KR101054961B1 - 알파-토코페롤 숙신산을 유효성분으로 포함하는 골 대사성 질환 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

알파-토코페롤 숙신산을 유효성분으로 포함하는 골 대사성 질환 예방 및 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 알파-토코페롤 숙신산 (alpha-tocopheryl succinate, 비타민 E 숙신산, Vitamin E succinate)을 유효성분으로 포함하는 골 대사성 질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명에 따른 조성물에 포함되는 알파-토코페롤 숙신산은 비타민 E 유사체로서 NF-κB의 수용체 활성인자 리간드(Receptor Activation for Nuclear Factor κB Ligand, RANKL)의 발현을 저해하고, 파골 세포의 형성을 억제하여, 인터루킨-1(IL-1)에 의한 파골 세포 형성으로 인한 골 손실을 막음으로 골대사성 질환의 예방 및 치료하는데 유용하다.
골 대사성 질환, 알파-토코페롤 숙신산 (alpha-tocopheryl succinate), NF-κB의 수용체 활성 인자 리간드(RANKL), IL-1

Description

알파-토코페롤 숙신산을 유효성분으로 포함하는 골 대사성 질환 예방 및 치료용 조성물 {A composition for preventing and treating bone metabolic disease comprising alpha-tocopheryl succinate as active ingredient}
본 발명은 파골세포(osteoclast cell) 분화의 필수적인 인자인 조골세포에서의 NF-κB의 수용체 활성 인자 리간드(RANKL)의 발현을 억제하여 파골 세포의 형성 및 골 손실 감소에 우수한 효과를 나타내는, 알파-토코페롤 숙신산(alpha-tocopheryl succinate)을 유효성분으로 포함하는 골 대사성 질환 예방 및 치료용 약학 조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다.
[문헌 1] Evans와 Bishop, 1922, Science 56:650-651
[문헌 2] Prasad와 Edwards-Prasad, Cancer Research 2:550-555, 1982
[문헌 3] Prasad 등, Journal of American College of Nutrition 22:108-117, 2003
[문헌 4] Ha H, Lee JH, Kim HM, Kwak HB, Lee S, Kim HH, LeeZH 2006 alpha-Lipoic acid inhibits inflammatory bone resorption by suppressing prostaglandin E2 synthesis. J Immunol 176:111-117
[문헌 5] Jong-Ho Lee, Ha-Neui Kim, Daum Yang, Kyoungsuk Jung, Hyun-Man Kim, Hong-Hee Kim, Hyunil Ha, and Zang Hee Lee Trolox Prevents Osteoclastogenesis by Suppressing RANKL Expression and Signaling. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 284, 13725-13734, 2009
골 조직은 연골과 골격계를 구성하며 기계적 기능으로 지지와 근 부착의 역할을 하고, 생체기관 및 골수를 보호하는 기능을 하며, 칼슘과 인 이온의 항상성 유지를 위해 이들을 보존하는 기능을 담당한다. 골 조직은 교원질, 당단백질과 같은 세포 기질과 조골세포(osteoblast cell), 파골세포(osteoclast cell) 및 골세포 등 여러 종류의 세포들로 이루어진다. 골수 내 간질세포(bone marrow stromal cell)로부터 유래한 조골세포는 골 형성(osteoblast)에 주된 역할을 담당하며. 조혈모세포로부터 유래되는 파골세포는 파괴된 노화된 골의 흡수를 담당하여, 조골세포와 파골세포의 균형 있는 작용을 하여 골의 재형성(remodeling)을 유지하게 된다.
골 대사성 질환은 생체 내에서 파골세포와 조골세포와의 평형이 깨짐으로써 발생한다. 골 대사성 질환의 예로써 골다공증을 들 수 있는데 골다공증은 조골세포에 비하여 파골 세포의 활성이 증가함으로써 총 골량(total bone mass)이 감소하면서 경미한 충격에도 뼈가 쉽게 부서지게 되는 질환을 말한다. 이 외에도 종양이 전이된 전이성 암, 류마티스성 관절염, 퇴행성 관절염 및 세균의 감염에 의해 치조골의 파괴를 유발하는 치주 질환 등이 있다. 골 대사성 질환 등은 파골세포가 과도하게 활성화되어 뼈를 쉽게 파괴하는 결과를 초래하게 된다.
뼈와 조직에 염증이 생기면 혈류 내 사이토카인의 수치가 증가하게 되고, 이 사이토카인 중 하나인 인터루킨-1 (IL-1)과 TNF 등이 모세혈관에 신호를 보내게 되 고 세포 표면에 NF-κB의 수용체 활성 인자 리간드 (RANKL)이라는 분자를 표시하게 된다. NF-κB의 수용체 활성 인자 리간드 (RANKL)은 인체가 파골세포라는 골 파괴 세포를 만들고 파골세포의 활성화에 중요한 신호이며 대식 세포 분화인자(macrophage colony-stimulating factor, M-CSF)의 존재 하에 파골세포 전구체가 성숙한 파골세포로의 분화에 중요한 역할을 담당하는 요소이다.
