl-L-methionin;
  • (e) N-Tosyl-glycyl-L-phenylalanyl-L-alanin-bromomethylketon aus N-Tosyl-glycyl-L-phenylalanyl-L-alanin; und
  • (f) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-glycinchloromethylketon aus N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-glycin.
    • Präparation 6 2,3,5,6-Tetramethyl-1,4-benzoldicarbonsäure (2,3,5,6-Tetramethyl-terephthalsäure)
  • 2,3,5,6-Tetramethyl-p-xylen-α,α'-diol (5.0 g, 26 mmol) wurde in 250 ml destilliertem Aceton suspendiert und auf 0ºC abgekühlt. Zu einer gesonderten Lösung von Chrom(VI)oxid (14.15 g, 0.14 ml) in 50 ml Wasser wurde tropfenweise konzentrierte Schwefelsäure (14.5 ml, 0.26 mol) bei 0ºC während 45 Minuten zugesetzt. Dieses Gemisch wurde dann tropfenweise während 30 Minuten unter Rühren bei 0ºC zu der Aceton Lösung hinzugefügt. Das Gemisch wurde bei 0ºC während einer Stunde und anschließend bei Raumtemperatur während 18 Stunden kräftig gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde am Rotationsverdampfer konzentriert und es wurde 1N HCl zugesetzt um einen pH Wert von 1 zu erreichen. Das Produkt wurde durch Abkühlung ausgefällt, danach filtriert, mit Wasser (3·) und Diethylether (3·) gewaschen und im Hochvakuum getrocknet um 4.55 g (80%) des Produktes (HOOC-C&sub6;(CH&sub3;)&sub4;- COOH) als weißen Festkörper zu erhalten. Smpkt. > 300ºC.
    • Präparation 7 2,6-Dimethyl-1,4-benzoldicarbonsäure (2,6-Dimethyl-terephthalsäure)
  • 2,4,6 Trimethylbenzoesäure (Mesitoinsäure) (10 g, 61 mmol) wurde in 150 ml Wasser suspendiert und das Gemisch auf 0ºC abgekühlt. Natriumhydroxid Plättchen (7.31 g, 0.18 mol) wurden nach und nach zugegeben, gefolgt von einer Zugabe von Kaliumpermanganat (4·7.2 g, 0.18 mol) in vier Intervallen von 30 Minuten. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur während 2 Stunden gerührt, danach auf einem Dampfbad während 15-30 Minuten erhitzt. Schwefelsäure (200 ml, 9 mol) wurde hinzugefügt, danach wurde Natriumbisulfit vorsichtig und nach und nach bei 0ºC zugesetzt. Der ausgefallene weiße Festkörper wurde abfiltriert und danach in 5N Ammoniumhydroxid gelöst. Die Lösung wurde mit Diethylether gewaschen, dann nach und nach, tropfenweise mit konzentrierter Schwefelsäure behandelt um das Produkt auszufällen. Abfiltrieren gefolgt von Waschen mit heißem Wasser (4·) und Petrolether (3·), Umkristallisation (Methanol-Wasser) und Trocknung im Hochvakuum ergab 10.5 g (89%) des Produktes als weißen Festkörper, Smpkt. > 300ºC (Ref. W. A. Noyes, Amer. Chem. J., 20, 789 (1898)).
    • Präparation 8 4-Methoxycarbonyl-2,6-dimethyl-benzoesäure
  • 2,6-Dimethyl-1,4-benzoldicarbonsäure (aus der Präparation 7) (5.0 g, 26 mmol) wurde in Methanol (40 ml) suspendiert, konzentrierte Schwefelsäure (5 ml) wurde hinzugefügt und das Gemisch während 2 Stunden zum Rückfluß erhitzt. Die Lösung wurde abgekühlt und Wasser wurde hinzugefügt um das Produkt auszufällen . . Filtration, gefolgt von Waschen mit Wasser (3·) und Petrolether (3·) und Trocknen im Hochvakuum ergab 2.05 g des Produktes als weißes Pulver, Smpkt. 191-192ºC (Ref. W. A. Noyes, oben besprochen).
    • Präparation 9 4-Aminocarbonyl-2,6-dimethyl-benzoesäure
  • 4-Methoxycarbonyl-2,6-dimethyl-benzoesäure (aus Präparation 8) (250 mg, 1.2 mmol) wurde in Methanol (50 ml) gelöst und die Lösung auf 0ºC abgekühlt. In die Lösung wurde bei 0ºC während 20 Minuten Ammoniak Gas geleitet, danach wurde das Gemisch in einem rostfreien Druckreaktionsgefäß (Parr Bombe) in einer Ammoniak Atmosphäre eingeschlossen. Nach Erhitzen des Gemisches auf 85ºC während 2er Tage wurde es abgekühlt und eingedampft. Der Rückstand wurde mit Ethylacetat vermischt, mit 1N HCl (3·), Wasser (2·) und Salzsole (3·) gewaschen, getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und am Rotationsverdampfer eingedampft. Der Rückstand wurde mit Hilfe von Silikagel Chromatographie gereinigt, wobei die Eluierung mit Dichlormethan/Methanol/ Essigsäure (79 : 20 : 1) durchgeführt wurde. Das Produkt wurde isoliert und mit Petrolether digeriert, filtriert und im Hochvakuum getrocknet um 120 mg des Produktes als weißen Festkörper zu erhalten, Smpkt. 238-240ºC (Ref. W. A. Noyes, oben besprochen).
    • Präparation 10 4-Phenylsulfonamidocarbonyl-2,6-dimethyl-benzoesäure
  • 2,6-Dimethyl-1,4-benzoldicarbonsäure (aus Präparation 7) (500 mg, 2.6 mmol) und Benzolsulfonamid (486 mg, 3.1 mmol) wurden in trockenem DMF (25 ml) kombiniert und EDCI (494 mg, 2.6 mmol) wurde nachfolgend unter Rühren bei 0ºC hinzugefügt. Das Gemisch wurde während 2 Stunden bei 0ºC und 2 Tage bei Raumtemperatur gerührt, danach wurde 1N HCl (10 ml) zugesetzt und das Gemisch mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wurde mit 1N HCl (1·), Wasser (5·) und Salzsole (3·) gewaschen; getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und am Rotationsverdampfer eingedampft, wobei das rohe Produkt (das als solches in der nächsten Stufe verwendet wird) als weißer Festkörper erhalten wird. NMR (Aceton-d&sub6;) zeigte 8.0-7.4 ppm (Multiplet mit einem Singlet bei 7.7 ppm, 7H) und 2.4 ppm (Singlet, 6H).
    • Präparation 11 4-Methoxycarbonyl-benzoesäure
  • 4-Hydroxymethyl-benzoesäure (9.25 g, 55.6 mmol) wurde in 460 ml destilliertem Aceton suspendiert und auf 0ºC abgekühlt. Zu einer gesonderten Lösung von Chrom(VI)oxid (29.9 g, 0.30 mol) in 100 ml Wasser wurde tropfenweise konzentrierte Schwefelsäure (27.8 ml, 0.52 mol) bei 0ºC während 45 Minuten hinzugefügt. Dieses Gemisch wurde anschließend tropfenweise während 75 Minuten der Aceton Lösung unter Rühren bei 0ºC hinzugefügt, danach wurde das Gemisch bei Raumtemperatur während 18 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde abfiltriert und der Festkörper mit Aceton gewaschen. Das Filtrat wurde am Rotationsverdampfer eingedampft und Wasser wurde hinzugefügt um das Produkt auszufällen. Der Festkörper wurde mit Wasser gewaschen und im Hochvakuum getrocknet um 9.4 g (94%) des Produktes (4-CH&sub3;OCO-C&sub6;H&sub4;-COOH) als weißen Festkörper zu erhalten, Smpkt. 222.5-225ºC.
