KR20070033938A - 메이스리그난 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을유효성분으로 함유하는 ＰＰＡＲα에 의해 매개되는 질환의예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 메이스리그난 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 PPARα(peroxisome proliferator activated receptor α)에 의해 매개되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 메이스리그난 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 비만, 고지혈증, 심혈관계 질환 등과 같은 PPARα에 의해 매개되는 대사관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 메이스리그난 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 가지므로 PPARα의 리간드로 작용하여 PPARα를 활성화하게 되므로 PPARα에 의해 매개되는 질환을 예방 및 치료하는 효과를 갖는다. 따라서 본 발명의 조성물은 비만, 고지혈증 및 심혈관계 질환과 같은 PPARα에 의해 매개되는 질환을 예방 및 치료하는 목적으로 사용할 수 있다.

메이스리그난(macelignan), PPARα 리간드, 비만, 고지혈증, 심혈관계질환

Description

메이스리그난 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 ＰＰＡＲα에 의해 매개되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating a PPARα-mediated disease comprising macelignan or pharmaceutically acceptable salt thereof as a active ingredient}

도 1은 미리스티카 프라그란스(Myristica fragrans)의 육두구(nutmeg로부터 메이스리그난(macelignan)을 분리하는 공정도이다.

도 2는 본 발명의 메이스리그난의 ¹³C-NMR 스펙트럼이다.

도 3은 본 발명의 메이스리그난의 ¹H-NMR 스펙트럼이다.

도 4는 본 발명의 메이스리그난의 ¹H-¹H COSY 스펙트럼이다.

도 5는 본 발명의 메이스리그난의 ¹H-¹³C HMBC 스펙트럼이다.

도 6은 본 발명의 메이스리그난의 EI-Mass 스펙트럼이다.

도 7은 본 발명의 메이스리그난이 농도별로 PPARα을 활성화 시키는 효과를 측정한 그래프이다.

도 8은 본 발명의 메이스리그난이 PPARα의 목표 유전자의 발현을 증가시키 는 효과를 측정한 결과이다.

A : CD36

B : CPT-1

C : PDK4

D : ACO

도 9는 비만/당뇨 마우스 모델에서 본 발명의 메이스리그난의 식이량에 미치는 영향을 측정한 결과이다.

도 10은 비만/당뇨 마우스 모델에서 본 발명의 메이스리그난이 체중에 미치는 영향을 측정한 결과이다.

도 11은 비만/당뇨 마우스 모델에서 본 발명의 메이스리그난의 지방조직의 무게에 미치는 영향을 측정한 결과이다.

도 12는 비만/당뇨 마우스 모델에서 본 발명의 메이스리그난의 근육 내 중성지방의 농도에 미치는 영향을 측정한 결과이다.

도 13은 비만/당뇨 마우스 모델에서 본 발명의 메이스리그난의 혈중 중성지방의 농도에 미치는 영향을 측정한 결과이다.

도 14는 비만/당뇨 마우스 모델에서 본 발명의 메이스리그난의 혈중 자유지방산의 농도에 미치는 영향을 측정한 결과이다.

도 15는 비만/당뇨 마우스 모델에서 본 발명의 메이스리그난의 혈중 총 콜레스테롤의 농도에 미치는 영향을 측정한 결과이다.

도 16은 비만/당뇨 마우스 모델에서 본 발명의 메이스리그난의 혈중 HDL-콜 레스테롤의 농도에 미치는 영향을 측정한 결과이다.

도 17은 비만/당뇨 마우스 모델에서 본 발명의 메이스리그난의 혈중 IL-6의 농도에 미치는 영향을 측정한 결과이다.

도 18은 비만/당뇨 마우스 모델에서 본 발명의 메이스리그난의 혈중 TNF-α의 농도에 미치는 영향을 측정한 결과이다.

도 19는 비만/당뇨 마우스 모델에서 본 발명의 메이스리그난의 간조직의 중성지방 함량에 미치는 영향을 측정한 결과이다.

도 20은 본 발명의 메이스리그난이 비만/당뇨 마우스 모델 간조직에서 PPARα의 목표 유전자의 발현을 증가시킨 효과를 측정한 결과이다.

A : CD36

B : ACO

C : CPT-1

본 발명은 메이스리그난 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 PPARα(peroxisome proliferator activated receptor α)에 의해 매개되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 메이스리그난 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 비만, 고지혈 증, 심혈관계 질환 등과 같은 PPARα에 의해 매개되는 대사관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

PPAR(peroxisome proliferator activated receptor)은 퍼옥시좀(peroxisome)의 수를 증가시킬 수 있는 화합물인 퍼옥시좀 증식제(peroxisome proliferator)를 리간드로 하는 핵내 수용체를 말하며, PPARα, PPARδ, PPARγ의 동형체(isoform)가 알려져 있다(J. Steroid Biochem . Molec . Biol ., 51, 157, 1994; Gene Expression, 4, 281, 1995; Biochem . Biophys . Res . Commun ., 224, 431, 1996).

PPAR은 주로 지방대사에 관여하는 유전자 또는 지방세포(adipocyte)의 분화에 관여하는 유전자의 발현을 조절하며(J. Invest . Dermatol . 111, 1116-1121, 1998; J. Med. Chem ., 43, 527-550, 2000), PPAR의 동형체 중 PPARα는 간, 망막(retina) 및 지방조직(adipose tissue)에서 주로 발현되며 지방산의 산화나 독성물질의 중화에 관여하며 염증반응에 관여한다. PPARγ은 지방세포, 면역세포, 부신(adrenal gland), 비장(spleen), 및 소장에서 주로 발현되며, 지방세포의 분화에 중심 조절자로 알려져 있다. PPARδ는 조직특이적으로 발현하지 않고, 광범위하게 발현되며 그 기능은 확실치 않다(Endocrinology., 137, 354, 1996).

PPAR이 지방대사에 중요한 역할을 하기 때문에, PPAR을 대상으로 하는 대사 질환의 치료제를 개발하기 위한 많은 연구가 진행되고 있다. PPARα이 활성화되면, 간에서 지방산 분해를 증가시키고 지방산 합성을 감소시키는 효소의 발현을 증가시켜 중성지방 합성 및 VLDL(초저밀도지질단백질)의 생성 및 분비를 감소시킨다는 점이 밝혀졌으며, PPARα의 활성화는 지방분해 효소인 LPL(지단백리파아제)를 활성화시킴과 동시에 VLDL을 생성시키는 apoC-III의 생성을 감소시킨다는 점이 밝혀졌다(Curr . Pharm Des., 3: 1-14, 1997). PPARα의 리간드로 알려져 있는 피브레이트(fibrate)는 트리글리세라이드(triglyceride)를 20 - 50% 감소시키고, LDL은 감소시킴과 동시에 HDL을 증가시키는 것으로 알려져 있다(Atherosclerosis, 171: 1-13, 2003). 따라서 PPARα의 리간드는 트리글리세라이드의 축적으로 인한 비만 및 지질혈증 이상, 심장 혈관 질환의 치료에 유용하다(Curr . Opin . Lipidol ., 10: 245-257, 1999).

