KR101547732B1 - 넥탄드린 ａ를 유효성분으로 함유하는 골형성 촉진용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명의 넥탄드린 A를 함유하는 약학적 조성물 또는 건강기능식품은 골형성 촉진 및/또는 골질환，예컨대 골다공증，골다공증성 골절，당뇨병성 골절, 불유합골절，골결손, 치조골 결손，골형성 부전증，골연화증 및 이로 인한 골절，골형성 장애，퇴행성골질환，부정교합 및 골형성 또는 골재생에 의해 치료 가능한 임의의 질병의 예방，개선 또는 치료 효과를 나타낸다.

Description

넥탄드린 Ａ를 유효성분으로 함유하는 골형성 촉진용 조성물 {A composition for promoting bone formation，comprising nectandrin A as an active ingredient}

본 발명은 골형성 촉진용 조성물에 관한 것이다.

인체의 골(bone)은 조골세포와 파골세포의 작용으로 형성(bone modeling)과 재형성(bone remodeling) 과정을 통해 그 항상성을 유지하게 된다. 그러나 고령화 사회 및 식생활의 변화로 골흡수가 증가되면 골조직이 취약해져 골다공증, 골절 등의 각종 골질환들이 발생하게 된다. 따라서 항상성 유지를 위한 골형성 촉진제의 개발이 요구 되어 왔다. 골관련 질환은 골다공증, 골절, 골형성장애, 부정교합 등이 있다.

골다공증(osteoporosis)은 낮은 골양과 골기질의 파괴로 골절의 위험과 골의 취약성이 증가하는 골격 질환으로, 다양한 원인에 의하여 뼈의 질환이 감소하고 뼈 조직의 미세구조 퇴화로 골절 위험이 지속적으로 증가하게 된다. 현재까지 사용되고 있는 골다공증 약제들은 골흡수 억제제와 골형성 촉진제로 분류할 수 있다.

골흡수 억제제는 기본적으로 파골세포에 의한 과도한 골흡수를 막고 골밀도를 증가시킴으로써 골절을 감소시키고, 골형성 촉진제는 골형성을 주도하는 조골세포의 수와 분화를 증가시킴으로써 골밀도를 증가시키고 골절을 감소시킨다.

일반적으로 사용되는 골다공증 치료제로는 파골세포의 기능을 약화시키고 사멸을 유도하는 골흡수 억제제 계열이며, 주로 포사맥스 (Fosamax, 성분명 : alendronate)와 악토넬 (Actonel, 성분명: risedronate)과 같은 비스포스포네이트 (bisphosphonate) 계열이 치료제로 사용되고 있다(Matthew T. Drake et al., Bisphosphonates: Mechanism of Action and Role in Clinical Practice, Mayo Clin Proc. 2008 September ; 83(9): 10321045). 그외 골형성 촉진제로 부갑상선호르몬이 사용되고 있으나 장기간 사용시 골육종의 발생빈도가 증가되기 때문에 18개월 이상 사용하는 것이 금지되어 있다.

골절 (fracture)은 뼈나 골 단판 또는 관절면의 연속성이 비정상적으로 끊어진 상태로 외상과 같은 외부 충격이나 골다공증, 골암 같은 대사이상으로 인해 일어나는 것으로 알려져 있다. 일반적으로 골절은 그 자체로는 큰 문제가 되지 않을 수 있으나 골절로 인한 이차적인 손상, 즉 합병증이 문제가 되는 것으로 알려져 있다.

골형성장애(osteodystrophy)는 신성 골이양증(Renal osteodystrophy)이라고도 하며 주로 신장 질환에 의해 발병한다. 신성 골이양증은 한가지 질병이 아니라 몇 종류의 질병(부갑상선 기능항진증, 골연화증(osteomalacia), 알루미늄에 의한 뼈질환, 무형성성신성골이양증)을 묶은 질환이며, 한 가지 또는 몇 가지가 복합되어서 발병하는 것으로 알려져 있다.