인산화효소는 지방족방향족인 인산모노에스테르(phosphoric acid monoesters)을 가수분해하여 인산을 유리시키는 효소이다. 적정 활성 pH가 알칼리 영역인 알칼리 인산화효소(alkaline phosphatase)와 산성 영역인 산성 인산화효소(acid phosphatase)가 알려져 있다. 산성 인산화효소는 많은 세포와 조직에 존재한다고 알려졌으나, 1959년 Burstone은 파골세포(osteoclasts)에는 산성 인산화효소 활성이 조골세포(osteoblasts)에는 알칼리 인산화효소(alkaline phosphatase) 활성이 있음을 보고하였다. 후속연구에서 파골세포의 산성 인산화효소 활성은 주석산염(tartrate) 존재 하에서도 활성을 잃지 않는 주석산염-저항성 산성 인산화효소 (tartrate-resistant acid phosphatase, TRACP)임이 밝혀졌다. 현재는 파골세포로서의 조건 중 하나로 TRACP의 활성유무가 포함된다.
지금까지 여러 물질이 골다공증 치료제로 개발되고 있으며, 그 중 골다공증 치료제로 가장 많이 사용되는 에스트로겐은 그 실제적인 효능이 아직 검증되지 않은 상태이며 생애 동안 계속 복용해야하는 단점이 있고, 장기간 투여하는 경우 유방암이나 자궁암이 증가하는 부작용이 있다. 알렌드로네이트(alrendronate)도 그 효능이 명확하지 않고 소화관에서의 흡수가 더디며 위장과 식도점막에 염증을 유발 하는 문제가 있다. 칼슘제제는 부작용이 적으면서도 효과가 우수한 것으로 알려져 있지만 치료제라기보다는 예방제에 해당한다. 그 외에 칼시토닌과 같은 비타민 D 제제가 알려져 있으나 아직 효능 및 부작용에 대한 연구가 충분히 되어있지 않은 상태이다.
비타민 E는 1922년 처음 보고(Evans와 Bishop, 1922, Science 56:650-651)된 이후 화학구조식이 밝혀졌으며, 생식에 중요한 기능을 하는 것으로 알려졌으며, 다른 말인 "토코페롤(tocopherol)"은 그리스어로 "to bear offspring" 즉, "자손을 낳다"라는 말에서 기원한다. 토코페롤의 다양한 형태 중에서 알파-토코페롤이 생물학적으로 가장 활성화된 것이다. 또한, 비타민 E의 에스테르화 화합물 중 하나인 알파-토코페롤 숙신산 (alpha-tocopheryl succinate)은 다른 비타민 E 유도체 (예, alpha-tocopheryl acetate, alpha-tocophery nicotinate 등)에 비하여 가장 효과적으로 항암 효과가 있는 것이 확인되었다 (Prasad와 Edwards-Prasad, Cancer Research 2:550-555, 1982). 아울러 방사선 치료, 항암제 치료 등을 시행할 때 보조적으로 같이 사용하면 항암치료의 효과가 증진된다고 보고되고 있다 (Prasad 등, Journal of American College of Nutrition 22:108-117, 2003). 이렇듯 알파-토코페롤 숙신산의 다양한 이점이 있음에도 불구하고, 특히 파골세포에 활성에 의한 골 소실에 있어 알파-토코페롤 숙신산의 효과에 대한 연구가 거의 미비함에 따라, 본 발명자는 부작용이 적고, 파골세포의 형성 및 분화를 억제하는 기전에 선택적으로 작용하는 효과가 우수한 알파-토코페롤 숙신산을 포함하는 조성물에 대한 발명을 완성하였다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 알파-토코페롤 숙신산(alpha-tocopheryl succinate)을 포함하는 골 대사성 질환 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 알파-토코페롤 숙신산(alpha-tocopheryl succinate)을 유효성분으로 포함하는 골 대사성 질환 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 알파-토코페롤 숙신산(alpha-tocopheryl succinate)은 파골세포의 형성을 억제하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 알파-토코페롤 숙신산(alpha-tocopheryl succinate)은 파골세포의 전구체에서 파골세포 분화 인자인 NF-κB의 수용체 활성 인자 리간드(RANKL)의 발현을 억제함으로써 뼈의 손실을 감소시키는 효과를 갖는 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명의 알파-토코페롤 숙신산(alpha-tocopheryl succinate)은 인터루킨-1(IL-1)에 의한 파골세포의 형성을 억제하는 것을 특징으로 한다.