이와 같이 PPAR이 비만 등 지방대사와 관련 있는 대사 질환을 치료하기 위한 좋은 목표가 되기 때문에 PPAR을 활성화시키는 PPAR 리간드를 개발하기 위한 시도가 있어 왔다. 미국특허 제6,939,875호는 PPAR에 매개된 질병을 치료하는 데에 사용할 수 있는 조성물에 대한 것이며, 상기 조성물이 제2형 당뇨병, 비만, 섭식 장애(eating disorders), 식욕 저하(suppressing appetite), 렙틴 수준 조절(leptin level modulation), 대사증후군(metabolic syndrome)에 효과가 있음이 기재되어 있다. 아울러, 미국특허 제6,967,212호는 PPAR의 작용제(agonist)로 작용하는 치환된 아졸산(azole acid) 유도체를 포함하는 조성물에 관한 것으로 상기 조성물이 인슐린 저항증(insulin resistance), 고혈당증, 고인슐린증, 고지질증 (hyperlipidemia), 비만(obesity), X 증후군(syndrome X), 대사이상증후군(dysmetabolic syndrome), 염증(inflammation), 당뇨합병증(diabetic complications), 당 항상성 손상(impaired glucose homeostasis), 내당능 손상(impaired glucose tolerance), 고중성지방혈증(hypertriglyceridemia) 또는 동맥경화증(atherosclerosis) 등에 효과가 있음이 기재되어 있다. 이외에도, PPAR을 매개로 하는 각종 질환을 치료할 수 있는 물질이 공지되어 있다(미국특허 제6,930,120호, 미국특허 제7,041,691호, 미국특허 제7,037,914호 등).

PPAR과 관련 있는 대표적인 대사질환 중 하나인 비만은 소모하는 에너지에 비해 과다한 음식을 섭취함으로써 여분의 에너지가 체내에 지방의 형태로 축적되어지는 현상을 말한다. 비만은 유전적 영향, 서구화되는 식생활에 의한 환경적인 영향, 스트레스에 의한 심리적인 영향 등 다양한 원인에 의해 유발되어지는 것으로 생각되고 있으나 아직 그 정확한 원인이나 기작에 관해서는 명확히 정립된 바가 없는 상황이다. 그러나 비만은 그 자체가 갖는 문제점뿐만 아니라, 고인슐린혈증, 동맥경화증, 심장 혈관 질환 등과 같은 많은 질병의 원인으로도 작용할 수 있기 때문에 전 세계적으로 비만치료에 많은 관심이 모아지고 있다(Nature, 404: 635-643, 2000; JAMA, 282: 1523-1529, 1999).

현재까지 알려진 비만치료제들 중에서 가장 대표적인 약물들로는 리덕틸 (Reductil^TM, 애보트사, 미국), 제니칼(Xenical^TM, 로슈제약회사, 스위스), 엑소리제(Exolise^TM, 아토파마, 프랑스) 등이 있으나 심장질환, 호흡기 질환, 신경계질환 등의 부작용과 함께 그 효능의 지속성이 낮아, 더욱 효율적인 비만치료제의 개발이 필요한 실정이다. 현재 비만치료제 개발 전략은 식사량 감소, 열량흡수의 억제, 발열반응 촉진, 에너지 대사 조절, 신경계를 통한 신호전달 조절과 같은 것들이며(Nature, 404: 635-643, 2000) PPAR은 이러한 전략을 충족시키기 위한 좋은 목표 중에 하나이다.

따라서, 하지만, 현재까지 알려진 PPAR 리간드는 간독성, 저혈당 증상 및 비만 등의 부작용을 일으키기 때문에 독성 등의 부작용이 적은 천연물 소재에서 PPAR을 활성화시키는 리간드를 찾을 필요성이 요구되고 있으나, 아직까지 천연물에서 PPAR을 활성화시키는 리간드를 찾고자 하는 연구는 그 수가 매우 적다.

한편, 미리스티카 프라그란스(Myristica fragrans)는 열대지방에서 재배되는 다년생 식물로서 메이스(mace)나 육두구(nutmeg)로 알려진 이것의 과실은 오래전부터 향신료로 이용되어 왔다. 메이스리그난(macelignan)은 미리스티카 프라그란스에서 발견되는 대표적인 리그난계 화합물로(Phytochemistry, 59: 169-173, 2002) 아폽토시스(apoptosis)를 유도하는 카스파제(caspase)-3 활성 증진작용(Biol . Pharm . Bull., 27: 1305-1307, 2004), 구강미생물에 대한 항균활성(대한민국특허 공개특허공보 10-2005-0035954), 뇌세포 지질 과산화 및 활성산소 생성 억제 효과(Biochem. Biophys. Res. Commu., 331: 1264-1269) 등이 보고되었다. 그러나 아직까지 메이스리그난과 PPAR과의 관계에 대한 연구는 보고된 바가 없으며, 아직까지 PPARα를 목표로 한 메이스리그난의 항비만과 항고지혈증 및 항심혈관계 질환 등의 용도에 대한 연구는 보고된 바가 없다.

이에 본 발명자들은 여러 종류의 천연물을 대상으로 하여 PPARα를 활성화 하여 비만과 고지혈증 및 심혈관계 질환을 치료 또는 예방할 수 있는 활성 물질을 찾고자 탐색한 결과, 미리스티카 프라그란스로부터 분리된 메이스리그난이 PPARα를 활성화시키고, 비만과 고지혈증 및 심혈관계 질환의 치료 또는 예방에 효과를 가짐을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 메이스리그난 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 PPARα에 의해 매개되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 메이스리그난 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 PPARα에 의해 매개되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

본 발명은 하기 화학식(I)로 표시되는 메이스리그난 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 PPARα에 의해 매개되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것을 특징으로 한다.

[화학식 I]

본 발명의 메이스리그난(macelignan)은 천연으로부터 분리 정제하거나, 상업적으로 구입하여 사용하거나 또는 당 업계에 공지된 화학적 합성법으로 제조할 수 있다.

바람직하게 본 발명의 메이스리그난은 천연으로부터 분리 정제될 수 있다. 더 바람직하게는, 미리스티카 프라그란스(Myristica fragrans)로부터 분리 정제될 수 있으며, 가장 바람직하게는 미리스티카 프라그란스의 육두구(nutmeg)나 가종피(aril)로부터 분리 정제될 수 있다. 또한 다른 육두구과 식물인 미리스티카 아르겐티아 워르브(Myristica argentea Warb)에서도 분리정제될 수 있으며(Nat . Prod. Lett., 16: 1-7, 2002), 후박나무(Machilus thunbergii)(Bio . Pharm . Bull., 27: 1305-1307, 2004), 레우카스 아스페라(Leucas aspera) 등에서도 분리정제될 수 있다(Chem . Pharm . Bull., 51: 595-598, 2003).