    • Präparation 12 4-Phenylsulfonamidocarbonyl-benzoesäure
  • 4-Methoxycarbonylbenzoesäure (aus Präparation 11) (5.0 g, 28 mmol) wurde in 100 ml wasserfreiem Dichlormethan gelöst. Nach Zugabe von DMAP (3.39 g, 28 mmol) und Benzolsulfonamid (4.36 g, 28 mmol), wurde EDCI (5.85 g, 31 mmol) nach und nach zu dem gerührten Gemisch hinzugefügt. Nach 18 Stunden bei Raumtemperatur ergab die Rotationsverdampfung des Gemisches einen Rückstand der mit Ethylacetat und 1N HCl vermischt wurde. Die organische Phase wurde mit Wasser (1·) und Salzsole (2·) gewaschen, getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;), am Rotationsverdampfer eingedampft und im Hochvakuum getrocknet um 8.7 g (98%) von 4-Phenylsulfonamido-carbonyl-benzoat (4-C&sub6;H&sub5;SO&sub2;-NHCO-C&sub6;H&sub4;- COOCH&sub3;) als weißen Festkörper zu erhalten. Eine Lösung dieses Materials (3.2 g, 10 mmol) in 130 ml Dioxan/Wasser (3 : 1) wurde auf 0ºC abgekühlt. 1N Natrium Hydroxid wurde tropfenweise hinzugefügt gefolgt von starkem Rühren bei 0ºC während 20 Minuten, dann bei Raumtemperatur während 2 Stunden. Das Gemisch wurde wieder auf 0ºC abgekühlt und danach auf pH 2 durch s;tufenweise Zugabe von IN HCl angesäuert. Das Gemisch wurde am Rotationsverdampfer eingedampft und der wäßrige Rückstand mit Ethylacetat (3·) extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden mit Salzsole gewaschen, getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;), am Rotationsverdampfer eingedampft und im Hochvakuum getrocknet um das Produkt (4-C&sub6;H&sub5;SO&sub2;NHCO-C&sub6;H&sub4;-COOH) zu erhalten, Smpkt. 267-270ºC.
    • Beispiel 1 N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-O-benzyl- L-threonin-pentafluorophenoxymethylketon
  • N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-O-benzyl-L-threoninbromomethylketon (50 mg, 0.084 mmol) und Pentafluorophenol (16 mg, 0.084 mmol) wurden in trockenem DMF (4 ml) gelöst und mit Argon Gas überdeckt. Die Lösung wurde mit Kaliumkarbonat (12 mg, 0.09 mmol), einem katalytischen Anteil von Tetra-n-butylammoniumiodid behandelt und bei Raumtemperatur während 4 Stunden gerührt. Ethylacetat (100 ml) wurde hinzugefügt. Die organische Lösung wurde mit Wasser (1·25 ml) und gesättigter NaCl Lösung (4·25 ml) gewaschen, gefolgt von Trocknen über wasserfreiem Na&sub2;SO&sub4;. Das Lösungsmittel wurde verdampft und der Rückstand auf eine Silikagel Kolonne aufgetragen. Das N- Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-O-benzyl-L-threo-ninpentafluorophenoxymethylketon wurde mit EtOAc/ Hexan (1 : 1) unter Druck eluiert. Verdampfen ergab einen weißen Festkörper (0.050 g, 85%), Smpkt. 140-141ºC.
    • Beispiel 2 N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl- L-alanin-pentafluorophenoxymethylketon
  • N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin-bromomethylketon (3.7 g) und Pentafluorophenol (1.52 g) wurden in trockenem DMF (100 ml) gelöst und mit Argon Gas überdeckt. Die Lösung wurde mit Kaliumkarbonat (1.14 g) und Tetra-n-butylammonium-iodid (100 mg) behandelt und bei Raumtemperatur während 4 Stunden gerührt. Ethylacetat (750 ml) wurde hinzugefügt. Die organische Lösung wurde mit Wasser (1·100 ml), danach mit gesättigter Natriumchoridlösung (4·100 ml) gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und zu einem festen Rückstand eingedampft. Das Produkt N- Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin-pentafluorophenoxymethylketon wurde aus EtOAc umkristallisiert um einen weißen Festkörper zu erhalten (2.69 g, 59%), Smpkt. 175ºC.
  • In einer ähnlichen Weise wurden mit Hilfe der in den Beispielen 1 und 2 beschriebenen Methoden die folgenden Verbindungen der Formel 1A hergestellt:
  • (a) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin- 2,3,5,6- tetrafluorophenoxymethylketon (Smpkt. 171-172.5ºC) aus N- Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin-bromomethylketon und 2,3,5,6-Tetrafluorophenol;
  • (b) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin- 4- ethoxycarbonyl-phenoxymethylketon (Smpkt. 152-155ºC) aus N- Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin-bromomethylketon und 4- Ethoxycarbonyl-phenol (Ethyl-4-hydroxybenzoat);
  • (c) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin- 2- methoxycarbonyl-phenoxymethylketon (Smpkt. 150-152ºC) aus N- Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin-bromomethylketon und 2- Methoxycarbonyl-phenol (Methyl-2-hydroxybenzoat);
  • (d) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin- 4-acetamidophenoxymethylketon (Smpkt. 205-207ºC) aus N-Benzyloxycarbonyl-L- phenylalanyl-L-alanin-bromomethylketon und 4-Acetamidophenol;
  • (e) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin- 2-acetamidophenoxymethylketon (Smpkt. 191-192ºC) aus N-Benzyloxycarbonyl-L- phenylalanyl-L-alanin-bromomethylketon und 2-Acetamidophenol;
  • (f) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin-2-carbamoylphenoxymethylketon (Smpkt. 166-168ºC) aus N-Benzyloxycarbonyl-L- phenylalanyl-L-alanin-bromomethylketon und 2-Carbamoylphenol (2- Hydroxy-benzamid);
  • (g) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin-4- nitrophenoxymethylketon (Smpkt. 159ºC, Zers.) aus N- Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin-bromomethyl-keton und 4- Nitrophenol;
  • (h) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin- 3, 5- bis(trifluoromethyl)-phenoxymethylketon (Smpkt. 178-179.5ºC) aus N- Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin-bromomethylketon und 3, 5- bis(Trifluoromethyl)-phenol;
  • (i) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanin-4-nitrophenoxymethylketon (Smpkt. 114-115ºC) aus N-Benzyloxy-carbonyl-L- phenylalanin-bromomethylketon und 4-Nitro-phenol;
  • (j) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-Nε-trifluoroacetyl-L- lysin-pentafluorophenoxymethylketon (Smpkt: 197-198ºC) aus N- Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-Nε-trifluoroacetyl-L-lysinbromomethylketon und Pentafluorophenol;
  • (k) N-Benzyloxycarbonyl-L-leucyl-L-leucin-pentafluorophenoxymethylketon (Smpkt. 88.5-89.5ºC) aus N- Benzyloxycarbonyl-L-leucyl-L-leucin-bromomethylketon und Pentafluorophenol;
  • (l) N-Benzyloxycarbonyl-L-leucyl-L-phenylalaninpentafluorophenoxymethylketon (Smpkt. 139.5-140.5ºC) aus N- Benzyloxycarbonyl-L-leucyl-L-phenylalanin-bromomethylketon und Pentafluorophenol;
  • (m) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-glycinpentafluorophenoxymethylketon (Smpkt. 110-115ºC) aus N- Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-glycin-bromomethyl-keton und Pentafluorophenol;
  • (n) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-O-benzyl-L-serinpentafluorophenoxymethylketon (Smpkt. 144-146. 5ºC) aus N- Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-O-benzyl-L-serin-bromomethylketon und Pentafluorophenol;
  • (o) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin-2- trifluoromethylphenoxymethylketon (Smpkt. 158-159ºC) aus N- Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin-bromomethylketon und 2- Trifluoromethylphenol;
  • (p) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin- 2-methyl-6- tert-butyl-phenoxymethylketon (Smpkt. 152.5-154.5ºC) aus N- Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin-bromomethylketon und 2- Methyl-6-tert-butyl-phenol;
  • (g) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin-2-methyl-1- naphthyloxymethylketon (Smpkt. 167.5-169.5ºC) aus N- Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin-bromomethylketon und 2- Methyl-1-naphthol;
  • (r) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin-2,4-dinitrophenoxymethylketon (Smpkt. 163-165ºC) aus N-Benzyloxycarbonyl-L- phenylalanyl-L-alanin-bromomethylketon und 2,4-Dinitrophenol;
  • (s) N-Benzyloxycarbonyl-L-leucin-2-nitrophenoxy-methylketon (Öl; [α]D -14.6º (Aceton)) aus N-Benzyloxycarbonyl-L-leucinbromomethylketon und 2-Nitrophenol;
  • (t) N-Benzyloxycarbonyl-L-leucin-3-nitrophenoxy-methylketon (Öl; [α]D -9.1º (Aceton)) aus N-Benzyloxycarbonyl-L-leucinbromomethylketon und 3-Nitrophenol; und
  • (u) N-Benzyloxycarbonyl-L-leucin-4-nitrophenoxy-methylketon (Öl; [α]D -0.3º (Aceton)) aus N-Benzyloxycarbonyl-L-leucinbromomethylketon und 4-Nitrophenol.
    • Beispiel 3 N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin- 2,6-dimethylphenoxymethylketon
  • N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin-bromomethylketon (50 mg, 0.11 mmol) und 2,6-Dimethylphenol (14 mg) wurden in trockenem DMF (5 ml) gelöst und mit Argon Gas überdeckt. Die Lösung wurde mit Kaliumiodid auf Aluminiumoxid (80 mg, KF-Aluminiumoxid, 2 : 3) behandelt und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt.