임플란트는 치아상실 부위의 치조골에 새 치아를 심는 기술이기 때문에 치조골의 상태가 매우 중요하다. 임플란트 시술시 치아 상실 후 오랜 기간 방치를 한 뒤거나 환자의 나이가 많은 경우 치조골이 약해 인공치근을 받쳐줄 수 없게 된다. 풍치나 치주염 등 치아상실의 원인이 되는 질환들로 인해 치조골이 손상되면 임플란트를 심을 수 없기 때문에 치조골 이식술이 필요하게 된다. 치조골 이식술은 치조골 부위의 결손정도, 이식 목적, 환자의 나이와 건강상태에 따라 그 방식과 종류가 결정되나 크게 자신의 뼈를 이식하는 방법과 인공적으로 만들어진 뼈 또는 동물의 뼈를 이용하는 방법, 그리고 사체에서 추출한 타인의 뼈를 이용하는 방법으로 나눌 수 있다. 유전적인 부작용과 거부반응을 생각한다면 본인의 뼈를 이용하는 것이 가장 안전하다. 치조골 이식시 가장 중요한 부분은 접합부분의 치조골 재형성이며 현재 치조골의 재형성을 도와주는 제품으로 노보시스(novosis, 성분명 : rhBMP-2)가 상용화 되어 있다. 노보시스는 대표적인 치조골 이식제로 골형성 촉진 단백질인 rhBMP-2(recombinant human bone morphogenetic protein-2)에 다공성세라믹 지지체를 접목시켜 압력이 가해지면 BMP-2가 유출되어 원하지 않는 부위까지 골이 형성되는 기존 제품의 부작용을 개선하였다(Sung Eun Kim et al., Bone Morphogenic Protein-2 (BMP-2) Immobilized Biodegradable Scaffolds for Bone Tissue Engineering, Macromolecular Research, Vol. 14, No. 5, pp 565-572 (2006)).

한편 부정교합과 같이 불규칙한 치열 등을 치료 또는 예방하기 위해 치열교정을 시행한다. 치열교정을 위한 교정적 치아이동에는 치조골 교체(turnover)가 수반되며 고정력에 의해 생리적인 치조골 교체가 변화된다고 알려져 있다. 교정적 치아이동중 치조골 교체 과정은 긴장측에서의 골형성과 압박측에서의 골흡수가 반복되며, 치아이동 중 초기(3-5일)에는 골흡수가 일어나고 그 후에는 역전기, 후기(7-14일)에는 골형성이 치조골 뿐만 아니라 치주조직 전체에서 일어나는 것으로 알려져 있다. 교정력에 의해 유발되는 골흡수는 1-14일동안 지속되고 골수의 간세포로부터 유래되는 파골세포는 치아이동시 압박측에서 12시간 후 나타나 7일간 존재하며 산 포스파타제 (acid phosphatase : ACP)와 타르트레이트-저항성 포스파타아제 (tartrate-resistant acid phosphatase : TRAP) 활성이 높게 나타나고, 골형성과 관련되어 있는 세포들은 높은 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase: ALP) 활성을 보이며 교정력에 의한 골형성은 21일까지 지속된다고 알려져 있다. 이와 같은 치열교정시 교정력에 의한 골형성 촉진 작용에 의해 빠르고 효과적으로 치열교정이 가능하므로 골형성 촉진에 의한 치열교정이 가능한 약물 또는 식품의 개발이 필요하다.

본 발명은 골형성 촉진용 약학적 조성물을 제공하고자 한다. 또한 본 발명은 골형성 촉진용 건강기능식품을 제공하고자 한다.

본 발명자들은 안전성이 우수한 천연물 및 천연물 유래 화합물들을 대상으로 골 관련 질환의 치료를 위한 다양한 활성 물질을 검색한 결과，넥탄드린 A가 골형성 촉진 물질인 BMP-2의 발현과 분비를 증진시켜 골형성 촉진 효과를 나타내는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 넥탄드린 A를 유효성분으로 포함하는 골형성 촉진용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 넥탄드린 A를 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 넥탄드린 A를 유효성분으로 포함하는 골형성 촉진용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명은 또한 넥탄드린 A를 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 골형성 촉진용 약학적 조성물 또는 건강기능식품은 교정적 치아이동 중 골형성 촉진에 의한 치아이동 촉진을 위해 사용할 수 있고, 다양한 골감소성 골질환을 예방 또는 치료하기 위해 사용할 수 있다. 이러한 골질환은 골다공증，골다공증성 골절，당뇨병성 골절，불유합골절，골결손, 치조골 결손，골형성 부전증，골연화증 및 이로 인한 골절，골형성 장애，퇴행성 골질환，및 부정교합 등을 포함하며，골형성 또는 골재생에 의해 치료 가능한 모든 질병을 포함한다. 치조골 결손 치료는 임플란트 시술을 위한 것일 수 있다.