바람직하게는 본 발명의 메이스리그난은 육두구에서 당업계에 공지된 용매 추출법 및 크로마토그래피를 이용한 분리방법에 의해 분리, 정제될 수 있다.

육두구에서의 추출은 예를 들어, 물, 에탄올, 메탄올, 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol)과 같은 탄소수 1 내지 6개의 알코올, 아세톤, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 메틸렌클로라이드, 헥산, 시클로헥산, 석유에테르(petrolem ether), 디에틸에테르, 벤젠과 같은 유기용매 중에서 선택된 어느 하나 또는 이들의 혼합용매를 이용하여 추출할 수 있다. 바람직하게는, 물 또는 탄소수 1 내지 6개의 알코올을 사용하여 추출할 수 있다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 메이스리그난은 메탄올 또는 에탄올을 용매로 이용하여 추출될 수 있다.

추출시의 육두구와 메탄올 또는 에탄올의 비율은 특별히 한정되지 않으나, 육두구 분말에 메탄올 또는 에탄올을 1배～20배(중량기준)로 첨가할 수 있다 바람직하게는, 추출효율을 증가시키기 위해서 육두구 분말에 대하여 메탄올 또는 에탄올을 2배～5배(중량기준)로 첨가할 수 있다.

추출시 온도는 상압 하의 실온에서 수행하는 것이 바람직하며 추출시간은 추출온도에 따라 다르지만, 6시간 내지 96시간, 바람직하게는 36시간 내지 72시간동안 추출한다. 또한, 추출시 교반기(shaker)로 교반할 경우에 더욱 추출효율을 증대시킬 수 있다.

추출에 사용되는 육두구는 수확한 후 세척하여 그대로 사용하거나 건조하여 사용할 수 있다. 건조방법으로는 양건, 음건, 열풍건조 및 자연 건조하는 방법을 모두 사용할 수 있다. 또한, 추출효율을 증대시키기 위해 육두구 또는 그 건체를 분쇄기로 분쇄하여 사용할 수 있다.

추출물에서 메이스리그난을 분리하는 것은 당업계에 공지된 크로마토그래피를 이용한 분리방법, 예를 들면, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피법을 이용하여 극성에 따른 분획물을 얻고 분리된 특정 분획물을 다시 역상 컬럼 크로마토그래피법 및 고속액체크로마토그래피(HPLC)법을 통하여 메이스리그난을 분리할 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 메이스리그난은 건조된 육두구를 20 내지 40mesh의 크기로 분쇄한 다음 상기 육두구 분말에 메탄올을 3배로 첨가하고 48시간동안 상온에서 추출한다. 상기 추출액을 원심 분리하여 침전물을 제거하고 상등액을 회수함 으로써 메이스리그난이 함유된 육두구 추출물을 제조할 수 있다. 상기 추출물을 에틸아세테이트, 부탄올, 물 층으로 분획하고 그 중 에틸아세테이트 분획물을 실리카겔 컬럼에 통과시킨 후 헥산과 에틸아세테이트를 10:1(v/v)로 혼합한 용매로 용출시킨 분획물을 제조하였다. 이를 다시 실리카겔 컬럼에 통과시킨 후 헥산과 에틸아세테이트를 20:1(v/v)로 혼합한 용매로 용출시킨 분획물을 제조한 다음, 이를 RP-18 컬럼에 통과시킨 후 80% 메탄올로 용출시켜 메이스리그난을 분리할 수 있다.

한편, 본 발명의 조성물은 육두구의 추출물을 포함할 수도 있으며, 추출용매 및 추출방법에 대해서는 상기 기재한 바와 같다.

본 발명의 조성물 또는 육두구 추출물내의 유효성분인 메이스리그난은 PPARα에 대한 리간드로 작용하여 PPARα를 활성화시키며, 이러한 점은 본 발명자들에 의해 처음으로 밝혀졌다.

본 발명의 일실시예에서는 PPARα에 결합하여 PPAR 반응서열(PPRE, PPAR response element)을 가지는 유전자를 활성화시키는 리간드를 찾는 공지의 방법을 이용하여 본 발명의 메이스리그난이 PPARα와 결합하여 이를 활성화시킨다는 것을 확인하였다. 아울러, 육두구의 에탄올 추출물이 PPARα와 결합하여 이를 활성화시킨다는 것을 확인하였다(도 7 참조).

PPARα가 활성화되면, PPRE(PPAR 반응 원소; PPAR response element)라는 DNA 서열에 결합함으로써 목표 유전자의 발현을 조절하며, 주로 지방대사에 관여하는 PPARα의 목표 유전자(target gene)들의 발현이 증가한다. 따라서, 본 발명의 다른 실시예에서는 PPARα의 목표 유전자로 알려진 CD36, CPT-1, PDK4, ACO의 발현이 증가하는지 알아보았다. 그 결과, 상기 PPARα의 목표 유전자의 발현이 메이스리그난 처리시 유의적으로 증가하는 것을 알 수 있었다(도 8 참조).

본 발명의 일실시예에서는 메이스리그난이 비만/당뇨 마우스 모델에서 체중을 유의하게 감소시켜 비만과 비만으로 인한 고지혈증 및 심혈관계 질환의 치료 또는 예방 효과가 있음을 확인하였다(도 9 내지 도 19 참조).

이와 같이 본 발명의 메이스리그난은 PPAR의 리간드, 특히 지방 분해를 증가시키는 PPARα의 리간드이며, 비만/당뇨 마우스 모델에서 유의 있게 체중과 혈중 중성지방을 감소시킴으로서 비만과 대사성 질환인 고지혈증 및 심혈관계 질환에 대한 억제 효과가 있음을 알 수 있었다.

따라서, 본 발명은 메이스리그난 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 PPARα에 의해 매개되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 “PPARα에 의해 매개되는 질환”이란 PPARα의 활성화로 인해 증상이 예방, 치료, 경감 또는 완화되는 질환을 의미한다. 바람직하게 상기 PPARα에 의해 매개되는 질병은 비만(obesity), 고지질증(hyperlipidemia), X 증후군(syndrome X), 고콜레스테롤증(hypercholesterolemia), 고지질단백질증(hyperlipoproteinemia), 동맥경화증(atherosclerosis), 고혈압(hypertension), 대사이상증후군(dysmetabolic syndrome), 고중성지방혈증(hypertriglyceridemia), 골다공증(osteoporosis; J. Biol . Chem. 275: 14388-14393, 2000) 및 사구체신염(glomerulonephritis; Kidney Int., 60: 14-30, 2001)이다.

