KR100844376B1

KR100844376B1 - 육두구 추출물 또는 이로부터 분리된 활성 화합물을포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR100844376B1
Application number: KR1020070012901A
Authority: KR
Inventors: 김영섭; 유시용; 연규환; 홍경식; 민용기; 김성환; 이병회; 최연희; 최재석
Original assignee: 한국화학연구원
Priority date: 2007-02-07
Filing date: 2007-02-07
Publication date: 2008-07-07
Also published as: WO2008096998A1

Abstract

본 발명은 마칠린 A(machilin A), 마셀리그난(macelignan), 마칠린 F(machilin F), 넥탄드린 B(nectandrin B), 사프롤(safrole), 리카린 A(licarin A), 리카린 B(licarin B), 미리스타게놀 A(myristagenol A), 메조-디하이드로구아이아레트 산(meso-dihydroguaiaretic acid), 이들의 혼합물 또는 이를 포함하는 육두구 추출물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 조성물은 조골 세포의 활성을 촉진시키므로, 골다공증 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

육두구 추출물 또는 이로부터 분리된 활성 화합물을 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물 {COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING OSTEOPOROSIS COMPRISING AN EXTRACT OF MYRISTICA FRAGRANS OR ACTIVE COMPOUNDS ISOLATED THEREFROM}

도 1은 육두구 메탄올 추출의 용매에 따른 분획 과정을 도식화하여 나타낸 것이고,

도 2는 육두구 추출물의 에틸아세테이트 분획으로부터 활성성분을 분리 정제하는 과정을 도식화하여 나타낸 것이고,

도 3a는 알리자린 레드 에스(alizarin red S) 염색법을 이용하여 육두구 추출물에 의해 형성된 칼슘을 염색한 것이고,

도 3b는 육두구 추출물에 의해 형성된 칼슘의 양을 측정한 것이고,

도 4는 육두구 추출물에서 분리한 화합물들에 의해 형성된 칼슘의 양을 측정한 것이고,

도 5는 조골 세포에 마칠린 A(machilin A)를 처리한 후 조골 세포의 세포수 증가를 나타낸 그래프이고,

도 6a는 마칠린 A가 조골 세포의 분화 마커인 알칼라인 포스파타아 제(alkaline phosphatase, ALP)의 활성에 미치는 영향을 그래프로 나타낸 것이고,

도 6b는 마칠린 A를 조골 세포에 처리한 후 ALP의 발현량 변화를 측정하기 위하여 ALP를 염색한 결과이고,

도 7a는 마칠린 A에 의해 형성된 칼슘의 양을 측정한 결과이고,

도 7b는 마칠린 A에 의해 형성된 칼슘을 아리자린 레드 에스 염색법을 이용하여 염색한 결과이고,

도 8은 마칠린 A에 의한 조골 세포의 무기질화 정도를 확인하기 위해 본코자(von Kossa) 염색법으로 세포를 염색한 결과이고,

도 9a는 마칠린 A에 의해 유도되는 조골 세포의 분화와 관련된 유전자의 발현 양상을 나타낸 그래프이고,

도 9b는 마칠린 A에 의해 유도되는 조골 세포의 무기질화와 관련된 유전자의 발현 양상을 나타낸 그래프이고,

도 10은 마칠린 A에 의해 유도되는 미토겐 활성 단백질(mitogen activated protein; MAP) 키나아제의 활성화 정도를 측정한 결과이다.

본 발명은 육두구(Myristica fragrans) 추출물 또는 이로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 포함하는 골다공증의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

뼈의 항상성은 파골 세포(osteoclast)에 의한 골 흡수(bone resoprtion)와 조골 세포(osteoblast)에 의한 골 형성(bone formation)의 대등한 작용에 의한 리모델링 과정(bone remodeling)이 지속적으로 조절되어 유지된다. 그러나, 파골 세포의 지나친 활성이나 조골 세포 활성의 저하는 리모델링 과정의 불균형을 초래하여, 골다공증(osteoporosis)과 같은 성인 골격계 질환을 유도한다. 이러한 불균형을 해소하기 위해서 일반적으로 파골 세포의 지나친 활성을 억제하거나, 조골 세포의 활성을 촉진시키거나, 또는 파골 세포의 활성을 억제하고 조골 세포의 활성을 촉진하는 방법이 사용되고 있으며, 이들은 골다공증의 치료에 대한 효과적인 치료적 접근 방법으로 여겨지고 있다.

조골 세포는 간엽줄기세포에서 기원하여 형성되는데 조골 세포의 분화에 의해 형성되는 칼슘 등을 포함한 무기질화는 뼈의 세기를 유지시켜줄 수 있을 뿐만 아니라, 신체 전체의 칼슘 및 호르몬 대사의 항상성에도 매우 중요한 기능을 하고 있다. 조골 세포의 분화에 의한 칼슘 형성은 비타민 D 및 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone) 등에 의해 조절되며, 세포 내에서 뼈형태 형성단백질(bone morphogenetic protein; BMP), Wnt, MAP 키나아제, 칼시뉴린-칼모듈린 키나아제(calcineurin-calmodulin kinase), NF-κB, AP-1 등의 다양한 신호 전달 체계의 상호 작용(cross-talk)에 의해 조골 세포의 분화에 관련된 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase; ALP)가 초기 분화단계에서 합성된 후, 무기질화에 관련된 오스테오폰틴(osteopontin), 오스테오칼신(osteocalcin), 타입 I 콜라겐 등이 합성됨으로써 조골 세포의 분화에 의한 골 형성이 이루어진다고 알려져 있다.

이와 같은 조골 세포의 활성 촉진은 일반적으로 환자에게 장기 투여하여야 하기 때문에 독성이 적고 경구투여가 가능한 것이어야 가장 이상적인 치료제로 사용될 수 있다. 따라서, 조골 세포의 활성 촉진제로서 독성이 없는 약제 및 기능성 식품의 개발이 요구되고 있다.

한편 육두구(Myristica fragrans)는 육두구과(Myristicaceae)에 속하는 상록교목으로 열매를 따서 씨를 꺼내어 말린 후 검은색의 단단한 씨껍질을 벗기고 석회즙에 하룻밤 담갔다가 상온에서 건조시킨 것을 말한다.

