KR101074030B1

KR101074030B1 - 이데솔리드의 신규 용도

Info

Publication number: KR101074030B1
Application number: KR1020090130668A
Authority: KR
Inventors: 김택중; 최인호
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2009-12-24
Filing date: 2009-12-24
Publication date: 2011-10-17
Also published as: KR20110073877A

Abstract

본 발명은 하기 화학식 (I)의 화합물, 그의 염 또는 용매화물, 이의 제조 방법 및 이를 유효성분으로 포함하는 근 위축 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 화학식 (I)의 화합물은 기존의 공지된 근 위축 억제제에 비해 우수한 근 위축 억제 활성을 나타내는 바, 근 위축과 연관된 질환의 예방 또는 치료를 위해 유용하게 사용될 수 있다.

[화학식 1]

이데솔리드, 근 위축

Description

이데솔리드의 신규 용도{Novel use of idesolide}

본 발명은 근 위축의 치료 또는 예방용 의약 및 식품의 제조를 위한 이데솔리드의 신규 용도에 관한 것이다.

골격근은 수축작용을 통해 운동을 포함한 대부분의 생존 활동을 가능하게 한다. 그러나 장기간 무중력 상태에 노출되면 근조직은 질량을 현저하게 상실하고(위축증), 심각한 근력 저하를 야기하게 된다. 근세포는 액틴과 미오신 필라멘트로 채워진 근원섬유의 수축작용으로 근력을 발생한다. 이들 필라멘트는 액틴, 미오신, 트로포닌, 트로포미오신 등 다양한 근단백질로 형성되어 있으며, 수축 요구량에 따라 관련 유전자의 단백질 발현이 조절된다. 만약 우리가 미소중력 또는 하지현수(hindlimb suspension)와 같은 무부하 상태에 있게 되면 지상에서는 중력에 대응하여 지속적으로 수축운동을 일으키던 근조직이 심각한 위축을 일으킨다. 예를 들어 17일간 우주비행을 마친 우주인의 가자미근(soleus muscle)은 단면적이 15%, 근력은 34% 감소하였으며, 2주간 하지현수를 겪은 흰쥐의 경우 가자미근 질량과 근력이 대조군에 비해 37%-45% 감소하는 것으로 보고되었다. 이러한 현상은 무부하 상태에서 근단백질의 생성이 감소되는 반면 분해는 증가되기 때문이다. 이차원전기영 동법(2-DE)을 통한 근단백질의 발현 증감을 조사해보면 근단백질 및 스트레스단백질(heat shock protein, HSP) 등의 발현이 32%에서 최대 80%까지 감소하는 것으로 밝혀졌다[참조:Lee K et al., J Cell. Biochem., 104, 642-656(2008)]. HSP은 chaperones으로서 다른 단백질들의 생성과 재생, 손상된 단백질의 복구 등을 도와주고 항산화작용 및 세포 보호기능도 하는 것으로 밝혀지고 있다[참조:Sarah, M. et al., FASEB Journal, 22, 3836-3845(2008)]. 만일 이러한 HSP 발현이 무부하 상태에서 감소된다면 근단백질 양의 감소과 세포사멸이 더욱 진행될 수밖에 없다. 따라서 우주 미소중력에서 유발되는 근위축을 억제하려면 이들 근단백질 및 HSP의 생성을 촉진하는 동시에 분해는 억제시켜야 한다.

근세포의 활성은 이에 전달되는 신경전달물질, 호르몬, 물리적 스트레스 등 다양한 자극요인에 의해 조절된다. 무부하 상태에서는 이러한 자극요인의 변화로 근세포의 활성이 감소되고, 근단백질의 생성저하와 분해촉진에 따라 근위축이 유발되는 것이다. 최근까지 선행 연구들에 의해 밝혀지고 있는 근위축의 주원인은 산화물질 증가에 의한 근세포 손상, 스트레스단백질(heat shock proteins) 발현 감소로 인한 근단백질 생성-재생 감소, proteasomal ubiquitination 활성화에 따른 근단백질 분해 촉진 등을 들 수 있다. 현재까지는 운동 프로그램이 우주선 내에서 이용된 유일한 대응방법이지만 근위축을 억제하기에 역부족이며, 따라서 상기 다양한 문제들을 해결할 수 있는 대안을 찾아야 한다.

현대인들의 근위축의 원인은 인체내 유리기 생성과 관련되어 있다. 이러한 유리기는 인체에 다양한 스트레스를 일으켜 노화뿐만 아니라 만성알콜중독, 죽상 동맥경화증, 암, 관상심장질환, 백내장, 당뇨병, 다운 증후군, 간염, 허혈이나 재관류성 손상, 류마티스성 관절염 및 신부전증 등 각종질병의 원인이 되고 있다[참고: Wink, D. A. et al., Free Radical Biology amp; Medicine 25, 434-456(1998)].