본 발명의 조성물을 이용하여 PPAR에 의해 매개되는 질환을 예방 또는 치료하기 위하여 메이스리그난 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 유효량을 개체에 투여할 수 있다. 상기에서 “유효량”이란 음성 대조군에 비해 그 이상의 반응을 나타내는 양을 말하며 바람직하게는 알레르기 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 말한다. 본 발명의 메이스리그난 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 유효량으로는, 이에 한정되지는 않으나, 0.1～200 mg/day/체중kg, 바람직하게는 1～30 mg/day/체중kg이다. 그러나, 상기 유효량은 질환 및 이의 중증정도, 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로, 투여시간, 식이, 배설, 치료기간 및 타 약제와의 혼합 등과 같은 여러 인자에 따라 적절히 변화될 수 있다. 상기에서 개체는 PPARα에 의해 매개되는 질환의 치료 또는 예방이 필요한 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간이다.

본 발명에 따른 메이스리그난은 염, 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하다. 상기 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.

상기에서 “약학적으로 허용되는”이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 활성성분의 작용을 저해하지 않으며 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 말한다.

한편, 본 발명에서 메이스리그난 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 투여 경로에 따라 적합한 담체와 함께 제형화될 수 있다. 상기 담체로는 모든 종류의 용매, 분산매질, 수중유 또는 유중수 에멀젼, 수성 조성물, 리포좀, 마이크로비드 및 마이크로좀이 포함된다. 상기 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 경로로는 이에 한정되지는 않으나 경구적 또는 비경구적으로 투여될 수 있다. 비경구적 투여 경로로는 예를 들면, 경피, 비강, 복강, 근육, 피하 또는 정맥 등의 여러 경로 가 포함된다.

본 발명의 메이스리그난 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 경구 투여하는 경우 적합한 경구 투여용 담체와 함께 당 업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 형태로 제형화될 수 있다. 적합한 담체의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합, 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 비경구적으로 투여하는 경우 본 발명의 메이스리그난 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 적합한 비경구용 담체와 함께 주사제, 경피 투여제 및 비강 흡입제의 형태로 당 업계에 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리 에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다.

경피 투여제의 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태가 포함된다. 상기에서 “경피 투여”는 약학적 조성물을 국소적으로 피부에 투여하여 약학적 조성물에 함유된 유효한 양의 활성성분이 피부 내로 전달되는 것을 의미한다. 이들 제형은 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania)에 기술되어 있다.

흡입 투여제의 경우, 본 발명에 따라 사용되는 화합물은 적합한 추진제, 예를 들면, 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여, 가압 팩 또는 연무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달 할 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투 약 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정할 수 있다. 예를 들면, 흡입기 또는 취입기에 사용되는 젤라틴 캡슐 및 카트리지는 화합물, 및 락토즈 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화할 수 있다.

그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

또한, 본 발명에 따른 메이스리그난 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 하나 이상의 완충제(예를 들어, 식염수 또는 PBS), 카보하이트레이트(예를 들어, 글루코스, 만노즈, 슈크로즈 또는 덱스트란), 항산화제, 정균제, 킬레이트화제(예를 들어, EDTA 또는 글루타치온), 아쥬반트(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드), 현탁제, 농후제 및/또는 보존제를 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 메이스리그난 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 개체에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다.

또한, 본 발명의 메이스리그난 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 PPARα에 의해 매개되는 질환을 예방 또는 치료하는 효과를 가지는 피브레이트 (Fibrate), 클로피브레이트(Clofibrate), 페노피브레이트(Fenofibrate), 벤자피브레이트(Bezafibrate)와 같은 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.

본 발명의 메이스리그난을 래트(rat)에 경구 투여시의 독성 실험을 수행한 결과, 경구 독성시험에 의한 50 % 치사량 (LD₅₀)은 2,000 mg/kg 이상인 것으로 나타났다.

이하. 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 미리스티카 프라그란스로부터 메이스리그난의 분리 및 정제

<1-1> 메이스리그난의 분리 및 정제

건조 분쇄한 육두구(nutmeg) 100 g에 75% 메탄올 400 ㎖을 가하여 상온에서 이틀 동안 방치하였다. 추출된 용액을 여과하고 진공 농축하여 육두구 메탄올 추출물(7g)을 제조하였으며, 상기 추출물을 에틸아세테이트, 부탄올, 물로 분획하고, 각각의 분획용액을 진공 농축하여 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물 및 물 문획물을 수득하였다. 에틸아세테이트 분획물(4.2 g)을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(Merck Kieselgel 66; 70-230 mesh) 를 이용하여 헥산과 에틸아세테이트를 10:1(v/v)의 비율로 혼합한 용매로 용출시켜 분획물 Ⅲ(1 g)를 얻었다. 분획물 Ⅲ를 헥산과 에틸아세테이트 20:1(v/v)의 비율로 혼합한 용매로 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(Merck Kieselgel 66; 70-230 mesh)하여 분획물 Ⅲ-B(0.52 g)을 얻었다. 이후, 분획물 Ⅲ-B를 Rp-18 컬럼 크로마토그래피(Merck LiChroprep; 25-40 ㎛)를 이용하여 80% 메탄올로 용출시켜 단일물질 분획 Ⅲ-B-2(0.5 g)을 얻었다. 이와 같은 분리 공정도를 도 1에 나타내었다.

<1-2> 구조분석

상기 분리된 단일물질 Ⅲ-B-2의 구조를 결정하기 위하여 ¹H-NMR 스펙트럼과 ¹³C-NMR 스펙트럼을 각각 600MHz와 150MHz(용매: DMSO)에서 측정하였다. 그 결과를 도 2와 도 3에 각각 나타내었다. ¹³C-NMR 스펙트럼과 ¹H-NMR 스펙트럼의 결과를 토대로 ¹H-¹H의 상관관계와 ¹H-¹³C의 상관관계를 측정하기 위하여 ¹H-¹H COSY 스펙트럼과 ¹H-¹³C HMBC 스펙트럼을 측정하였다. 그 결과를 도 4와 도 5에 각각 나타내었다. ¹H-NMR, ¹³C-NMR, ¹H-¹H COSY, ¹H-¹³C HMBC의 결과를 종합적으로 분석하여 하기 표 1에 나타내었다.

Position	13C-NMR	1H-NMR	1H-1H COSY	1H-13C HMBC
1	135.4
2	109.2	6.72 brs		C-7, C-6, C-4, C-3
3	147.3
4	145.1
5	107.9	6.79 d(7.8)	6.61	C-6, C-4, C-3, C-1
6	121.7	6.61 dd(7.8)	6.79	C-7, C-5, C-4, C-2, C-1
7	38.2	2.23 dd(13.2, 9.3) 2.66 dd(13.2, 4.8)	1.64, 2.66 1.64, 2.23	C-8, C-6, C-2, C-1 C-9, C-8, C-6, C-2, C-1
8	38.7	1.64 brs	0.75, 2.23, 2.66	C-7
9	16.0	0.75 d(6.3)	1.64	C-8, C-7
1'	132.4
2'	112.9	6.66 brs		C-7', C-6', C-4', C-3'
3'	147.1
4'	144.4
5'	115.2	6.66 d(7.9)	6.53	C-6', C-4', C-3', C-1'
6'	121.0	6.53 d(7.9, 1.1)	6.66	C-7', C-5', C-4', C-2', C-1'
7'	38.0	2.17 dd(13.2, 9.3) 2.66 dd(13.2, 4.8)	1.64, 2.66 1.64, 2.17	C-8', C-6', C-2', C-1' C-9', C-8', C-6', C-2', C-1'
8'	38.7	1.64 brs	0.75, 2.17, 2.66	C-7'
9'	16.1	0.75 d(6.3)	1.64	C-8', C-7'
OMe	55.5	3.72(s)
O-CH2-O	100.6	5.95 d(4.8)		C-3, C-4

<1-3> 질량분석

상기 분리된 단일물질 Ⅲ-B-2의 질량 분석을 위해 측정한 EI/MS의 결과를 도 6에 나타내었다. 본 화합물은 EI/MS에서 [M]⁺가 m/z 328에서 관측되어 분자량이 328로 판명되었고, 분자식은 C₂₀H₂₄O₄이었다.

