KR100909867B1

KR100909867B1 - 골대사성 질환의 예방 및 치료를 위한 조성물

Info

Publication number: KR100909867B1
Application number: KR1020070037167A
Authority: KR
Inventors: 이장희; 류현모; 배석철
Original assignee: 주식회사바이오러넥스
Priority date: 2007-04-16
Filing date: 2007-04-16
Publication date: 2009-07-29
Also published as: KR20080093343A; WO2008126974A1

Abstract

본 발명은 약제학적 유효량의 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 골대사성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

[화학식 1]

골대사성 질환, 약제학적 조성물, HDAC inhibitor, Runx-2, c-Fos, NFATc1

Description

골대사성 질환의 예방 및 치료를 위한 조성물{Composition for preventing and treating osseous metabolic disease}

도 1는 화학식 1의 화합물이 골수유래 파골세포 전구세포에서 파골세포로의 분화에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.

도 2는 화학식 1의 화합물이 파골세포 분화 마스터 유전자인 c-Fos 또는 NFATc1의 발현에 미치는 영향을 RT-PCR 및 웨스턴블롯으로 확인한 그림이다.

도 3은 화학식 1의 화합물이 조골세포 분화 마스터 유전자인 Runx-2의 활성에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.

도 4는 화학식 1의 화합물이 난소절제술에 의해 유도된 마우스 골다공증 모델에 미치는 영향을 마이크로전산화단층촬영술로 분석한 그림이다.

도 5는 화학식 1의 화합물이 LPS에 의해 유도된 염증성 골소실 마우스 모델에 미치는 영향을 마이크로전산화단층촬영술로 분석한 그림이다.

도 6은 화학식 1의 화합물이 콜라젠 유도 마우스 관절염 모델에서 관절염 지수에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.

도 7은 화학식 1의 화합물이 콜라젠 유도 마우스 관절염 모델에서 관절의 골소실에 미치는 영향을 마이크로전산화단층촬영술로 분석한 그림이다.

도 8은 화학식 1의 화합물이 콜라젠 유도 마우스 관절염 모델에서 관절의 골소실에 미치는 영향을 조직표본을 제작하여 H-E 염색으로 관찰한 그림이다.

[화학식 1]

뼈는 골세포(osteocyte), 파골세포(osteoclast), 조골세포(osteoblast)와 같은 뼈세포(bone cell), 수산화인회석(hydroxyapatite crystal), 교원질 섬유(collagenous fibers), 글리코스아미노글리칸(glycosaminoglycans)과 같은 뼈 기 질(bone matrix) 및 골수의 공동(bone marrow cavity), 혈관(vascular canals), 소관(canaliculi), 골소강(lacunae)과 같은 공간으로 구성되어 있다(Stavros C. M., Endocrine Reveiws, 21(2), 115-137 (2000)). 뼈는 몸을 기계적으로 지지하고, 중요장기를 보호하며, 조혈작용(hemopoeisis)에 필요한 미세 환경을 제공하고, 칼슘 및 여러 미네랄을 저장하는 역할을 한다.

뼈의 성장, 발달 및 유지는 일생을 거쳐 연속적으로 일어난다. 노화된 뼈는 파괴되고 이를 대신하여 새로운 뼈가 재형성(regeneration)된다. 이러한 교체(turnover)는 파골세포와 조골세포로 구성된 BMU(Basic Multicellular Units)에서 주로 일어나는데, 이 과정은 성장과 스트레스로 인한 뼈의 미세한 손상을 회복시키고 뼈의 기능을 유지하게 하는 역할을 한다. 노화된 뼈의 파괴 또는 흡수는 파골세포가 그 일을 수행한다. 반면, 새로운 뼈의 형성은 조골세포가 담당한다. 파골세포는 뼈의 표면에 부착하여 산과 분해효소를 분비함으로써 뼈를 구성하는 인회석 결정 및 교원질과 같은 뼈 기질(bone matrix)을 제거하여 뼈를 파괴하고, 조골세포는 뼈 기질을 합성하여 분비하고 칼슘과 인의 농도를 조절하여 골격을 형성한다(Stavros C. M., Endocrine Reviews, 21(2), 115-137 (2000)).