육두구에 대한 연구로는 암 세포주에 대한 세포 독성 효과[Lee 등, Kor. J. Pharmacogn. 37(3), 206-211, 2006]; 항균 및 항산화 효과[Singh 등, Journal of Food Science, 70(2), 141-148, 2005]; 및 항균 효과[Orabi 등, Journal of Natural Products, 54(3), 856-859, 1991; Narasimhan 등, journal of Medicinal Food, 9(3), 395-399, 2006; Miyazawa 등, Natural Product Letters, 8(4), 271-273, 1996]; 간장의 해독효과(Singh 등, Food and Chemical Toxicologyl, 31(7), 517-521, 1993); 치매와 관련이 있는 뇌 콜린스테라아제 저해(Dhingra 등, Journal of Medicinal Food, 9(2), 281-283, 2006); 및 항불안 효과(Sonavane 등, Biochemistry and Behavior, 71(1-2), 239-244, 2002) 등이 보고되어 있다. 그러나, 아직까지 육두구 추출물의 조골 세포의 활성 촉진에 대한 연구는 보고된 바가 없다.

이에, 본 발명자들은 육두구 추출물이 조골 세포의 활성을 촉진할 수 있어 골다공증 및 관련 골질환의 예방 및 치료의 용도로 사용될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 골다공증 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 골다공증을 예방하는 건강 증진용 식품을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1의 마칠린 A(machilin A), 화학식 2의 마셀리그난(macelignan), 화학식 3의 마칠린 F(machilin F), 화학식 4의 넥탄드린 B(nectandrin B), 화학식 5의 사프롤(safrole), 화학식 6의 리카린 A(licarin A), 화학식 7의 리카린 B(licarin B), 화학식 8의 미리스타게놀 A(myristagenol A), 화학식 9의 메조-디하이드로구아이아레트 산(meso-dihydroguaiaretic acid), 이들의 혼합물 또는 이를 포함하는 육두구(Myristica fragrans) 추출물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다:

본 발명에 따른 육두구 추출물은 육두구 또는 이의 건조물을 용매 추출함으로써 제조할 수 있다. 구체적으로는, 응달에서 건조하여 잘게 자른 육두구에 육두 구 부피의 2 내지 200배, 바람직하게는 10 내지 30배의 유기용매를 가하고, 10 내지 30℃에서 1 내지 20일간, 바람직하게는 5 내지 10일간 추출하고 여과한 후 감압 농축함으로써 육두구 추출물을 제조할 수 있다.

상기 용매로는 메탄올, 메탄올 수용액, 에탄올, 에탄올 수용액 및 뷰탄올과 같은 C_1-4 알콜 및 이의 수용액, 다이클로로메탄, 에틸아세테이트 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 유기 용매를 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 80 내지 100% 메탄올 또는 메탄올 수용액을 사용할 수 있다.

또한, 상기와 같이 얻어진 육두구 추출물을 뷰탄올 또는 에틸아세테이트로 재추출할 수 있으며, 바람직하게는 에틸아세테이트로 재추출할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 육두구 또는 이의 건조물을 100% 메탄올을 사용하여 약 7일간 냉침시킨 후 여과하고 여액을 감압 농축하여 메탄올 추출물을 얻고, 이 메탄올 추출물을 증류수에 현탁한 후 동량의 에틸아세테이트로 분획하고 감압 농축함으로써 육두구 추출물을 얻을 수 있다.

또한, 상기 육두구 추출물로부터 상기 화학식 1 내지 9의 화합물을 크로마토그래피(chromatography)에 의해 분리 및 정제할 수 있다. 상기 크로마토그래피는 역상 또는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 1 내지 2회 수행하는 것이 바람직하다. 이동상으로는 노말헥산/에틸아세테이트 (100:1 ~ 0:1) 또는 메탄올/물 (50% MeOH ~ 100% MeOH)를 사용할 수 있다. 이때, 사용되는 용매는 비극성에서 극성 또는 극성에서 비극성으로 순차적으로 변화시킴으로써 농도구배 용출방식(gradient elution) 으로 활성 물질들을 용출 분리하며, 수집된 물질의 조골 세포 촉진효과를 측정하여 원하는 활성 분획을 수득할 수 있다. 또한, 필요에 따라 상기 화학식 1 내지 9의 화합물들을 화학적으로 합성할 수도 있다.

본 발명에 따른 육두구 추출물 또는 이로부터 분리한 상기 화합물들은 통상적인 방법에 따라 약제학적으로 허용되는 적절한 담체 또는 부형제와 혼합하거나 희석제로 희석하여 상기한 기능을 갖는 약학 조성물로 제조될 수 있다. 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리쓰리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 아울러, 본 발명의 약학 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 제형은 정제, 알약, 분말, 새세이 (sachet), 엘릭서 (elixir), 현탁액, 에멀젼, 용액, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말 등의 형태일 수 있다.

또한, 본 발명의 약학 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 통상적인 1일 투여량 은 유효성분을 기준으로 할 때 육두구 추출물은 10 내지 100 ㎎/㎏ 체중, 바람직하게는 10 내지 30 ㎎/㎏ 체중의 범위이고, 이로부터 분리한 상기 화합물은 1 내지 30 ㎎/㎏ 체중, 바람직하게는 1 내지 10 ㎎/㎏ 체중의 범위이며, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 활성성분의 실제 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중, 및 질환의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1 내지 9의 화합물, 이들의 혼합물 또는 이를 포함하는 육두구 추출물을 포함하는 골다공증 예방용 건강 증진용 식품을 제공한다.

상기 건강 증진용 식품으로는, 예를 들면 각종 식품류, 음료수, 스넥류, 과자류, 껌류, 아이스크림류, 티백차, 인스턴트차, 과립, 향료, 비타민 복합제 및 그 밖의 건강보조식품류 등이 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 육두구 추출물 또는 이로부터 분리된 상기 화합물을 식품 제조 시 원료 물질에 첨가하거나 조리된 식품에 적절히 혼합하여 상기 건강 증진용 식품을 제조할 수 있으며, 이 때 최종적으로 제조된 식품 중에 상기 화학식 1 내지 9의 화합물, 이들의 혼합물 또는 이를 포함하는 육두구 추출물의 함량은 0.01 내지 30 중량% 범위일 수 있다.

본 발명의 약학 조성물 또는 건강 증진용 식품은 목적하는 효과를 상승시키거나 보완하기 위해 약학적으로 허용되는 다른 생약재 또는 이의 추출물을 추가로 포함할 수 있으며, 그러한 생약재의 대표적인 예로는 희렴, 초두구, 연자육 및 정향피 등을 들 수 있다. 상기 생약재는 조성물의 총 중량을 기준으로 0.01 내지 50 중량%의 양으로 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명을 한정하는 것은 아니다.