<1-4> 비선광도 측정

상기 분리된 단일물질 Ⅲ-B-2 20mg을 클로로포름(CHCl₃) 2ml에 녹인 후 비선광도측정기(Polarimeter; Automatic Polarimeter, APⅢ-589, Rodulph, NJ, USA)로 비선광도([α]_D) 값을 측정한 결과 [α]_D = +4.0 (CHCl₃, c=1.0)으로 나타났다.

이상의 ¹H-NMR, ¹³C-NMR, ¹H-¹H COSY, ¹H-¹³C HMBC, EI/MS 및 [α]_D 에 대한 결과와 기존에 발표된 연구보고(Woo, W.S. et al., Phytochemistry, 26: 1542-1543, 1987)를 비교 분석하여 동정한 결과, 분리된 단일 물질은 하기 화학식(I)로 표시되는 메이스리그난(macelignan)인 것으로 확인되었다.

[화학식 I]

< 실시예 2> 메이스리그난에 의한 PPAR α의 활성화

<2-1> 메이스리그난에 의한 PPAR α의 활성화

메이스리그난이 PPARα의 리간드로 작용하는 지 알아보기 위하여, PPARα를 발현하는 플라스미드와 PPRE 통제하에 있는 루시퍼라제(luciferase) 유전자를 갖는 벡터를 사용한 공지의 방법(Cell , 68: 879-887, 1992; J. Biol . Chem ., 272: 25252-25259, 1997)에 따라 수행하였다.

루시퍼라제 발현의 활성화는 COS-7 원숭이 신장세포(ATCC CRL-1651)를 PPARα플라스미드와 pFR-luciferase 벡터(Stratagene, USA)로 형질감염 시킨 후 상기 실시예 1에서 분리한 메이스리그난을 24시간 처리하여 측정하였다. 상기 PPARα플라스미드는 사람의 PPARα(Genbank Acession No. S74349)의 전체 아미노산 서열 중 PPARα 리간드 결합 도메인인 아미노산서열 200번부터 510번까지의 아미노산을 암호화하는 염기서열을 서열번호 1(CTTGGATCCGAACATGACATA) 및 서열번호 2(TGGGGTACCTGTGGCTGAT)의 프라이머를 이용한 RT-PCR을 수행하여 수득한 뒤, pFA벡터(Stratagene, USA)의 BamHI와 KpnI의 제한효소부위에 클로닝하여 제조하였다. RT-PCR의 주형이 되는 mRNA는 배양된 Hep G2(ATCC HB-8065) 사람 간세포에서 트리졸(TRIZOL; Invitrogen, USA)을 사용하여 총 RNA를 분리한 것을 이용하였으며, RT-PCR은 역전사효소를 이용하여 42℃에서 60분간 cDNA를 합성한 다음, Taq 중합효소를 이용하여 95℃에서 1분, 54℃ 30초, 72℃에서 2분을 30번 반복하여 수행하였다. 이 때 본 발명의 메이스리그난을 농도별(1, 5, 10 및 25 μM)로 함께 처리한 실험군과 DMSO 0.1% 처리한 대조군 및 PPARα 리간드로서 공지된 화합물인 Wy-14643(Sigma, USA)을 농도별(1, 5, 10 및 25 μM)로 함께 처리한 것을 비교하였다.

그 결과, 도 7A에 나타난 바와 같이 메이스리그난은 PPARα 활성을 농도 의존적으로 증가 시켰고, 처리한 모든 농도에서 대조군과 비교 했을 때 유의적인 차이(*, p < 0.01)를 보였다. 예를 들어, 25 μM을 각각 처리하였을 때, 비교화합물인 Wy-14643의 활성은 대조군에 비해 약 16 배 높았고. 본 발명의 메이스리그난에 의해 유도된 루시퍼라제 활성은 대조군보다 약 14 배 높았다. 이는 본 발명의 천연물질인 메이스리그난이 PPARα의 리간드로써 PPARα를 활성화 시켰을 뿐 아니라 공지된 PPARα의 리간드인 합성물질 Wy-14643와 비슷한 활성을 나타내어 효율적으로 PPARα를 활성화시킴을 알 수 있었다.

<2-2> 육두구 ( nutmeg )의 추출물에 의한 PPAR α의 활성화

미리스티카 프라그란스(Myristica fragrans)의 육두구(nutmeg)의 100% 에탄올 추출물이 PPARα의 리간드로 작용하는 지 알아보기 위하여, 육두구의 추출물을 10 ㎍/ml으로 처리한 실험군과 DMSO 0.1% 처리한 대조군 및 Wy-14643(Sigma, USA)을 10 μM로 처리한 대조군을 사용한 것 이외에 상기 <2-1>과 동일하게 하여 PPARα 활성화 능력을 확인하였다. 이 때, 육두구의 추출물은 건조 분쇄한 육두구(nutmeg) 100 g에 100% 에탄올 400 ㎖을 가하여 상온에서 이틀 동안 방치한 후, 추출된 용액을 여과하고 진공 농축한 것을 사용하였다.

그 결과, 도 7B에 나타난 바와 같이 육두구의 100% 에탄올 추출물은 PPARα 활성을 대조군에 비해 2.42배 증가 시켰고, 대조군과 비교 했을 때 유의적인 차이(*, p < 0.05)를 보여 육두구의 추출물이 효율적으로 PPARα를 활성화시킴을 알 수 있었다.