본 발명의 조성물 내 유효성분인 넥탄드린 A(nectandrin A)는 2,5-비스-아릴-3,4-디메틸테트라하이드로퓨란 리그난계 화합물로서, 화학 구조는 다음과 같다.

[화학식 1]

본 발명에서，넥탄드린 A는 당 분야에 공지된 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 육두구 또는 후박나무 등으로부터 분리될 수 있으며，예컨대，육두구 또는 후박나무로부터 초음파 추출법 또는 고성능 액체 크로마토그래피법 등에 의하여 분리될 수 있으나, 분리 방법은 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 약학적 조성물 내 넥탄드린 A의 함량은 질환의 증상，진행 정도，환자의 상태 등에 따라서 적절히 조절 가능하며，예컨대，전체 조성물 중량을 기준으로 5 내지 80 중량%，바람직하게는 50 내지 80 중량%이나，이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물 내 유효성분으로 함유되는 넥탄드린 A는 약제학적으로 또는 식품학적으로 허용되는 담체，부형제 또는 희석제 등과 함께 제제화할 수 있으며，제제화에 관한 내용은 Remington's Pharmaceutical Science(최근판)，Mack Publishing Company，Easton PA 등의 문헌을 참조할 수 있다.

본 발명의 구현형태로써，본 발명에 따른 넥탄드린 A를 함유하는 약학적 조성물은，각각 통상의 방법에 따라 산제，과립제，정제，캡슐제，현탁액，에멀젼, 시럽，에어로졸 등의 경구형 제형，외용제，좌제 또는 멸균 주사용액 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

여기에 포함될 수 있는 담체，부형제 및 희석제로는 락토즈，덱스트로즈，수크로스，솔비톨，만니톨，자일리톨，에리스리톨，말티톨，전분，아카시아 고무，알지네이트，젤라틴，칼슘 포스페이트，칼슘 실리케이트，셀룰로즈，메틸 셀룰로즈，미정질 셀룰로스，폴리비닐 피롤리돈，물，메틸히드록시벤조에이트，프로필히드록시벤조에이트，탈크，마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

또한，본 발명의 약학적 조성물은 보통 사용하는 충진제，증량제, 결합제，습윤제，붕해제，계면활성제 등의 희석제 또는 부형제，기타 약제학적으로 허용가능한 첨가제를 포함할 수 있다.

경구투여를 위한 고형제제로 제제화되는 경우，정제，환제，산제，과립제，캡슐제 등이 가능하며，이러한 고형제제는 넥탄드린 A 이외에 적어도 한 가지 이상의 부형제，예를 들면，전분，칼슘카보네이트，수크로스 또는 락토오스，젤라틴 등을 혼합하여 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.

경구투여를 위한 액상제제로 제제화되는 경우，현탁제，내용액제，유제，시럽제 등이 가능하며, 흔히 사용되는 단순희석제인 물，리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제，예를 들면 습윤제，감미제，방향제，보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제로 제제화되는 경우，멸균된 수용액，비수성 용제，현탁제，유제，동결건조제제，좌제가 포함된다. 비수성용제，현탁제로는 프로필렌글리콜，폴리에틸렌글리콜，올리브 오일과 같은 식물성 기름，에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol)，마크로골，트윈(tween) 61，카카오지，라우린지，글리세로제라틴 등이 사용될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중，질병의 정도，약물형태，투여경로 및 기간에 따라 다르지만，당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 바람직한 효과를 위하여，본 발명의 조성물의 투여량은 유효성분인 넥탄드린 A 함량을 기준으로 70kg의 성인 남성 기준 1일 0.1 mg/kg 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 1 mg/kg 내지 50mg/kg이다.