실시예 1: 육두구 추출물의 제조

경동시장에서 구입한 건조된 육두구 1.8 ㎏을 5ℓ 메탄올에 7일간 냉침시킨 후 감압 농축하는 과정을 3회 반복하여 메탄올 추출물 300 g을 얻었다. 상기 메탄올 추출물을 증류수 2ℓ에 현탁시킨 후, 동량의 에틸아세테이트로 추출하는 과정을 3회 반복하여 얻어진 추출액을 다시 감압 농축하여 에틸아세테이트 분획 255 g을 얻었으며, 여액을 동량의 노말-뷰탄올로 3회 반복 추출하고 추출액을 감압 농축하여 뷰탄올 분획 6 g을 얻은 후 남은 물층은 동결 건조시켰다.

실시예 2: 육두구 추출물에서 마칠린 A(machilin A) 의 분리 정제 및 동정

실시예 1에서 얻은 육두구 에틸아세테이트 추출물 255 g 중에서 60 g은 노말헥산/에틸아세테이트 혼합용매(이동상)를 3 ㎖/분의 유속으로 흘려주면서 농도 구 배 용출방식(10:1~0.1)으로 실리카 겔(70-230 메쉬, 2 ㎏) 컬럼(φ=10.0 × 28 ㎝) 크로마토그라피를 실시하여 3ℓ씩 5개의 분획(제1 내지 제5분획)으로 나누었다. 제1분획(7.9 g)을 재차 실리카겔(70-230 메쉬, 1 ㎏) 컬럼(φ=7.0 × 28 ㎝) 크로마토그래피(이동상: 노말헥산/에틸아세테이트(100:1), 유속: 3 ㎖/분)를 실시하여 3ℓ씩 2개의 분획(제11 및 제12분획)으로 나누었다. 제12분획을 80% 메탄올(이동상)로 역상 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 930 ㎎의 마칠린 A를 황색 오일로 분리하였다.

EI-MS m/z : 326 [M]⁺; ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) : δ 0.75 (6H, d, J = 6.7 Hz, H-9, 9'), δ 1.67 (2H, m, H-8, 8'), δ 2.29 (2H, dd, J = 13.4, 9.3 Hz, H-7a, 7'a), δ 2.65 (2H, dd, J = 13.4, 4.8 Hz, H-7b, 7'b), δ 5.82 (4H, s, -OCH₂O- ×2), δ 6.52 (2H, dd, J=7.8, 1.6Hz, H-6, 6'); ¹³C-NMR (125 MHz, CDCl₃) : δ 135.6 (C-1, 1'), 107.9 (C-2, 2'), 145.4 (C-3, 3'), 147.4 (C-4, 4'), 109.3 (C-5, 5'), 121.7 (C-6, 6'), 39.4 (C-7, 7'), 39.0 (C-8, 8'), 16.1 (C-9, 9'), 100.6 (-OCH₂O-).

실시예 3: 육두구 추출물에서 마셀리그난(macelignan)의 분리 정제 및 동정

실시예 2의 제3분획(13.6g)을 노말헥산/에틸아세테이트 혼합용매(5:1)를 이동상으로 하여 3 ㎖/분의 유속으로 흘려주면서 실리카 겔(70-230 메쉬, 1.2 ㎏) 컬럼(φ=7.0 × 32 ㎝) 크로마토그라피를 실시하여 5ℓ씩 2개의 분획(제31 및 제32 분획)으로 나누었다. 제31분획을 감압농축하는 과정중 무색 결정의 마셀리그난 3.9 g을 분리하였다.

m.p. 70-72 ℃, [α]_D ²⁰= +5.28° (c = 1.8, CHCl₃); EI-MS m/z (rel. int.): 328 [M]⁺(11), 137 [C₈H₉O₂]⁺ (100) and 135 [C₈H₇O₂]⁺ (68); ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) : δ 6.87 (1H, d, J = 7.8 Hz, H-5), δ 6.76 (1H, d, J=7.8 Hz, H-5'), δ 6.66 (1H, d, J = 1.8 Hz, H-2), δ 6.63 (1H, d, J = 1.8 Hz, H-2'), δ 6.64 (1H, dd, J = 7.8, 1.8 Hz, H-6), δ 6.70 (1H, dd, J = 7.8, 1.8 Hz, H-6'), δ 5.95 (2H, s, O-CH₂-O), δ 5.32 (1H, s, 4-OH), δ 3.87 (3H, s, -OCH₃), δ 2.76 and δ 2.30 (each 2H, m, H-7, 7'), δ 1.78 (2H, m, H-8, 8'), δ 0.88 (6H, m, H-9, 9'); ¹³C-NMR (125 MHz, CDCl₃) : δ 135.6 (C-1), 107.8 (C-2), 147.4 (C-3), 145.5 (C-4), 109.3 (C-5), 121.7 (C-6), 39.0 (C-7), 39.3 (C-8), 16.1 (C-9), 133.6 (C-1'), 111.4 (C-2'), 146.2 (C-3'), 143.5 (C-4'), 114.0 (C-5'), 121.6 (C-6'), 38.7 (C-7'), 39.2 (C-8'), 16.0 (C-9'), 55.7 (-OCH₃), 100.6 (-OCH₂O-).

실시예 4: 육두구 추출물에서 마칠린 F(machilin F)의 분리 정제 및 동정

실시예 2의 제4분획(6.7g)을 노말헥산/에틸아세테이트 혼합용매(5:1)를 이동상으로 하여 3㎖/분의 유속으로 흘려주면서 실리카 겔(70-230 메쉬, 420 g) 컬럼(φ=4.0 × 35 ㎝) 크로마토그라피를 실시하여 2ℓ씩 4개의 분획 (제41분획 내지 제44분획)으로 나누었다. 다시 제43분획(670 ㎎)을 80% 메탄올을 이동상으로 하여 역상 컬럼(φ=2.0 × 25 ㎝) 크로마토그래피를 실시하여 200 ㎖씩 5개의 분획(제431분획 내지 제435분획)으로 나누고 제432분획을 감압농축 중 무색 결정의 마칠린 F 60 ㎎을 분리하였다.