  • Ethylacetat wurde zugegeben und die anorganischen Salze wurden durch Filtration entfernt. Das organische Filtrat wurde mit gesättigter NaCl Lösung (4·25 ml) gewaschen, danach über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde verdampft und der Rückstand wurde auf eine Silikagel Kolonne aufgetragen. N- Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin-2,6-dimemethylphenoxymethylketon wurde mit EtOAc/Hexan (1 : 1) unter Druck eluiert. Verdampfung ergab einen weißen Festkörper (30 mg, 49%), Smpkt. 167- 168ºC.
    • Beispiel 4 N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin- 4-nitro-phenoxymethylketon
  • N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin-chloromethylketon (50 mg, 0.13 mmol) und 4-Nitrophenol (22 mg, 0.16 mmol) wurden in trockenem DMF gelöst. Die Lösung wurde mit Kaliumkarbonat (17 mg, 0.12 mmol), einem katalytischen Anteil von Tetra-n-butylammonium iodid (2 mg) behandelt und mit Argon Gas überdeckt. Nach Rühren während 16 Stunden wurde das Reaktionsgemisch mit Ethylacetat (100 ml) verdünnt, danach mit Wasser (1·25 ml) und gesättigter NaCl Lösung (4·20 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, zu einem Festkörper eingedampft und mittels Chromatographie gereinigt um das N- Benzyloxycarbonyl-L-phenyl-alanyl-L-alanin-4-nitrophenoxymethylketon (20 mg, 35%) zu erhalten, das mit dem aus Bromomethylketon erhaltenem Material (beschrieben im obigen Beispiel 2(g)) identisch war.
  • In einer ähnlichen Weise wurden unter Verwendung der in den Beispielen 1-4 beschriebenen Methoden die nachfolgenden Verbindungen hergestellt:
  • (a) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-O-methyl-L-tyrosinpentafluorophenoxymethylketon aus N-Benzyloxycarbonyl-L- phenylalanyl-O-methyl-L-tyrosin-bromomethylketon und Pentafluorophenol;
  • (b) N-Acetyl-D, L-phenylalanyl-O-benzyl-L-serinpentafluorophenoxymethylketon aus N-Acetyl-D, L-phenylalanyl-O- benzyl-L-serin-bromomethylketon und Pentafluorophenol;
  • (c) N-Benzoyl-L-phenylalanyl-L-alanin-pentafluorophenoxymethylketon aus N-benzoyl-L-phenylalanyl-L-alaninbromomethylketon und Pentafluorophenol;
  • (d) N-Boc-L-leucyl-L-methionin-pentafluorophenoxymethylketon aus N-Boc-L-leucyl-L-methionin-bromomethylketon und Pentafluorophenol;
  • (e) N-Tosyl-glycyl-L-phenylalanyl-L-alaninpentafluorophenoxymethylketon aus N-Tosyl-glycyl-L-phenylalanyl-L- alanin-bromomethylketon und Pentafluorophenol.
    • Beispiel 5 N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin- 2,6-bis(trifluoromethyl)benzoyloxymethylketon
  • Wasserfreies Kaliumfluorid (0.39 mmol, 23 mg) wurde einer Lösung von N-CBZ-L-phenalalanyl-L-alanin bromomethyl keton (0.16 mmol, 73 mg) in 10 ml wasserfreiem DMF hinzugefügt. Das Gemisch wurde während 3 Minuten bei Raumtemperatur gerührt, 2,6-bis (Trifluoromethyl)benzoesäure (Aldrich, 0.16 mmol, 73 mg) wurde hinzugefügt und das Gemisch während 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde mit 100 ml Ethylether verdünnt, mit Wasser (5·) und Salzsohle gewaschen, getrocknet (MgSO&sub4;), am Rotationsverdampfer eingedampft und im Hochvakuum getrocknet um 70 mg (68%) des Produktes als weißen Festkörper zu erhalten, Smpkt. 158-164ºC;
  • [α]²&sup0;D -25.9º(c=0.54, Aceton); I.R. (KBr) 1765,1745, 1695, 1665 cm&supmin;¹.
    • Beispiel 6 N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-S-benzyl- L-cystein-2,4,6-trimethylbenzoyloxymethylketon
  • Wasserfreies Kaliumfluorid (0.29 mmol, 17 mg) wurde einer Lösung von N-CBZ-L-phenylalanyl-S-benzyl-L-cystein-bromomethylketon (0.12 mmol, 71 mg) in 10 ml wasserfreiem DMF hinzugefügt. Das Gemisch wurde während 3 Minuten bei Raumtemperatur gerührt, 2,4,6,- Trimethylbenzoesäure (Aldrich, 0.12 mmol, 20 mg) wurde hinzugefügt und das Gemisch während 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde mit 100 ml Ethylether verdünnt, mit Wasser (5%) und Salzsole (3·) gewaschen, getrocknet (MgSO&sub4;), am Rotationsverdampfer eingedampft um einen leicht gelblichen Festkörper zu ergeben. Das Material wurde aus Ethylether umkristallisiert wobei 37 mg (46%) des Produktes als weißes Pulver zu erhalten wurden, Smpkt. 173-176ºC;
  • [α]²&sup0;D -66.8º (c=0.51, Aceton);I.R. (KBr) 1730, 1690, 1660 cm&supmin;¹.
    • Beispiel 7 N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin- 1-naphthoyloxymethylketon
  • Wasserfreies Kaliumfluorid (0.67 mmol, 39 mg) wurde zu einer Lösung von N-CBZ-L-phenylalanyl-L-alanin-bromomethylketon (0. 22 mmol, 100 mg) in 6 ml wasserfreiem DMF hinzugefügt. Nach einigen Minuten wurde 1-Naphthalincarbonsäure (Aldrich, 0.22 mmol, 38 mg) hinzugefügt und das Gemisch während 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde mit 100 ml Ethylether verdünnt, mit Wasser (4·), wäßrigem NaHCO&sub3;(1·) und Salzsole (3·) gewaschen, getrocknet (MgSO&sub4;), am Rotationsverdampfer eingedampft und im Hochvakuum getrocknet um 127 mg eines weißen Festkörpers zu ergeben. Umkristallisation aus Ethylacetat-Petrolether ergab das Produkt als weißes Pulver, Smpkt. 188-189.5ºC; [α]²% -29.1º(c = 1.02, DMSO); I.R. (KBr) 1740, 1715, 1685, 1640 cm&supmin;¹.
    • Beispiel 8 N-Benzyloxycarbonyl-D-phenylalanyl-L-prolyl- L-alanin-2,4,6-trimethylbenzoyloxymethylketon
  • Wasserfreies Kaliumfluorid (0.29 mmol, 17 mg) wurde zu einer Lösung von N-CBZ-D-phenylalanyl-L-alanin bromomethyl keton (0.13 mmol, 70 mg) in 10 ml wasserfreiem DMF hinzugefügt. Das Gemisch wurde während 3 Minuten bei Raumtemperatur gerührt, 2,4,6- Trimethylbenzoesäure (Aldrich, 0.13 mmol, 22 mg) wurde hinzugefügt und das Gemisch während 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde mit 100 ml Ethylether verdünnt, mit Wasser (4·) und Salzsole (3·) gewaschen, getrocknet (MgSO&sub4;) und am Rotationsverdampfer eingedampft, wobei ein klarer- öliger Rückstand erhalten wurde. Dieses Material wurde aus Ethylether-Hexan kristallisiert wobei 30 mg (37%) des Produktes als Pulver erhalten wurden, Smpkt. 65-80ºC, [α]²&sup0;D -82.1º (c = 0.56, Aceton).
    • Beispiel 9 N-Tosyl-L-phenylalanin-2,4,6-trimethylbenzoyloxymethylketon
  • Wasserfreies Kaliumfluorid (0.64 mmol, 37 mg) wurde zu einer Lösung von N-Tosyl-L-phenylalanin-chlormethylketon (Sigma, 0.21 mmol, 75 mg) in 10 ml wasserfreiem DMF hinzugefügt. Nach einigen Minuten wurde 2,4,6-Trimethylbenzoesäure (Aldrich, 0.22 mmol, 37 mg) hinzugefügt und das Gemisch bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Das Gemisch wurde mit Ethylether verdünnt, mit Wasser (5·), wäßrigem NaHCO&sub3; (1·) und Salzsole (3·) gewaschen, getrocknet (MgSO&sub4;) und am Rotationsverdampfer eingedampft wobei ein hellbrauner Festkörper erhalten wurde. Umkristallisation aus Ethylacetat- Petrolether ergab 38 mg (38%) des Produktes als gebrochen weißes Pulver, Smpkt. 102-103ºC.