근 위축에는, 예를 들면, 근 위축성 측색(側索) 경화증, 진행성 척수성 근 위축, 쿠겔버그-벨란더 질환, 베르드니히-호프만 질환 등의 신경원성 근 위축(neurogenic atrophy) 및, 예를 들면, 진행성 근 이영양증(dystrophy)[듀시엔형, 베커형, 지대(肢帶)형, 안면형갑상완형, 근 긴장성 이영양증] 등의 근원성 근 위축(myogenic atrophy)이 포함된다.

근 위축시에는, 위축된 근육내에서 TBA (티오바르비투르산) 반응 양성물질(TBARS)의 증가, 산화형 글루타티온(GSSG)의 증가, 총 글루타티온에 대한 GSSG의 비의 증가가 확인되며, 지질 과산화반응의 항진 및 산화 스트레스의 증가가 시사되고 있다[참조: Kondo, H. et al., Acta. Physiol. Scand., 142, 527-528(1991)]. 또한, 근 위축시에는, 위축된 근육의 마이크로좀 분획에서 철의 증가와 함께 TBARS의 증가가 보여지며 이러한 철의 증가가 하이드록시 라디칼의 생성을 증대시키고, 이로써 과산화 지질이 증가하는 것이 시사되고 있다[참조: Kondo, H. et al., Acta. Physiol. Scand., 142, 527-528(1991)].

모든 호기성 유기체는 대사과정 중에서 필연적으로 해로운 활성 산소종을 수반하게 되므로, 이 활성 산소종을 제거하는 기작을 모든 유기체가 가지고 있어야 생존이 가능하다. 활성 산소종은 크게 과산화수소와 같이 산소 라디칼종을 형성하 게 하는 화합물과 산소 라디칼종의 두 가지로 분류될 수 있다. 이미 알려진 바와 같이, 과산화수소는 카탈라제(catalase)나 페록시다제(peroxidase)에 의해 산소나 물로 전환되나, 산소 라디칼종 제거 기작의 경우, 수퍼옥사이드 음이온(O2-, superoxide anion)을 제거하는 기작 이외의 다른 산소 라디칼종 제거 기작은 아직 확실히 규명되지 않은 상태이다.

산소 라디칼종의 일종인 하이드록실 라디칼은 생명체 내에서 과산화수소(H2O2) 및 산소(O2)의 반응에 의해 형성되며, 거의 모든 생체물질 (biomolecules)에 존재하는 것으로 알려져 있다[참고: Fidovich, et al., Ann. Rev. Biochem., 44, 147-159(1975); Tauber et al., Blood, 53, 666-676(1979)]. 따라서, 생체 내에서의 항상성을 유지하기 위해서는 필연적으로 반응성이 강한 하이드록실 라디칼에 대한 방어가 요구된다고 하는 것은 자명하다. 이와 관련하여, 아스코르빈산, 요산 등 유기물질이 화학반응을 통해 하이드록실 라디칼을 제거하는 것으로 알려져 있으나, 이는 근원적으로 하이드록실 라디칼을 제거하는 것이 아니라 반응성이 적은 라디칼로 변환시킴은 물론, 생체 내에서 산화제로 철과 같은 전이금속과 반응하여 오히려 활성 산소 라디칼종의 생성을 촉진시킬 수 있는 것으로 보고되고 있다[참고: Borg, D. C. et al., Free Radicals and Antioxidant in Biomedicine, vol I, 63-80(1989)].

지금까지 알려진 합성 항산화제로는 BHA(Butylated hydroxy anisole), BHT(Butylated hydroxy toluene) 및 NDGA(Nordihydro-guaiaretic acid), 토코페롤 등이 있으며, 천연 항산화제로는 수퍼옥시다이드 디뮤스타제, 퍼옥시다아제, 카탈 라아제, 글루타치온 퍼옥시다아제 등의 항산화 효소와 비타민 E, 비타민 C, 글루타치온 등의 비효소적 항산화 물질이 있다. 그러나, 합성 항산화제는 생체 내에서 독성을 나타내어 알러지와 종양을 발생시킬 수 있으며, 온도에 약해 한번 열을 가하면 쉽게 파괴되는 단점이 있다. 반면에 천연 항산화제는 합성 항산화제에 비교하여 생체에 안전한 장점은 있지만, 그 효과가 약하다는 단점이 있다.