본원에서 정의되는 골 대사성 질환은 골다공증(osteoprosis), 파제트병(paget disease), 치주질환(periodontal disease), 골전이암(metastatic cancer) 또는 류마티스 관절염(rheumatoid arthiritis), 바람직하게는 골다공증을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학조성물.
본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 알파-토코페롤 숙신산을 0.1 내지 50% 중량으로 포함한다.
그러나 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 질환의 종류 및 진행 정도에 따라 변할 수 있다.
본 발명의 알파-토코페롤 숙신산을 포함하는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 알파-토코페롤 숙신산을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 화합물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들 면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 알파-토코페롤 숙신산의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 알파-토코페롤 숙신산은 1일 0.01 mg/kg 내지 10 g/kg으로, 바람직하게는 1 mg/kg 내지 1 g/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명은 골 대사성 질환의 예방 및 개선 효과를 나타내는 알파-토코페롤 숙신산을 유효성분으로 함유하는 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 알파-토코페롤 숙신산을 포함하는 건강기능식품은 골 대사성 질환의 예방 및 개선을 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 알파-토코페롤 숙신산을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.
본 발명의 알파-토코페롤 숙신산 자체는 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있는 화합물이다.
본 발명의 알파-토코페롤 숙신산은 골 대사성 질환의 예방 및 개선을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 화합물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ml를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.
본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ml당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
상기와 같이, 본 발명의 알파-토코페롤 숙신산 (alpha-tocopheryl succinate, 비타민 E 숙신산, Vitamin E succinate)은 NF-κB의 수용체 활성 인자 리간드(Receptor Activation for Nuclear Factor B Ligand, RANKL)의 발현을 저해하고, 파골 세포의 형성을 억제함을 확인하며, 인터루킨-1(IL-1) 에 의한 파골 세포 형성으로 인한 골 손실을 막아줌으로서 골대사성 질환의 예방 및 치료하는데 유용하게 쓰일 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 참고예 및 실험예에 의하여 상세히 설명한다. 단, 이는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용은 이에 의해 한정되는 것은 아니 다.
참고예 1. 조골세포의 분리
생후 1일인 ICR 마우스(오리엔트바이오, 성남, 경기도)를 70% 에탄올에 넣어 소독한 후 가위와 핀셋을 이용하여 두개골을 분리하여 몇 조각으로 자른 후 3xHBSS가 들어있는 6 cm 배양접시에 모은다. 여기에 0.1% 콜라젠분해효소 (collagenase, Gibco BRL)와 0.2% 디스파제 (dispase; Boehringer Mannheim)를 넣고 37에서 15분간 5회 처리한다. 2회 처리시부터 얻은 세포를 수집하여 1600 rpm으로 5분간 원심분리하여 조골세포를 얻는다.
상기에서 수득한 조골세포을 약 1-2x106/10 cm 배양접시에 옮겨 10% FBS가 함유된 a-MEM 15 ml에서 3일간 배양한다. 배양 후 냉동 바이얼에 분주하여 질소탱크에 냉동 보관하였다가 하기 상호배양 (co-culture) 실험에 사용한다 (Ha 등, Journal of Immunology, 2006, 176:111-117 참조).
참고예 2. 골수세포의 분리
6주내지 7주령인 ICR 암컷 마우스(오리엔트바이오, 성남, 경기도)를 경부염전으로 희생시킨 후 70% 에탄올로 뒷다리 부위를 소독한 다음 경골 (tibia)을 무균적으로 분리하였다. 분리한 경골을 3xHBSS (Gibco BRL)에 넣고 연조직을 깨끗하게 제거하였다. 상기 경골의 양쪽 끝을 자르고 1cc 주사기를 이용하여 1xa-MEM으로 골 수에 주입하여 골수세포를 얻은 후에 수회 파이펫팅하여 골수세포를 충분히 풀어주었다. 그 후 1600 rpm에서 5분간 원심분리하여 상층액은 버리고 침전된 세포 성분인 골수세포와 적혈구를 획득하였다. 침전된 세포에 ACK 완충액 (155 mM NH4Cl, 11 mM KHCO3, 0.01 mM EDTA) 약 15-20 ml을 2분간 처리하고, 인산완충용액을 첨가하여 골수세포의 손상을 최소한으로 줄이고 적혈구를 용해시켰다. 그 후 1600 rpm에서 5분간 원심분리한 후, 10% FBS가 함유된 a-MEM 배지로 세포를 현탁하였다 (Ha 등, Journal of Immunology, 2006, 176:111-117 참조).
참고예 3. 상호배양 (Co-culture)
상기 참고예 1 및 2에서 분리 배양한 골수세포와 조골세포를 문헌 등의 방법 (Ha 등, Journal of Immunology, 2006, 176:111-117 참조)으로 하기와 같이 상호배양하였다.
