KR100833654B1

KR100833654B1 - 삼백초 추출물 또는 이로부터 분리된 활성 화합물을포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR100833654B1
Application number: KR1020070013661A
Authority: KR
Inventors: 김영섭; 유시용; 연규환; 홍경식; 민용기; 김성환; 이병회; 최연희; 김현기; 권대영; 고우석
Original assignee: 한국화학연구원; 한국식품연구원
Priority date: 2007-02-09
Filing date: 2007-02-09
Publication date: 2008-05-29
Also published as: WO2008097057A1

Abstract

본 발명은 (-)-소서네올[(-)-saucerneol], 사우리스토락탐(sauristolactam), 이들의 혼합물 또는 이를 포함하는 삼백초 추출물을 유효성분으로 함유하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 조성물은 파골 세포의 형성 및 활성을 효과적으로 억제하므로, 골다공증 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

삼백초 추출물 또는 이로부터 분리된 활성 화합물을 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물{COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING OSTEOPOROSIS COMPRISING AN EXTRACT OF SAURURUS CHINENSIS OR ACTIVE COMPOUNDS ISOLATED THEREFROM}

도 1은 파골 세포로 분화 중인 RAW264.7 세포에 삼백초 잎 메탄올(MeOH) 추출물을 처리하고 파골 세포 분화 동안에 유도되는 TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase)의 활성 및 발현 정도를 확인한 결과이고,

도 2는 파골 세포로 분화 중인 RAW264.7 세포에 삼백초 잎 추출물로부터 분리한 다이클로로메탄(MC) 분획을 처리하고 TRAP의 활성 및 발현 정도를 확인한 결과이고,

도 3은 파골 세포로 분화 중인 RAW264.7 세포에 삼백초 잎 추출물로부터 분리한 에틸아세테이트(EA) 분획을 처리하고 TRAP의 활성 및 발현 정도를 확인한 결과이고,

도 4는 파골 세포로 분화 중인 RAW264.7 세포에 삼백초 잎 추출물로부터 분리한 뷰탄올(BuOH) 분획(A) 및 물 분획(B)을 처리하고 TRAP의 활성 및 발현 정도를 확인한 결과이고,

도 5는 파골 세포로 분화 중인 RAW264.7 세포에 본 발명에 사용된 (-)-소서네올[(-)-saucerneol]을 처리하고 TRAP의 활성 및 발현 정도를 확인한 결과이고,

도 6은 파골 세포로 분화 중인 RAW264.7 세포에 본 발명에 사용된 사우리스토락탐을 처리하고 세포 생존률, 및 TRAP의 활성 및 발현 정도를 확인한 결과이고,

도 7은 파골 세포로 분화 중인 RAW264.7 세포에 사우리스토락탐을 처리한 후 세포의 골 흡수 활성을 비디 바이오코트 골 다중실험 슬라이드(BD BioCoat Osteologic MultiTest slide)를 이용하여 분석한 결과이고,

도 8은 파골 세포로 분화 중인 마우스의 조혈모세포에 사우리스토락탐을 처리하고 TRAP의 활성 및 발현 정도를 확인한 결과이고,

도 9는 파골 세포로 분화 중인 마우스의 조혈모세포에 사우리스토락탐을 처리하고 세포의 골 흡수 활성을 비디 바이오코트 골 다중실험 슬라이드를 이용하여 분석한 결과이고,

도 10은 마우스의 조혈모세포에 사우리스토락탐을 처리하고 ERK의 인산화 정도를 관찰한 결과이다.

본 발명은 (-)-소서네올[(-)-saucerneol], 사우리스토락탐(sauristolactam), 이들의 혼합물 또는 이를 포함하는 삼백초 추출물을 유효성분으로 함유하는 골다공 증 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

뼈의 항상성은 파골 세포(osteoclast)에 의한 골 흡수(bone resoprtion)와 조골세포(osteoblast)에 의한 골 형성(bone formation)의 대등한 작용에 의한 리모델링 과정(bone remodeling)이 지속적으로 조절되어 유지된다. 그러나, 파골 세포의 지나친 활성이나 조골세포 활성의 저하는 리모델링 과정의 불균형을 초래하여, 골다공증(osteoporosis)과 같은 성인 골격계 질환을 유도한다. 이러한 불균형을 해소하기 위해서 일반적으로 파골 세포의 지나친 활성을 억제하거나, 조골세포의 활성을 촉진시키거나, 또는 파골 세포의 활성을 억제하고 조골세포의 활성을 촉진하는 방법이 사용되고 있으며, 이들은 골다공증의 치료에 대한 효과적인 치료적 접근 방법으로 인지되고 있다.