  • In einer ähnlichen Weise wurden mit Hilfe der in den Beispielen 5 bis 9 beschriebenen Methode (mit in einigen Fällen zusätzlich durchgeführter Reinigung mittels Silikagel Kolonnenchromatographie unter Verwendung von Hexan/EtOAc als Eluent) die nachfolgenden Verbindungen der Formel IB hergestellt:
  • (a) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanin-2,4,6-trimethylbenzoyloxymethylketon (Smpkt. 83.5-84ºC) aus N- Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanin-bromomethylketon und 2,4,6- Trimethylbenzoesäure;
  • (b) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin- 2,4,6- trimethylbenzoyloxymethylketon (Smpkt. 169-170ºC) aus N- Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin-bromomethylketon und 2,4,6-Trimethylbenzoesäure;
  • (c) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin-2,6-dimethylbenzoyloxymethylketon (Smpkt. 157-163ºC) aus N-Benzyloxycarbonyl-L- phenylalanyl-L-alanin-bromomethylketon und 2,6-Dimethylbenzoesäure;
  • (d) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alaninbenzoyloxymethylketon (Smpkt. 164-165ºC) aus N-Benzyloxycarbonyl-L- phenylalanyl-L-alanin-bromomethylketon und Benzoesäure;
  • (e) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin-4- nitrobenzoyloxymethylketon (Smpkt. 157-161ºC) aus N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin-bromomethylketon und 4- Nitrobenzoesäure;
  • (f) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin-4-methoxybenzoylxymethylketon (Smpkt. 172-173ºC) aus N-Benzyloxycarbonyl-L- phenylalanyl-L-alanin-bromomethylketon und 4-Methoxybenzoesäure;
  • (g) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin-2,6- dimethoxy-benzoyloxymethylketon (Smpkt. 112-115ºC) aus N- Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin-bromomethylketon und 2,6- Dimethoxybenzoesäure;
  • (h) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin-3,5- bis(trifluoromethyl)-benzoyloxymethylketon (Smpkt. 165-168.5ºC) aus N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin-bromomethylketon und 3,5-bis(Trifluoromethyl)-benzoesäure;
  • (i) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin-2-amino-6- methyl-benzoyloxymethylketon (Smpkt. 146-147.5ºC) aus N- Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin-bromomethylketon und 2- Amino-6-methyl-benzoesäure;
  • (j) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin-2,6- dichlorobenzoyloxymethylketon (Smpkt. 14[-150ºC) aus N- Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin-bromomethylketon und 2,6- Dichlorobenzoesäure;
  • (k) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin-3,5- dihydroxybenzoyloxymethylketon (Smpkt. 207-209ºC) aus N- Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin-bromomethylketon und 3,5- Dihydroxybenzoesäure;
  • (l) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alaninpentafluorobenzoyloxymethylketon (Smpkt. 157-158ºC) aus N- Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin-bromomethylketon und Pentafluorobenzoesäure;
  • (m) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin-2-naphthoyloxymethylketon (Smpkt. 174-176ºC) aus N-Benzyloxycarbonyl-L- phenylalanyl-L-alanin-bromomethylketon und 2-Naphthalincarbonsäure;
  • (n) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin-2-methyl-1- naphthoyloxymethylketon (Smpkt. 166-167ºC) aus N-Benzyloxycarbonyl- L-phenylalanyl-L-alanin-bromomethylketon und 2-Methyl-1- naphthalincarbonsäure;
  • (o) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin- 2-methoxy-1- naphthoyloxymethylketon (Smpkt. 133-134ºC) aus N-Benzyloxycarbonyl- L-phenylalanyl-L-alanin-bromomethylketon und 2-Methoxy-1-naphthalincarbonsäure;
  • (p) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin-2-ethoxy-1- naphthoyloxymethylketon (Smpkt. 141-143ºC) aus N-Benzyloxycarbonyl-L- phenylalanyl-L-alanin-bromomethylketqn und 2-Ethoxy-1- naphthalincarbonsäure;
  • (g) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin-9-anthracencarbonyloxymethylketon (Smpkt. 181-182ºC) aus N-Benzyloxycarbonyl-L- phenylalanyl-L-alanin-bromo-methylketon und 9-Anthracencarbonsäure;
  • (r) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-glycin-2,4,6- trimethylbenzoyloxymethylketon (Smpkt. 100-105ºC) aus N- Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-glycin-bromomethylketon und 2,4,6- Trimethylbenzoesäure;
  • (s) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-phenyl-alanin-2,4,6- trimethylbenzoyloxymethylketon (Smpkt. 198-204ºC) aus N- Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanin-bromomethylketon und 2,4,6-Trimethylbenzoesäure;
  • (t) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-O-benzyl-L-serin-2,4,6- trimethylbenzoyloxymethylketon (Smpkt. 137-142ºC) aus N- Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-O-benzyl-L-serin-bromomethylketon und 2,4,6-Trimethylbenzoesäure;
  • (u) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-O-benzyl-L-threonin- 2,4,6-trimethylbenzoyloxymethylketon (Smpkt. 97-104ºC) aus N- Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-O-benz yl-L-threoninbromomethylketon und 2,4,6-Trimethylbenzoesäure;
  • (v) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-S-benzyl-L-cystein-2,6- bis(trifluoromethyl)benzoyloxymethylketon (Smpkt. 129-132ºC) aus N- Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-S-benzyl-L-cystein-bromomethylketon und 2,6-bis(Trifluoromethyl)benzoesäure;
  • (w) N-Benzyloxycarbonyl-L-prolyl-L-valin-2,6- bis(trifluoromethyl)benzoyloxymethylketon (viskoses Öl) aus N- Benzyloxycarbonyl-L-prolyl-L-valin-bromomethylketon und 2,6- bis(Trifluoromethyl)benzoesäure;
  • (x) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-Nε-trifluoroacetyl-L- lysin-2,4,6-trimethylbenzoyloxy-methylketon (Smpkt. 182-183ºC) aus N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-Nε-trifluoroacetyl-L-lysin-bromomethylketon und 2,4,6-Trimethylbenzoesäure;
  • (y) N-Benzyloxycarbonyl-L-leucyl-L-leucin-2,4,6- trimethylbenzoyloxymethylketon (Smpkt. 115.5-118ºC) aus N- Benzyloxycarbonyl-L-leucyl-L-leucin-bromomethylketon und 2,4,6- Trimethylbenzoesäure;
  • (z) N-Benzyloxycarbonyl-L-leucyl-L-phenylalanin-2,4,6- trimethylbenzoyloxymethylketon (Smpkt. 140-142ºC) aus N- Benzyloxycarbonyl-L-leucyl-L-phenylalanin-bromomethylketon und 2,4,6-Trimethylbenzoesäure;
  • (aa) N-Benzyloxycarbonyl-L-leucyl-L-leucin-2,6- bis(trifluoromethyl)benzoyloxymethylketon (Smpkt. 141-142ºC) aus N- Benzyloxycarbonyl-L-leucyl-L-leucin-bromomethylketon und 2,6- bis(Trifluoromethyl)benzoesäure;
  • (bb) N-Benzyloxycarbonyl-L-leucyl-L-phenylalanin-2,6- bis(trifluoromethyl)benzoyloxymethylketon (Smpkt. 131-133ºC) aus N- Benzyloxycarbonyl-L-leucyl-L-phenyl-alanin-bromomethylketon und 2,6- bis(Trifluoromethyl)-benzoesäure;
  • (cc) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin-2,6- difluorobenzoyloxymethylketon (Smpkt. 164-165.5ºC) aus N- Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin-bromomethylketon und 2,6- Difluorobenzoesäure;
  • (dd) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin-3,4- difluorobenzoyloxymethylketon (Smpkt. 163-164ºC) aus N- Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin-bromomethylketon und 3,4- Difluorobenzoesäure;
  • (ee) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin-2,4,6- triisopropylbenzoyloxymethylketon (Smpkt. 167-169ºC) aus N- Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin-bromomethylketon und 2,4,6-Triisopropylbenzoesäure;
  • (ff) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin-1-hydroxy-2- naphthoyloxymethylketon (Smpkt. 193-195ºC) aus N-benzyloxycarbonyl- L-phenylalanyl-L-alanin-bromo-methylketon und 2-Hydroxy-1- naphthalincarbonsäure;