m.p. 102-104℃, [α]_D +52.0° (c = 0.79, MeOH); EI-MS m/z : 326 [M]⁺; ¹H-NMR (CDCl₃,300 MHz) : δ 1.37 (3H, d, J = 6.8 Hz, CH₃-8), 1.86 (3H, d, J = 6.5 Hz, CH₃-9'), 3.44 (1H, m, H-8), 3.88 (6H, s, -OCH₃×2), 5.09 (1H, d, J = 9.4 Hz, H-7), 5.65 (1H, s, OH), 6.06 - 6.16 (1H, m, H-8'), 6.33 (1H, br-d, J = 15.7 Hz, H-7'), 6.76 - 7.00 (5H, m, H-aromatic); ¹³C-NMR (CDCl₃, 125 MHz) : δ 108.9 (C-2), 146.7 (C-3), 145.7 (C-4), 114.1 (C-5), 119.9 (C-6), 93.8 (C-7), 45.6 (C-8), 132.2 (C-1'), 113.3 (C-2'), 133.3 (C-3'), 146.6 (C-4'), 144.2 (C-5'), 109.2 (C-6'), 130.9 (C-7'), 123.5 (C-8'), 18.4 (C-9'), 17.6 (-CH₃), 55.9 (OCH₃), 56.0 (OCH₃).

실시예 5: 육두구 추출물에서 넥탄드린 B( nectandrin B)의 분리 정제 및 동정

실시예 2의 제5분획(11.4 g)을 분취용 HPLC를 이용하여 60~100% 메탄올(이동상)을 3 ㎖/분의 유속으로 흘려주면서 역상 크로마토그라피 (250 × 40 ㎜ i.d Merck, 40-63 ㎛)를 실시하여 820 ㎎의 넥탄드린 B를 무색 오일로 분리하였다.

[α]_D: 0°(c = 0.4, CHCl₃); EI-MS m/z : 344.2 [M]⁺; ¹H-NMR (CDCl₃, 300 MHz): δ 1.03 (6H, d, J = 6.6 Hz, CH₃-3, 4), 2.32 (2H, m, H-3, 4), 3.88 (6H, s, OCH₃-3', 3''), 4.49 (2H, d, J = 6.4 Hz, H-2, 5), 5.57 (2H, s, HO-4', 4''), 6.80 - 6.95 (6H, m, H-2', 5', 6', 2'', 5'', 6''); ¹³C-NMR (CDCl₃, 125 MHz) : δ 87.5 (C-2, 5), 44.5 (C-3, 4), 134.3 (C-1', 1''), 109.2 (C-2', 2''), 146.6 (C-3', 3''), 145.2 (C-4', 4''), 114.1 (C-5', 5''), 119.2 (C-6', 6''), 13.1 (CH₃-3, 4), 55.8 (OCH₃).

실시예 6: 육두구 추출물에서 사프롤(safrole)의 분리 정제 및 동정

실시예 2와 동일한 방법으로 크로마토그래피를 실시하여, 제11분획으로서 미황색 오일상태의 사프롤(3.2 g)을 얻었다.

EI-MS m/z : 162 [M]⁺; ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) : δ 3.22 (2H, d, J = 6.6 Hz, H-7), δ 5.00 (1H, m, H-9a), δ 5.02 (1H, m, H-9b), δ 5.85 (1H, m, H-8), δ 5.83 (2H, s, -OCH₂O-), δ 6.58 (1H, J = 8.1 Hz, H-6), δ 6.63 (1H, m, H-2), δ 6.67 (1H, d, J = 8.1 Hz, H-5); ¹³C-NMR (125 MHz, CDCl₃) : δ 133.4 (C-1), 108.0 (C-2), 147.3 (C-3), 145.5 (C-4), 108.8 (C-5), 121.1 (C-6), 40.0 (C-7), 137.8 (C-8), 115.4 (C-9), 100.7 (-OCH₂O-)

실시예 7: 육두구 추출물에서 리카린 A(licarin A)의 분리 정제 및 동정

실시예 4와 동일한 방법으로 크로마토그래피를 실시하여, 제434분획으로서 무색 오일의 리카린 A(150 ㎎)를 얻었다.

[α]_D: 0° (c = 0.1, CHCl₃); EI-MS m/z : 342.15 [M]⁺;¹H-NMR (CDCl₃, 300 MHz) : δ 1.00 (6H, d, J = 6.6 Hz, Me-3, 4), 2.26 (2H, m, H-3, 4), 3.88 (3H, s, CH₃O-3''), 4.45 (2H, d, J = 5.1 Hz, H-2, 5), 5.66 (1H, s, HO-4''), 5.95 (2H, s, -OCH₂O-), 6.77 - 6.97 (6H, m, H-Ar); ¹³C-NMR (CDCl₃, 125 MHz) : 136.2 (C-1'), 106.8 (C-2'), 147.8 (C-3'), 146.9 (C-4'), 109.0 (C-5'), 119.6 (C-6'), 87.3 (C-2), 44.5 (C-3), 44.6 (C-4), 87.4 (C-5), 134.0 (C-1''), 108.0 (C-2''), 146.5 (C-3''), 145.0 (C-4''), 114.2 (C-5''), 119.9 (C-6''), 12.8 (Me-3, 4), 55.9 (-OCH₃), 100.9 (-OCH₂O).

실시예 8: 육두구 추출물에서 리카린 B(licarin B)의 분리 정제 및 동정

실시예 2의 제 2분획(19.0 g)을 60% 메탄올(이동상)을 3 ㎖/분의 유속으로 흘려주면서 역상 크로마토그라피(φ=5.0 × 30 ㎝)를 실시하여 140 ㎎의 리카린 B를 황색 오일로 분리하였다.

[α]_D : -45.4° (c = 0.1, CHCl₃); EI-MS m/z: 324 [M]⁺; ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) : δ 1.31 (3H, d, J = 6.8 Hz, H-9), δ 1.79 (3H, d, J= 6.7 Hz, H-9'), δ 3.3 (1H, m, H-8), δ 3.82 (3H, s, -OCH₃), δ 5.02 (1H, d, J = 9.0 Hz, H-7), δ 5.88 (2H, s, -OCH₂O-), δ 6.03 (1H, dq, J = 15.7, 6.7 Hz, H-8'), δ 6.28 (1H, d, J = 15.7 Hz, H-7'), δ 6.70 - 6.86 (5H, m, H-2, 4, 5, 2', 6'); ¹³C-NMR (125 MHz, CDCl₃) : δ 134.3 (C-1), 106.7 (C-2), 147.8 (C-3), 147.5 (C-4), 108.1 (C-5), 121.1 (C-6), 93.3 (C-7), 45.7 (C-8), 17.8 (C-9), 132.2 (C-1'), 113.3 (C-2'), 133.0 (C-3'), 146.5 (C-4'), 144.1(C-5'), 109.4 (C-6'), 130.9 (C-7'), 123.3 (C-8'), 18.3 (C-9'), 56.0 (-OCH₃), 101.0 (-OCH₂O-).