파골 세포의 분화는 식균세포/단핵구 세포(macrophage/monocyte)의 조혈 전구 세포(hematopoietic precursor cells)에서 기원하여 대식세포 집락 자극 인자인 M-CSF(macrophage-colony stimulating factor) 및 파골 세포 분화 인자인 RANKL(receptor activator of nuclear factor κB (RANK) ligand)에 의해 단핵의 전구체들이 융합하여 골 소실의 활성을 갖는 다핵 파골 세포(multinucleated osteoclasts)로 분화할 수 있다. 이러한 분화 과정은 세포외부의 RANKL이 RANK에 결합하여 미토겐 활성 단백질(mitogen-activated protein; MAP) 키나아제의 활성을 촉진하고, 이는 NF-κB라는 전사 인자가 핵 내로 들어가서 파골 세포 분화와 관련된 TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase), MMP-9(matrix metalloproteinase-9), c-Src 티로신 키나아제(tyrosine kinase) 등의 발현을 증가시킴으로써 가능한 데, 이러한 과정으로 형성된 다핵 파골 세포는 결과적으로 무기질 골(mineralized bone)을 흡수할 수 있다. 따라서, RANKL에 의해 활성화되는 신호 전달 경로의 차단은 골다공증의 치료를 위한 치료적 접근 방법 중의 하나로 인지되고 있다.

한편, 삼백초(Saururus chinensis)는 삼백초과(Saururaceae) 삼백초속(Saururus)에 속하는 다년생 초본으로서, 중국에서 오래 전부터 민간약으로 사용되어 온 약초이다. 중약대사전에는 삼백초가 청리습열, 소종해독 작용이 있어, 수종, 각기, 황달, 임탁, 대하, 옹종, 정독에 효과가 있음이 기재되어 있다. 또한, 민간에서는 전초 또는 뿌리, 잎이 풍독, 이뇨, 수종, 임질, 간염, 폐렴, 변독, 고혈압 등의 치료에 사용되어 왔다.

삼백초의 성분에 대한 연구는 그 동안 플라보노이드류 (flavonoids), 알칼로이드류 (alkaloids), 아미노산 (amino acids), 지방산류 (fatty acids), 퀴논류 (quinones) 및 정유 성분에 대해 주로 진행되어 왔고, 전초에는 메틸-노말-노닐-케톤 (methyl-n-nonyl ketone), 줄기에는 가수분해형 탄닌이 다량 함유되어 있으며, 잎에는 퀘르세틴 (quercetin), 이소퀘르시트린 (isoquercercitrin), 아비큘라린 (avicularin), 하이페린 (hyperin), 루틴 (rutin) 및 가수분해형 탄닌이 함유되어 있고, 뿌리에는 각종 아미노산, 유기산, 당류 등이 함유되어 있다고 보고되고 있다.

또한, 쇼발 등(Chaubal et al., phytochemistry. 14(2) : 595-596, 1975)은 북미대륙의 습지에 널리 분포하는 동속 식물인 미국 삼백초(Saururus cernuus)의 추출물에 세스퀴테르펜(sesquiterpene)계 화합물이 존재하고 있음을 보고한 바 있 으며, 라오 등(Rao et al., Tetrahedron Lett. 24(45): 4947-4950, 1983)은 미국 삼백초의 추출물로부터 SC-8, SC-9, 마나산틴 A, 마나산틴 B 및 소서네올이라는 화합물들을 분리하여 이들의 구조를 규명하였고, 이중 마나산틴 A가 신경중추억제 효과가 있음을 확인한 바 있다. 국내에서도 다이메틸 테레프탈레이트와 퀘르세틴을 분리·동정하여 약리작용 및 항균작용을 확인하였고(곽재욱, 경희대학교 박사학위논문, 1988), 최근에는 삼백초의 항암활성(대한민국 특허 제 248942 호) 및 항염증활성(대한민국 특허공개 제 2004-75135 호)에 관련된 연구도 진행되고 있다. 그러나, 아직까지 삼백초 추출물이 파골 세포의 증식을 억제하는 활성을 갖는다는 것에 대해서는 보고된 바가 없다.

이에, 본 발명자들은 삼백초 추출물이 파골 세포의 증식을 억제할 수 있어 골다공증 및 관련 골진환의 예방 및 치료의 용도로 사용될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 골다공증 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 골다공증 예방용 건강 증진 식품을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1의 (-)-소서네올[(-)-saucerneol], 하기 화학식 2의 사우리스토락탐(sauristolactam), 이들의 혼합물 또는 이를 포함하는 삼백초(Saururus chinensis) 추출물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다:

이하, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.