  • (gg) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin-2,3,5,6- tetramethyl-4-carboxy-benzoyloxymethylketon (Smpkt. 198-200ºC) aus N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin-bromomethylketon und einem 3.5fachen Überschuß von 2,3,5,6-Tetramethyl-1,4- benzoldicarbonsäure (aus Präparation 6);
  • (hh) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin-2,6-dimethyl- 4-methoxycarbonyl-benzoyloxymethylketon (Smpkt. 158-159ºC) aus N- Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin-bromomethylketon und 2,6- Dimethyl-4-methoxycarbonyl-benzoesäure;
  • (ii) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin-2,6-dimethyl- 4-phenylsulfonamidocarbonyl-benzoyloxy-methylketon (Smpkt. 158- 159ºC) aus N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alaninbromomethylketon und 2,6-Dimethyl-4-phenylsulfonamidocarbonylbenzoesäure (aus Präparation 10);
  • (jj) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin-4- phenylsulfonamidocarbonyl-benzoyloxymethylketon (Smpkt. 222-223ºC) aus N-Benzyloxycarbonyl-L-phenyl-alanyl-L-alanin-bromomethylketon und 4-Phenylsulfon-amidocarbonyl-benzoesäure (aus Präparation 12)
  • (kk) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin-2,6-dimethyl- 4-aminocarbonyl-benzoyloxymethylketon (Smpkt. 184-185ºC) aus N- Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin-bromometylketon und 2,6- Dimethyl-4-aminocarbonyl-benzoesäure (aus Präparation 9);
  • (ll) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-glycin-2,6- bis(trifluoromethyl)benzoyloxymethylketon (Smpkt. 99-100ºC) aus N- Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-glycin-bromomethylketon und 2,6- bis(Trifluoromethyl)benzoesäure;
  • (mm) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-O-benzyl-L-serin-2,6- bis(trifluoromethyl)benzoyloxymethylketon (Smpkt. 141-144ºC) aus N- Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-O-benzyl-L-serin-bromomethylketon und 2,6-bis(Trifluoromethyl)benzoesäure; und
  • (nn) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-O-benzyl-L-threonin- 2,6-bis(trifluoromethyl)benzoyloxymethylketon (Öl) aus N- Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-O-benzyl-L-threoninbromomethylketon und 2,6-bis(Trifluoromethyl-benzoesäure; In einer gleichen Weise werden hergestellt:
  • (a) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-O-methyl-L-tyrosin- 2,4,6-trimethylbenzoyloxymethylketon aus N-Benzyloxycarbonyl-L- phenylalanyl-O-methyl-L-tyrosin-bromomethylketon und 2,4,6- Trimethylbenzoesäure;
  • (b) N-Acetyl-D,L-phenylalanyl-O-benzyl-L-serin-2,4,6- trimethylbenzoyloxymethylketon aus N-Acetyl-D, L-phenylalanyl-O- benzyl-L-serin-bromomethylketon und 2,4,6-Trimethylbenzoesäure;
  • (c) N-Benzoyl-L-phenylalanyl-L-alanin-2,4,6-trimethylbenzoyloxymethylketon aus N-Benzoyl-L-phenylalanyl-L-alaninbromomethylketon und 2,4,6-Trimethylbenzoesäure;
  • (d) N-Boc-L-leucyl-L-methionin-2,4,6-trimethylbenzoyloxymethylketon aus N-Boc-L-leucyl-L-methioninbromomethylketon und 2,4,6-Trimethylbenzoesäure;
  • (e) N-Tosyl-glycyl-L-phenylalanyl-L-alanin-2,4,6- trimethylbenzoyloxymethylketon aus N-Tosyl-glycyl-L-phenylalanyl-L- alanin-bromomethylketon und 2,4,6-Trimethylbenzoesäure.
    • Beispiel 10 L-Phenylalanyl-L-alanin- 2,4,6-trimethylbenzoyloxymethylketon, hydrochlorid
  • Zu einem Gemisch von N-CBZ-L-phenylalanyl-L-alanin-2,4,6- trimethylbenzoyloxymethylketon(0.38 mmol, 200 mg) in 100 ml Ethanol enthaltend 150 ul (0.75 mmol) 5N HCl wurden 10% Palladium auf Holzkohle (20 mg) gegeben. Dieses Gemisch wurde in einer Wasserstoffatmosphäre während 3 Stunden heftig gerührt, danach der Katalysator mittels Filtration durch ein Celitbett entfernt und das Filtrat am Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde daraufhin aus Ethanol-Ethylether ausgefällt, mit Ethylether gewaschen und im Hochvakuum getrocknet um das Produkt in quantitativer Ausbeute als Pulver zu erhalten, Smpkt. 123-126ºC.
  • In einer ähnlichen Weise, werden die entsprechenden, N- Benzyloxycarbonyl-geschützten Verbindungen der Formel I hergestellt:
  • (a) L-Phenylalanyl-L-alanin-2,6-bis(trifluoromethyl)benzoyloxymethylketon hydrochlorid; und
  • (b) L-Phenylalanyl-L-alanin-pentafluorophenoxy-methylketon hydrochlorid.
    • Beispiel 11 N-Methylsuccinyl-L-phenylalanyl-L-alanin- 2,4,6-trimethylbenzoyloxymethylketon
  • L-Phenylalanyl-L-alanin-2,4,6-trimethylbenzoyloxymethylketon hydrochlorid (Beispiel 10) (500 mg, 1.16 mmol) wurde in wasserfreiem Dichlormethan (30 ml) in einer Argon Atmosphäre gelöst, NMM (255 ul, 2.31 mmol) wurde hinzugefügt und das Gemisch auf 0ºC abgekühlt. Monomethylsuccinat (168 mg, 1.27 mmol) wurde hinzugefügt, gefolgt von EDCI (244 mg, 1.27 mmol) und DMAP (10 mg, 0.08 mmol). Das Gemisch wurde während 2 Stunden bei 0ºC gerührt und danach bei Raumtemperatur während 18 Stunden. Das Reaktionsgemisch wurde am Rotationsverdampfer eingedampft und der Rückstand zwischen Ethylacetat und IN HCl verteilt. Die organische Phase wurde mit Wasser (2·), wäßrigem NaHCO&sub3; und Salzsole (2·) gewaschen, getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und am Rotationsverdampfer abgedampft. Der Rückstand wurde umkristallisiert (EtOAc-Pet.ether) und danach weiter gereinigt mittels Silica-Gel Kolonnenchromatographie (EtOAc als Eluent), wobei 203 mg des Produktes als weißes Pulver, Smpkt. 185- 186ºC erhalten wurden.
  • In einer ähnlichen Weise wurden die nachfolgenden Verbindungen der Formel IB hergestellt:
  • (a) N-(4-Methoxycarbonyl-benzoyl)-L-phenylalanyl-L-alanin- 2,4,6-trimethylbenzoyloxymethylketon (Smpkt. 213-214ºC) aus L- Phenylalanyl-L-alanin-2,4,6-trimethylbenzoyloxymethylketon hydrochlorid und 4-Methoxycarbonylbenzoesäure; und
  • (b) N-(4-Phenylsulfonamidocarbonyl-benzoyl)-L-phenylalanyl-L- alanin-2,4,6-trimethylbenzoyloxymethyl-keton (Smpkt. 182-185ºC) aus L-Phenylalanyl-L-alanin-2,4,6-trimethylbenzoyloxymethylketon.hydrochlorid und 4-Phenylsulfonamidocarbonylbenzoesäure
    • Beispiel 12 N-Hydroxysuccinyl-L-phenylalanyl-L-alanin- 2,4,6-trimethylbenzoyloxymethylketon
  • L-Phenylalanyl-L-alanin-2,4,6-trimethylbenzoyloxymethylketon.hydrochlorid (Beispiel 10) (1.0 g, 2.31 mmol) wurde in wasserfreiem DMF (35 ml) in einer Argon Atmosphäre gelöst. NMM (255 ul, 2.31 mmol) wurde hinzugefügt und das Gemisch während 5- 10 Minuten gerührt. Bernsteinsäureanhydrid (693 mg, 6.93 mmol) wurde hinzugefügt und das Gemisch bei Raumtemperatur während 18 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Diethylether verdünnt, mit IN HCl (2·), Wasser (5·) und Salzsole (3·) gewaschen, getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und am Rotationsverdampfer eingedampft. Der Rückstand wurde umkristallisiert (EtOAc-Pet.ether) um 297 mg des Produktes als weißes Pulver zu erhalten, Smpkt. 193-194ºC.
    • Beispiel 13 N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-lysin- 2,4,6-trimethylbenzoyloxymethylketon, hydrogenoxalat oder hydrochlorid
  • (i) Zu einer gerührten Lösung von N-CBZ-L-phenylalanyl-N'- trifuoroacetyl-L-lysin-2,4,6-trimethyl-benzoyloxymethylketon (0.33 mmol, 223 mg) in 1,2-Dimethoxyethan (15 ml) wurde 1N NaOH (8-12 Mol-Äquivalente) während einer Periode von 1-3 Stunden bei Raumtemperatur zugesetzt. Nach einer zusätzlichen Stunde bei Raumtemperatur, wurde das Gemisch mit THF verdünnt und danach mit Salzsole (4·) gewaschen. Die Lösung wurde weiter mit Ethylacetat verdünnt, getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und anschließend wasserfreie Oxalsäure (1.1 mmol, 100 mg) zugesetzt. Rotationsverdampfung gefolgt von Digerieren mit Hexan und Waschen mit Ethylether ergab das Rohprodukt (als das Hydrochlorid Salz) als einen Festkörper. Weitere Reinigung wird durch Chromatographie oder Umkristallisation erreicht.