본 발명자들은 상기한 목적 달성을 위해 예의 연구를 거듭하는 과정에서, 산화 스트레스의 관여가 시사되어 있는 근 위축의 억제에는 HSP(heat shock protein)의 발현 향상 및 항산화 작용을 갖는 물질의 섭취가 효과적이라는 관점에서 각종 항산화 작용을 갖는 물질에 관하여 검토를 거듭했다. 그 결과, 이나무에서 추출한 이데솔리드가 HSP70단백질 발현증가에 의한 근세포 손상을 억제하고 근 위축에 대하여 억제 효과를 나타낸다는 사실을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명은 근 위축과 관련된 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 이데솔리드의 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 과제의 해결을 위해 본 발명은 하기 화학식 (I)의 화합물, 그의 염 또 는 용매화물을 유효성분으로 포함하는 근 위축 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 화학식 (I)의 화합물은 이나무(Idesia polycarpa Maxim.)로부터 분리된 천연 화합물로서, 기존의 공지된 근 위축 억제제에 비해 우수한 근 위축 억제 활성을 나타내는 바, 근 위축 억제와 연관된 질환의 치료를 위해 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명은 하기 화학식 (I)의 화합물, 그의 염 또는 용매화물을 유효성분으로 포함하는 근 위축 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

[화학식 I]

본 발명의 조성물의 유효성분인 이데솔리드는 공지의 화학적 방법으로 합성하거나 이나무 열매의 추출물로부터 분리, 정제하여 얻을 수 있다. 이나무 열매 추출물로부터 이데솔리드를 분리, 정제할 경우 추출을 위해 건조 또는 미건조시킨 복 분자 열매 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있다. 추출의 효율성을 위해 이나무 열매은 잘게 부수어 사용될 수 있다. 또한, 효과적인 이나무 열매 추출물을 얻기 위해, 분쇄 전에 약 100℃의 높은 온도에서 약 5분간 블랜칭(blanching)을 수행하여 생체 세포내 효소를 불활성화시키는 과정을 거칠 수 있다.

이나무 열매 추출물의 제조를 위해서는 복분자 열매의 1 내지 10 배의 추출 용매를 사용하여 통상적인 추출 방법에 따라 추출할 수 있다.

추출 용매로는 천연물 추출에서 널리 이용되고 있는 물, 유기 용매 또는 이들의 혼합 용매를 이용하여 추출될 수 있다. 상기 유기 용매로는 메탄올 또는 에탄올이 포함된다. 이 경우 메탄올 또는 에탄올은 물과 혼합하여 사용할 수 있으나, 활성 성분의 용이한 용출을 위해서는 물과 혼합하지 않고 사용할 수도 있다. 상기 이나무 열매 추출물은 유기 용매, 예컨대, 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 알코올 등을 사용하여 추가로 분획할 수 있다. 또한, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography), 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 등과 같은 다양한 크로마토그래피를 이용하여 추가로 정제된 분획을 얻을 수도 있다. 본 발명의 한 실시예에서는, 이나무 열매의 메탄올 추출물 중 클로로포름 분획을 물과 메탄올로 다시 역상 레진 컬럼크로마토그라피를 수행하여 소분획을 얻고, 이를 다시 실리카겔 컬럼 크로마토그라피하여 얻은 소분획으로부터 이데솔리드를 얻는다. 본 발명의 조성물에서 사용되는 유효성분인 이데솔리드는 이와 같이 천연 물질인 이나무 추출물로부터 얻은 것이므로 기존의 유기합성 약제에 비해 부작용이 없고, 안전성이 매우 높다.

일반식 I의 화합물의 염은 약제학적으로 또는 생리학적으로 허용 가능한 염을 의미하며, 무기산 또는 유기산 또는 염기로 형성되는 통상적인 비독성염 또는 사차 암모늄염을 포함한다. 이러한 산부가염의 예로는 아세테이트, 아디페이트, 벤조에이트, 벤젠술포네이트, 시트레이트, 캄포레이트, 도데실술페이트, 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 락테이트, 말레에이트, 메탄술포네이트, 니트레이트, 옥살레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 숙시네이트, 술페이트 및 타르트레이트를 들 수 있다. 염기성 염으로는 암모늄염, 나트륨염 및 칼륨염 등의 알칼리 금속염, 칼슘염 및 마그네슘염 등의 알칼리 토금속염, 디사이클로헥실아미노염 등의 유기 염기와의 염 및 아르기닌 등의 아미노산과의 염을 들 수 있다. 또한, 염기성 질소 함유기는 예를 들면, 할로겐화알킬로 사급화될 수 있다.

또한, 본 발명의 화합물은 하나 이상의 다형체 또는 비결정질 결정성 형태를 가질 수 있고, 그 자체로서 본 발명의 범위 내에 포함된다. 또한, 화합물은 예를 들면 물 (즉, 수화물) 또는 범용 유기 용매와 용매화물을 형성할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 용어 "용매화물"은 본 발명의 화합물과 하나 이상의 용매 분자의 물리적 결합을 의미한다. 이러한 물리적 결합은 수소 결합을 포함하여, 이온 및 공유 결합 정도를 변화시키는 것을 포함한다. 경우에 따라서는, 용매화물은 예를 들면, 하나 이상의 용매 분자가 결정성 고체의 결정격자 내에 혼입되는 경우에는 분리될 수 있을 것이다. 용어 "용매화물"은 액상 및 분리 가능한 용매화물을 포함하도록 이루어진 것이다. 적절한 용매화물의 비한정적인 예로는 에탄올레이트, 메탄올레이 트 등을 들 수 있다.