실시예 9: 육두구 추출물에서 미리스타게놀 A(myristagenol A)의 분리 정제 및 동정

실시예 3의 제32분획(5.0 g)을 노말헥산/에틸아세테이트 혼합용매(5:1)를 이동상으로 하여 3 ㎖/분의 유속으로 흘려주면서 실리카 겔(70-230 메쉬, 400 g) 컬럼(φ=4.0 × 32 ㎝) 크로마토그라피를 실시하여 흰색 분말의 미리스타게놀 A 570 ㎎을 분리하였다.

¹H-NMR (300 MHz, acetone-d ₆) : δ 0.62 (3H, d, J = 7.0 Hz, H-9), 0.85 (3H, d, J = 7.0 Hz, H-9'), δ 1.80 (1H, m, H-8), δ 2.38 (1H, m, H-8'), δ 2.13 (1H, dd, J = 12.9, 2.0 Hz, H-7a'), δ 2.95 (1H, dd, J = 12.9, 3.4 Hz, H-7b'), δ 4.45 (1H, dd, J = 9.2, 1.0 Hz, H-7), δ 6.68 (1H, dd, J = 9.0, 1.3 Hz, H-6'), δ 6.80 (1H, dd, J= 8.1, 2.0 Hz, H-6), δ 6.73 (1H, d, J = 9.0 Hz, H-5'), δ 6.76 (1H, d, J = 8.1 Hz, H-5), δ 6.70 (1H, br. s, H-2'), δ 7.01 (1H, d, J = 1.3 Hz, H-2), δ 3.84 (3H, s, -OCH₃), δ 5.94 (2H, s, O-CH₂-O) δ 5.62 (s, Ar-OH); ¹³C-NMR (125 MHz, acetone-d ₆) : δ 138.6 (C-1), 111.5 (C-2), 148.6 (C-3), 148.5 (C-4), 115.6 (C-5), 121.0 (C-6), 77.4 (C-7), 46.4 (C-8), 12.3 (C-9), 137.8 (C-1'), 109.0 (C-2'), 148.9 (C-3'), 146.8 (C-4'), 110.6 (C-5'), 123.2 (C-6'), 38.2 (C-7'), 36.6 (C-8'), 18.4 (C-9'), 56.7 (-OCH₃), 102.0 (O-CH₂-O).

실시예 10: 육두구 추출물에서 메조-디하이드로구아이아레트 산의 분리 정제 및 동정

실시예 9의 컬럼 크로마토그라피를 실시하는 중에 1.2 g의 메조-디하이드로구아이아레트 산을 무색 결정으로 얻었다.

시험예 1: 육두구 추출물에 의한 조골 세포의 칼슘 형성 분석

1) 조골 세포의 배양 및 분화 유도

본 시험에서 조골 세포는 MC3T3-E1 서브클론 4(ATCC CRL-2593)을 사용하였으며, 세포 배양에 사용된 배지 및 재료는 하이클론(Hyclone)사의 제품을 사용하였다. 입수된 조골 세포를 10% FBS가 포함된 αMEM 배지에서 배양하면서 3일 간격으로 배지를 교체하였다. 세포가 70% 정도 성장한 후, 트립신을 이용하여 세포를 배양 플레이트에서 분리하고, 이를 48-웰 플레이트의 각 웰에 1 × 10⁴세포/웰의 농 도로 넣었다. 세포가 95% 이상 자라면, 세포를 분화유도 배지(αMEM, 10% FBS, 50 ㎍/㎖ 아스코르브산(ascorbic acid) 및 10 mM β-글리세로포스페이트(β-glycerophosphate))로 옮기고, 3일에 한번씩 배지를 교체하며 배양하였다. 상기 분화유도 배지에 실시예 1의 육두구 메탄올 추출물, 에틸아세테이트 분획, 뷰탄올 분획 및 물 분획을 각각 0.1, 1 및 10 ㎍/㎖로 첨가하였다.

2) 조골 세포에서 형성된 칼슘 염색 및 정량

실험 물질을 첨가한 21일 후에 PBS 용액으로 세포를 세척한 후, 알리자린 레드 에스(alizarin red S) 염색액(물 10 ㎖ 중 0.1368 g, pH 4.2)을 넣어 반응시키고 다시 물로 세척하여 붉은 색으로 염색된 칼슘을 확인하였다(도 3a). 축적된 칼슘은 1N HCl로 적출한 후, 칼슘 C 키트(Wako, 일본)를 이용하여 정량하였다(도 3b).

도 3a에 나타난 바와 같이, 육두구 메탄올 추출물, 에틸아세테이트 분획 및 물 분획을 10 ㎍/㎖의 농도로 세포에 처리한 경우, 무처리 대조군에 비해 칼슘이 더욱 많이 염색되는 것을 관찰할 수 있다. 또한, 도 3b의 결과에 나타난 바와 같이, 육두구 메탄올 추출물, 에틸아세테이트 분획 및 물 분획을 10 ㎍/㎖의 농도로 처리한 경우에는 형성된 칼슘양이 무처리 대조군에 비해 통계적 유의성을 가지고 더욱 많이 형성됨을 알 수 있다. 도 3b의 결과에서 모든 대조군의 평균값은 2.75 ㎎/dL이며, 유의성 검증은 t-테스트로 수행하였다(* p<0.01, ** p<0.001).

시험예 2: 육두구 추출물로부터 분리한 화합물들에 의한 조골 세포의 칼슘 형성 분석

육두구 추출물로부터 분리된 실시예 2 내지 9의 화합물이 조골 세포의 칼슘 형성 촉진에 미치는 영향을 상기 시험예 1과 동일한 방법으로 실험하였다.

그 결과, 도 4에 표시된 바와 같이, 마칠린 A를 10 μM 처리하였을 때 조골 세포의 칼슘 농도가 가장 증가하였으며, 마셀리그난, 마칠린 F, 넥탄드린 B, 사프롤, 리카린 A, 리카린 B, 미리스타게놀 A 및 메조-디하이드로구아이아레트 산의 경우에는 5 μM를 처리하였을 때 조골 세포의 칼슘 농도가 가장 증가하였다. 결과적으로, 육두구 추출물로부터 분리된 실시예 2 내지 9의 화합물들에 의한 조골 세포에서의 칼슘 형성은 무처리 대조군에 비해 15배 내지 100배 이상의 효과를 보였다.