투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고，수회 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 본 발명의 투여는 상기 투여량 및 투여횟수에 의해 제한되지 않는다.

본 발명의 약학적 조성물은 랫트，마우스，가축，인간 등의 포유동물에 다양한 경로로，예를 들면，경구로，또는 복강내，직장내，정맥내，근육내, 피하，자궁내 경막 또는 뇌실내(Intracerebroventricular)로 주사 등에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 골질환，예컨대，골다공증，골다공증성 골절，당뇨병성 골절，불유합골절, 골결손, 치조골 결손，골형성 부전증，골연화증 및 이로 인한 골절，골형성 장애，퇴행성골질환 및 부정교합 중에서 선택되는 하나 이상의 질환의 예방 또는 치료를 위하여 사용될 수 있다.

따라서，본 발명은 상기 열거한 질환의 예방 또는 치료를 위한 넥탄드린 A의 용도，상기 열거한 질환의 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조를 위한 넥탄드린 A의 용도，인간을 포함한 포유류에 약제학적으로 유효한 양의 넥탄드린 A를 투여하는 것을 포함하는 상기 열거한 질환의 예방 또는 치료를 위한 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 넥탄드린 A를 유효성분으로 함유하는，골형성 촉진용 건강기능식품을 제공한다. "건강기능식품"이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, "식품 첨가물"로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한，식품의약품안전처에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.

상기 "식품 첨가물 공전"에 기재된 품목으로는 예를 들어，케톤류，글리신，구연산칼륨，니코틴산，계피산 등의 화학적 합성물，감색소，감초추출물，결정셀룰로오스，고량색소，구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨 제제，면류첨가알칼리제，보존료제제，타르색소제제 등의 혼합제제류들을 들 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 골형성 촉진 또는 골질환，예컨대，골다공증, 골다공증성 골절，당뇨병성 골절，불유합골절, 골결손, 치조골 결손，골형성 부전증，골연화증 및 이로 인한 골절，골형성 장애，퇴행성골질환 및 부정교합 중 선택되는 하나 또는 이상의 예방 또는 개선을 위한 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있으며，예컨대 각종 식품류, 껌，차，비타민 복합제, 건강기능성 보조 식품，식품 첨가제 등에 사용될 수 있고，과립，정제，캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다. 상기 기재한 것 외에도 모든 식품 형태일 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 골형성 촉진 또는 골질환，예컨대，골다공증，골다공증성 골절，당뇨병성 골절，불유합골절，골결손, 치조골 결손，골형성 부전증，골연화증 및 이로 인한 골절，골형성 장애，퇴행성골질환 및 부정교합 중 선택되는 하나 이상의 예방 또는 개선을 목적으로，조성물 총 중량에 대하여 넥탄드린 A를 약 5 내지 80 중량%，바람직하게는，50 내지 80 중량%로 포함할 수 있다.

또한，본 발명의 건강기능식품은 골형성 촉진 또는 골질환，예컨대，골다공증，골다공증성 골절，당뇨병성 골절，불유합골절，골결손, 치조골 결손，골형성 부전증，골연화증 및 이로 인한 골절，골형성 장애，퇴행성골질환 및 부정교합 중 선택되는 하나 이상의 예방 및/또는 개선을 목적으로，정제，캅셀，분말，과립，액상，환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.

예를 들어，상기 정제 형태의 건강기능식품은 넥탄드린 A，부형제，결합제，붕해제 및 다른 첨가제와의 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음，활택제 등을 넣어 압축성형하거나，상기 혼합물을 직접 압축성형할 수 있다. 또한，상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수 있으며，필요에 따라 적당한 제피제로 제피할 수도 있다.

캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질캅셀제는 통상의 경질캅셀에 넥탄드린 A，및 부형제 등의 첨가제와의 혼합물 또는 그의 입상물 또는 제피한 입상물을 충진하여 제조할 수 있으며，연질캅셀제는 넥탄드린 A，및 부형제 등의 첨가제와의 혼합물을 젤라틴 등 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제，착색제，보존제 등을 함유할 수 있다.