  • (ii) Alternativ wurde eine Lösung von N-CBZ-L-phenylalanyl-Nεtrifluoroacetyl-L-lysin-2,4,6-trimethylbenzoyloxymethylketon (50 mg) in Methanol (25 ml), die vorhergehend mit wasserfreiem Chlorwasserstoffgas gesättigt wurde, bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die Lösung wurde danach am Rotationsverdampfer eingedampft und der Rückstand mit Ethylacetat und Ether gewaschen um das Produkt (als das Hydrochlorid Salz) als einen weißen Festkörper zu ergeben, Smpkt. 165-167ºC (Zers.) IR (KBr) 1725, 1690, 1655 cm&supmin;¹.
  • In einer ähnlichen Weise wird die nachfolgende Verbindung hergestellt:
  • (a) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-lysinpentafluorophenoxymethylketon.hydrogenoxalat oder hydrochlorid aus N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-Nε-trifluoroacetyl-L-lysinpentafluorophenoxymethylketon.
  • In den nachfolgenden Beispielen 14 bis 21 ist der Wirkstoff die Verbindung N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin-2,4,6- trimethylbenzoyloxymethylketon. Es können jedoch auch andere Verbindungen gemäß der Erfindung an ihre Stelle treten.
    • Beispiel 14
  • Eine injizierbare Zubereitung, die auf einen pH Wert von 7 gepuffert ist wird hergestellt und besitzt die folgende Zusammensetzung:
    • Bestandteile
  • Wirkstoff 0.2 g
  • KH&sub2;PO&sub4; Puffer (0.4 M Lösung) 2 ml
  • KOH (1 N) q.s. auf pH 7
  • Wasser (dest., steril) q.s. auf 20 ml
    • Beispiel 15
  • Eine orale Suspension wird hergestellt und besitzt die folgende Zusammensetzung:
    • Bestandteile
  • Wirkstoff 0.1 g
  • Fumarsäure 0.5 g
  • Natriumchlorid 2.0 g
  • Methylparaben 0.1 g
  • Granulierter Zucker 25.5 g
  • Sorbitol (70%ige Lösung) 12.85 g
  • Veegum K (Vanderbilt Co.) 1.0 g
  • Geschmacksstoffe 0.035 ml
  • Farbstoffe 0.5 mg
  • Destilliertes Wasser q.s auf 100 ml
    • Beispiel 16
  • Bestandteile Menge pro Tablette, mg
  • Wirkstoff 25
  • Maisstärke 20
  • Laktose, sprühgetrocknet 153
  • Magnesiumstearat 2
  • Die obigen Bestandteile werden durchmischt und zu einzelnen eigekerbten Tabletten verpreßt.
    • Beispiel 17
  • Bestandteile Menge pro Tablette, mg
  • Wirkstoff 100
  • Laktose, sprühgetrocknet 148
  • Magnesiumstearat 2
  • Die obigen Bestandteile werden gemischt und in eine hartschalen Gelatine-Kapsel eingefüllt.
    • Beispiel 18
  • Bestandteile Menge pro Tablette, mg
  • Wirkstoff 200
  • Maisstärke 50
  • Laktose 145
  • Magnesiumstearat 5
  • Die obigen Bestandteile werden intensiv vermischt und zu einzelnen eigekerbten Tabletten verpreßt.
    • Beispiel 19
  • Bestandteile Menge pro Tablette, mg
  • Wirkstoff 108
  • Laktose 15
  • Maisstärke 25
  • Magnesiumstearat 2
  • Die obigen Bestandteile werden gemischt und in eine hartschalen Gelatine-Kapsel eingefüllt.
    • Beispiel 20
  • Bestandteile Menge pro Tablette, mg
  • Wirkstoff 150
  • Laktose 92
  • Die obigen Bestandteile werden gemischt und in eine hartschalen Gelatine-Kapsel eingefüllt.
    • Beispiel 21 Topische Zubereitung
  • Bestandteile Gramm
  • Wirkstoff 0.2-2
  • Span 60 2
  • Tween 60 2
  • Mineral Öl 5
  • Petrolatum 10
  • Methylparaben 0.15
  • Propylparaben 0.05
  • BHA (butyliertes Hydroxyanisol) 0.01
  • Wasser q.s. 100
  • Alle obigen Bestandteile, mit Ausnahme von Wasser, werden vermischt und unter Rühren auf 60ºC erhitzt. Eine genügende Menge Wasser bei 60ºC wird dann unter heftigem Rühren hinzugefügt um die Bestandteile zu emulgieren und anschließend wird Wasser auf 100 g zugesetzt.
    • Beispiel 22 Prüfung auf Hemmung von Cathepsin B
  • Cathepsin B wurde aus der Rindermilz mit Hilfe des von Bajkowski und Frankfater (J. Biol. Chem. 258, 1645-1649 (1983)) beschriebenen Verfahrens gereinigt. Das Enzym wurde bei -70ºC in 25 mM Acetat Puffer, pH 5.1 enthaltend 5 mM HgCl&sub2; aufbewahrt. Die Hemmung wurde untersucht durch Überwachung der Spaltung eines fluoreszierenden Substrats bei Abwesenheit und Anwesenheit einer Verbindung der Formel I gemäß der nachfolgenden Vorgangsweise.
  • Der Untersuchungspuffer (0.10 M Kaliumphosphat, 1 mM Ethylendiamin Tetraessigsäure, 1 mM Dithio-threitol, pH 6.0) wurde hergestellt und durch wiederholtes Evakuieren und Austausch mit Stickstoff und Argon anaerobisch gemacht. Zwei ml dieses Puffers wurden in eine Fluorimeter Küvette gegeben, die mit Hilfe eines Thermostaten auf eine Temperatur von 25ºC eingestellt und in einer Stickstoff oder Argon Atmosphäre in einem Parkin-Elmer 650-40 Flourimeter untergebracht wurde. Enzym (0.5 bis 5 Mikroliter einer Vorratslösung, genügend um ungefähr 0.1 Fluoreszenseinheiten (FU) pro Minute eines nicht gehemmten Anteils abzugeben) wurde hinzugefügt und nach 1 bis 5 Minuten Inkubation wurde das Substrat zugesetzt (5 bis 10 Mikroliter einer 1 mM Vorratslösung in Me&sub2;SO) und die Zunahme der Fluoreszenz kontinuierlich überwacht. Eines der beiden Substrat e wurde verwendet: 7-(Benzyloxycarbonyl-phenylalanylarginyl)-4-methylcuma-rinamid (Peninsula Laboratories, San Carlos, CA) oder 7-(Benzoyl-valyl-lysyl-lysyl-arginyl)-4-trifluoromethylcumarinamid (Enzym Systems Products, Livermore, CA), für die sich die Fluorimeter Anregung und Emissionswellenlängen im Bereich von 370 und 460 nm oder 400 und 505 nm befanden. Nachdem ein anfänglicher (nicht gehemmter) Anteil von Substrat Hydrolyse festgestellt wurde (1 bis 3 Minuten), wurde die zu untersuchende Verbindung hinzugefügt (0.5 bis 10 Mikroliter einer Vorratslösung in Me&sub2;SO). Die Floureszenz-Überwachung wurde fortgesetzt, üblicherweise über einen Zeitraum von zusätzlichen 10-40 Minuten.
  • Die Cathepsin B Hemmung war in dieser Untersuchung durch zwei Erscheinungsbilder charakterisiert: (1) eine sofortige Hemmung, die sich als Abnahme des Anteils der Produktion eines floureszierenden Produktes, sogleich nach Zugabe des Inhibitors, darstellt und (2) zeitabhängige Hemmung, die sich als Annäherung an eine scheinbar vollständige Inaktivierung darstellt. Die Konstante zweiter Ordnung für diese zeitabhängige Phase ist unser wesentlichstes Kriterium der Wirkungsstärke, die aus den Resultaten wie folgt erhalten wurde. Für jede Verbindung wurden, wie oben besprochen, Untersuchungen bei zwischen 3 und 8 verschiedenen Inhibitorenkonzentrationen durchgeführt. Die Anteilskonstanten der Inaktivierung bei jeder Untersuchung (kobs) wurden durch nicht-lineare Regression der Fluoreszenz vs. Zeit herleitbar aus jeder der Gleichungen erhalten. (Fluoreszenz) = Ae&supmin;(kobst) + B + Ct oder (Fluoreszenz) = Ae&supmin;(kobst) + B. In einigen Fällen steigt der kobs linear mit der Konzentration des Inhibitors ([I]) und in anderen wird der kobs gesättigt. Die erwünschte Anteilskonstante der zweiten Ordnung für die Inaktivierung (k/k) wurde daher durch Regression zu entweder kobs = (k/k)[I] oder kobs = k[I]/(K + [I]) erhalten.