본 발명에 따른 삼백초 추출물은 삼백초 또는 이의 건조물을 용매 추출함으로써 제조할 수 있다. 구체적으로는, 응달에서 건조하여 잘게 자른 삼백초에 삼백초 부피의 2 내지 200배, 바람직하게는 10 내지 30배의 유기용매를 가하고, 10 내지 30℃에서 1 내지 20일간, 바람직하게는 5 내지 10일간 추출하고 여과한 후 감압 농축함으로써 삼백초 추출물을 제조할 수 있다. 이때, 추출용매로는 메탄올, 메탄올 수용액, 에탄올, 에탄올 수용액 및 뷰탄올과 같은 C_1-4알콜 및 이의 수용액, 다이클로로메탄, 에틸아세테이트 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 용매를 사용할 수 있으며, 80 내지 100 % 메탄올 또는 메탄올 수용액이 바람직하다.

또한, 이와 같이 얻어진 삼백초 추출물을 뷰탄올, 다이클로로메탄 또는 에틸아세테이트로 재추출할 수 있으며, 바람직하게는 에틸아세테이트로 재추출할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 삼백초 또는 이의 건조물을 100 % 메탄올을 사용하여 7일간 냉침시킨 후 여과하고 여액을 감압 농축하여 메탄올 추출물을 얻고, 이 메탄올 추출물을 증류수에 현탁한 후 동량의 다이클로로메탄으로 분획하여 분리한 물층을 동량의 에틸아세테이트로 분획하고 감압 농축함으로써 삼백초 추출물을 얻을 수 있다.

또한, 상기 삼백초 추출물로부터 상기 화학식 1 및 2의 화합물을 크로마토그래피(chromatography)에 의해 분리 및 정제할 수 있다. 상기 크로마토그래피는 역상 또는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 1 내지 2회 수행하는 것이 바람직하다. 이동상으로는 다이클로로메탄/메탄올(100:1~1:1) 또는 헥산/에틸아세테이트(10:1~1:1)를 사용할 수 있다. 이때, 사용되는 용매는 비극성에서 극성 또는 극성에서 비극성으로 순차적으로 변화시킴으로써 농도구배 용출방식(gradient elution)으로 활성 물질들을 용출 분리하며, 수집된 물질의 파골 세포 억제효과를 측정하여 원하는 활성 분획을 수득할 수 있다. 또한, 필요에 따라, 화학식 1 및 2 의 화합물들을 화학적으로 합성할 수도 있다.

본 발명에 따른 삼백초 추출물 또는 이로부터 분리한 상기 화합물들은 통상적인 방법에 따라 약제학적으로 허용되는 적절한 담체 또는 부형제와 혼합하거나 희석제로 희석하여 상기한 기능을 갖는 약학 조성물로 제조될 수 있다. 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리쓰리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 아울러, 본 발명의 약학 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 제형은 정제, 알약, 분말, 새세이 (sachet), 엘릭서 (elixir), 현탁액, 에멀젼, 용액, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말 등의 형태일 수 있다.

또한, 본 발명의 약학 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 통상적인 1일 투여량은 유효성분을 기준으로 할 때 삼백초 추출물은 10 내지 100 ㎎/㎏ 체중, 바람직하게는 10 내지 30 ㎎/㎏ 체중의 범위이고, 이로부터 분리한 상기 화합물은 1 내지 30 ㎎/㎏ 체중, 바람직하게는 1 내지 10 ㎎/㎏ 체중의 범위이며, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 활성성분의 실제 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중, 및 질환의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1 및 2의 화합물 ((-)-소서네올 및 사우리스토락탐), 이들의 혼합물 또는 이를 포함하는 삼백초 추출물을 포함하는 골다공증 예방용 건강 증진용 식품을 제공한다.

상기 건강 증진용 식품으로는, 예를 들면 각종 식품류, 음료수, 스넥류, 과자류, 껌류, 아이스크림류, 티백차, 인스턴트차, 과립, 향료, 비타민 복합제 및 그 밖의 건강보조식품류 등이 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 삼백초 추출물 또는 이로부터 분리된 상기 화합물을 식품 제조 시 원료 물질에 첨가하거나 조리된 식품에 적절히 혼합하여 상기 건강 증진용 식품을 제조할 수 있으며, 이 때 최종적으로 제조된 식품 중에 상기 화학식 1 및 2의 화합물, 이들의 혼합물 또는 이를 포함하는 삼백초 추출물의 함량은 0.01 내지 30 중량% 범위일 수 있다.

본 발명의 약학 조성물 또는 건강 증진용 식품은 목적하는 효과를 상승시키거나 보완하기 위해 약학적으로 허용되는 다른 생약재 또는 이의 추출물을 추가로 포함할 수 있으며, 그러한 생약재의 대표적인 예로는 희렴, 초두구, 연자육 및 정향피 등을 들 수 있다. 상기 생약재는 조성물의 총 중량을 기준으로 0.01 내지 50 중량%의 양으로 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명을 한정하는 것은 아니다.