환 형태의 건강기능식품은 넥탄드린 A，부형제，결합제，붕해제 등의 혼합물을 적당한 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며，필요에 따라 백당이나 다른 적당한 제피제로 제피를，또는 전분，탈크 또는 적당한 물질로 환의를 입힐 수도 있다.

과립형태의 건강기능식품은 넥탄드린 A，부형제，결합제，붕해제 등의 혼합물을 적당한 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며，필요에 따라 착향제，교미제 등을 함유할 수 있다. 과립형태의 건강기능식품은 12호(1680 μm)，14호(1410 μm) 및 45호(350 μm)체를 써서 다음 입도시험을 할 때에 12호 체를 전량 통과하고 14호 체에 남는 것이 전체량의 5.0%이하이고 또 45호 체를 통과하는 것은 전체량의 15.0 %이하일 수 있다.

상기 부형제，결합제，붕해제，활택제，교미제，착향제 등에 대한 용어 정의는 당업계에 공지된 문헌에 기재된 것으로 그 기능 등이 동일 내지 유사한 것들을 포함한다(대한약전 해설편，문성사，한국약학대학협의회，제5 개정판，p33-48，1989).

본 발명의 넥탄드린 A는 우수한 골형성 촉진 효과를 나타낸다. 따라서，본 발명의 넥탄드린 A를 함유하는 약학적 조성물 또는 건강기능식품은 골형성 촉진 및/또는 골질환，예컨대 골다공증，골다공증성 골절，당뇨병성 골절, 불유합골절，골결손, 치조골 결손，골형성 부전증，골연화증 및 이로 인한 골절，골형성 장애，퇴행성골질환，부정교합 및 골형성 또는 골재생에 의해 치료 가능한 임의의 질병의 예방，개선 또는 치료 효과를 나타낸다.

도 1은 넥탄드린 A의 세포독성을 나타낸 도이다.
도 2는 다양한 농도의 넥탄드린 A 처리가 ALP 활성에 미치는 효과를 나타낸 도이다.
도 3은 분화 유도 시간별로 20 mM의 넥탄드린 A 처리가 ALP 활성에 미치는 효과를 나타낸 도이다.
도 4는 다양한 농도의 넥탄드린 A 처리가 석화 정도에 미치는 효과를 나타낸 도이다.
도 5는 분화 유도 시간별로 20 mM의 넥탄드린 A 처리가 석화 정도에 미치는 효과를 나타낸 도이다.
도 6은 넥탄드린 A 처리가 골형성 촉진 유전자인 BMP-2 유전자, ALP 유전자 및 Col-I 유전자의 발현에 미치는 효과를 나타낸 도이다.
도 7은 noggin 처리가 넥탄드린 A 처리에 의한 효과를 상쇄하는지 여부를 확인한 도이다.

이하，본 발명을 제조예 및 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 제조예 및 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 제조예 및 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[ 제조예 ]

제조예 1. 넥탄드린 A의 준비

넥탄드린 A는 후박나무에서 추출하여 구입하여 DMSO에 녹여 사용하였다.

제조예 2. 마우스 근아세포의 준비

마우스 근아세포(mouse myoblast cell line)인 C2C12를 ATCC 은행에서 구입하여 10% 우태아 혈청과 1% 페니실린/스트렙토마이신(인비트로젠, CA, USA)이 첨가된 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium: DMEM) (Gibco BRL, USA)에 섭씨 37도, 5% CO₂ 배양기에서 3일마다 계대 배양하였다.

[ 실시예 ]

실시예 1. 넥탄드린 A의 세포 증식에 대한 독성 확인

MTS kit를 이용하여 넥탄드린 A의 세포 독성을 확인하였다. 제조예 2에서 준비한 마우스 세포를 96-웰 플레이트에 세포를 웰당 3 x 10⁵개가 되도록 접종한 다음, 10, 20, 40, 80 mM의 넥탄드린 A를 각각 처리하였다. 24시간 후 각 웰당 20 ml의 MTS 솔루션을 처리하여 30분간 반응시킨 다음 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

도 1에서 확인되는 바와 같이, 넥탄드린 A는 80 mM에서 세포 증식을 억제하여 세포독성을 나타내었다.