골 대사성 질환은 생체 내에서 파골세포와 조골세포의 평형이 깨짐으로써 발생한다. 골 대사성 질환의 대표적인 예로는 골다공증을 들 수 있다. 골다공증은 파골세포의 활성이 조골세포에 비해 증가함으로써 총골량(total bone mass)이 감소하는 증상을 말한다. 골다공증이 발생하면 피질뼈(cortical bone)의 폭이 감소되고 골수의 공동(cavity)이 확대되며 망상조직 골주가 낮아져서 뼈가 계속해서 다공질로 된다. 골다공증이 진전됨에 따라 뼈의 물리적 강도가 저하되어 요통과 관절통이 유발되고, 약간의 충격에도 뼈가 쉽게 부서진다. 골 대사성 질환은 이외에도 유방암, 전립선암 등의 종양이 뼈로 전이된 뼈전이암 병소, 원발성(Primary)으로 뼈에 생성된 종양(예, 다발성 골수종), 류마티스성 또는 퇴행성 관절염, 치주질환을 야기하는 세균에 의해 발생하여 치조골의 파괴가 일어난 치주질환, 치과용 임프란트를 식립한 후에 야기된 염증성 치조골 흡수 질환, 정형외과 영역에서 뼈를 고정하기 위하여 식립된 임프란트에 의해 야기된 염증성 뼈 흡수 질환, 각종 유전적인 소인에 의해 발생하는 파게트 질병(Paget's disease) 등이 있다.

골수종은 심한 통증을 동반하면서 뼈가 쉽게 골절이 되는 질환으로 종양세포가 파골세포의 활성을 증진시켜 발생한다. 유방암이나 전립선암은 쉽게 뼈로 전이되어 역시 파골세포의 활성을 증진시켜 뼈를 파괴시킨다. 류마티스성 관절염이나 퇴행성 관절염이 있는 경우에도 면역반응에 의해 생성된 종양괴사인자(tumor necrosis factor, TNF), 인터루킨-1, 인터루킨-6 등이 관절강에 존재하는 파골세포의 활성을 증진시켜 관절 부위에 국소적인 뼈의 파괴가 일어난다. 치주질환을 일으키는 세균이 감염되어 염증을 일으키면 면역반응의 결과, TNF, 인터루킨-1, 인터루킨-6 등 염증성 싸이토카인이 만들어지고 이들이 파골세포의 분화를 촉진시켜 치아를 지지하고 있는 치조골을 파괴하게 된다.

최근에 골다공증을 비롯한 이러한 골대사성 질환의 치료를 위한 분자생물학적 연구가 활발하게 이루어지면서 골형성 촉진 인자와 파골 억제 인자가 개발되었 다. 골형성 촉진 인자로는 불소제재, 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone), 티지에프-베타(TGF-β), 골형성 단백질(bone morphogenetic protein), 인슐린유사 성장호르몬(insulin like growth factor) 등이 있다. 파골 억제 인자로는 에스트로겐(estrogen), 칼시토닌(calcitonin), 비타민 D와 그의 유사체(Vitamin analogues), 비스포스포네이트(bisphosphonate) 등이 알려져 있다(Jardine et al., Annual Reports in Medicinal Chemistry, 31, 211 (1996)).

지금까지 여러 물질이 골다공증 치료제로 개발되었다. 그 중 골다공증 치료제로 가장 많이 사용되는 에스트로겐은 그 실제적인 효능이 아직 검증되지 않은 상태이며 생애 동안 계속 복용해야 하는 단점이 있고 또한, 장기간 투여하는 경우 유방암이나 자궁암이 증가하는 부작용이 있다. 알렌드로네이트(alrendronate)도 그 효능이 명확하지 않고 소화관에서의 흡수가 더디며 위장과 식도점막에 염증을 유발하는 문제가 있다. 칼슘제제는 부작용이 적으면서도 효과가 우수한 것으로 알려져 있지만 치료제라기보다는 예방제에 해당한다. 그 외에 칼시토닌과 같은 비타민 D 제제가 알려져 있으나 아직 효능 및 부작용에 대한 연구가 충분히 되어있지 않은 상태이다.