시험예 3: 마칠린 A에 의한 조골 세포의 증식, 및 조골 세포 초기 분화마커인 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase, ALP)의 활성 및 발현량 증가 분석

1) 조골 세포의 증식 분석

시험예 1에서 사용한 조골 세포인 MC3T3-E1 서브클론 4를 96-웰 플레이트의 각 웰에 1 × 10³세포/웰이 되도록 넣고, 12시간 후에 마칠린 A를 각 웰에 0, 0.625, 1.25, 2.5 및 10 μM의 농도로 처리하였다. 시험물질을 처리한 후 1일 및 3일째에 각각 CCK-8 키트(Dojindo, 일본)를 이용하여 조골 세포의 증식을 분석하고 그 결과를 도 5에 표시하였다. 측정 12시간 전에 세포 수를 2배씩 증가시켜 플레이트에 처리하고 이를 세포 수에 대한 표준 그래프(standard graph)로 사용하였으며, 측정된 흡광도는 세포수로 전환하여 그래프에 표기하였다.

2) ALP의 활성 및 발현량 분석

마칠린 A가 조골 세포 분화의 초기단계에서 활성 및 발현이 증가된다고 알려진 ALP의 활성 및 발현량에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 하기와 같은 방법으로 실험을 수행하였다.

상기 1)에서와 동일한 방법으로 마칠린 A를 처리하여 배양한 세포에 대하여 시험물질 처리 5일 후에 세포를 용균 용액 (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.5 mM MgCl₂, 0.1% Triton X-100)을 이용하여 30분 동안 상온에서 용균하고, 이를 12,000 rpm, 4℃에서 20분 동안 원심분리한 후, 얻어진 상층액으로부터 BCA 키트(Bio-Rad)를 이용하여 ALP를 정량하였으며, 랩어세이 ALP 키트(LabAssay ALP kit)(Wako, 일본)를 이용하여 ALP 활성을 측정하고 결과를 도 6a에 표시하였다. 측정된 활성은 유닛/mg 단백질로 표기하였다. 유의성 검증은 t-테스트로 수행하였다(일반 배지에서의 세포 ALP 활성 대 분화 유도 배지에서의 세포 ALP 활성, * p<0.05; 분화 유도 배지에서의 세포 ALP 활성 대 마칠린 A가 포함된 분화 유도 배지에서의 세포 ALP 활성, ## p<0.01).

한편, 마칠린 A에 의한 조골 세포에서의 ALP의 발현량 변화를 확인하기 위하여 다음과 같은 방법으로 ALP 염색을 수행하였다. 세포를 PBS 용액으로 3회 세척한 후, 10% 포르말린 용액으로 30초간 고정하고 다시 물로 세척하였다. 그 다음, 알칼라인 용액을 넣고 1시간 동안 빛이 차단된 상태로 염색을 하고 물로 다시 세척하였다. 이 때, 알칼라인 용액은 패스트 블루 RR 1 캡슐(Sigma, cat. no. 85L1-1 키트에 포함된 제품)을 48 ㎖의 물에 녹인 후, 2 ㎖의 나프톨 AS-MX 포스페이트(Sigma, cat. no. 85L1-1 키트에 포함된 제품)를 첨가함으로써 제조할 수 있다. 염색된 ALP는 자주색을 나타내며, 결과는 도 6b에 나타내었다.

3) 결과 및 분석

도 5에 표시된 결과를 보면, 마칠린 A를 10 μM의 농도로 처리하였을 때 대조군에 비해 세포 수가 약간 증가하였음을 볼 수 있다. 비록 세포량의 증가가 현저하지는 않았지만, 분화 초기 마커인 ALP의 활성 및 발현량은 대조군에 비해 유의적으로 증가하였다(도 6a 및 6b). 이러한 결과로부터 마칠린 A가 조골 세포로의 분화를 촉진하는 활성을 나타냄을 확인할 수 있다.

시험예 4: 마칠린 A에 의한 조골 세포의 칼슘 형성 및 무기질화 정도 평가

1) 조골 세포에서 형성된 칼슘 염색 및 정량

마칠린 A에 의한 조골 세포에서의 칼슘 형성 정도를 측정하기 위하여 시험예 3에서와 동일한 방법으로 조골 세포에 마칠린 A를 처리하고 14일 및 21일 후에 시험예 1의 2)와 동일한 방법으로 칼슘 염색 및 정량을 수행하였으며, 이를 도 7a(일반 배지에서의 세포 칼슘 형성 농도 대 분화 유도 배지에서의 세포 칼슘 형성 농도, ** p<0.01; *** p<0.001; 분화 유도 배지에서의 세포 칼슘 형성 농도 대 마칠린 A가 포함된 분화 유도 배지에서의 세포 칼슘 형성 농도, ### p<0.001) 및 도 7b에 표시하였다.

도 7a 및 도 7b에 표시된 결과에서 볼 수 있듯이, 마칠린 A를 5 내지 10 μM의 농도로 세포에 처리한 14일 후에 대조군에 비해 세포 내에 칼슘이 2.5배 이상 형성되었음을 알 수 있다. 처리 21일 후에는 그 증가폭이 더욱 증대되어 0.625 μM을 처리한 실험군에서도 유의적으로 칼슘의 형성이 촉진됨을 관찰할 수 있다.

2) 조골 세포의 무기질화 평가

마칠린 A에 의한 조골 세포의 무기질화 정도의 변화를 하기와 같은 본코자(von Kossa) 염색법에 의해 평가하였다. 먼저, PBS 용액으로 세포를 세척한 후, 2.5% 글루타르알데하이드/PBS 용액으로 30분간 세포를 고정시켰다. 증류수로 2번 세척하고 5% 질산은 용액을 넣은 후 상온에서 자외선을 비추어 무기질화 된 부분(검은 색)을 관찰하였으며, 결과는 도 8에 표시하였다.

도 8에 표시된 결과에서 볼 수 있듯이, 마칠린 A의 처리량이 증가함에 따라 조골 세포의 무기질화가 증가되는 것을 확인할 수 있다. 상기 결과로부터, 마칠린 A가 조골 세포의 분화를 촉진시켜 칼슘 및 무기질화를 촉진시키는 활성을 갖고 있 음을 알 수 있다.