본 발명에 따른 상기 화학식 (I)의 화합물은 하기 실시예에서 확인할 수 있는 바와 같이, 탁월한 근 위축 억제 활성을 갖는다. 따라서, 본 발명은 근 위축 예방 또는 치료용 의약의 제조를 위한 상기 화학식 (I)의 화합물, 그의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물의 용도 및 치료학적 유효량의 상기 화학식 (I)의 화합물, 그의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는 근 위축 억제 방법을 제공한다.

한 구체예에서, 상기 조성물은 근 위축과 연관된 질환, 예를 들어, 우주의 무중력 상태로 인한 근 위축, 근위축성 측삭경화증, 또는 근 위축 증상을 갖는 신체 장애인의 재활치료를 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 의약 조성물은 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등의 가용화제를 사용할 수 있다.

본 발명의 의약 조성물은 투여를 위해서 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 의약 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 의약 조성물의 약제 제제 형태는 과립제, 산제, 피복정, 정제, 캡슐제, 좌제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있다.

본 발명의 의약 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.

본 발명의 의약 조성물의 유효성분의 유효량은 질환의 예방 또는 치료, 또는 근 위축 억제 효과를 이루는데 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 예컨대, 성인의 경우, 본 발명의 화합물은 1일 1회 내지 수회 투여시, 0.01~500mg/kg의 용량으로 투여할 수 있다. 바람직하게는 0.1∼200mg/kg, 보 다 바람직하게는 0.1∼100mg/kg을 일일 1 내지 3회 투여할 수 있다. 이렇게 제형화된 단위투여형 제제는 필요에 따라 일정시간 간격으로 수회 투여할 수 있다.

본 발명에 있어서, '대상체'는 인간, 오랑우탄, 침팬지, 마우스, 랫트, 개, 소, 닭, 돼지, 염소, 양 등을 포함하나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, '치료'는 본 발명에 기재된 장애의 임의의 증상의 임의 감소가 포함된다. 증상의 감소 또는 축소뿐만 아니라, 치료는 또한 악화가 예상되는 환자의 현 상태를 유지하는 것, 또는 증상, 장애, 또는 질환의 개시가 예상되는 개체에서 증상의 발생을 예방하는 것을 또한 포함한다. 치료는 상태, 장애 또는 질환의 예상되는 증상 또는 예상되는 진행에 비한 감소를 포함할 수 있다. 또한 상기 '치료'에는 근 위축과 연관된 질환으로 인한 조직 악화 또는 손상을 치료, 예방, 억제, 완화, 또는 감소시키거나 상기 질환에 의해 악영향을 받는 조직을 회복시키는 것을 포함한다.

본 발명에 따른 이데솔리드를 유효성분으로 포함하는 근 위축 예방 또는 치료용 조성물은 또한 식품 조성물일 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 근육 노화 억제 또는 운동기능 향상을 위해 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 식품 조성물은 상기 약제학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 건강기능식품, 특히 우주 생활로 인해 야기될 수 있는 문제점들을 보완해 줄 수 있도록 제조된 우주식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타 민 복합제, 건강보조식품류 등이 있다.

한 구체예에서, 상기 식품 조성물은 음료 또는 건강기능식품에 포함될 수 있다. 건강기능식품이란, 본 발명의 식품 조성물을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다. 이와 같이 하여 얻어지는 본 발명의 건강기능식품은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 매우 유용하다. 이와 같은 건강식품에 있어서의 이데솔리드를 포함하는 식품 조성물의 첨가량은, 대상인 건강식품의 종류에 따라 달라 일률적으로 규정할 수 없지만, 식품 본래의 맛을 손상시키지 않는 범위에서 첨가하면 되며, 대상 식품에 대하여 통상 0.01 ~ 50 중량%, 바람직하기로는 0.1 ~ 20 중량%의 범위이다. 또한, 과립, 정제 또는 캡슐형태의 식품의 경우에는 통상 0.1 ~ 100 중량%, 바람직하기로는 5 ~ 100 중량%의 범위에서 첨가하면 된다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시 예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시 예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

[실시예]