따라서, 부작용이 적고 효과가 우수한 새로운 대사성 골 질환 치료제가 요구되고 있다. 본 발명자들은 상기 화학식 1의 화합물이 파골세포 분화와 관련된 유전자인 c-Fos와 NFATc1의 발현을 억제하고, 조골세포 분화 유도 유전자인 Runx-2 활성을 촉진시키며, 마우스 골대사성 질환 모델에서 골다공증 억제, 염증에 의해 유 도된 골소실 억제 및 콜라젠 유도 관절염 치료에 탁월한 효과가 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 약제학적 유효량의 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 골대사성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 약제학적 유효량의 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 골대사성 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

본 발명의 약제학적 조성물에 사용되는 상기 화학식 1의 화합물은 일본등록특허 제349462호, 미국등록특허 제6399568호, 일본특허출원 특원평제11-53851호 및 미국등록특허 제6825317호 등에서 히스톤 탈아세틸화효소 억제제(histone deacetylasee, HDAC inhibitor) 또는 MHC class-1의 발현촉진인자로서 개시되어 있으며, 약제학적 용도로 사용될 가능성이 언급되어 있다. 그러나 상기 화합물이 조골세포 분화 촉진기능 또는 파골세포 분화 억제기능을 가진다거나 골대사성 질환에 유효하다는 언급은 전혀 기재되어 있지 않다.

본 발명의 약제학적 조성물에 사용되는 활성성분은 화학식 1의 화합물의 “약제학적으로 허용가능한 염”을 포함한다. "약학적으로 허용가능한"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 이들 염은 물이나 유기 용매 또는 이들 두 용매의 혼합물 중에서 적절한 염기 또는 산의 화학량론을 반응시켜 제조하는 것이다. 일반적으로, 본 발명에 따른 약제학적으로 허용되는 염으로는 무기 염기와의 염, 유기 염기와의 염, 무기 산과의 염, 유기산과의 염 및 염기성 또는 산성 아미노산과의 염이 포한된다. 무기 염기와의 염은 예를 들면 나트륨 염 및 칼륨 염과 같은 알카리 금속 염, 칼슘 염 및 마그네슘 염과 같은 알카리 토금속 염, 알루미늄 염 및 암모늄 염이 포함된다. 유기 염기와의 염으로는 트리메틸아민, 트리에틸아민, 피리딘, 피콜린, 2,6-루티딘, 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 사이클로헥실아민, 디사이클로헥실아민 및 N,N'-디벤질에틸렌디아민과의 염을 예로 들 수 있다. 무기 산과의 염의 예로는 염산, 붕산, 푸마르 산, 옥살산, 타르타르산, 말레산, 시트르산, 석신산, 말산, 메탄설폰산, 벤젠설폰산 또는 p-톨루엔설폰산과의 염이 포함된다. 염기성 아미노산과의 염은 예를 들면 아르기닌, 라이신 및 오르니틴이 포함된다. 산성 아미노산과의 염의 예로는 아스파트산 및 글루탐산과의 염을 들 수 있다. 본 발명의 염은 예컨대 이온 교환과 같은 통상적인 방법에 의해 제조할 수 있다.

본 발명의 화합물 및 이의 약제학적으로 허용가능한 염은 각각 단독으로 또는 둘 이상의 혼합물로서 골대사성 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명에서 "골대사성 질환"이란 골의 파괴 흡수가 과대하여 생리적 병리상태를 초래하는 질병을 말한다. 골대사성 질환의 예로는 골다공증, 유방암 또는 전립선암 등의 종양이 뼈로 전이된 뼈전이암 병소(bone metastatic lesion), 원발성(primary)으로 뼈에 생성된 종양, 류마티스성 또는 퇴행성 관절염, 치주질환, 염증성 치조골 흡수 질환, 염증성 뼈 흡수 질환 및 파게트 질병(Paget's disease)을 포함하며, 바람직하게는 골다공증, 염증성 치조골 흡수 질환, 류마티스성 관절염을 말하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 화학식 1의 화합물은 파골세포 분화의 마스터 유전자인 c-Fos와 NFATc1의 mRNA 발현 및 단백질의 발현을 억제함으로써 파골세포에 의한 골 흡수를 억제할 수 있다. 핵전사인자인 NF-kB(nuclear factor kB), c-Fos, NFATc1(nuclear factor of activated T cells c1), PU1, 그리고 MITF는 RANKL(receptor activator of NK ligand) 처리에 의한 파골세포 분화에 매우 중요한 것으로 알려져 왔다(Teitelbaum 등, Nature Review of Genetics 4 :638-649, 2003). 특히 RANKL에 의해 유도되는 c-Fos의 발현은 파골세포 분화의 개시에 필수적인 역할을 하는 것으로 알려져 왔다. 또한, c-Fos 발현은 NFATc1의 발현을 야기시키는데(Matsuo 등, Journal of Biological Chemistry 279:26475-26480, 2004), RANKL 없이 NFATc1 자체의 발현만으로도 파골세포의 분화를 유도할 수 있기 때문에, NFATc1은 파골세포 분화에 필수적인 인자로 알려져 왔다(Takayanagi 등, Developmental Cell 3:889-901, 2002). 본 발명자들은 구체적인 실시예에서, 상기 화학식 1의 화합물이 c-Fos와 NFATc1의 발현에 미치는 영향을 RT-PCR과 웨스턴블롯 방법으로 확인한 결과, 파골세포 배양시 화학식 1의 화합물을 첨가한 경우에 c-Fos와 NFATc1의 발현이 탁월하게 억제됨을 확인하였다(도2 참조).