시험예 5: 마칠린 A에 의해 유도되는 조골 세포 분화 및 무기질화에 관련된 유전자 발현 분석

조골 세포의 분화시 나타나는 바이오마커는 분화 시점에 따라 달라진다. 분화 초기에는 ALP가 나타나고, 조골 세포에 의한 무기질화가 진행되는 단계에서는 오스테오폰틴(osteopontin; OP), 오스테오칼신(osteocalcin; OC) 및 콜라젠 (type I collagen; Col)과 같은 유전자의 발현이 높아지는 것으로 알려져 있다. 이에 따라, 조골 세포 분화에 관련된 것으로 알려진 4개의 유전자의 발현량이 마칠린 A 처리 후 5일차 및 14일차에 어떻게 변화하는지를 알아보기 위하여, 시험예 3에서와 동일한 방법으로 조골 세포에 마칠린 A를 처리하고 5일 및 14일 후에 각각 하기와 같이 실시간 RT-PCR을 수행하였다.

1) 실시간 RT-PCR

배양된 조골 세포의 총 RNA를 트리졸 시약(Life Technologies)으로 추출한 후, 1 ㎍의 RNA와 1 μM 올리고-dT15 프라이머 및 옴니스크립트 역 전사효소(Omniscript Reverse Transcriptase)(Qiagen)을 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 배양액을 이용하여 50분의 1로 희석한 후, 브릴리언트 SYBR 그린 마스터 믹스(Brilliant SYBR Green Master Mix)(Stratagene)와 프라이머 20 pmole을 사용하여 스트라타진(Stratagene) Mx3000P 기기로 PCR을 수행하였다. 이 때, 증폭하고자 하는 각 유전자에 대해 사용된 프라이머는 다음과 같다:

(1) ALP

5'-atgggcgtctccacagtaac-3'(정방향; 서열번호 1)

5'-tcacccgagtggtagtcaca-3'(역방향; 서열번호 2)

(2) OP

5'-cccggtgaaagtgactgatt-3'(정방향; 서열번호 3)

5'-tctcctggctctctttggaa-3'(역방향; 서열번호 4)

(3) OC

5'-tatgtgtcctccgggttcat-3'(정방향; 서열번호 5)

5'-gccctctgcaggtcatagag-3'(역방향; 서열번호 6)

(4) Col

5'-aggcataaagggtcatcgtg-3'(정방향; 서열번호 7)

5'-gttcgggctgatgtaccagt-3'(역방향; 서열번호 8)

(5) GAPDH

5'-ggcctctcttgctcagtgtcc-3'(정방향; 서열번호 9)

5'-ctgcaccaccaactgcttag-3'(역방향; 서열번호 10).

PCR 반응은 94℃에서 3분간 초기 변성한 후, ① 94℃에서 40초간 변성, ② 60℃에서 40초간 어닐링 및 ③ 72℃에서 1분간 연장하는 사이클(①→②→③)을 40 회 반복하고, 마지막 연장을 72℃에서 5분 동안 수행하였다. 증폭된 산물을 2^-△△CT 방법(Livak 등, Methods, 25(4), 402-408, 2001)을 이용하여 GAPDH (glyseraldehyde -3-phosphate dehydrogenase)로 보정하여 수치화하였으며 대조군에 대한 퍼센트로 나타내었다. 유의성 검증은 t-테스트로 수행하였으며, 결과는 도 9a 및 도 9b에 나타내었다(* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001).

도 9a에 표시된 바와 같이, 마칠린 A 처리 5일 후에는 세포에서 상기 유전자(ALP, OP, OC, Col)들이 모두 유의적으로 증가되었다. 또한, 도 9b에 표시된 바와 같이, 마칠린 A 처리 14일 후에는 세포에서 무기질화에 관련된 유전자들(OP, OC, Col)이 유의적으로 증가되었다.

시험예 6: 마칠린 A에 의한 미토겐 활성 단백질(mitogen activated protein; MAP) 키나아제의 활성화 유도 분석

MAP 키나아제의 활성이 증가하면 조골 세포의 분화를 촉진시킬 수 있는 것으로 알려져 있다. 이에 따라, 마칠린 A가 세포 내의 MAP 키나아제의 활성에 어떤 영향을 미치는지를 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

1) 웨스턴 블럿 분석

시험예 1에서와 같이 조골 세포를 분화유도 배지에서 7일 동안 마칠린 A를 3 일에 한번씩 처리하면서 배양한 뒤, 분화가 유도된 조골 세포를 RIPA 용액을 이용하여 용균시켜 세포 내 단백질을 얻었다. 얻어진 단백질의 양을 BCA 키트(Bio-Rad)를 이용하여 정량하고, 단백질 10 ㎍/레인을 12% SDS-젤에서 분리한 뒤, 이를 니트로셀룰로오즈(NC) 막에 전달하였다. 10% 탈지유로 차단한 후, MAP 키나아제인 p-JNK(phosphorylated jun N-terminal kinase), JNK(jun N-terminal kinase), p-ERK(phosphorylated externally regulated kinases), ERK(externally regulated kinases), p-p38 및 p38에 대한 항체(SantaCruz, 미국)와 반응시켜, 결과를 도 10에 표시하였다.

도 10에 표시된 바와 같이, MAP 키나아제 중에서 JNK의 인산화가 분화 7일차에 마칠린 A에 의해 농도 의존적으로 증가하였다. 이는 마칠린 A의 조골 세포 분화 촉진 활성이 MAP 키나아제인 JNK의 활성을 촉진시킴으로써 나타나는 것임을 보여준다.

상기 실시예에서 제조한 다양한 육두구 추출물 또는 활성 화합물을 이용하여 다음과 같은 예시적인 약학 제제 및 식품을 제조하였다.