<실시예 1> 삼백초 추출물의 제조

건조된 삼백초 15 ㎏을 200 ℓ의 메탄올에 7일간 냉침시킨 후 여과하고 여액을 감압 농축하여 메탄올 추출물 1.7 ㎏을 얻었다. 상기 메탄올 추출물을 증류수 20ℓ에 현탁시킨 후 동량의 다이클로로메탄(dichloromethane, CH₂Cl₂)으로 추출하고 추출액을 감압 농축하여 다이클로로메탄 분획물(MC fraction) 922 g을 얻었다. 남은 수층을 다시 동량의 에틸아세테이트(ethylacetate, EtOAc)로 추출하였고, 이로부터 얻은 추출액을 감압 농축하여 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물(EA fraction) 18 g을 얻었다. 또한, 남은 수층을 다시 동량의 뷰탄올(n-butanol)로 추출한 추출액을 감압 농축하여 뷰탄올(n-butanol) 분획물(BuOH fraction)을 얻었으며, 남은 수층(H₂O fraction)은 동결 건조하였다.

<실시예 2> 삼백초 추출물에서 (-)-소서네올[(-)-saucerneol] 및 사우리스토락탐(sauristolactam)의 분리 정제 및 동정

상기 다이클로로메탄 분획물 430 g을 다이클로로메탄/메탄올(100:1) 혼합용 액을 이동상으로 사용하여 유속 3 ㎖/분으로 흘려주면서 메탄올의 농도를 0 %에서부터 100 %까지 순차적으로 올려주는 농도구배 용출방식(gradient elution)의 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(column chromatography)로 분석하였다. 이로부터 10 ℓ씩 총 4개의 분획(분획 1 내지 4)을 수득하였다. 이들 중 파골 세포 억제효과를 나타내는 분획 2를 헥산/에틸아세테이트(10:1 내지 1:1) 혼합용액을 이동상으로서 유속 3 ㎖/분으로 흘려주는 농도구배 용출방식의 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분석하여 4 ℓ씩 총 5개의 분획(분획 21 내지 25)을 수득하였다. 다시 이들 중 파골 세포 억제효과를 나타내는 분획 25를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(이동상: 헥산/에틸아세테이트=10:1 내지 1:1)를 이용하여 유속 3 ㎖/분으로 흘려주면서 3 ℓ씩 분획하여 세 번째 분획(분획 253)에서 1.5 g의 (-)-소서네올을 분리하고, 네 번째 분획(분획 254)에서 800 ㎎의 사우리스토락탐을 분리하였다.

(-)-소서네올

¹H-NMR (CD₃OD, 500 MHz) δ 7.00-6.77 (9H, H-2',2'',5,2,6',6,6'',5',5''), 5.46 (2H, d, J=7.0 Hz, H-7,7'), 4.72 (1H, d, J=6.3 Hz, H-7''), 4.42 (1H, d, J=6.6 Hz, H-8''), 3.89 (3H, s, -OCH₃), 3.86 (3H, s, -OCH₃), 3.82 (3H, s, -OCH₃), 3.81 (3H, s, -OCH₃), 2.30 (2H, m, H-8,8'), 1.10 (3H, d, J=6.2 Hz, H-9''), 0.69 (6H, d, J=6.3Hz, H-9,9')

¹³C-NMR (CD₃OD, 500 MHz) δ 151.5, 150.3, 150.1, 148.7, 147.8, 146.7, 136.8, 135.2, 134.1, 120.9, 120.2, 120.1, 117.8, 115.8, 112.5, 112.1, 111.3, 85.7, 85.4, 81.6,77.9, 56.6, 56.5, 56.4, 44.7, 44.6, 16.5, 14.8, 14.7

사우리스토락탐

¹H-NMR (DMSO-d₆, 300 MHz) : 3.39 (s, 3H, NMe), 4.03 (s, 3H, OMe), 7.30 (s, 1H, H-9), 7.64 (s, 1H, H-2), 7.57 (td, J=7.0, 2.5 Hz, H-6,7), 7.95 (dd, J=7.0, 2.5 Hz, 1H, H-8), 9.12 (dd, J=7.0, 2.5 Hz, 1H, H-5), 10.33 (s, 1H, OH)

¹³C-NMR (DMSO-d₆, 500 MHz) : 26.0 (NMe), 59.4 (OMe), 103.3, 113.5, 120.1, 121.0, 125.4, 126.3, 126.8, 127.3, 128.9, 134.6, 136.8, 148.7, 152.1, 166.7

<시험예 1> 삼백초 추출물, (-)-소서네올 및 사우리스토락탐에 의한 파골 세포의 분화 억제

1) RAW264.7 세포 배양 및 TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase) 염색