또한, 본 발명의 화학식 1의 화합물은 조골세포 분화의 마스터 유전자인 Runx-2의 활성을 촉진시킴으로써 파골세포에 의한 골 흡수를 억제할 수 있다. 본 발명자들은 구체적인 실시예에서, 상기 화학식 1의 화합물을 마우스 C2C12 세포에 처리한 결과, FGF2(fibroblast growth factor-2) 또는 SAHA(suberoylanilide hydroxamic acid)를 처리한 경우보다 Runx-2의 활성이 월등히 증가됨을 확인하였다(도3 참조).

또한, 본 발명자들은 화학식 1의 화합물의 생체 내(in vivo) 실험을 실시하였는바, 난소가 적출되어 에스트로겐이 분비되지 않는 마우스에 본 발명의 화합물을 투여하고 마이크로전산화단층촬영술로 femur의 골량을 측정한 결과, 골량이 현저하게 증가하여 골다공증을 억제함을 확인할 수 있었다(도 4 참조). 또한, LPS(lipopolysaccharide)를 투여하여 골소실을 유도한 마우스 모델에 본 발명의 화 합물을 투여하고 마이크로전산화단층촬영술로 femur의 골량을 측정한 결과, 골량이 현저하게 증가하여 염증성 골소실을 억제함을 확인할 수 있었다(도 5 참조). 또한, 콜라겐을 투여하여 관절염을 유도한 마우스 모델에 본 발명의 화합물을 투여하고 마이크로전산화단층촬영술로 및 조직학 소견으로 관찰한 결과, 골소실 정도를 현저하게 억제하여 관절염 예방 및 치료에 효과가 있음을 확인할 수 있었다(도 6 내지 도8 참조).

따라서 본 발명의 화학식 1의 화합물은 파골세포 분화 억제제 또는 조골세포 분화 촉진제로 유용하게 사용할 수 있고, 상기 화합물을 유효성분으로 포함하는 골 대사성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염에 추가하여 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 그러한 유효성분의 예로는 뼈의 조골세포 분화를 촉진시키는 것으로 알려진 BMP-2,4,7(bone morphogenetic protein-2,4,7) 등이 있다.

본 발명의 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 예를 들어 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 이들의 배합물 등을 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현 탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mark Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내, 국소 적용 등)할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 화학식 1의 화합물이 약 0.1 내지 1 ㎎/㎏, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 조성물은 골 대사성 질환의 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나, 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 골수세포의 분리 및 파골세포 전구세포 유도

6주 내지 7주령인 ICR(Institute of Cancer Research) 암컷 마우스를 경부염전으로 희생시킨 후 70% 에탄올로 뒷다리 부위를 소독한 다음 경골(tibia)을 무균 적으로 분리하였다. 분리한 경골을 3X HBSS(Gibco BRL)에 넣고 연조직을 깨끗하게 제거하였다. 상기 경골의 양쪽 끝을 자르고 1cc 주사기를 이용하여 1X α-MEM으로 골수에 주입하여 골수세포를 얻은 후에 수회 파이펫팅하여 골수세포를 충분히 풀어주었다. 그 후 원심분리(1600rpm, 5min)하여 상청액은 버리고 침전된 세포 성분(골수세포와 적혈구)을 획득하였다. 침전된 세포에 ACK 완충액(155 mM NH4Cl, 11 mM KHCO3, 0.01 mM EDTA) 약 15-20 ㎖을 2분간 처리하고, 인산완충용액을 첨가하여 골수세포의 손상을 최소한으로 줄이고 적혈구를 용해시켰다. 그 후 원심분리(1600rpm, 5분)하고 10%(v/v) 우태아 혈청(FBS ; Gibco BRL), 100U/㎖ 페니실린, 100㎍/㎖ 스트렙토마이신, 10ng/㎖ 대식세포 집락자극 인자(M-CSF; Peprotech EC, London, England)를 함유하는 α-MEM으로 세포를 현탁하였다. 하룻동안 배양한 후, 부착되지 않은 세포를 얻어 배양접시에 30ng/㎖ 대식세포 집락자극 인자(M-CSF)가 함유되어 있는 배양액에서 3일 동안 배양하였다. 배양이 끝난 이 세포들을 파골세포 전구세포라 칭하며, 이 전구세포를 이용하여 본원 발명의 화합물이 파골세포로의 분화에 미치는 영향을 검증하였다.