< 실시예 3> 메이스리그난의 PPAR α 활성화에 따른 목표유전자의 발현 확인

10% FBS가 포함된 DMEM 배지에서 배양된 SK-HEP-1 간세포(ATCC CL-173)를 1× 10⁶개씩 분주하여 5시간동안 추가로 배양하였다. 배양된 세포의 배지에 메이스리그난을 농도별(1, 5, 10 및 25 μM)로 첨가하여 24시간 방치하였다. 세포를 수득하고, 트리졸(TRIZOL; Invitrogen, USA)을 사용하여 총 RNA를 분리하였다. 분리한 총 RNA는 정량하여 역전사효소를 이용하여 42℃에서 20분간 cDNA를 합성하였다. 이를 각각 CD36 증폭용 프라이머(서열번호 3(CGGCGATGAGAAAGCAGAA) 및 서열번호 4(CAACCAGGCCCAGGAGC)), CPT-1 증폭용 프라이머(서열번호 5(AGACGGTGGAACAGAGGCTGAAG) 및 서열번호 6(TGAGACCAAACAAAGTGATGATGTCAG)), PDK4증폭용 프라이머(서열번호 7(TCAAATCAAAATAGCCTTCCC) 및 서열번호 8(ATAAGTTAAGTGGGCCTGG)) 및 ACO 증폭용 프라이머(서열번호 9(GGGCATGGCTATTCTCATTGC) 및 서열번호 10(CGAACAAGGTCAACAGAAGTTAGGTTC))와 Taq Polymerase를 이용하여 95℃에서 1분, 56℃ 30초, 72℃에서 2분을 30번 반복하여 RT-PCR을 실시하였다.

그 결과, 도 8에서 보는 바와 같이, PPARα에 의해 발현이 증가되는 목표유전자인 CD36, CPT-1, PDK4, ACO의 mRNA 발현이 메이스리그난의 처리시 모든 실험군에서 대조군에 비해 유의적으로(*, p < 0.01; **, p < 0.05) 증가함을 확인하였다. 이는 본 발명의 메이스리그난이 PPARα을 활성화시켜 PPARα의 목표 유전자들의 발현을 조절할 수 있음을 의미한다.

< 실시예 4> 메이스리그난의 항비만 효과 확인

본 실시예에서 비만 모델동물로서 이용된 비만/당뇨 마우스(ob/ob mouse)는 렙틴 유전자의 결핍으로 식욕이 조절되지 않아 지속적으로 음식을 과도하게 섭취하게 된다. 그 결과, 지방이 체내에 과도하게 축적되며 일반 마우스에 비하여 과도한 체중과 고지혈을 가지는 전형적인 비만 및 대사성 질환의 모델이 된다.

이를 이용하여 메이스리그난의 항비만에 대한 효과를 알아보기 위하여 성숙한 10 주령의 비만/당뇨 마우스(ob/ob mouse)를 실험군 마다 각각 10 마리씩 사용하였다. 실험군으로는 메이스리그난을 0.25% 카르복시메틸 셀룰로스(carboxymethyl cellulose)에 현탁하여 10 mg/kg의 투여농도로 1일 1회씩 10일 동안 일정한 시간에 경구 투여하였고, 대조군의 경우는 실험군이 섭취하는 양과 동일한 양의 0.25% 카르복시메틸 셀룰로스만을 경구 투여하였다.

경구 투여시작 10 일후에 실험군과 대조군의 체중을 측정한 결과, 대조군의 경우 체중이 50.32 ± 3.16 g 인 것과 비교하여, 메이스리그난을 처리한 군은 44.21 ± 2.25 g 으로 유의하게(p < 0.01) 체중이 감소하는 현상을 보여 메이스리그난의 비만에 대한 예방 및 치료효과를 관찰할 수 있었다.

< 실시예 5> 메이스리그난의 항비만 효과 확인

본 실시예에서 모델동물(비만/당뇨 마우스)로서 이용된 마우스(db/db mouse; The Jackson Laboratory, USA)는 렙틴 유전자의 결핍으로 식욕이 조절되지 않아 지속적으로 음식을 과도하게 섭취하게 된다. 그 결과, 지방이 체내에 과도하게 축적되며 일반 마우스에 비하여 과도한 체중과 고지혈을 가져, 전형적인 비만 및 대사성 질환의 모델이 된다.

이를 이용하여 메이스리그난의 항비만에 대한 효과를 알아보기 위하여 성숙한 10 주령의 상기 마우스를 실험군마다 각각 7 마리씩 사용하였다. 실험군으로는 메이스리그난을 0.25% 카르복시메틸 셀룰로스에 현탁하여 각각 5mg/kg체중, 10 mg/kg체중 및 25mg/kg체중의 투여농도로 1일 1회씩 14일 동안 일정한 시간에 경구 투여하였고, 실험군이 섭취하는 양과 동일한 양의 0.25% 카르복시메틸 셀룰로스만을 경구 투여한 정상 마우스, 실험군이 섭취하는 양과 동일한 양의 0.25% 카르복시메틸 셀룰로스만을 경구 투여한 비만/당뇨 마우스 대조군과 트로글리타존을 10mg/kg체중을 경구 투여한 군을 사용하였다. 투여시작 6일 전부터 비만/당뇨 마우스의 식이량과 개체의 무게를 3일에 한번씩 측정하였다. 또한 경구 투여시작 14일후 지방조직(white adipose tissue)의 무게와 근육내에 축적된 중성지방(triglyceride)의 양을 측정하였다(중성지방측정용 Kit, Wako, no. 432-40201, Japan).

투여후 14일동안 실험군과 대조군의 식이량과 체중의 변화를 측정한 결과, 도 9에서 보는 바와 같이 식이량은 대조군과 실험군의 차이가 없는 반면에 도 10에서 보는 바와 같이 경구투여 14일째 대조군의 경우 체중이 48.16 ± 2.09 g 인 것과 비교하여, 메이스리그난을 5 mg/kg체중, 10 mg/kg체중 및 25 mg/kg체중으로 처리한 군은 각각 46.32 ± 2.31 g, 43.8 ± 2.94 g, 41.80 ± 1.56 g 으로 나타나 체중이 감소하는 현상을 보였으며(p < 0.05) 경구투여 14일 후 지방조직의 무게는 도 11에서 보는 바와 같이 대조군의 지방조직의 무게는 대조군의 경우 4508.30 ± 605.20 mg인 것과 비교하여, 메이스리그난을 5 mg/kg체중, 10 mg/kg체중 및 25 mg/kg체중으로 처리한 군은 각각 4231.9 ± 284.5 mg, 3904.1±278.6 mg, 2689.40 ± 154.2 mg 으로 지방조직이 감소하는 현상을 나타났다(p < 0.05). 근육내의 중성지방의 축적은 도 12에서 보는 바와 같이 대조군이 27.62 ± 2.44 mg/g인 것에 비해 메이스리그난을 5 mg/kg체중, 10 mg/kg체중 및 25 mg/kg체중으로 처리한 군은 각각 24.73 ± 4.74 mg/g체중, 22.80 ± 5.76 mg/g체중, 20.24 ± 3.82 mg/g체중으로 측정되어 근육내의 지방축적을 감소시키는 현상이 나타났다(p < 0.05). 이와 같이 비만/당뇨 마우스 모델에서 메이스리그난을 경구투여한 결과 체중 및 지방조직의 무게가 감소하고 근육 내 지방의 축적이 감소한 결과를 종합하여 볼 때 메이스리그난의 비만에 대한 예방 및 치료효과를 확인할 수 있었다.