파골 세포의 분화모델로서, 다음과 같이 단핵구 세포인 RAW264.7 세포(ATCC TIB-71)에 RANKL을 처리함으로써 파골 세포로 분화시켰다. 우선, RAW264.7 세포를 10 % FBS가 포함된 DMEM 배지에서 배양하였으며, 2일 간격으로 새로운 배지로 교체 하였다. 세포 배양과 관련된 시약은 하이클론(Hyclone)사에서 구입하였다. RAW264.7 세포가 70 % 정도 성장한 후, 트립신을 이용하여 세포를 배양 플레이트에서 분리하고, 이를 96-웰 플레이트의 각 웰에 1 x 10³세포/웰의 농도로 넣었다. 이때, 세포를 부유시키는 배지는 100 ng/㎖의 RANKL(R&D systems) 및 10 % FBS가 포함된 α-MEM(Hyclone)이다. 24시간 후, 삼백초 잎 메탄올(MeOH) 추출물, 다이클로로메탄(MC) 분획, 에틸아세테이트(EA) 분획, 뷰탄올(BuOH) 분획, 물 분획, (-)-소서네올 및 사우리스토락탐을 0, 0.625, 1.25, 2.5, 5 및 10 ㎍/㎖의 농도로 각각 처리한 후 3일 뒤에 백혈구 산 포스파타아제 키트(leukocyte acid phosphatase kit)(Sigma)를 이용하여 TRAP을 염색하고, 그 결과를 도 1 내지 6에 표시하였다.

2) TRAP 활성 측정

파골 세포의 분화시 증가하는 TRAP의 활성도를 측정하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다. 먼저, 세포를 10 % 포르말린으로 10분 동안 고정시킨 후, 95 % 에탄올로 탈수시키고 상온에서 건조하였다. 이후, 10 mM 타르타르산 나트륨과 5 mM p-니트로페닐포스페이트가 첨가된 100 ㎕의 구연산 버퍼(50 mM, pH 4.6)를 각 웰에 첨가한 후 20 내지 30분 동안 반응시켰다. 그 다음, 새로운 96-웰 플레이트에 효소 반응액을 옮기고 100 ㎕의 0.1 N NaOH로 반응을 종결시킨 후 410 ㎚에서 흡광도를 측정하고, 결과를 도 1 내지 6에 나타내었다. TRAP 활성은 흡광도 값을 대조군에 대한 %로 환산하여 나타내었으며, t-테스트로 유의성 검증을 하였다(* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001).

3) 세포 독성 측정

96-웰 플레이트에 4 x 10³세포/웰의 농도로 RAW264.7 세포를 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 이후, 시험 물질을 농도별로 첨가하고 48시간 동안 배양하였다. 세포에 대한 화합물의 독성은 CCK-8 키트(Dojindo)를 사용하여 측정하고 그 결과를 도 6의 A에 표시하였다. 세포 독성은 대조군에 대한 퍼센트로 나타내었으며 t-테스트로 유의성 검증을 하였다(* p < 0.05, ** p < 0.01, ***, p < 0.001).

4) 결과

도 1 내지 3, 도 5 및 도 6에 표시된 결과에서 볼 수 있듯이, 시험 물질 중 삼백초 잎 MeOH 추출물(도 1), MC 분획(도 2), EA 분획(도 3) 및 (-)-소서네올(도 5)을 처리한 경우에는 농도 의존적으로 TRAP 활성 및 발현이 억제되었고, 사우리스토락탐(도 6의 B) 역시 처리 농도가 5 및 10 ㎍/㎖로 높아짐에 따라 TRAP 활성이 억제되는 것을 확인할 수 있다. 이는 상기 물질들이 단핵구 세포가 다핵 파골 세포로 분화되는 것을 억제할 수 있음을 의미한다. 또한, 사이리스토락탐 처리군에 대한 세포독성실험 결과는 이러한 억제효과가 세포독성에 의한 부작용이 아님을 보여준다(도 6의 A). 반면, 도 4의 A 및 도 4의 B에 표시된 바와 같이, BuOH 분획(도 4의 A) 및 물 분획(도 4의 B)에서는 이러한 억제 효과가 나타나지 않았다.

<시험예 2> 사우리스토락탐에 의한 파골 세포 분화 관련 유전자의 발현 변화

사우리스토락탐이 파골 세포 분화 동안에 유도되는 것으로 알려진 3개의 유전자, TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase), MMP-9(matrix metalloproteinase-9), c-Src 티로신 키나아제(tyrosine kinase)의 발현에 어떠한 영향을 끼치는지 알아보기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

시험예 1의 1)과 동일한 방법으로 배양한 RAW264.7 단핵구 세포에 사우리스토락탐을 5 ㎍/㎖ 및 10 ㎍/㎖의 농도로 1시간 동안 각각 처리한 후, RANKL을 100 ng/ml의 양으로 처리하여 파골 세포 분화를 유도하고 1일차 및 4일차에 상기 유전자 발현 양상을 실시간 RT-PCR로 평가하였다.