실시예 2. 화학식 1의 화합물이 파골세포 전구세포의 분화에 미치는 영향

실시예 1에서 준비된 파골세포 전구세포를 파골세포로 분화시키기 위하여 30ng/㎖ 대식세포 집락자극 인자(M-CSF)와 50ng/㎖ RANKL(Peprotech EC, London, England)의 존재하에 배양시켰다. 이 때, 화학식 1의 화합물이 파골세포의 분화에 미치는 영향을 검증하기 위하여 여러 가지 농도(10 nM, 25 nM, 50 nM, 75 nM, 100 nM)의 화학식 1의 화합물을 같이 첨가하여 배양시켰다. 화학식 1의 화합물은 일본 국립규슈공업대학의 Nishino 교수에게 특허실시권을 이전받아 사용하였다. 분화가 완료된 파골세포는 TRAP 염색에 의해 확인하였다. TRAP 염색은 백혈구 산 포스포타제 키트(Sigma, cat. No. 387-A)를 사용하였다. 분화가 끝난 파골세포가 있는 배양접시에서 배양액을 제거한 후에 세포를 고정하기 위하여 10% 포르말린으로 5분 동안 처리하였다. 포르말린을 제거하고 0.1% Triton X-100을 10초 동안 처리하였다. 그 후 Triton X-100 용액을 제거하고 키트에 있는 TRAP 염색용액을 약 5분 동안 처리하였다. TRAP 염색용액 제거하고 증류수로 2번 수세하고 건조시켰다. TRAP 양성인 파골세포의 수를 광학현미경 100배에서 산정하였다.

실험 결과 도1에서 보듯이 대조군에 비하여 농도의존적으로 파골세포의 분화를 억제하였다. 따라서, 화학식 1의 화합물은 골수세포에서 유래된 파골세포 전구세포의 파골세포 분화를 용량별로 억제함을 알 수 있었다.

실시예 3. 화학식 1의 화합물이 c- Fos 및 NFATc1 에 미치는 영향

파골세포 분화 억제에 대한 화학식 1의 화합물의 메카니즘을 규명하기 위하여 파골세포 분화에 중요한 유전자인 c-Fos 또는 NFATc1의 발현에 미치는 영향을 RT-PCR 및 웨스턴블롯 방법으로 확인하였다. RT-PCR 분석은 TRI 시약을 사용하여 준비한 총 RNA의 2㎍을 SuperScriptⅡ 역전사효소(Gibco BRL)로 역전사하였다. 역전사된 c-DNA의 10%를 PCR로 증폭하였다. 이때 사용한 프라이머의 서열은 다음과 같다:

5’-CTGGTGCAGCCCACTCTGGTC-3’ (서열번호 1)

5’- CTTTCAGCAGATTGGCAATCTC-3’ (서열번호 2),

5’- CAACGCCCTGACCACCGATAG-3’ (서열번호 3)

5’-GGCTGCCTTCCGTCTCATAGT-3’ (서열번호 4),

5'-ACTTTGTCAAGCTCATTTCC-3' (서열번호 5)

5'-TGCAGCGAACTTTATTGATG-3' (서열번호 6)

PCR 반응은 94℃에서 30초간 변성, 58℃에서 30초간 어닐링 및 72℃에서 30초간 확장하는 사이클을 22-25회 반복하였다. PCR 생성물은 1.2-2.0% 아가로오스 겔로 분리하였고, 에티디움 브로마이드(ethidium bromide)로 염색하였다. 그 결과 도2의 윗 그림에서 보듯이 배양 시 화합물 화학식 1의 화합물을 첨가한 경우에는 RANKL 첨가시 증가하는 유전자인 c-Fos와 NFATc1의 발현을 현저하게 억제함을 알 수 있었다. 즉, 화학식 1의 화합물은 파골세포 분화 관련 마스터 유전자인 c-Fos와 NFATc1의 mRNA 발현을 탁월하게 억제함을 확인하였다.