각각 웰(well)당 골수세포 2x105개와 조골세포 2x104개가 되도록 조절하고 48웰 세포배양접시에 10% FBS가 함유된 a-MEM의 존재하에서 상호배양하였다. 이때 파골세포 분화 촉진인자인 인터루킨-1 (IL-1) (10 ng/ml) 혹은 비타민 D3 (10-8 M)을 처리한 상태에서 알파-토코페롤 숙신산 (T3126, 시그마-알드리치사)을 10 μM, 20 μM의 농도가 되도록 처리하였다. 토코페롤 (T3251, 시그마-알드리치사)을 10 μM, 20 μM의 농도가 되도록 처리하여 비교군으로 하고, 화합물을 처리하지 않은 무처 리군을 대조군으로 하였다.
실험예 1. 파골세포 분화 억제능
파골세포의 분화를 연구하는 데 있어서 가장 큰 어려운 점은 현재까지 파골세포의 기능을 유지하고 있는 세포주가 확립되어 있지 않다는 것이다. 파골세포는 골수기원의 조혈모세포에서 기원하고 이들이 분화를 할 때 조골세포/기저세포의 도움을 받기 때문에 파골세포의 분화모델 시스템으로 골수세포와 조골세포의 상호배양 시스템이 많이 이용되고 있다.
본 발명인은 골수세포와 조골세포를 상호배양하여 골수세포가 파골세포로 분화되는 시스템을 조성하고 이 시스템에서 알파-토코페롤 숙신산이 파골세포의 분화를 억제하는지를 문헌 등의 방법(Lee 등, Journal of Biological Chemistry, 2009, 284:13725-13734)에 따라 하기와 같이 실험을 수행하였다.
배양 6일 후 분화가 끝난 파골세포가 있는 배양접시에서 배양액을 제거하고 세포를 고정하기 위하여 10% 포르말린으로 5분 동안 처리하였다. 포르말린을 제거하고 0.1% 트립톤 X-100 (Triton X-100)을 10초 동안 처리하였다. 트립톤 X-100 용액을 제거하고 5분간 TRACP (tartrate-resistant acid phosphatase)염색하였다. TRACP 염색은 백혈구 산 포스파타제 키트 (LEUKOCYTE ACID PHOSPHATASE KIT, Sigma, cat. No. 387-A)를 사용하였다. TRACP 염색용액 제거하고 증류수로 2번 수세하고 건조시킨 다음 TRACP 양성인 다핵의 파골세포의 수를 광학현미경 (X100)으로 카운팅하였다.
실험결과, 도 1에 나타난 바와 같이 화합물을 처리하지 않은 대조군과 비교군인 토코페롤에 비해 알파-토코페롤 숙신산은 파골세포의 분화를 강력하게 억제함을 알 수 있었다. 즉, 본 발명의 알파-토코페롤 숙신산을 포함하는 골 대사성 질환 예방 및 치료용 약학조성물은 골수 세포와 조골 세포의 상호배양에서 IL-1에 의해 생성된 파골세포의 형성을 강하게 억제함을 확인할 수 있었다.
실험예 2. 파골세포 전구세포에 대한 파골세포 분화 억제능
골수세포에서 유래된 파골세포 전구세포에 대한 알파-토코페롤 숙신산의 직접적인 파골세포 분화 억제능을 검증하기 위해 문헌 등 (Lee 등, Journal of Biological Chemistry, 2009, 284:13725-13734)의 방법에 따라 하기와 같이 실험을 수행하였다.
골수 세포로부터 (bone marrow cells) 마우스 파골 세포(murine osteoclast)가 분화된다. 5주령 되는 ICR-마우스의 대퇴부 및 경골에서 참고예 2의 방법으로 얻은 마우스 골수 세포 (mouse bone marrow cell)를 준비하고, 10% FBS (Invitrogen Life Technologies) 100 U/ml 페니실린(penicillin, Invitrogen Life Technologies), 100 ㎍/ml 스트렙토마이신(streptomycin, Invitrogen Life Technologies)이 포함되어 있는 a-MEM (Invitrogen Life Technologies) 배지로 M-CSF (10 ng/ml) (PeproTech)가 처리되 있는 10 cm 배양 접시에서 하루 밤 동안(overnight) 배양했다. 비 부착 세포(Nonadherent cell)들은 10-cm 박테리아 배양 접시(bacterial culture dish)로 옮겨서 3일 동안 M-CSF (30 ng/ml) (PeproTech)을 첨가한 상태에서 배양하였다.