1) 실시간 RT-PCR

배양된 세포의 총 RNA를 트리졸 시약(Life Technologies)으로 추출한 후, 1 ㎍의 RNA와 1 μM의 올리고-dT15 프라이머를 사용하여 옴니스크립트 역 전사효소(Omniscript Reverse Transcriptase)(Qiagen)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 배양액을 이용하여 50분의 1로 희석한 후, 브릴리언트 SYBR 그린 마스터 믹스(Brilliant SYBR Green Master Mix)(Stratagene)와 프라이머 20 pmole을 사용하여 스트라타진(Stratagene) Mx3000P 기기로 PCR을 수행하였다. 이때, 사용된 프라이머는 다음과 같다:

(1) TRAP

5′-ACACAGTGATGCTGTGTGGCAACTC-3′(정방향; 서열번호 1)

5′-CCAGAGGCTTCCACATATATGATGG-3′(역방향; 서열번호 2)

(2) MMP-9

5′-AGTTTGGTGTCGCGGAGCAC-3′(정방향; 서열번호 3)

5′-TACATGAGCGCTTCCGGCAC-3′(역방향; 서열번호 4)

(3) c-Src 티로신 키나아제

5′-CCAGGCTGAGGAGTGGTACT-3′(정방향; 서열번호 5)

5′-CAGCTTGCGGATCTTGTAGT-3′(역방향; 서열번호 6)

(4) GAPDH

5′-GGCCTCTCTTGCTCAGTGTCC-3′(정방향; 서열번호 7)

5′-CTGCACCACCAACTGCTTAG-3′(역방향; 서열번호 8)

PCR 반응은 94℃에서 3분간 초기 변성한 후, 94℃에서 40초간 변성, 60℃에서 40초간 어닐링 및 72℃에서 1분간 연장하는 사이클을 40회 반복하고, 마지막 연장을 72℃에서 5분 동안 수행하였다. 증폭된 산물을 2^-△△CT 방법(Livak 등, Methods 25(4), 402-408, 2001)에 의해 GAPDH로 보정하여 수치화하였으며 대조군에 대한 상대적 비율로 나타내었다. 유의성 검증은 t-테스트로 수행하였으며, 결과는 하기 표 1 내지 3에 나타내었다(* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001). 표 1 내지 3은 순서대로 RANKL과 사우리스토락탐을 함께 처리한 실험군에서의 TRAP, MMP-9 및 c-Src 티로신 키나아제의 발현량 변화를 아무것도 처리하지 않은 대조군 에서의 유전자 발현량의 변화에 대한 비율인 FC(fold change)로 나타내었으며, 하기 표 1 내지 3에서 (A)는 분화 1일차인 경우를 나타내고 (B)는 분화 4일차인 경우를 나타낸다.

2) 결과

표 1 내지 3에 표시된 결과에서 볼 수 있듯이, TRAP, MMP-9 및 c-Src 티로신 키나아제 유전자는 RANKL의 처리에 의해 분화 1일차 및 4일차에 발현량이 크게 증가하였으나, 사우리스토락탐을 첨가한 경우에는 세가지 유전자의 발현이 모두 강하게 저해되었다. 이러한 결과로부터 삼백초 추출물로부터 분리한 사우리스토락탐이 파골 세포의 분화 시 유도되는 유전자들의 발현을 억제함으로써 단핵구 세포의 다핵 파골 세포로의 분화를 억제할 수 있다는 것을 알 수 있다.

<시험예 3> 사우리스토락탐에 의한 파골 세포의 골 흡수 활성 억제

1) 골 흡수 함요 분석

골 흡수 함요 분석(Resorption pit assay)을 이용하여 사우리스토락탐이 파골 세포의 골 흡수 활성에 미치는 영향을 조사하였다. 골 흡수 함요 분석은 비디 바이오코트 골 다중실험 슬라이드(BD BioCoat Osteologic MultiTest slide)에서 수행되었다. 먼저, RAW264.7 세포를 RANKL(100 ng/㎖)과 함께 10 % FBS가 포함된 α-MEM(Hyclone) 배지에서 1일 동안 배양한 후, 사우리스토락탐을 0, 2.5 및 5 ㎍/㎖의 농도로 처리하였다. 배양 10일차에 6 % NaOCl 100 ㎕로 세포를 5분 동안 용균시키고 증류수로 3회 세척한 후, 현미경 상에서 골 흡수 정도를 관찰하였다(도 7).

2) 결과

도 7에 표시된 결과에서 볼 수 있듯이, RANKL을 처리하였을 때에는 골 흡수가 많이 진행되는 반면, 세포 분화 시 사우리스토락탐을 첨가한 경우에는 골 흡수 활성이 억제되었다. 이러한 결과는 파골 세포로의 분화가 억제됨에 따라 파골 세포에 의한 골 흡수 활성 역시 억제되었음을 의미한다.

<시험예 4> 사우리스토락탐에 의한 파골 세포로의 분화 억제 및 ERK 신호 전달 억제

마우스의 조혈모세포를 이용하여 사우리스토락탐의 파골 세포 분화억제 효과를 하기와 같은 방법으로 확인하였다.