< 실시예 6> 메이스리그난의 항고지혈증 및 항심장 혈관 질환 효과 확인

메이스리그난의 고지혈증 및 심장 혈관 질환에 대한 치료효과를 알아보기 위하여 성숙한 10 주령의 비만/당뇨 마우스(ob/ob mouse)를 실험군 마다 각각 10마리씩 사용하였다. 실험군으로는 메이스리그난을 0.25% 카르복시메틸 셀룰로스(carboxymethyl cellulose)에 현탁하여 10 mg/kg의 투여농도로 1일 1회씩 10일 동안 일정한 시간에 경구 투여하였고, 대조군의 경우는 실험군이 섭취하는 양과 동일한 양의 0.25% 카르복시메틸 셀룰로스만을 경구 투여하였다.

경구 투여시작 10 일후에 실험군과 대조군의 혈액 내 중성지방을 측정한 결과 대조군의 경우 94.00 ± 21.86 mg/dl 인 것과 비교하여, 메이스리그난을 처리한 군은 61.5 ± 17.31 mg/dl 로 혈액 내 중성지방이 유의하게(p < 0.01)감소하는 현상을 보여 메이스리그난의 고지혈증 및 심장 혈관 질환에 대한 예방 및 치료효과를 관찰할 수 있었다.

< 실시예 7> 메이스리그난의 항고지혈증 및 항심장 혈관 질환 효과 확인

메이스리그난의 고지혈증 및 심장 혈관 질환에 대한 치료효과를 알아보기 위하여 성숙한 10 주령의 비만/당뇨 마우스(db/db mouse)를 실험군 마다 각각 7마리씩 사용하였다. 실험군으로는 메이스리그난을 0.25% 카르복시메틸 셀룰로스에 현탁하여 5 mg/kg체중, 10 mg/kg체중 및 25 mg/kg체중의 투여농도로 1일 1회씩 14일 동안 일정한 시간에 경구 투여하였고, 대조군의 경우는 실험군이 섭취하는 양과 동일한 양의 0.25% 카르복시메틸 셀룰로스만을 경구 투여한 정상 마우스, 실험군이 섭취하는 양과 동일한 양의 0.25% 카르복시메틸 셀룰로스만을 경구 투여한 비만/당뇨 마우스 대조군과 트로글리타존을 10mg/kg체중을 경구 투여한 군을 사용하였다.

투여시작 14 일후에 실험군과 대조군의 혈중 중성지방(중성지방측정용 Kit, Wako, Japan), 자유지방산(free fatty acid)(자유지방산 측정용 Kit, Wako, Japan), 혈중 총 콜레스테롤(ASAN T-CHO-Lq Reagents), 아산제약, Korea), HDL-콜레스테롤(ASAN HDL-Cholesterol, 아산제약, Korea), 혈중 IL-6(IL-6 Quantikine ELISA Kit, R & D systems, USA) 및 TNF-α(TNF-α Quantikine ELISA Kit. R & D systems, USA)의 양을 측정하였다.

그 결과, 하기 표 2와 도 13 내지 도 18과 같이 혈중 중성지방, 자유지방산, IL-6, TNF-α는 유의적으로 감소하였으며, 혈중 총 콜레스테롤의 양은 대조군과 실험군에서 유의적 차이가 없었는데 비해 혈중 HDL-콜레스테롤은 유의적으로 증가하였음을 알 수 있었다.

	정상 마우스	음성대조군	트리글리타존 10mg/kg체중	메이스리그난 5mg/kg체중	메이스리그난 10mg/kg체중	메이스리그난 25mg/kg체중
혈중 중성지방(mg/dl)	72.57±36.36	279.29 ± 67.89	112.57± 57.47	98.71 ± 36.62	91.71 ± 44.04	84.00 ± 31.24
혈중 자유지방산(mEq/l)	0.76±0.27	1.69± 0.34	1.22±0.27	1.26±0.19	1.16±0.31	1.14 ± 0.15
혈중 총 콜레스테롤(ng/ml)	98.33±19.69	146.29±12.67	133.67±34.86	118.86±13.75	109.71±15.25	110.40±23.72
혈중 HDL-콜레스테롤(ng/ml)	35.74±6.41	23.07 ± 8.97	43.85±6.34	43.50 ± 6.73	42.17 ± 7.29	46.58 ± 3.89
혈중 IL-6(pg/ml)	3.97±1.60	36.42±10.2	10.24±3.60	21.42±11.42	12.04±5.47	4.86±2.46
혈중 TNF-α(pg/ml)	24.99±8.04	49.59± 9.86	30.49±13.18	36.92±16.27	16.41±9.60	27.54±9.77

따라서 비만/당뇨 마우스 마우스 모델에서 메이스리그난을 처리한 군에서 혈중 중성지방 및 자유지방산, 혈중 IL-6, TNF-α의 농도가 감소하고 HDL-콜레스테롤이 증가하는 현상이 보여 메이스리그난의 고지혈증 및 심혈관계 질환에 대한 예방 및 치료효과를 확인할 수 있었다.

< 실시예 8> 메이스리그난의 지방간 예방 및 치료 효과 검정

메이스리그난의 지방간 예방 및 치료효과를 알아보기 위하여 성숙한 10 주령의 비만/당뇨 마우스(db/db mouse)를 실험군마다 각각 7 마리씩 사용하였다. 실험군으로는 메이스리그난을 0.25% 카르복시메틸 셀룰로스에 현탁하여 5 mg/kg체중, 10 mg/kg체중, 25 mg/kg체중의 투여농도로 1일 1회씩 14일 동안 일정한 시간에 투여하였고, 대조군의 경우는 실험군이 섭취하는 양과 동일한 양의 0.25% 카르복시메틸 셀룰로스만을 경구 투여한 정상 마우스, 실험군이 섭취하는 양과 동일한 양의 0.25% 카르복시메틸 셀룰로스만을 경구 투여한 비만/당뇨 마우스 대조군과 트로글리타존을 10mg/kg체중을 경구 투여한 군을 사용하였다. 경구 투여시작 14일후 간 조직을 분리하여 분쇄한 후 총 지질 및 지방을 추출한 후 간 조직 내에 축적된 중성지방(triglyceride)의 함량을 측정하였다.

그 결과 도 19에서 보는 바와 같이 간조직 내 중성지방의 함량이 대조군의 경우 10.32 ± 1.72 mg/g 인 것과 비교하여, 메이스리그난 25 mg/kg을 처리한 군은 6.30 ± 1.59 mg/g 로 혈액 내 중성지방이 유의하게(*, p < 0.05) 감소하는 현상을 보여 메이스리그난의 지방간의 예방 및 치료효과를 확인할 수 있었다.