    • Beispiel 23 Untersuchung auf Cathepsin B Aktivität ex vivo
  • Weibliche Lew/CrBr Ratten mit einem Gewicht von 140-150 Gramm wurden in Gruppen von vier verwendet. Das Untersuchungsmaterial wurde wie angegeben verabreicht. Drei Stunden später wurden die Tiere mit Natrium Barbital anästhesiert und die Lebern mit eiskalter physiologischer Kochsalzlösung übergossen. Die Lebern wurden entfernt, gewogen und in 2 Volumsanteilen eiskalter 0.25 M Saccharose-Lösung unter Verwendung eine Glas/Teflon Homogenisators homogenisiert. Lysosome wurden unter Verwendung der nachfolgenden sequentiellen Differential Zentrifugiertechnik die bei 4ºC durchgeführt wurde hergestellt. Das Homogenat wurde bei 600·g während 10 Minuten zentrifugiert und das Pellet verworfen. Danach wurde der Überstand bei 3,000·g während 10 Minuten zentrifugiert und dieses zweite Pellet verworfen. Dieser zweite Überstand wurde bei 15,000·g während 15 Minuten zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das lysosomale Pellet wurde 2· mit 0.25 M Saccharose gewaschen und das Pellet anschließend mit destilliertem Wasser lysiert. Dieses lysosomale Lysat wurde bei 100,000·g während 60 Minuten zentrifugiert. Das Enzym wurde gefroren aufbewahrt bis es bereit war verdünnt und geprüft zu werden auf Cathepsin B. Die Aktivität wurde in einer fluorimetrischen Untersuchungsanordnung unter Verwendung eines spezifischen Substrats 7-Amino-4-methylcumarin (AMC) gemäß der Methode von Barret (Methods in Enzymology, Band 80, Seiten 535-561) gemessen.
  • Die Resultate sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengefaßt:
    • Untersuchungsmaterial
  • Verbindung 1: N-(Phenylsulfonamidocarbonyl-benzoyl)-L- phenylalanyl-L-alanin-2,4,6-trimethylbenzoyloxy-methylketon;
  • Verbindung 2: N-Hydroxysuccinyl-L-phenylalanyl-L-alanin-2,4,6- trimethylbenzoyloxymethylketon;
  • Verbindung 3: N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin- 2,3,5,6-tetramethyl-4-carboxy-benzoyloxy-methylketon;
  • Verbindung 4: N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-lysin- 2,4,6-trimethylbenzoyloxymethylketon, oxalat.
    • Untersuchungsmaterial Prozent Hemmung
  • Dosis: 100 mg/Kg ip
  • Verbindung 1 97
  • Verbindung 2 90
  • Verbindung 3 99
  • Verbindung 4 100
    • Beispiel 24 Toxizität
  • N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin-2,4,6- trimethylbenzoyloxymethylketon wurde während 17 Tagen an Ratten in einer Dosis von 100 mg/Kg/Tag verabreicht. Es wurden keine Zeichen von Toxizität beobachtet.
  • Andere Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung zeigen ebenfalls keine toxischen Effekte.

Claims (25)

1. Eine Verbindung der Formel
oder ein optischer Isomer davon oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon, worin
n 0 oder 1 ist;
m 0, 1 oder 2 ist;
X für Wasserstoff oder eine N-Schutzgruppe ausgewählt aus Trifluoroacetyl, Acetyl, Isobutyloxycarbonyl, Methoxycarbonyl, Phenylsulfonyl, Methoxysuccinyl, Hydroxysuccinyl, Benzoyl, p-Methoxycarbonyl-benzoyl (p-CH&sub3;OCO-C&sub6;H&sub4;CO-), p-Phenylsulfonainidocarbonyl benzoyl(p-C&sub6;H&sub5;SO&sub2;SO&sub2;NHCO-C&sub6;H&sub4;CO), Boc, CBZ, Tosyl oder 9-Fluorenmethoxycarbonyl steht;
jedes Symbol Y unabhängig voneinander den Rest einer natürlichen Aminosäure bedeutet, der aus Alanyl, Arginyl, Asparaginyl, Aspartyl, Cysteinyl, Glutamyl, Glutaminyl, Glycyl, Histidyl, Leucyl, Isoleucyl, Lysyl, Methionyl, Phenylalanyl, Seryl, Tyrosyl, Threonyl, Tryptophanyl, Valyl und Prolyl ausgewählt ist, wobei dieser Rest eine durch eine O-Schutzgruppe, eine S-Schutzgruppe oder eine N-Schutzgruppe gegebenenfalls geschützte Seitenkette hat;
R für H oder eine Seitenkette von einem vorher erwähnten natürlichen Aminosäurerest mit der Ausnahme von Prolyl steht, wobei die vorher erwähnte Seitenkette gegebenenfalls durch eine O-Schutzgruppe, eine S-Schutzgruppe oder eine N-Schutzgruppe geschützt ist,
R' 2-Naphthyl; 9-Anthracyl; Phenyl, das gegebenenfalls durch 1 bis 5 Fluorsubstituenten oder 1 bis 3 Substituenten ausgewählt aus niedrigem Alkyl, niedrigem Alkoxy, Nitro, Halogen, Acetyl, Benzoyl, Hydroxy, Amino, Methylamino, Dimethylamino, Diethylamino, Methylthio, Cyano, Trifluormethyl, Phenylsulfonamidocarbonyl (-CONHSO&sub2;C&sub6;N&sub5;), -COOH, -CONH&sub2;, -COOR² und -NHCOR², worin R² niedriges Alkyl ist, substituiert ist; 2,3,5,6-Tetramethyl-4-carboxyphenyl (-C&sub6;H&sub5;(CH&sub3;)&sub4;COOH); oder gegebenenfalls in Stellung 2 durch niedriges Alkyl, niedriges Alkoxy oder Trifluoromethyl substituiertes 1-Naphthyl, bedeutet.
2. Eine Verbindung nach Anspruch 1, worin m 1 oder 2 bedeutet.
3. Eine Verbindung nach Anspruch 2, worin Y ein fest einer hydrophobischen Aminosäure ist.
4. Eine Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3 worin, wenn m = 1, Y Phenylalanyl, Leucyl, oder Alanyl ist; und wenn m = 2, (Y)m Glycyl-Phenylalanyl, Leucyl-Leucyl, Phenylalanyl-Phenylalanyl oder Alanyl-Phenylalanyl ist.
5. Eine Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, worin in 1 ist und Y für Phenylalanyl steht.
6. Eine Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, worin R ausgewählt ist aus:
Wasserstoff;
niedrigem Alkyl;
(CH&sub2;)aWR³, worin a 1 oder 2, und W Sauerstoff oder Schwefel, und R³ Methyl oder Benzyl ist;
-CH(CH&sub3;)OCH&sub2;Ph;
-(CH&sub2;)bNHR&sup4;,
worin b 4, und R&sup4; H, Ac, Boc, oder OBZ ist;
-(CH&sub2;)cC(O)R&sup5;,
worin c für 1 oder 2, und R&sup5; für Amino, Methoxy, oder Benzyloxy steht; und
-(CH&sub2;)dR&sup6;,
worin d für 1 und R&sup6; für Phenyl steht, oder worin d 1 und R&sup6; durch Methoxy oder Benzyloxy monosubstituiertes Phenyl bedeutet.
7. Eine Verbindung nach Anspruch 6, worin R aus den Seitenketten von Glycin, Alanin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, O-Benzylserin, S-Benzylcystein, und 0-Benzylthreonin ausgewählt ist.
8. Eine Verbindung nach Anspruch 7, worin R für Wasserstoff, Methyl, 4-Aminobutyl oder Benzyloxymethyl steht.
9. Eine Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, worin X aus Wasserstoff, Acetyl, Methoxysuccinyl, Hydroxysuccinyl, Benzoyl, p-Methoxycarbonylbenzoyl (p-CH&sub3;OCO-C&sub6;H&sub4;CO-), p-Phenylsulfonamidocarbonylbenzoyl, (p-C&sub6;H&sub5;SO&sub2;NHCO-C&sub6;H&sub4;CO-), Boc, OBZ, oder Tosyl ausgewählt ist.
10. Eine Verbindung nach Anspruch 9, worin X CBZ, Methoxysuccinyl, Hydroxysuccinyl, p-Methoxycarbonylbenzoyl, oder -p-Phenylsulfonamidocarbonylbenzoyl ist.