실시예 1: 이데솔리드의 추출

이나무의 열매는 2003년 9월 전라남도 광양시 백운산에서 채집하여 건조되지 않은 열매 (9kg)을 분쇄기를 이용하여 잘게 간 후, 10L 메탄올로 상온에서 3회 추출하였다. 메탄올 추출물을 감압농축하여 1.2kg의 엑스를 얻고 이를 극성에 따라 n-헥산 (180g), CHCl₃ (32g), EtOAc (440g) 및 n-BuOH (548g)로 분획하여 각 분획의 활성을 하기 실험예와 같이 검색한 결과 CHCl₃ 분획 (32g)이 가장 높은 활성을 나타내었다.CHCl3 분획을 H₂O과 MeOH의 혼합용매를 전개용매로 하여 역상(reversed-phase: RP) 레진 컬럼 크로마토그라피를 수행하여 8개의 소분획 (C-I∼C-VIII)을 얻었다. 이 중 소분획 C-IV에 대하여 CHCl3과 MeOH의 혼합용매를 전개용매로 실리카겔 컬럼 크로마토그라피하여 2개의 서브분획을 얻었다(CII-1과 CII-2). CII-1 분획에 대해 반-분취(semi-preparative) HPLC (Microsorb C18 80-299, 10×250mm, H2O:MeOH = 80:20, 20ml/min, tr=25.8min)를 실시하여 무색의 투명한 결정 (200mg)을 얻었다(mp 141.0∼143.0℃, [α]25D = -230.0 °(c 1.0 CHCl3). 이 화합물은 아니스알데하이드(anisaldehyde)-H2SO4 발색시약으로 처리한 후 온도를 가할 때 옅은 분홍색으로 발색하였다.

ESIMS(ElectroSpray Ionization Mass Spectroscopy)로부터 m/z 363 [M+Na]+의 피크를 얻었고 다시 HRFABMS(High Resolution Fast Atomic Bombardment Mass Spectroscopy)로부터 얻은 m/z 341.1246 [M+H]+로 확인하였다. 이를 통하여 분자식이 C16H20O8 (calcd. 340.33)인 화합물로 추정하였다.　IR 스펙트럼에서 나타나는 3364, 2954 및 1735 cm-1의 피크를 통하여 히드록실기, 메틸렌 및 카보닐 결합이 존재함을 추정할 수 있었다. 1H NMR 스펙트럼을 통해서는 두 개의 메톡실기과 네 개의 올레핀성 프로톤이 존재함을 알 수 있었다. 13C NMR 스펙트럼을 통해 각각 두 개의 카보닐기, 네 개의 메틴(methine), 두 개의 2-산화된 4급(di-oxygenated quaternary) 카본, 두 개의 1-산화된(monooxygenated)4급 카본, 두개의 메톡실 카본 및 네 개의 메틸렌 카본으로 이루어진 16개의 카본을 확인할 수 있었다. 비슷한 화학 변위를 가진 카본들이 두개씩 짝을 지어 나타나는 것으로 미루어 보아 이 화합물은 유사한 골격의 두개의 서브유니트로 구성되어 있으며 각각의 서브유니트는 8개의 카본으로 구성된 것으로 추정할 수 있었다. 각 서브유니트의 1H와 13C NMR 스펙트럼은 이나무과 식물인 호말륨 셀라니컴(Homalium ceylanicum)에서 분리, 보고된 화합물인 1-히드록시-6-옥소시클로헥스-2-엔산 메틸 에스테르와 매우 유사한 양상을 나타내었다. 13C NMR 스펙트럼에서 1-히드록시-6-옥소시클로헥스-2-엔산 메틸 에스테르에 존재하는 케톤기에 해당하는 피크가 없고 2-산화된 카본에 해당하는 피크 (δC110.81 또는 102.03)가 존재하는 차이를 나타내었다. 2D 1H-1H COSY 스펙트럼으로부터 δH 5.43에 해당하는 이중결합 위치의 3' 프로톤 피크가 4'번, 5'번 및 6'번 프로톤과 상관(correlation)하는 것을 관찰할 수 있었고 HMBC 스펙트럼으로 부터 같은 결과를 확인할 수 있었다. HMBC 스펙트럼을 통해서 4'번 프로톤이 2'번, 5'번, 6'번 카본과 상관하고 3'번 프로톤이 1'번, 5'번 카본과 상관함을 확인 하여 시클로헥센 환의 구조를 포함하는 것을 확인하였다. 또한 메톡실기가 결합되어 있는 에스테르 카보닐 카본이 3'번 프로톤과 상관하는 것을 관찰함으로써 결합위치를 결정하였다. 이상의 결과를 통해 각각의 서브유니트는 2-산화된 시클로헥센산 메틸 에스테르로 구성되어있음을 추정하였다. 따라서 한 서브유니트의 3a번, 7a번 카본이 다른 서브유니트의 1'번, 2'번 카본과 산소를 사이에 두고 결합하였을 것으로 추측할 수 있다. 이러한 결과를 바탕으로 두 가지 구조를 유추해보았다. 그 첫 번째 것으로는 두개의 서브유니트가 7a번과 1'번 카본 사이에 산소가 결합하여 이루어진 것으로 이 경우에는 3a번과 7a번 카본과 산소가 연결되어 에폭사이드를 형성하여야 한다. 그러나 이러한 화학구조를 이룰 경우 1'번 카본에 결합된 유리된 히드록실기 때문에 두 서브유니트 간의 결합이 매우 불안정해지므로 이 가설은 제외되었다. 3a번, 7a번, 1'번 및 2'번 카본이 완전히 치환된 4급 탄소이기 때문에 2D NMR을 비롯한 스펙트럼 데이타는 두 서브유니트간의 결합에 대한 충분한 정보를 제공할 수 없었다. 따라서 이 화합물에 대해 단결정 X-선 회절 분석(single-crystal X-ray diffraction study)을 수행하여 두 서브유니트간의 결합위치를 확인하고 입체구조를 결정하였다.