< 실시예 9> 비만/당뇨 마우스 모델에서 PPAR α 활성화에 따른 목표유전자의 발현 확인

실시예 5, 7 및 8에서 경구투여된 실험군 및 대조군에서 간 조직만을 적출하였다. 적출된 간을 액체질소 내에서 냉동 분쇄 시킨 후 분쇄된 조직을 TRIZOL(Invitrogen, USA)를 사용하여 총 RNA를 분리하였다. 분리한 총 RNA는 정량한 후 각 시료별 동일량의 RNA를 역전사효소를 이용하여 42℃에서 20분간 cDNA를 합성하였다. 이를 각각 CD36 증폭용 프라이머(서열번호 3 및 서열번호 4), ACO 증폭용 프라이머(서열번호 9 및 서열번호 10) 및 CPT-1 증폭용 프라이머(서열번호 5 및 서열번호 6)와 Taq Polymerase를 이용하여 95℃에서 1분, 56℃ 30초, 72℃에서 2분을 30번 반복하여 RT-PCR을 실시하였으며, 실시간 PCR(real-time PCR)로 유전자의 발현을 정량화 하였다.

그 결과, 도 20에서 보는 바와 같이, PPARα활성에 의해 발현이 증가되는 목표유전자 CD36과 ACO 그리고 CPT-1의 mRNA 발현은 각 농도별로 메이스리그난을 처리 했을 때, 모든 실험군이 대조군에 비해 유의적으로(*, p < 0.05) 증가함을 확인하였다. 이 때, 도 20의 그래프는 실시예 5, 7 및 8에서 사용된 각각의 마우스에서 얻은 결과를 통계적으로 처리한 것이며, 사진은 그 중 대표적인 결과를 예시한 것이다. 이러한 결과는 본 발명의 메이스리그난이 PPARα를 활성화시켜 지방산 산화, 지방대사, 염증억제에 중요한 PPARα의 목표 유전자들의 발현을 조절하여 혈중 및 간조직의 지방을 감소시켜 PPAR에 의해 매개되는 고지혈증 과 심혈관계 질환 및 지방간을 예방 및 치료할 수 있음을 알 수 있었다.

< 제조예 1> 본 발명에 따른 비만 및 고지혈증, 심장 혈관 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 함유하는 약제의 제조

<1-1> 정제의 제조

본 발명의 메이스리그난 25㎎을 부형제 직타용 락토오스 26㎎과 아비셀(미결정 셀룰로오스) 3.5㎎, 붕해 보조제인 나트륨 전분 글리코네이트 1.5㎎, 그리고 결합제인 직타용 L-HPC(low-hydrosyprophylcellulose) 8㎎과 함께 U형 혼합기에 넣고 20분간 혼합하였다. 혼합이 완료된 후 활탁제로서 마그네슘 스테아레이트 1㎎을 추가로 첨가하고 3분간 혼합하였다. 정량 시험과 항습도 시험을 거쳐 타정하고 필름 코팅하여 정제를 제조하였다.

<1-2> 시럽제의 제조

본 발명의 메이스리그난 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분 2%(W/V)로 함유하는 시럽은 다음과 같은 방법으로 제조하였다: 본 발명의 메이스리그난의 산부가염 2g, 사카린 0.8g 및 당 25.4g을 온수 80g에 용해시켰다. 상기 용액을 냉각시킨 후, 여기에 글리세린 8.0g, 향미료 0.04g, 에탄올 4.0g, 소르브산 0.4g 및 적량의 증류수를 혼합하였다. 상기 혼합물에 물을 첨가하여 100 ㎖가 되도록 하였다.

<1-3> 캡슐제의 제조

본 발명의 메이스리그난 50㎎, 유당 50㎎, 전분 46.5㎎, 탈크 1㎎ 및 적량의 스테아린산 마그네슘을 혼합하고 이를 경질 젤라틴 캡슐에 충진함으로써 캡슐제를 제조하였다.

<1-4> 주사액제의 제조

유효성분 10㎎을 함유하는 주사액제는 다음과 같은 방법으로 제조하였다: 본 발명의 메이스리그난의 염산염 1g, 염화나트륨 0.6g 및 아스코르브산 0.1g을 증류수에 용해시켜서 100㎖를 제조하였다. 상기 용액을 병에 넣고 20℃에서 30분간 가열하여 멸균시켰다.

이상에서 설명한 바와 같이 본 발명의 조성물은 메이스리그난 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 가지므로 PPARα의 리간드로 작용하여 PPARα를 활성화하게 되므로 PPARα에 의해 매개되는 질환을 예방 및 치료하는 효과를 갖는다. 따라서 본 발명의 조성물은 비만, 고지혈증 및 심혈관계 질환과 같은 PPARα에 의해 매개되는 질환을 예방 및 치료하는 목적으로 사용할 수 있다.

<110> Biocare Co. <120> Composition for preventing or treating a PPARa-mediated disease comprising macelignan or pharmaceutically acceptable salt thereof as a active ingredient <130> NP06-1090 <150> KR10-2005-0087991 <151> 2005-09-22 <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPARa forward <400> 1 cttggatccg aacatgacat a 21 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPARa reverse <400> 2 tggggtacct gtggctgat 19 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD36 forward <400> 3 cggcgatgag aaagcagaa 19 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD36 reverse <400> 4 caaccaggcc caggagc 17 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CPT-1 forward <400> 5 agacggtgga acagaggctg aag 23 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CPT-1 reverse <400> 6 tgagaccaaa caaagtgatg atgtcag 27 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDK4 forward <400> 7 tcaaatcaaa atagccttcc c 21 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDK4 reverse <400> 8 ataagttaag tgggcctgg 19 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACO forward <400> 9 gggcatggct attctcattg c 21 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACO reverse <400> 10 cgaacaaggt caacagaagt taggttc 27

Claims (4)

1. 하기 화학식 (I)로 표시되는 메이스리그난 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 PPARα에 의해 매개되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물.

   [화학식 I]

   
2. 제1항에 있어서, 상기 PPARα에 의해 매개되는 질환은 비만(obesity), 고지질증(hyperlipidemia), X 증후군(syndrome X), 고콜레스테롤증(hypercholesterolemia), 고지질단백질증(hyperlipoproteinemia), 동맥경화증(atherosclerosis), 고혈압(hypertension), 대사이상증후군(dysmetabolic syndrome), 고중성지방혈증(hypertriglyceridemia), 골다공증(osteoporosis), 및 사구체신염(glomerulonephritis)로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 조성물.
3. 육두구(nutmeg) 추출물을 유효성분으로 함유하는 PPARα에 의해 매개되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
4. 제3항에 있어서, 상기 PPARα에 의해 매개되는 질환은 비만(obesity), 고지질증(hyperlipidemia), X 증후군(syndrome X), 고콜레스테롤증(hypercholesterolemia), 고지질단백질증(hyperlipoproteinemia), 동맥경화증(atherosclerosis), 고혈압(hypertension), 대사이상증후군(dysmetabolic syndrome), 고중성지방혈증(hypertriglyceridemia), 골다공증(osteoporosis), 및 사구체신염(glomerulonephritis)로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 조성물.

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