11. Eine Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10, worin n 1 und R' ausgewählt ist aus:
Phenyl;
in Stellung 4 durch Acetylamino, Acetyl, Benzoyl, Halogen, Amino, Methylamino, Dimethylamino, Diethylamino, Hydroxy, Methoxy, Ethoxy, Methylthio, Cyano, Phenylsulfon amidocarbonyl, Nitro, Trifluormethyl, Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, oder t.-Butyl substituiertem Phenyl;
in den Stellungen 3, 5 durch Hydroxy oder Trifluormethyl disubstituiertem Phenyl;
in den Stellungen 2, 6 durch Methyl, Trifluormethyl, Methoxy, Fluor, oder Chlor disubstituiertem Phenyl;
Pentafluorphenyl;
2,4,6-Trimethylphenyl;
2,4,6-Triisopropylphenyl;
2,6-Dimethyl-4-Methoxycarbonyl-Phenyl;
2,6-Dimethyl-4-Phenylsulfonamidocarbonyl-Phenyl;
2,3,5,6-Tetramethyl-4-Carboxy-Phenyl (-C&sub6;(CH&sub3;)&sub4;-COOH); gegebenenfalls in Stellung 2 durch Methyl, Methoxy, oder Ethoxy substituiertem 1-Naphthyl;
2-Naphthyl; und
9-Anthracyl.
12. Eine Verbindung nach Anspruch 11, worin R' ausgewählt ist aus:
2,3,5,6-Tetramethyl-4-Carboxy-Phenyl (-C&sub6;(CH&sub3;)&sub4;-COOH);
2,6-Bis(Trifluormethyl)Phenyl;
2,6-Dimethyl-4-Methoxycarbonyl-Phenyl;
2,6-Dimethyl-4-Phenylsulfonamidocarbonyl-Phenyl;
2,4,6-Trimethylphenyl;
2-Methyl-1-Naphthyl; und
9-Anthracyl.
13. Eine Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10, worin n O und R' ausgewählt ist aus:
Phenyl;
durch 1 oder 2 Fluoratome substituiertem Phenyl;
2,3,5,6- oder 2,3,4,6-Tetrafluorphenyl;
Pentafluorphenyl;
in den Stellungen 2,6 durch Methyl, Methoxy, Chlor, Isopropyl oder Phenyl disubstituiertem Phenyl;
3,5-Bis (Trifluormethyl) Phenyl; und
in der Stellung 2 oder 4 durch Cyano, Methoxy, Hydroxy, Acetoxy, Nitro, Acetamido, oder C(O)Q (worin Q Amino, H oder niedriges Alkoxy ist) monosubstituiertem Phenyl.
14. Eine Verbindung nach Anspruch 13, worin R' ausgewählt ist aus:
2,3,5,6- oder 2,3,4,6-Tetrafluorphenyl;
Pentafluorphenyl; und
in der Stellung 2 durch Nitro, Acetamido oder CONH&sub2; monosubstituiertem Phenyl.
15. Eine Verbindung ausgewählt aus:
N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alaninpentafluorophenoxymethylketon;
N-Benzyloxycarbonyl-L-phenyialanyl-Q-benzyl-L- threonin-pentafluorophenoxymethylketon;
N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin- 2-carbamoyl-phenoxymethylketon;
N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin- 4-nitrophenoxymethylketon;
N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin- 2,6-bis(trifluormethyl)benzoyloxymethylketon;
N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin- 2,4,6-trimethylbenzoyloxymethylketon;
N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-O-benzyl- L-serin-2,4,6-trimethylbenzoyloxymethyl-keton;
N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-S-benzyl- L-cystein-2,6-bis(trifluormethyl)benzoyloxymethylketon;
N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-O-benzyl- L-threonin-2,4,6-trimethylbenzoyloxymethylketon;
N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin- 2-methyl-1-naphthoyloxymethylketon;
N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-glycin- 2,4,6-trimethylbenzoyloxymethylketon;
N-Methoxysuccinyl-L-phenylalanyl-L-alanin- 2,4,6-trimethylbenzoyloxymethylketon;
N-Hydroxysuccinyl-L-phenylalanyl-L-alanin- 2,4,6-trimethylbenzoyloxymethylketon;
N-(4-Phenylsulfonamidocarbonyl-benzoyl)-phenylalanyl-L-alanin-2,4,6-trimethylbenzoyloxymethylketon;
N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-lysin- 2,4,6-trimethylbenzoyloxymethylketon, Chlorhydratsalz; und
N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-alanin 2,3,5,6-tetramethyl-4-carboxy-benzoyloxymethylketon.
16. Anwendung einer Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 15 in der Herstellung eines Medikamentes zur Hemmung von Thiol-Proteasen wie Cathepsin B.
17. Anwendung einer Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 15 in der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung oder Vorbeugung von Gewebeschädigung in Myokardinfarkt.
18. Anwendung einer Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 15 in der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von Entzündung.
19. Anwendung einer Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 15 in der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung oder Vorbeugung von Knochenresorption.
20. Anwendung einer Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 15 in der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung oder Vorbeugung von Gewebeschädigung in einer dystrophischen Krankheit.
21. Anwendung einer Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 15 in der Herstellung eines Medikamentes zur Förderung von Gewichtszunahme.
22. Anwendung einer Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 15 zur Förderung von Gewichtszunahme in einer Pflanze.
23. Eine pharmazeutische Zubereitung enthaltend eine Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 15 in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.
24. Eine Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 15 zur Verwendung als Pharmazeutikum.
25. Ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (I) nach Anspruch 1 oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes oder eines optischen Isomers davon wobei das Verfahren umfaßt:
(1) die Umsetzung einer Verbindung der Formel
worin X, Y, m und R wie oben definiert sind und Z eine austretende Gruppe ist, mit einem aromatischen Alkohol oder einer aromatischen Carbonsäure, die gegebenenfalls substituiert sind; oder
(2) die Entfernung oder den Zusatz einer Schutzgruppe X (wobei X eine N-Schutzgruppe ist) am Aminoterminus einer Verbindung der Formel I; und/oder an irgendeinem C-, S- oder N-Atom einer α-Aminoseitenkette von Y oder R; und/oder an irgendeinem C-, S-, oder N-Atom der Gruppe R'; oder
(3) die Kupplung einer Verbindung der Formel
X-(Y)m-OH
worin X und Y wie oben definiert sind und m für 1 oder 2 steht, mit einer Verbindung der Formel
worin Y, m, R, R' und n wie oben definiert sind; oder
(4) die Acylierung einer Verbindung der Formel
worin X, Y, in und R wie oben definiert sind, zur Bildung der entsprechenden Verbindung der Formel 1 worin n 1 ist; oder
(5) die Umsetzung einer Verbindung der Formel
worin X, Y, m und R wie oben definiert sind, mit einer Verbindung der Formel
Z¹-R'
worin R' wie oben definiert ist und Z¹ eine austretende Gruppe ist, zur Bildung einer Verbindung der Formel I, worin n 0 ist; oder
(6) die Umsetzung einer Verbindung der Formel
worin X, Y, m, R' und n wie oben definiert sind mit einer organo-metallischen Verbindung, worin der organische Teil R ist; oder
(7) die Umsetzung einer Verbindung der Formel
worin X, Y, m und R wie oben definiert sind, mit einem aromatischen Alkohol oder einer aromatischen Carbonsäure, die gegebenenfalls substituiert sind; oder
(8) die Umsetzung einer Verbindung der Formel
X-(Y)m-NH&sub2;
worin X und Y wie oben definiert sind und m für 1 oder 2 steht, mit einer Verbindung der Formel
worin R, R' und n wie oben definiert sind und Z² eine austretende Gruppe ist; oder wenn m 1 ist mit einer Verbindung der Formel
worin R, R', Z² und n wie oben definiert sind und R² eine gegebenenfalls geschützte α-Aminosäure-Seitenkette ist; oder
(9) die Entfernung eines Ketals, Thioketals oder Dithioketals einer Ketonfunktion in der Formel I; oder
(10) die Oxidation einer Verbindung der Formel
worin X, Y, m, R, n und R' wie oben definiert sind; oder
(11) die Überführung einer Verbindung der Formel I in ein pharmazeutisch annehmbares Säureadditionssalz; oder
(12) die Überführung einer Verbindung der Formel I, die eine Carboxygruppe enthält in ein pharmazeutisch annehmbares Base-Additionssalz; oder
(13) die Überführung eines Säureadditionssalzes einer Verbindung der Formel I in ein anderes Säureadditionssalz; oder
(14) die Überführung eines Base-Additionssalzes einer Verbindung der Formel I in ein anderes Base-Additionssalz; oder
(15) die Auflösung eines optischen Isomerengemisches einer Verbindung der Formel I; oder
(16) die Isomerisierung eines Stereoisomers einer Verbindung der Formel I in einen anderen Stereoisomer.
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