실시예 2. 넥탄드린 A의 골형성 촉진 효과 확인

제조예 2에서 준비한 마우스 세포를 96-웰 플레이트에 웰당 각각 5 x 5⁵ 세포수로 접종한 후, 비교군은 100 mg/ml의 BMP-2를 처리하고, 실험군은 100 ng/ml BMP-2와 각각 5, 10, 20 μM의 넥탄드린 A를 첨가하여, 조골세포(osteoblast)로의 분화를 유도하였다.

(1) ALP ( alkaline phosphatase ) 활성도 확인

ALP는 골형성 초기 단계에서 나타나는 골형성 지표로 알려져 있다. 따라서 넥탄드린 A가 ALP 활성도에 미치는 영향을 확인하여 넥탄드린 A의 골형성 촉진 효과를 확인하고자 하였다.

ALP 활성을 측정한 방법은 다음과 같다.

배양된 세포를 수득하여, 차가운 PBS buffer로 2회 세척한 다음, 0.1% Triton X-100로 현탁시킨 후 초음파 기계(브랜손, USA)로 용해(lysis) 시켰다. 용해된 세포를 섭씨 4도, 12000 rpm 에서 20분간 원심분리한 후 상층액을 회수하여 브리드포트법으로 단백질 정량을 하고, 동량의 단백질을 ALP kit(시그마알드리치, MO, USA)로 제조사의 지침에 따라 450 nm에서 ALP 활성도를 측정하였다.

도 2는 넥탄드린 A의 처리 농도에 따른 ALP 활성 변화를 측정한 실험 결과를 나타낸다. 도 2에 나타난 바와 같이, 실험군에만 넥탄드린 A를 각각 5, 10, 20 μM 처리하고 7일간 배양하여 ALP 활성을 측정한 결과, 비교군에 비하여 실험군에서 농도 의존적으로 ALP 활성이 증가하였다.

도 3은 분화 유도 시간에 따른 ALP 활성 변화를 측정한 실험 결과를 나타낸다. 도 3에 나타난 바와 같이, 실험군에만 넥탄드린 A를 20 μM 첨가하고 배양 3, 7, 14, 21, 28일째에 세포를 수득하여 ALP 활성을 측정한 결과, 배양 7일째에 수득한 세포에서 비교군에 비하여 넥탄드린 A 처리군에서 ALP 활성이 약 1.3배 증가하여 가장 높게 나타났다.

(2) 석화작용( mineralization ) 확인

골아세포는 칼슘을 생산하여 세포 외부로 방출한다. 따라서 골아세포를 배양시키는 배지에서 골아세포 주위로 칼슘이 축적되는 석화작용이 일어난다. 따라서 넥탄드린 A가 석화작용에 미치는 영향을 확인하여 넥탄드린 A의 골형성 촉진 효과를 확인하고자 하였다.

석화작용이 일어난 정도는 골아세포 배양 배지를 2% 알리자린 레드 에스(Alizarin Red S: 시그마 알드리치, USA)와 VonKossa (인비트로젠, CA, USA)로 10분간 염색하여 확인하였다.

도 4는 넥탄드린 A의 처리 농도에 따른 석화 정도를 측정한 실험 결과로서, 상단의 사진은 VonKossa 염색 결과를 200x로 확대한 것이고, 하단의 도표는 알리자린 레드 에스로 염색하고 탈염색 과정을 거쳐 흡광도를 측정한 결과를 나타낸다. 도 4에 나타난 바와 같이, 실험군에만 넥탄드린 A를 각각 5, 10, 20 μM 처리하고 28일간 배양하고 10% 포르말린으로 고정시킨후, 2% 알리자린 레드 용액 및 1% VonKossa 용액으로 염색하여 확인한 결과, 비교군에 비하여 실험군에서 농도 의존적으로 석화 정도가 증가하였다.