부착(Adherent) 세포들은 비 부착 세포(Nonadherent cell)들을 제거한 후에 파골 세포의 전구체로서 골수에서 유래한 대식세포로서 사용된다. 파골 세포의 분화를 위해 M-CSF (30 ng/ml)와 NF-B의 수용체 활성 인자 리간드(RANKL) (100 ng/ml) (PeproTech)이 첨가된 48웰 (1 ml/well) 조직 배양 플레이트에서 골수 유래 대식세포(Bone Marrow-Drived Macrophages: BMMs) (4x104cell/ml)를 배양했다. 이때 비교군인 알파-토코페롤과 알파-토코페롤 숙신산을 각각 5 μM, 10 μM, 20 μM의 농도가 되도록 처리한 후, 분화가 완료된 파골세포는 TRACP 염색에 의해 확인하였다.
배양 6일 후 분화가 끝난 파골세포가 있는 배양접시에서 배양액을 제거하고 세포를 고정하기 위하여 10% 포르말린으로 5분 동안 처리하였다. 포르말린을 제거하고 0.1% 트립톤 X-100 (Triton X-100)을 10초 동안 처리하였다. 트립톤 X-100 용액을 제거하고 5분간 TRACP (tartrate-resistant acid phosphatase, LEUKOCYTE ACID PHOSPHATASE KIT, Sigma, cat. No. 387-A) 염색하였다. TRACP 염색용액 제거하고 증류수로 2번 수세하고 건조시킨 다음 TRACP 양성인 다핵의 파골세포의 수를 광학현미경 (X100)으로 카운팅하였다.
실험결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 알파-토코페롤과 알파-토코페롤 숙신산을 처리한 경우 모두 TRACP 양성인 파골세포의 수의 변화가 없음을 확인할 수 있었다. 즉, 실험군으로 사용한 알파-토코페롤 숙신산은 파골세포 전구세포에 직접적인 영향을 미치지 않는 것을 알 수 있었다.
따라서, 실험예 1과 실험예 2의 결과를 종합하면 알파-토코페롤 숙신산은 파골세포 전구세포에 직접적으로 작용하는 것이 아니라, 파골세포 분화를 유도하는 조골세포에 영향을 주어 결과적으로 파골세포의 분화를 억제함을 확인할 수 있었다.
실험예 3. 파골세포 분화 유도인자인 RANKL의 발현 억제능
알파-토코페롤 숙신산이 조골세포에서 파골세포 분화에 필수적인 분화 유도인자인 RANKL의 발현을 억제하는 지를 문헌 (Lee 등, Journal of Biological Chemistry, 2009, 284:13725-13734) 등의 방법에 따라 실험을 수행하였다.
상기 참고예 1의 ICR 마우스 두개(calvariae)로부터 원발성 조골세포를 준비한 후, 참고예 3에서 준비된 상호배양 시스템에서 NF-κB의 수용체 활성 인자 리간드(RANKL)의 발현을 RT-PCR 및 효소면역분석법(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay: ELISA)에 의해 측정하였다.
3-1. RT-PCT
RT-PCR 분석(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)을 위하여 전체 RNA는 제조사의 사용지침서에 따라 TRIzol 시약(reagent)(Invitrogen)을 사용해서 준비해놓고, cDNA는 역전사효소(Superscrip Preamplifiction System; Invitrogen)에 의해 전체 RNA 중 2 ㎍에서부터 합성하였다. cDNA(1 ㎕)는 PCR에 의해 하기 표 1의 프라이머 셋트를 각각 이용해서 증폭하였다. PCR 반응은 94℃에서 30초간 변성, 58℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 1분간 확장하는 사이클을 19-25 회 행하였다. 증폭된 cDNA 절편들은 1% 아가로스 겔에서 런닝하여 분리하고, 에티디움 브로마이드(ethidium bromide)로 염색하여 관찰하였다.
구분 프라이머
mouse NF-κB의 수용체 활성 인자 리간드(RANKL)의 forward 5'-CAGGTTTGCAGGACTCGAC-3'
mouse NF-κB의 수용체 활성 인자 리간드(RANKL)의 reverse 5'-AGCAGGGAAGGGTTGGACA-3'
mouse β-actin forward 5'-AACCCTAAGGCCAACCGTGA-3'
mouse β-actin reverse 5'-ATGGATGCCACAGGATTCCA-3'
실험결과, 도 3A에 나타난 바와 같이 RANKL 유도인자인 IL-1과 비타민 D3에 의해 조골세포에서의 NF-κB의 수용체 활성 인자 리간드(RANKL)의 발현은 증가 되며, 알파-토코페롤 숙신산의 처리 결과 IL-1과 비타민 D3에 의한 NF-κB의 수용체 활성 인자 리간드(RANKL)의 발현은 억제됨을 확인할 수 있었다. 이때, 비교군으로 사용한 알파-토코페롤을 처리한 경우 RANKL의 발현에 영향을 미치지 않음을 확인할 수 있었다.
3-2. 효소면역분석법
효소면역분석법(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay: ELISA)은 R&D systems (Minneapolis, MN, USA)의 ELISA kit를 사용하여 제조사의 사용지침서에 따라 시행하였다.