아울러, 화학식 1의 화합물이 c-Fos와 NFATc1의 단백질 수준을 억제하는 지를 확인하기 위하여 웨스턴블롯을 시행하였다. 웨스턴블롯은 준비된 세포를 20mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 및 프로테아제(protease) 및 포스파테아제 억제제(phosphatase inhibitors)를 함유하는 완충액에서 용균하였다. 세포 단백질의 용균액(30-40㎍)을 10% SDS-PAGE로 분리하고 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막(polyvinylidene difluoride membrane; Millipore, Bedford, MA)으로 전달하였다. 5% 탈지유로 차단한 후, 막을 anti-Fos, NFATc1, TRAF6(Cell Signaling Technology, everly, MA)으로 정밀조사하였다. 같은 막을 제거하고 액틴(Cell Signaling Technology)으로 재조사하였다. 그 결과 화학식 1의 화합물은 도2의 아래 그림에서 보듯이 c-Fos와 NFATc1 단백질 수준도 현저하게 억제함을 알 수 있었다. 이상의 결과에서 화학식 1의 화합물이 파골세포 분화의 마스터 유전자인 c-Fos와 NFATc1의 발현을 현저하게 억제함을 확인할 수 있었다.

실시예 4. 화학식 1의 화합물이 Runx -2에 미치는 영향

화학식 1의 화합물이 다른 HDAC 억제제처럼 조골세포 분화의 마스터 유전자인 Runx-2 활성을 증가시키는지 여부를 알기 위하여 다음과 같은 실험을 진행하였다. 실험에는 6xOSE2-Luc reporter vector가 stable transfection된 C2C12 세포를 사용하였다. OSE2(osteoblast specific element-2)는 bone marker인 osteocalcin의 promoter에서 Runx-2가 결합하는 부위로서, C2C12 세포는 이러한 OSE2를 6개 직렬로 연결한 artificial promoter를 pGL3 promoter vector에 cloning 하여 이 reporter vector를 stable transfection 한 세포이다. 실험한 결과 도3에서 보듯이 화학식 1의 화합물은 Runx-2 활성을 올려주는 것으로 이미 잘 알려진 positive control인 FGF2와 같은 HDAC 억제제나 항암효과가 있는 것으로 알려진 약제인 SAHA 보다 Runx-2의 활성을 증가시켰다. 또한, 일반적으로 세포배양에 사용되는 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS)에 의해 Runx-2 활성이 영향을 받을 수 있으므로 혈 청 존재 유무에 따른 활성 변화를 조사한 결과, 혈청 존재하에서 효과가 떨어지기는 하나 다른 것에 비해 여전히 높은 활성을 나타냄을 알 수 있었다. 따라서, 화학식 1의 화합물은 조골세포 분화의 마스터 유전자인 Runx-2의 활성을 촉진시켜 조골세포로의 분화를 촉진시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 5. 화학식 1의 화합물이 골다공증 마우스 모델에 미치는 영향

골다공증은 주로 폐경 이후 에스트로겐의 결핍에 따라 파골세포 형성이 증가됨으로써 야기되는 대표적인 질병으로(J Clin Invest 112:915-923, Lean et al., 2003), 파골세포 분화 억제효과가 있는 화학식 1의 화합물이 골다공증의 동물모델인 난소절제 마우스에서 실제로 효과가 있는지 검증하였다. 16주된 암컷 마우스의 양쪽 난소를 적출하고, 4주 경과 후 뼈의 흡수를 유도하였다. 이후부터 일주일에 3회 복강 내로 화학식 1의 화합물을 마우스 체중 1 g 당 0.1 ㎍의 용량으로 주 3회로 4주 동안 투여하였다. 이때 한쪽 실험군에는 화학식 1의 화합물 대신에 인산완충용액을 투여하여 화합물의 효과를 비교하였다. 화합물을 투여한 지 4주 후에 마우스를 경부염전으로 희생시키고, 대퇴골(femur)을 채취하여 마이크로전산화단층촬영(micro-computed tomography scan, Skyscan 1072 micro-CT system; SkyScan, Aartselaar, Belgium)으로 횡단면과 종단면의 골량을 측정하였으며, 정량적으로 나타내기 위해 총 조직량(tissue volume)에 대해 골 조직량(bone volume)의 비율을 산정하였다. 그 결과 도4에서 보듯이 화학식 1의 화합물은 인산완충용액만을 투여한 마우스에 비하여 골량이 현저하게 증가하였으며, 거의 정상적인 마우스에 근접 하였다. 따라서, 화학식 1의 화합물이 난소절제에 의하여 유도된 골다공증을 억제함을 확인할 수 있었다.