1) 마우스의 조혈모세포 분리 및 파골 세포로의 분화

6주 내지 7주령인 DDY 수컷 마우스(중앙실험동물(주))를 질소로 희생시킨 후, 70 % 에탄올로 소독한 넓적 다리(뒷다리)의 대퇴골을 분리하여 항생제(200 units/㎖)가 포함된 PBS 용액 내에 방치하였다. 용액 내에 담겨져 있는 대퇴골에서 남아있는 조직을 제거하고 이를 새로운 PBS 용액으로 세척한 후, 양끝의 골단을 제거하고 10 % FBS가 포함된 α-MEM(Hyclone) 배지가 들어 있는 주사기를 이용하여 골수를 밀어낸 다음 밀어낸 골수를 페트리디시에 모아 단일 세포가 되도록 처리하였다. 그 다음, M-CSF 5 ng/㎖를 처리하고 하룻 동안 배양한 후, 부유되어 있는 세포를 모아 이를 조혈모세포로 사용하였다. 얻어진 조혈모세포를 3 × 10⁵ 세포/웰의 농도로 96 웰/플레이트의 각 웰에 넣어 배양하였고, M-CSF 30 ng/㎖ 및 RANKL 100 ng/㎖를 처리하여 파골 세포로 분화시켰다. TRAP 염색 및 활성 분석, 및 골 흡수 함요 분석을 시험예 1 및 시험예 3과 각각 동일하게 수행하였으며, 결과는 도 8 및 도 9에 표시하였다.

2) 웨스턴 블럿 분석

3일 동안 30 ng/㎖의 M-CSF를 포함하는 10 % FBS α-MEM(Hyclone)배지에서 배양된 조혈모세포의 배지를 M-CSF가 없는 10 % FBS α-MEM(Hyclone)배지로 교체한 후, 2시간 동안 사우리스토락탐(2.5, 10 ㎍/㎖)을 처리하고, 다시 RANKL 100 ng/㎖를 30분 동안 처리한 후, RIPA 용액(Elpis Biotech, 한국)을 이용하여 세포를 용균시켜 세포 내 단백질을 모았다. 단백질의 양은 BCA 키트(Bio-Rad)를 이용하여 정량하고, 단백질 10 ㎍/레인을 12 % SDS-젤에서 분리하였으며, 이를 니트로셀룰로오즈(NC) 막에 전달하였다. 10 % 탈지유로 차단한 후, 막을 ERK(externally regulated kinases), p-ERK(phosphorylated externally regulated kinases)에 대한 항체(SantaCruz, 미국)와 반응시켜, 사우리스토락탐이 RANKL에 의한 ERK의 활성에 미치는 영향을 조사하고, 그 결과를 도 10에 표시하였다.

3) 결과

도 8 및 도 9에 표시된 결과에서 볼 수 있듯이, 사우리스토락탐은 마우스 조혈모세포가 파골 세포로 분화되는 것을 농도 의존적으로 억제하였으며, 골 흡수 또한 효과적으로 억제하였음을 알 수 있다.

한편, RANKL에 의한 ERK 활성 촉진은 파골 세포 분화를 유도하는 중요한 신호 전달 체계라는 보고(Lee et al., Bone 30: 71-77, 2002)가 있으며, 이에 따라 ERK 활성은 파골 세포 분화를 억제할 수 있는 치료적 타겟으로 여겨지고 있다. 도 10에 표시한 결과에서 볼 수 있듯이, RANKL에 의해 ERK의 인산화가 매우 높게 유도되지만, 사우리스토락탐을 2.5 ㎍/㎖ 이상의 농도로 처리한 경우에는 ERK의 인산화가 억제되는 것을 확인할 수 있다. 이러한 결과는 사우리스토락탐이 마우스의 조혈모세포가 파골 세포로 분화될 때 강하게 활성화되는 ERK 신호 전달 체계를 효과적으로 억제하며, 결과적으로 파골 세포로의 분화를 억제하는 탁월한 파골 세포 분화억제효능을 갖고 있음을 나타낸다.

<제조예 1> 산제

하기 성분을 혼합한 후 통상의 산제 제조방법에 따라서 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다:

삼백초 건조 추출물 또는 활성 화합물 2 g

유당 1 g

<제조예 2> 정제

하기 성분을 혼합한 후 통상의 정제 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다:

삼백초 건조 추출물 또는 활성 화합물 100 ㎎

옥수수 전분 100 ㎎

유당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

<제조예 3> 캡슐제

하기 성분을 혼합한 후 통상의 캡슐제 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다:

삼백초 건조 추출물 또는 활성 화합물 100 ㎎

옥수수 전분 100 ㎎

유당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

<제조예 4> 선식

현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 만들었다. 검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 만들었다. 본 발명의 삼백초 추출물 또는 활성 화합물을 진공 농축기에서 감압 농축하고, 분무 열풍건조기로 건조하여 얻은 건조물을 분쇄기로 입도 60 메쉬로 분쇄하여 삼백초 추출물 또는 활성 화합물의 건조 분말을 얻었다.