이상의 결과를 통하여 이 화합물을 디메틸(2S*, 2'R*,3aR*,7aS*)-2',7a-디히드록시-6,7,3a,7a-테트라히드로스피로[1,3-벤조디옥솔-2,1'-시클로헥스-3-엔]-2',3a-디카복실레이트로 결정하였으며 이데솔리드(idesolide)를 추출하였다.

[제제예]

하기의 제제예에서는 약학적 조성물을 경구투여용 제형으로서 시럽제 또는 정제로 제조한 예와 비경구투여용 제형으로 주사제를 제조한 예를 예시하고는 있지만, 그 밖에도 당 분야에서 널리 알려진 일반적 부형제를 사용한 공지의 제형 형태로 제제화하는 것도 본 발명의 권리범위에 포함된다.

제제예 1: 시럽제의 제조

본 발명의 화학식 (I)의 화합물, 그의 염 또는 용매화물을 유효성분으로서 2 %(중량/부피)로 함유하는 시럽제는 하기와 같은 방법으로 제조하였다.

제조된 항산화 화합물(2 g), 사카린(0.4 g), 당(25.4 g)을 온수 80 g에 용해시켰다. 이 용액을 냉각시킨 후, 여기에 글리세린(8.0 g), 사카린(0.4 g), 향미료(0.04 g), 에탄올(4.0 g) 및 소르브산(0.4 g)을 혼합하고, 여기에 증류수를 첨가하여 전체 용량이 100 ㎖가 되게 하였다. 상기 항산화 화합물은 기타 다른 형태의 약학적으로 허용되는 그의 염으로도 대체 사용할 수 있다.

제제예 2: 정제의 제조

본 발명의 화학식 (I)의 화합물, 그의 염 또는 용매화물이 유효성분으로서 15 mg이 함유된 정제는 하기와 같은 방법으로 제조한다.

제조된 항산화 화합물(250 g)을 락토오스(175.9 g), 감자전분(180 g) 및 콜로이드성 규산(32 g)과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분(160 g), 활 석(50 g) 및 스테아린산 마그네슘(5 g)을 첨가해서 얻은 혼합물을 타정하여 정제로 만들었다.

제제예 3: 주사액제의 제조

본 발명의 화학식 (I)의 화합물, 그의 염 또는 용매화물을 유효성분으로서 10 mg을 함유하는 주사액제는 하기와 같은 방법으로 제조하였다.

실시예 1에서 제조된 항산화 화합물(1 g), 염화나트륨(0.6 g) 및 아스코르브산(0.1 g)을 증류수에 용해시켜서 100 ㎖ 용액을 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 20 ℃에서 30 분간 가열하여 멸균시켰다.

[실험예] 생리활성 확인 실험

시험예 1: 근육세포배양계에서의 항산화를 통한 생존률 향상 효과

(1) 세포배양

정상 골격근육세포(C₂C₁₂)를 우태아 혈청(fetal bovine serum; FBS)이 5% 함유된 DMEM배지에서 배양하였다. 즉, 75-㎠ 플라스틱 플라스크 (Falcon Co., England)에 정상 골격근육세포를 10% FBS, 7.5% NaHCO₃ 150 μg/ml, 글루타민 58.4 μg/ml 및 항생제(antibiotic)/항진균제(antimycotics) 4.4 μl/ml 가 함유된 DMEM 배지에서 37℃, 5% CO₂의 조건하에서 배양하였다. 2∼3일마다 한번씩 2차 배양하여 세포주를 유지하였다.

(2) 세포정량

세포가 자란 75-㎠ 플라스틱 플라스크에서 배지액을 제거하고, CMF-PBS (calcium magnesium free-phosphate buffered saline, pH 7.2)로 세척한 후, 0.25% 트립신/EDTA를 처리하여 세포를 플라스크 바닥으로부터 떼어낸 후 세포 배양액으로 중화시켜서 원심분리(1500 rpm, 3min) 하였다. 남은 세포의 펠렛(pellet)에 배양액을 가한 다음, 멸균 피펫으로 반복 흡입하여 단일 세포부유액을 만든 후 트립판 블루(trypan blue)를 세포부유액과 9:1의 비율로 혼합하여 광학현미경상에서 혈구계산판(hemocytometer)을 이용하여 측정하였다.