도 5는 분화 유도 시간에 따른 석화 정도를 측정한 실험 결과를 나타낸다. 도 5에 나타난 바와 같이, 실험군에만 넥탄드린 A를 20 μM 처리하고 분화 7, 14, 21, 28일째에 수득하여 10% 포르말린으로 고정시킨 후, 2% 알리자린 레드 용액 및 1% VonKossa 용액을 각각 넣고 10분간 염색한 결과, 배양 28일째에 수득한 세포에서 비교군에 비하여 실험군에서 석화 정도가 약 2배 증가하여 가장 높게 나타났다.

(3) 골분화 촉진 유전자 발현 증가 확인

넥탄드린 A 처리가 골분화 촉진 유전자의 발현에 미치는 영향을 확인하기 위하여 하기의 실험을 수행하였다.

BMP-2 유전자는 골형성 초기 단계의 신호 물질의 유전자이고, ALP는 골세포 분화 초기 단계의 유전자이고, Col-I 유전자는 골세포 분화 후기 단계의 유전자에 해당한다.

배양 1, 3, 7, 14, 28일차에 각각 수득한 세포를 차가운 PBS로 2회 세척한 다음 트리졸 시약 1 ml 을 넣어 용해시켰다. 용해된 세포에 200 ml 클로로포름을 넣어 섞어준 다음 섭씨 4도, 12000 rpm으로 20분간 원심분리하여 상층액을 분리하였다. 분리된 상층액에 동량의 이소프로판을 넣어 섞어준 다음 섭씨 4도, 12000 rpm으로 다시 원심 분리하였다. 상층액은 버리고 남은 펠렛은 70% 에탄올로 3회 세척한 다음 전체 RNA를 트리졸 시약(인비트로젠, CA, USA)을 사용하여 제조사의 지침에 따라 분리하였다. real-time PCR을 위해 동량의 RNA(20 mg)를 RT-PCR 증폭 키트에 넣어 섭씨 45도에서 60분간 반응시켜 cDNA를 제조하였다. cDNA는 하기 표 1의 프라이머를 이용하여 real-time PCR 방법으로 증폭하였다. real-time PCR은 cDNA에 SYBR 그린 시약(로슈, Basel, Switzerland)을 사용하여 제조사의 지침에 따라 실시하였다. 구체적으로, 동량의 cDNA에 SYBR 그린을 25 ㎕와 각각의 프라이머를 1 ㎕ 넣은 후, 섭씨 5도에서 30초, 섭씨 50도에서 1시간 동안 반응을 시켜 증폭하여 각 유전자의 발현량을 확인하였다.

[표 1] 골형성 관련 유전자 프라이머

도 6에서 확인되는 바와 같이, 대조군에 비해 넥탄드린 A 20 μM을 처리한 실험군에서 BMP-2의 발현은 분화 3일째부터 증가하여 분화 7일째까지 증가하였고(도 6A), 분화 초기물질인 ALP 발현 역시 분화 7일째 현저히 높아짐을 확인하였다(도 6B). 골분화의 후기지표인 collagen I (Col-I) 또한 분화 28일째 넥탄드린 A 20 μM을 처리한 실험군에서 비교군에 비해 2배 가량 증가함을 확인하였다(도 6C).

실시예 3. 넥탄드린 A의 골형성 촉진 기전 확인

넥탄드린 A에 의한 골형성 촉진 효과가 넥탄드린 A에 의해 BMP-2 분비가 촉진되기 때문인지 확인하기 위해, BMP-2의 억제제인 noggin 처리시 넥탄드린 A의 효과가 상쇄되는지 여부를 확인하였다.

제조예 2에서 준비한 마우스 세포에 Runx2 발현벡터를 transfection한 후, 세포를 세 개 군으로 나누어 1군은 BMP-2 만, 2군은 넥탄드린 A 전처리 2시간후 BMP-2 처리, 3군은 noggin 2시간 전처리후 BMP-2 +넥탄드린 A를 처리한 다음 하기와 같이 promoter assay 실험을 진행하였다.

(1) Runx2 발현 및 Smad1 /5/8 활성 억제 여부 확인

BMP-2의 골분화 촉진 경로에 관여하는 인자들의 발현 또는 활성이 억제되는지 여부를 하기의 실험에서 확인하였다.