실시예 6. 화학식 1의 화합물이 염증성 골소실 마우스 모델에 미치는 영향

일반적으로, 염증은 골소실을 야기시키기 때문에 생체 내에서 이를 확인하기 위한 동물모델로 LPS(lipopolysaccharide, E. coli O55:B5, Sigma)를 마우스 복강 내에 투여하여 femur의 골소실 정도를 측정한다(Miyaura 등, J Exp Med 197:1303-1310, 2003). LPS 투여 유도 골소실 마우스 모델에 대한 화학식 1의 화합물의 효과를 검증하기 위하여 LPS를 마우스 복강 내에 0일과 4일에 5 ㎍/g(마우스 체중)을 투여하여 femur의 골흡수를 야기시켰다. 이 때, 화학식 1의 화합물의 효과를 검증하기 위하여 -1일, 1일, 3일, 5일, 7일에 마우스 체중 1 g 당 0.1 ㎍의 용량으로 화학식 1의 화합물을 복강 내에 투여하였고, 대조군으로 인산완충용액을 복강 내에 투여하였다. LPS를 처음 투여한 지 8일째에 마우스를 희생시켜서 femur를 채취한 다음 마이크로전산화단층촬영(micro-computed tomography scan, Skyscan 1072 micro-CT system; SkyScan, Aartselaar, Belgium)로 횡단면과 종단면의 골량을 측정하였으며, 정량적으로 나타내기 위해 총 조직량(tissue volume)에 대해 골 조직량(bone volume)의 비율을 산정하였다. 그 결과, 도5에서 보듯이 화학식 1의 화합물은 인산완충용액만을 투여한 마우스에 비하여 골량이 현저하게 증가하였으며, 거의 정상적인 마우스에 근접하였다. 따라서, 화학식 1의 화합물이 LPS에 의해 유도된 염증성 골소실을 억제함을 확인할 수 있었다.