RANKL는 대부분 막에 부착한 형태로 존재로 단백질이 존재하기 때문에 세포 용해액에서 측정하였다. 배양액을 모두 제거하고 인산완충용액으로 수세한 후에 배양접시를 얼음 위에서 정치한 상태에서 세포용해완충용액 (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM Na3VO4, 1 mM NaF, 1% Triton X-100, 0.5% NP-40, 0.25% deoxycholate, 및 protease 및 phosphatase inhibitors)을 세포에 처리하여 세포 용해액을 얻고, 단백질을 정량을 실시하여 동일한 단백질 양을 측정하도록 한다. 사용하고자 하는 웰에 RANKL에 대한 항체를 활성화시키기 위하여 키트에 제공된 검사 희석액을 50 ㎕씩 넣는다. 표준시료와 세포 용해액을 50 ㎕씩 넣어 웰 당 총 부피가 100 ㎕가 되게 한다. RANKL 항원과 항체의 반응을 위해 2시간 동안 진탕시킨다. 그리고, 수세 완충액으로 5회 수세 후 준비된 100 ㎕의 conjugate diluent를 처리한다. 다시 2시간 동안 상온에서 진탕시킨 후에 같은 방법으로 5번 수세 후 효소의 기질 (Reagent A+Reagent B)을 100 ㎕ 처리하고, 차광하면서 30분 동안 진탕시킨다. 그 후 650 nm의 파장에서 흡광도를 측정하고 표준시료와 비교하여 단백질 양을 측정한다.
실험결과, 도 3B에 나타난 바와 같이 RANKL 유도인자인 인터루킨-1(IL-1)과 비타민 D3에 의해 조골세포에서의 NF-κB의 수용체 활성 인자 리간드(RANKL)의 발현은 증가 되며, 알파-토코페롤 숙신산의 처리 결과 IL-1과 비타민 D3에 의한 NF-κB의 수용체 활성 인자 리간드(RANKL)의 발현은 억제됨을 확인할 수 있었다. 이때, 토코페롤을 처리한 경우 RANKL의 발현에 영향을 미치지 않음을 확인할 수 있었다.
따라서, 알파-토코페롤 숙신산은 조골세포에서 파골세포 분화 유도인자인 NF-κB의 수용체 활성 인자 리간드(RANKL)의 발현억제능이 있음을 mRNA와 단백질 수준에서 확인할 수 있었다.
실험예 4. 알파-토코페롤 숙신산의 마우스 두개골 소실 억제 효과
마우스 골소실 억제에 대한 본 발명의 알파-토코페롤 숙신산의 효과를 알아보기 위하여, 생체 내에서 인터루킨-1에 의해 유도된 마우스 두개골 소실에 미치는 영향을 문헌 (Ha H, Lee JH, Kim HM, Kwak HB, Lee S, Kim HH, Lee ZH 2006 alpha-Lipoic acid inhibits inflammatory bone resorption by suppressing prostaglandin E2 synthesis. J Immunol 176:111-117) 등의 방법으로 실험을 수행하였다.
구체적으로, 콜라겐(Cellmatrix type I-A, Wako co., Japan, Cat. No. 637-00653)을 페트리 디쉬(60 x 15 mm)에 5-7 ml을 부어서 동결건조를 하였다. 동결건조된 콜라젠 스폰지를 이식(implantation)하기에 좋도록 적당한 크기로 나눈 후, 마우스의 국소적인 골 소실을 유도하기 위하여 IL-1 (Peprotech, London, England)을 인산완충용액에 희석시켜 마우스 한 마리당 2 ㎍이 되도록 하여 콜라겐 스폰지에 적셨다. IL-1 용액이 처리된 콜라겐 스폰지를 마우스의 두피(scalp)를 절개(incision)하여 두개골 표면에 접촉하도록 하여 실험군과 대조군 각각 5마리의 마우스(5주령, 숫컷, ICR strain)에 이식한 다음, 봉합(suture)하여 7일 동안 키운 후, 희생시켜 두개골을 얻었다. 이때 실험군으로 수술한 후 다음날부터 마우스를 희생시키기 전날까지 2일에 한번씩 알파-토코페롤 숙신산을 2 mg/마리의 용량으로 30 ㎕ DMSO 용액에 용해시켜 복강내 주사로 투여하였다. 대조군으로는 알파-토코페롤 숙신산 처리 동일한 양인 30 ㎕ DMSO 용액을 복강내 주사로 투여하였다. 비히클처리군(음성대조군)은 30 ㎕ DMSO 용액만 복강내 주사로 투여하였다. 7일 후 마우스를 희생시키고 적출된 마우스 두개골을 인산완충용액으로 3-4회 수세한 다음 4% 파라포름알데하이드 용액에 24시간 고정하였다. 고정이 끝난 마우스 두개골은 마이크로전산화단층촬영(micro-computed tomography scan, SMX-90CT, Shimadzu, Japan)을 수행하였고, 3차원 이미지를 얻어 그 결과를 도 4A에 나타내었다(Volume Graphics, VG studio Max 1.2.1 참고).