Runx2는 골분화 유도 전사인자로서, BMP-2의 골분화 촉진 경로에서 작용하는 물질이다.

1군, 2군, 3군의 세포에 각각 넥탄드린 A를 20 μM 처리한 6시간 후 Runx2 luciferase 발현 정도를 luciferase assay kit(Promega)를 이용하여 측정한 결과, noggin에 의하여 Runx2의 전사활성이 감소했음을 확인하였다 (도 7A).

Smad 1/5/8은 BMP-2의 타겟 신호인자로 알려져 있으며, 역시 BMP-2의 골분화 촉진 경로에서 작용하는 물질에 해당한다.

Smad 1/5/8이 활성화되면 인산화되므로, 인산화된 Smad에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 western blot을 실시하였다. 인산화된 Smad에 결합하는 항체에 결합하는, 효소로 표지된 2차 항체를 넣은 후 기질을 넣어주어 발색을 확인하여 인산화된 Smad의 양을 확인하였다. 그 결과 noggin에 의하여 Smad 1/5/8의 활성이 감소했음을 확인했다(도 7B).

(2) ALP 활성 억제 확인

넥탄드린 A 처리 6시간 후 실시예 2의 (1)에서 상술한 방법을 이용하여 ALP 활성이 억제되는지 여부를 확인하였다. 결과는 도 7C에 나타내었다.

도 7C에 나타난 바와 같이, noggin 처리시 넥탄드린 A에 의해 증가되는 ALP 활성이 억제됨을 알 수 있다.

(3) 석화작용 감소 확인

넥탄드린 A 처리 6시간 후 실시예 2의 (2)에서 상술한 방법을 이용하여 석화작용이 감소되는지 여부를 확인하였다. 결과는 도 7C에 나타내었다. 결과는 도 7C에 나타내었다.

도 7C에 나타난 바와 같이, noggin 처리시 넥탄드린 A에 의해 증가되는 석화작용이 감소됨을 알 수 있다.

상기 실험 결과로부터 넥탄드린 A는 BMP-2의 분비 촉진을 유도하는 기전으로 골형성 촉진 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

<110> University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University <120> A composition for promoting bone formation comprising nectandrin A as an active ingredient <130> P13-054-KHU <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BMP-2 forward primer <400> 1 tgaggattag caggtctttg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BMP-2 reverse primer <400> 2 cacaaccatg tcctgataat 20 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALP forward primer <400> 3 atctttggtc tggctcccat g 21 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALP reverse primer <400> 4 tttcccgttc accgtccac 19 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Col-I forward primer <400> 5 actcagccgt ctgtgcctca 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Col-I reverse primer <400> 6 ggaggcctcg gtggacatta 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward primer <400> 7 atgttcgtca tgggtgtgaa 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH reverse primer <400> 8 tgtggtcatg agtccttcca 20

Claims (8)

1. 넥탄드린 A를 유효성분으로 함유하는, 골형성 촉진용 약학적 조성물.
2. 넥탄드린 A를 유효성분으로 함유하는, 골감소성 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
3. 제 2항에 있어서, 상기 골질환은 골다공증, 골다공증성 골절, 당뇨병성 골절, 불유합골절, 골결손, 치조골 결손, 골형성 부전증, 골연화증, 및 골연화증으로 인한 골절로 이루어진 군에서 선택되는 약학적 조성물.
4. 넥탄드린 A를 유효성분으로 함유하는, 골형성 촉진용 건강기능식품.
5. 넥탄드린 A를 유효성분으로 함유하는, 골감소성 골질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
6. 제 5항에 있어서, 상기 골질환은 골다공증, 골다공증성 골절, 당뇨병성 골절, 불유합골절, 골결손, 치조골 결손, 골형성 부전증, 골연화증, 및 골연화증으로 인한 골절로 이루어진 군에서 선택되는 건강기능식품.
7. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 교정적 치아이동 중 골형성 촉진에 의한 치아이동 촉진용인 조성물.
8. 제4항에 있어서, 상기 건강기능식품은 교정적 치아이동 중 골형성 촉진에 의한 치아이동 촉진용인 건강기능식품.
   

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