실시예 7. 화학식 1의 화합물이 관절염 마우스 모델에 미치는 영향

만성 염증성 질환인 류마티스성 관절염은 파골세포의 활성이 증가되어 관절 주위에 골소실이 동반된다. 화학식 1의 화합물이 골소실이 유도된 마우스 관절염 모델에 미치는 영향을 검증하기 위하여 콜라젠 유도 마우스 관절염 모델에서 영향을 관찰하였다. 콜라젠에 의한 관절염 유도는 소에서 추출하여 동결건조된 타입 Ⅱ 콜라젠(Chondrex, Redmond, WA, USA, Cat. No. 2002-1)을 2.0 mg/ml의 농도로 0.05M 초산에 용해시키기 위하여 하룻밤 동안 섭씨 4도에서 천천히 혼합하였다. 다음날 용해된 콜라겐 용액과 동량의 완전 프로인트 면역증강제(Chondrex, Redmond, WA, USA, Cat. No. 7001)를 첨가하였다. 호모게나이저(Homogenizer)를 이용하여 현탁액을 만들기 위해 잘 혼합하였다. 완전히 현탁액이 만들어져 있는 지를 확인한 후, 1.0 ml 튜베르큘린 테스트용 주사기에 담았다. DBA/1 마우스를 잘 고정시킨 후에 꼬리 바로 위 등부분의 털을 제거하고, 피부 아래로 들어가지 않도록 매우 조심하면서 현탁액 0.1 ml을 피내(intradermal) 주사하였다. 1차 면역 유도 후 2 주 후에 2차 면역 유도를 실시하였다. 이때 1차 면역에 사용하였던 완전 프로인트 면역증강제 대신에 불완전 프로인트 면역증강제(Chondrex, Redmond, WA, USA, Cat. No. 7002)를 사용하며, 1차 면역과 동일한 방법으로 주사하였다. 이때에 화학식 1의 화합물의 관절염에 대한 예방적인 효과를 검증하기 위하여 1차 면역을 유도한 다음 2주부터 마우스 체중 1 g 당 0.1 ㎍의 용량으로 일주일에 3회 복강 내로 투여하였다. 또한, 관절염에 대한 치료적인 효과를 검증하기 위하여 1차 면역을 유도한 다 음 3주부터 동일한 방법으로 투여하였으며, 7주에 마우스를 희생시켜 마이크로단층촬영과 조직학 소견을 관찰하였다. 3주부터는 매주 육안으로 관찰할 수 있는 관절염 지수를 미국류마티스학회의 기준에 따른 아래의 기준에 따라 측정하였다. 즉, 발의 관절마디에 정상적인 소견을 보이면 0점, 발가락 부위만 종창이 있을 시에는 1점, 발바닥까지 종창이 있거나, 종창이 심한 경우에는 2점, 그리고 종창이 매우 심하거나 전체적인 발 전체에 종창이 있을 시에는 3점으로 매긴다. 각 마우스당 최고 12점이며 최저 0점이 된다. 관절염이 발생한 마우스의 골소실 정도를 분석하기 위하여 미세한 골조직의 변화를 분석할 수 있으며, 골조직의 변화를 3차원적으로 분석하기 위하여 관절염이 유도된 마우스의 앞발을 마이크로전산화단층촬영(micro-computed tomography scan, Skyscan 1072 micro-CT system; SkyScan, Aartselaar, Belgium) 장치로 촬영한 후, V-works(Cyberland, Seoul, korea) 프로그램으로 3차원 재구성을 하였다. 또한, 조직학적 소견을 분석하기 위하여 채취한 골을 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde) 로 고정하였으며, 12% EDTA로 탈회시킨 다음에 조직절편을 만들기 위하여 파라핀에 포매하였다. 포매된 절편을 H-E(hematoxylin-Eosin) 염색을 실시하였으며, 광학현미경으로 관찰하였다. 도8에서 보듯이 관절염이 유발된 마우스에서 골의 소실와 변형이 나타나는 전형적인 관절염 소견을 확인하였다. 그 결과 화학식 1의 화합물은 도6에서 보듯이 예방적, 치료적 투여군 모두에서 관절염군에 비하여 현저하게 관절염 지수를 낮추었으며, 도7에서 보듯이 화학식 1의 화합물 처리군이 관절염군에 비하여 골소실 정도를 현저하게 억제하였다. 아울러 조직표본에서도 화학식 1의 화합물 처리군이 관절염군에 비하여 골소실 정 도를 현저하게 억제하여 정상적인 소견을 관찰할 수 있었다.

상기 화학식 1의 화합물은 c-Fos와 NFATc1을 포함하는 파골세포 분화와 관련된 유전자의 발현을 억제하고, 조골세포 분화 유도 유전자인 Runx-2 활성을 촉진시키며, 본 발명의 약제학적 조성물은 난소절제 유도 골다공증 억제, 염증에 의해 유도된 골소실 억제, 콜라젠 유도 관절염 치료에 매우 유효하다.

<110> BIOLUNX <120> Composition for preventing and treating osseous metabolic disease <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 ctggtgcagc ccactctggt c 21 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ctttcagcag attggcaatc tc 22 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 caacgccctg accaccgata g 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ggctgccttc cgtctcatag t 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 actttgtcaa gctcatttcc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 tgcagcgaac tttattgatg 20

Claims

약제학적 유효량의 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 골대사성 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물:

[화학식 1]
제1항에 있어서, 골대사성 질환이 골다공증, 뼈전이암 병소(bone metastatic lesion), 원발성(primary)으로 뼈에 생성된 종양, 류마티스성 또는 퇴행성 관절염, 치주질환, 염증성 치조골 흡수 질환, 염증성 뼈 흡수 질환 및 파게트 질병(Paget's disease)로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 류마티스 관절염 치료용 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 골다공증 치료용 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 염증성 골흡수 질환 치료용 약제학적 조성물.
제 1항에 의한 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 함유하는 파골세포 분화 억제제.
제 6항에 있어서, 제 1항에 의한 화학식 1의 화합물에 의해 c-Fos, NFATc1의 활성을 억제함을 특징으로 하는 파골세포 분화 억제제.
제 1항에 의한 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 함유하는 조골세포 분화 촉진제.
제 8항에 있어서, 제 1항에 의한 화학식 1의 화합물에 의해 Runx-2의 탈아세틸화를 억제함을 특징으로 하는 조골세포의 분화 촉진제.