제제예 1: 산제의 제조

하기 성분을 혼합한 후 통상의 산제 제조방법에 따라서 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다:

육두구 건조 추출물 또는 활성 화합물: 2 g

유당: 1 g

제제예 2: 정제의 제조

하기 성분을 혼합한 후 통상의 정제 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다:

육두구 건조 추출물 또는 활성 화합물: 100 ㎎

옥수수 전분: 100 ㎎

유당: 100 ㎎

스테아린산 마그네슘: 2 ㎎

제제예 3: 캡슐제의 제조

하기 성분을 혼합한 후 통상의 캡슐제 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다:

육두구 건조 추출물 또는 활성 화합물: 100 ㎎

옥수수 전분: 100 ㎎

유당: 100 ㎎

스테아린산 마그네슘: 2 ㎎

제제예 4: 주사제의 제조

통상의 주사제 제조방법에 따라 육두구 추출물 또는 활성 화합물을 주사용 증류수에 용해하고 pH를 약 7.5로 조절한 다음 하기 나머지 성분 전체를 주사용 증류수로 2 ㎖ 용량의 앰플에 충진하고 멸균시켜서 주사제를 제조하였다:

육두구 건조 추출물 또는 활성 화합물: 100 ㎎

주사용 증류수: 적량

pH 조절제: 적량

제제예 5: 선식의 제조

현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말을 만들었다. 검정콩, 검정깨 및 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 만들었다. 본 발명의 육두구 추출물 또는 활성 화합물을 진공 농축기에서 감압 농축하고, 분무 열풍건조기로 건조하여 얻은 건조물을 분쇄기로 입도 60 메쉬로 분쇄하여 육두구 추출물 또는 활성 화합물 건조 분말을 얻었다. 상기에서 제조한 곡물류, 종실류 및 육두구 추출물 또는 활성 화합물의 건조 분말을 다음의 비율로 배합하여 과립을 만들었다.

곡물류 : 현미 30 중량%, 율무 15 중량%, 보리 20 중량%, 찹쌀 9 중량%,

종실류 : 들깨 7 중량%, 검정콩 8 중량%, 검정깨 7 중량%,

육두구 추출물 건조 분말 3 중량%, 영지 0.5 중량%, 지황 0.5 중량%

제제예 6: 츄잉껌의 제조

껌 베이스 20 중량%, 설탕 76.9 중량%, 향료 1 중량%, 물 2 중량% 및 육두구 추출물 0.1 중량%를 배합하여 통상의 방법으로 츄잉껌을 제조하였다.

제제예 7: 캔디의 제조

설탕 60 중량%, 물엿 39.8 중량%, 향료 0.1 중량%, 및 육두구 추출물 또는 활성 화합물 0.1 중량%를 배합하여 통상의 방법으로 캔디를 제조하였다.

제제예 8: 비스켓의 제조

박력 1급 25.59 중량%, 중력 1급 22.22 중량%, 정백당 4.80 중량%, 식염 0.73 중량%, 포도당 0.78 중량%, 팜쇼트닝 11.78 중량%, 암모늄 1.54 중량%, 중조 0.17 중량%, 중아황산나트륨 0.16 중량%, 쌀가루 1.45 중량%, 비타민 B₁0.0001 중량%, 비타민 B₂0.0001 중량%, 밀크향 0.04 중량%, 물 20.6998 중량%, 전지분유 1.16 중량%, 대용분유 0.29 중량%, 제1인산칼슘 0.03 중량%, 살포염 0.29 중량%, 분무유 7.27 중량%, 및 육두구 추출물 또는 활성 화합물 1 중량%를 배합하여 통상의 방법으로 비스켓을 제조하였다.

제제예 9: 건강 음료의 제조

꿀 0.26 중량%, 치옥토산아미드 0.0002 중량%, 니코틴산아미드 0.0004 중량%, 염산리보플라빈나트륨 0.0001 중량%, 염산피리독신 0.0001 중량%, 이노시톨 0.001 중량%, 오르트산 0.002 중량%, 물 98.7362 중량%, 및 육두구 추출물 또는 활 성 화합물 1 중량%를 배합하여 통상의 방법으로 건강 음료를 제조하였다.

제제예 10: 건강보조식품의 제조

스피루리나 55 중량%, 구아검효소 분해물 10 중량%, 비타민 B₁염산염 0.01중량%, 비타민 B6 염산염 0.01 중량%, DL-메티오닌 0.23 중량%, 스테아린산 마그네슘 0.7 중량%, 유당 22.2 중량%, 옥수수전분 1.85 중량%, 및 육두구 추출물 또는 활성 화합물 10 중량%를 배합하여 통상의 방법으로 정제형 건강보조식품을 제조하였다.

본 발명에 따른 마칠린 A, 마셀리그난, 마칠린 F, 넥탄드린 B, 사프롤, 리카린 A, 리카린 B, 미리스타게놀 A, 메조-디하이드로구아이아레트 산, 이들의 혼합물 또는 이를 포함하는 육두구 추출물은 조골 세포의 분화를 촉진시키므로 이를 포함하는 조성물은 골다공증 등의 조골 세포 관련 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

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Claims

화학식 1의 마칠린 A(machilin A), 화학식 2의 마셀리그난(macelignan), 화학식 3의 마칠린 F(machilin F), 화학식 4의 넥탄드린 B(nectandrin B), 화학식 5의 사프롤(safrole), 화학식 6의 리카린 A(licarin A), 화학식 7의 리카린 B(licarin B), 화학식 8의 미리스타게놀 A(myristagenol A), 화학식 9의 메조-디하이드로구아이아레트 산(meso-dihydroguaiaretic acid), 이들의 혼합물 또는 이를 포함하는 육두구 추출물을 유효성분으로 함유하는, 골다공증의 예방 또는 치료용 조성물:

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]

[화학식 7]

[화학식 8]

[화학식 9]
제 1 항에 있어서,

상기 육두구 추출물이 C_1-4 알콜 및 이의 수용액, 다이클로로메탄, 에틸아세테이트 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 용매를 사용하여 추출되는 것임을 특징으로 하는 조성물.
화학식 1의 마칠린 A(machilin A), 화학식 2의 마셀리그난(macelignan), 화학식 3의 마칠린 F(machilin F), 화학식 4의 넥탄드린 B(nectandrin B), 화학식 5의 사프롤(safrole), 화학식 6의 리카린 A(licarin A), 화학식 7의 리카린 B(licarin B), 화학식 8의 미리스타게놀 A(myristagenol A), 화학식 9의 메조-디하이드로구아이아레트 산(meso-dihydroguaiaretic acid), 이들의 혼합물 또는 이를 포함하는 육두구 추출물을 함유하는, 골 형성 촉진용 건강 증진 식품:

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]

[화학식 7]

[화학식 8]

[화학식 9]
제 3 항에 있어서,

상기 화학식 1 내지 9의 화합물, 이들의 혼합물 또는 이를 포함하는 육두구 추출물의 함량이 0.01 내지 30 중량% 범위인 것을 특징으로 하는 식품.
제 3 항에 있어서,

상기 육두구 추출물이 C_1-4 알콜 및 이의 수용액, 다이클로로메탄, 에틸아세테이트 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 용매를 사용하여 추출되는 것임을 특징으로 하는 식품.
제 3 항에 있어서,

상기 식품이 음료의 형태인 것을 특징으로 하는 식품.