(3) H₂O₂ 농도별 근육 세포괴사에 대한 이데솔리드의 효과

H₂O₂의 농도별 세포괴사에 대한 이데솔리드의 효과를 관찰하기 위하여, 먼저 96-웰 플레이트에 근육세포를 5×10⁴ cells/well이 되도록 넣고 CO₂ 배양기에서 배양하였다. 그 다음, 이데솔리드를 각각 0, 10, 25 μM의 농도로 첨가한 후, 10% FBS-DMEM 배지로 전체부피를 100 ㎕로 조절하여 37℃, 5% CO₂의 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 이 배양액에 H₂O₂를 0 mM에서부터 4 mM까지 농도별로 전체 부피가 200㎕가 되게 첨가한 다음, 이를 다시 60분 배양하였다. 배양 후, EzCytox kit 10㎕를 첨가하고, 한시간 후 흡광도를 측정하여 그 효과를 결정하였다.

도 1에서 볼 수 있는 바와 같이, H₂O₂의 농도에 따른 정상 근육세포의 생존력을 측정한 결과, H₂O₂의 농도가 증가됨에 따라 근육세포의 괴사가 유도됨을 알 수 있었다. H₂O₂농도별 근육세포괴사에 대한 이데솔리드의 근육세포괴사 예방 능력을 측정한 결과, 이데솔리드 첨가군이 세포 생존율이 증가함을 볼 수 있었다.

(4) H₂O₂로 유도된 근육 세포괴사에 대한 이데솔리드의 농도별 효과

H₂O₂로 유도된 세포괴사에 대한 이데솔리드의 농도별 효과를 관찰하기 위하여, 먼저 96-웰 플레이트에 근육세포를 5×10⁴ cells/well이 되도록 넣고 CO₂ 배양기에서 배양하였다. 그 다음, 이데솔리드를 0, 10, 25, 50, 100 μM의 농도로 각각 첨가한 후, 10% FBS-DMEM 배지로 전체부피를 100 ㎕로 조절하여 37℃, 5% CO₂의 조건에서 24시간 배양하였다. 이 배양액에 H₂O₂를 1 mM 농도로 전체부피가 200㎕가 되게 첨가한 다음, 이를 다시 60분 배양하였다. 배양 후, EzCytox kit 10㎕를 첨가하고, 한시간 후 흡광도를 측정하여 그 효과를 결정하였다.

도 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 1 mM의 H₂O₂에 의해 유도된 근육세포괴사에 대한 이데솔리드의 농도별 근육세포생존률을 측정한 결과, 이데솔리드의 농도가 0 μM로부터 100 μM증가됨에 따라 세포생존율이 회복됨을 알 수 있었다. 이에 따라 이데솔리드에 농도 의존적으로 근육세포괴사 예방 효과가 증가됨을 알 수 있었다.

(5) H₂O₂로 유도된 근육 세포괴사에 대한 이데솔리드와 토코페롤의 비교 효과

H₂O₂로 유도된 근육세포괴사에 대한 이데솔리드와 토코페롤 효과를 비교 관찰하기 위하여, 먼저 96-웰 플레이트에 근육세포를 5×10⁴ cells/well이 되도록 넣고 CO₂ 배양기에서 배양하였다. 그 다음, 이데솔리드와 토코페롤를 25 μM씩 첨가한 후, 10% FBS-DMEM 배지로 전체부피를 100 ㎕로 조절하여 37℃, 5% CO₂의 조건에서 24시간 배양하였다. 이 배양액에 H₂O₂를 1 mM 농도로 전체부피가 200㎕가 되게 첨가한 다음, 이를 다시 60분 동안 배양하였다. 배양 후, EzCytox kit 10㎕ 를 첨가하고, 한시간 후 흡광도를 측정하여 그 효과를 결정하였다.

도 3에서 볼 수 있는 바와 같이, H₂O₂로 유도된 근육세포괴사에 대한 이데솔리드와 토코페롤 효과를 비교 관찰한 결과, 이데솔리드와 토코페롤의 농도 25 μM에서 토코페롤보다 이데솔리드의 뛰어난 세포생존율이 회복됨을 알 수 있었다.

(6) 세포독성 측정

이데솔리드의 독성측정은 EzCytox 키트를 이용하였다. 즉, 정상 근육세 포(C₂C₁₂)를 96-웰 플레이트에 5×10⁴ cells/well 되도록 분주하였다. 이를 37℃, 5% CO₂ 조건의 배양기에서 배양한 후, 10, 25, 50, 100 μM의 다양한 농도의 이데솔리드를 첨가하여 48시간 동안 배양하였다. 세포생존율을 48시간 동안 배양한 정상 근육세포를 대상으로 EzCytox 키트를 이용하여 이데솔리드의 세포독성을 결정하였다.