상기에서 제조한 곡물류, 종실류, 및 삼백초 추출물 또는 활성 화합물의 건조 분말을 다음의 비율로 배합하여 과립을 만들었다.

곡물류 : 현미 30 중량%, 율무 15 중량%, 보리 20 중량%, 찹쌀 9 중량%,

종실류 : 들깨 7 중량%, 검정콩 8 중량%, 검정깨 7 중량%,

삼백초 추출물 건조 분말 3 중량%, 영지 0.5 중량%, 지황 0.5 중량%

<제조예 5> 츄잉껌

껌 베이스 20 중량%, 설탕 76.9 중량%, 향료 1 중량% 및 물 2 중량%와 본 발명의 삼백초 추출물 또는 활성 화합물 0.1 중량%를 배합하여 통상의 방법으로 츄잉껌을 제조하였다.

<제조예 6> 캔디

설탕 60 중량%, 물엿 39.8 중량% 및 향료 0.1 중량%와 본 발명의 삼백초 추출물 또는 활성 화합물 0.1 중량%를 배합하여 통상의 방법으로 캔디를 제조하였다.

<제조예 7> 비스켓

박력 1급 25.59 중량%, 중력 1급 22.22 중량%, 정백당 4.80 중량%, 식염 0.73 중량%, 포도당 0.78 중량%, 팜쇼트닝 11.78 중량%, 암모늄 1.54 중량%, 중조 0.17 중량%, 중아황산나트륨 0.16 중량%, 쌀가루 1.45 중량%, 비타민 B₁0.0001 중량%, 비타민 B₂0.0001 중량%, 밀크향 0.04 중량%, 물 20.6998 중량%, 전지분유 1.16 중량%, 대용분유 0.29 중량%, 제1인산칼슘 0.03 중량%, 살포염 0.29 중량% 및 분무유 7.27 중량%와 본 발명의 삼백초 추출물 또는 활성 화합물 1 중량%를 배합하여 통상의 방법으로 비스켓을 제조하였다.

<제조예 8> 건강 음료

꿀 0.26 중량%, 치옥토산아미드 0.0002 중량%, 니코틴산아미드 0.0004 중량%, 염산리보플라빈나트륨 0.0001 중량%, 염산피리독신 0.0001 중량%, 이노시톨 0.001 중량%, 오르트산 0.002 중량% 및 물 98.7362 중량%와 본 발명의 삼백초 추출물 또는 활성 화합물 1 중량%를 배합하여 통상의 방법으로 건강 음료를 제조하였다.

<제조예 9> 건강보조식품

스피루리나 55 중량%, 구아검효소 분해물 10 중량%, 비타민 B₁염산염 0.01중량%, 비타민 B₆ 염산염 0.01 중량%, DL-메티오닌 0.23 중량%, 스테아린산 마그네슘 0.7 중량%, 유당 22.2 중량% 및 옥수수전분 1.85 중량%와 본 발명의 삼백초 추출물 또는 활성 화합물 10 중량%를 배합하여 통상의 방법으로 정제형 건강보조식품을 제조하였다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 (-)-소서네올[(-)-saucerneol], 사우리스토락탐(sauristolactam), 이들의 혼합물 또는 이를 포함하는 삼백초 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물은 파골 세포의 증식을 효과적으로 억제시키므로 골다공증 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

화학식 2의 사우리스토락탐(sauristolactam) 또는 이를 포함하는 삼백초 추출물을 유효성분으로 함유하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학 조성물:

[화학식 2]
제 1 항에 있어서,

상기 삼백초 추출물이 C_1-4알콜 및 이의 수용액, 다이클로로메탄, 에틸아세테이트 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 용매를 사용하여 추출되는 것임을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 1 항에 있어서,

사우리스토락탐을 유효성분으로 함유하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
사우리스토락탐 또는 이를 포함하는 삼백초 추출물을 유효성분으로 함유하는 골다공증 예방용 건강 증진 식품.
제 4 항에 있어서,

사우리스토락탐 또는 이를 포함하는 삼백초 추출물의 함량이 0.01 내지 30 중량 % 범위인 것을 특징으로 하는, 골다공증 예방용 건강 증진 식품.
제 4 항에 있어서,

상기 삼백초 추출물이 C_1-4알콜 및 이의 수용액, 다이클로로메탄, 에틸아세테이트 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 용매를 사용하여 추출되는 것임을 특징으로 하는, 골다공증 예방용 건강 증진 식품.
제 4 항에 있어서,

상기 식품이 음료의 형태인 것을 특징으로 하는, 골다공증 예방용 건강 증진 식품.