또 상기 3차원 이미지 파일을 TRI 3D-BON(RATOC system Engineering Co. Tokyo, Japan) 프로그램을 이용하여 골-미네랄 양(bone mineral content, BMC)을 측정하여 그래프로 표시하였다.
실험결과, 도 4A에 나타낸 바와 같이, 음성 대조군으로 사용된 비히클 처리군에 비해 본 발명의 화합물은 두개골의 골소실을 억제하여 전체적인 골-미네랄양이 증가되어 있음을 관찰할 수 있었다.
또한, 골소실과 직접적인 관계가 있는 파골세포의 숫자를 알기 위하여 두개골 전체를 TRACP 염색(시그마-알드리치사)을 수행하여 붉은색으로 염색이 되는 즉, TRACP 양성인 파골세포의 전체 면적은 image J 프로그램 (인터넷상으로 무료로 다운받을 수 있는 공유 프로그램)을 이용하여 그래프로 표시하였다.
실험결과, 도 4B에 나타난 바와 같이, 음성 대조군으로 사용된 비히클 처리군에 비해 본 발명의 화합물은 골 소실을 야기하는 파골 세포가 현저히 감소함을 확인할 수 있었다. 따라서 세포 수준에서 확인된 골 흡수 억제능을 마우스 두개골 소실 모델을 통하여 생체 내에서도 골흡수 억제능이 작용함을 확인할 수 있었다.
하기에 본 발명의 화합물을 함유하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예 1. 산제의 제조
알파-토코페롤 숙신산 20 mg
유당 100 mg
탈크 10 mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
제제예 2. 정제의 제조
알파-토코페롤 숙신산 10 mg
옥수수전분 100 mg
유당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
제제예 3. 캅셀제의 제조
알파-토코페롤 숙신산 10 mg
결정성 셀룰로오스 3 mg
락토오스 14.8 mg
마그네슘 스테아레이트 0.2 mg
통상의 캅셀제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캅셀제를 제조한다.
제제예 4. 주사제의 제조
알파-토코페롤 숙신산 10 mg
만니톨 180 mg
주사용 멸균 증류수 2974 mg
Na2HPO4,12H2O 26 mg
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 (2 ml) 상기의 성분 함량으로 제조한다.
제제예 5. 액제의 제조
알파-토코페롤 숙신산 20 mg
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ml로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.
제제예 6. 건강 식품의 제조
알파-토코페롤 숙신산 1000 mg
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트 70 ㎍
비타민 E 1.0 mg
비타민 B1 0.13 mg
비타민 B2 0.15 mg
비타민 B6 0.5 mg
비타민 B12 0.2 ㎍
비타민 C 10 mg
비오틴 10 ㎍
니코틴산아미드 1.7 mg
엽산 50 ㎍
판토텐산 칼슘 0.5 mg
무기질 혼합물 적량
황산제1철 1.75 mg
산화아연 0.82 mg
탄산마그네슘 25.3 mg
제1인산칼륨 15 mg
제2인산칼슘 55 mg
구연산칼륨 90 mg
탄산칼슘 100 mg
염화마그네슘 24.8 mg
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
제제예 7. 건강 음료의 제조
알파-토코페롤 숙신산 1000 mg
구연산 1000 mg
올리고당 100 g
매실농축액 2 g
타우린 1 g
정제수를 가하여 전체 900 ml
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.