이데솔리드가 첨가된 배양 정상 근육세포에서 세포독성을 측정한 결과를 도 4에 나타내었다. 이데솔리드를 첨가하지 않았을 경우, 세포 생존율을 100%로 볼 때 이데솔리드를 첨가한 첨가군에서는 95% 이상의 생존율을 보였다. 따라서, 본 실험에 사용한 이데솔리드는 배양 근육세포에 독성을 나타내지 않음을 알 수 있었다.

(7) Heat Shock Proein(HSP) 70 단백질의 발현 변화 비교

이데솔리드의 HSP70단백질양의 변화 측정은 웨스텐불롯을 이용하였다. 즉, 정상 근육세포(C₂C₁₂)를 6-웰 플레이트에 5×10⁴ cells/well 되도록 분주하였다. 이를 37℃, 5% CO₂ 조건의 배양기에서 배양하였다. 그 다음, 이데솔리드를 25 μM씩 첨가한 후, 10% FBS-DMEM 배지로 전체부피를 2 ml로 조절하여 37℃, 5% CO₂의 조건에서 24시간 배양하였다. 이 배양액에 H₂O₂를 1 mM 농도로 전체부피가 2 ml이 되게 첨가한 다음, 이를 다시 60분 동안 배양하였다. 배양 후, 세포를 파쇄하여 단백질을 획득하였다. 웨스턴블롯을 이용하여 HSP70과 베타엑틴 항체를 이용하여 HSP70단 백질의 발현량을 검출하였다. HSP70단백질 발현을 측정한 결과를 도 5에 나타내었다. 이데솔리드를 첨가하지 않았을 경우, HSP70을 100%로 볼 때 이데솔리드를 첨가한 첨가군에서는 3배 의 HSP70단백질 발현의 증가를 보였다. 따라서, 본 실험에 사용한 이데솔리드는 근육세포의 HSP70단백질의 발현 증가를 통해 근 위축 억제를 예방할 수 있음을 알 수 있었다.

실험예 2: 랫트에 대한 비경구투여 급성 독성 시험

이데솔리드의 급성 독성을 알아보기 위하여, 6 주령의 특정병원부재(SPF) SD계 랫트를 사용하여 다음과 같은 방법으로 급성독성실험을 실시하였다. 이데솔리드를 각각 10 mL의 생리식염수에 현탁하여 0.1 g/kg의 용량으로 상기 랫트 2 마리의 전경골근 (anterior tibialis)에 근육 내 주사 투여하였다. 시험물질 투여 후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액 생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다. 시험결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과 본 발명의 화학식 1의 항산화 화합물은 랫트에서 0.1 g/kg까지 독성변화를 나타내지 않으며 비경구 투여 최소치사량(LD50)은 0.1 g/kg 이상인 안전한 물질로 판단되었다.

도 1은 이데솔리드를 선처리한 근육세포에 H₂O₂를 다양한 농도로 처리함에 따른 근육세포의 생존률을 보여주는 그래프이다.

도 2는 H₂O₂로 근육세포 괴사를 유도한 근육세포에서 이데솔리드가 근육세포의 괴사를 농도의존적으로 예방하고 회복하는 효과를 나타낸 그래프이다.

도 3은 H₂O₂로 근육세포 괴사를 유도한 근육세포에 대한 이데솔리드와 토코페롤의 근육세포의 괴사 억제 효과를 비교한 결과를 보여주는 그래프이다.

도 4는 이데솔리드를 10, 25, 50, 100 μM을 처리한 후 근육세포에서 배양하였을 때 나타나는 세포독성을 보여주는 그래프이다.

도 5는 이데솔리드를 25 μM을 처리한 후 근육세포에서 HSP70단백질 발현의 변화를 보여주는 그래프이다.

Claims

하기 화학식 (I)의 화합물, 그의 염 또는 용매화물을 유효성분으로 포함하는 근 위축 예방 또는 치료용 의약 조성물.

[화학식 1]
제1항에 있어서, 상기 조성물이 우주의 무중력 상태로 인한 근 위축, 근위축성 측삭경화증, 또는 근 위축 증상을 갖는 신체 장애인의 재활치료를 위해 사용되는 것인 근 위축 예방 또는 치료용 의약 조성물.
화학식 (I)의 화합물을 유효성분으로 포함하는 근 위축 예방 또는 치료용 식품 조성물.
제3항에 있어서, 상기 조성물이 근육 노화 억제 또는 운동기능 향상을 위해 사용되는 것인 근 위축 예방 또는 치료용 식품 조성물.
제3항에 있어서, 상기 조성물이 음료, 건강기능식품에 포함되는 것인 식품 조성물.
제5항에 있어서, 상기 건강기능식품은 우주식품인 식품 조성물.