상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
[이 발명을 지원하는 국가개발연구과제]
[과제고유번호] 0617-20090007
[연구사업명] 선도연구센터육숭사업
[연구과제명] 골대사제어물질탐색과 평가시스템 확립
[지원부처명] 교육과학기술부
[주관기관] 서울대학교 산학협력단
[연구기간] 2009녀 3 월 1일 ~ 2010년 2월 28일
도 1은 공동배양(coculture)에서 인터루킨-1(IL-1)에 의한 파골 세포의 형성에서 토코페롤-숙신산(alpha-tocopheryl succinate)의 효과를 나타내는 도면(aTP: 알파 토코페롤, aTP-suc: 토코페롤-숙신산)이며,
도 2는 골수 대식세포에서 NF-κB의 수용체 활성 인자 리간드(RANKL)에 의한 파골 세포 형성에서 토코페롤-숙신산의 효과의 측정을 위해 M-CSF와 NF-κB의 수용체 활성 인자 리간드(RANKL)가 포함되어 있는 골수 대식세포에서 토코페롤-숙신산에 처리에 따른 TRACP-다중 핵산 양성 반응을 보이는 세포 수를 나타내는 도면(aTP: 알파 토코페롤, aTP-suc: 토코페롤-숙신산)이고,
도 3A는 조골세포에서 토코페롤-숙신산에 처리에 따른 인터루킨-1(IL-1)과 비타민 D3(VD3)에 의한 NF-κB의 수용체활성 인자 리간드(RANKL)의 발현에 미치는 결과를 나타내는 RT-PCR 실험결과를 나타내는 도면(a-TP: 알파 토코페롤, TP-suc: 토코페롤-숙신산)이며,
도 3B은 조골세포에서 인터루킨-1(IL-1)과 비타민 D3(VD3)에 의한 NF-κB의 수용체 활성 인자 리간드(RANKL)의 양을 ELISA kit으로 측정한 결과를 나타내는 도면(a-TP: 알파 토코페롤, TP-suc: 토코페롤-숙신산, VD3: 비타민 D3)이고,
도 4A는 생체 내(in vivo)에서 인터루킨-1 (IL-1)에 의한 골 파괴에 있어 토코페롤-숙신산의 효과를 알아보기 위한 마이크로 CT분석(analysis)을 실시한 삼차원 이미지 사진(위쪽) 및 삼차원적 이미지를 바탕으로 골-미네랄 양(mg)을 수치로 표현한 도면이며,
도 4B은 생체 내(in vivo)에서 인터루킨-1(IL-1)에 의한 골 파괴에 있어 토코페롤-숙신산의 효과를 알아보기 위한 전체 두 개(calvaria)를 TRACP 염색을 실시한 사진(위쪽) 및 파골세포를 관찰하기 위하여 TRACP 염색을 한 것을 바탕으로 파골세포의 면적(아래쪽)을 나타낸 도면이다.
<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> A composition for preventing and treating bone metabolic disease comprising alpha-tocopheryl succinate as active ingredient <130> DIF/2009-06-0001/CA <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RANKL forward <400> 1 caggtttgca ggactcgac 19 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RANKL reverse <400> 2 agcagggaag ggttggaca 19 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin forward <400> 3 aaccctaagg ccaaccgtga 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin reverse <400> 4 atggatgcca caggattcca 20

Claims (11)

  1. 알파-토코페롤 숙신산(alpha-tocopheryl succinate)을 유효성분으로 포함하는 골 대사성 질환 예방 및 치료용 약학조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 알파-토코페롤 숙신산(alpha-tocopheryl succinate)은 파골 세포의 형성을 억제하는 것을 특징으로 하는 약학조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 알파-토코페롤 숙신산(alpha-tocopheryl succinate)은 파골 세포의 전구체에서 파골 세포 분화 인자인 NF-κB의 수용체 활성 인자 리간드(RANKL)의 발현을 억제함으로써 뼈의 손실을 감소시키는 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 약학조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 알파-토코페롤 숙신산(alpha-tocopheryl succinate)은 인터루킨-1(IL-1)에 의한 파골 세포의 형성을 억제하는 것을 특징으로 하는 약학조성물.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 골 대사성 질환은 골다공증, 파제트병, 치주질환, 골전이암 또는 류마티스 관절염을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학조성물.
  6. 알파-토코페롤 숙신산(alpha-tocopheryl succinate)을 유효성분으로 포함하는 골 대사성 질환 예방 및 개선용 건강기능식품.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 알파-토코페롤 숙신산(alpha-tocopheryl succinate)은 파골 세포의 형성을 억제하는 것을 특징으로 하는 건강기능식품.
  8. 제 6항에 있어서, 상기 알파-토코페롤 숙신산(alpha-tocopheryl succinate)은 파골 세포의 전구체에서 파골 세포 분화 인자인 NF-κB의 수용체 활성 인자 리간드(RANKL)의 발현을 억제함으로써 뼈의 손실을 감소시키는 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 건강기능식품.
  9. 제 6항에 있어서, 상기 알파-토코페롤 숙신산(alpha-tocopheryl succinate) 은 인터루킨-1(IL-1)에 의한 파골 세포의 형성을 억제하는 것을 특징으로 하는 건강기능식품.
  10. 제 6항에 있어서, 상기 골 대사성 질환은 골다공증, 파제트병, 치주질환, 골전이암 또는 류마티스 관절염을 포함하는 것을 특징으로 하는 건강기능식품.
  11. 제 6항에 있어서, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 건강기능식품.
KR1020090058115A 2009-06-29 2009-06-29 알파-토코페롤 숙신산을 유효성분으로 포함하는 골 대사성 질환 예방 및 치료용 조성물 KR101054961B1 (ko)

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Cancer Immunol Immunother. 2004, vol.53, pp.580-588
Nutrition and cancer. 2005, vol.53, no.2, pp.177-193

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