KR20200016640A

KR20200016640A - 금제제를 유효성분으로 포함하는 파골세포 분화 억제용 조성물

Info

Publication number: KR20200016640A
Application number: KR1020180091968A
Authority: KR
Inventors: 강건욱; 김현영; 김형식; 이광열
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2018-08-07
Filing date: 2018-08-07
Publication date: 2020-02-17
Also published as: WO2020032452A1; KR102122970B1

Abstract

본 발명은 금제제를 유효성분으로 포함하는 파골세포 분화 억제용 조성물 등에 관한 것으로서, 금제제는 파골세포 분화와 관련되는 신호 전달 경로에 있어서 보다 상위에 위치하는 NFATc1의 발현을 억제하고 IKK-IκBα의 인산화를 방해하여 NF-κB 활성화를 차단하고, 염증조절복합체 매개의 IL-1β 분비를 차단함으로써 파골세포 분화를 효과적으로 억제할 수 있다. 또한, 난소적출 동물모델에서 골 소실을 억제하고 골 밀도를 향상시키는 효과가 있는바, 파골세포 분화 억제 및 파골세포 분화에 기인하는 대사성 골 질환의 개선, 예방, 또는 치료를 위한 의약용, 의약외용, 식품 첨가물용, 향장소재용 조성물 등 다양한 방면으로 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

금제제를 유효성분으로 포함하는 파골세포 분화 억제용 조성물{Composition for inhibiting osteoclast differentiation comprising gold compound as an active ingredient}

본 발명은 금제제를 유효성분으로 포함하는 파골세포 분화 억제용 조성물 등에 관한 것이다.

뼈(bone)는 인체의 연조직과 체중을 지탱해주고 내부기관을 둘러싸서 내부 장기를 외부의 충격으로부터 보호하며, 근육이나 장기를 구조적으로 지탱할 뿐만 아니라 체내의 칼슘이나 다른 필수 무기질 즉 인이나 마그네슘과 같은 물질을 저장하는 인체의 중요한 부분 중 하나이다. 따라서 성장이 끝난 성인의 뼈는 멈추지 않고 죽는 날까지 오래된 뼈는 제거하고 새로운 뼈로 대체하는 생성과 흡수과정을 매우 역동적, 지속적으로 반복 재생 하면서 균형을 유지하게 된다. 이를 뼈의 재형성(bone remodeling)이라고 한다. 이러한 뼈의 재형성은 성장과 스트레스에 의해서 일어나는 뼈의 미세한 손상을 회복시키고 적절히 뼈의 기능을 유지하는데 필수적이다.

뼈의 재형성에는 크게 두 종류의 세포가 관여하는 것으로 알려져 있다. 두 세포 중 하나는 뼈를 생성하는 조골세포(osteoblast)이고, 다른 하나는 뼈를 파괴하는 파골세포(osteoclast)이다. 조골세포는 RANKL(receptor activator of NF-κB ligand)과 이것의 유도 수용체(decoy receptor)인 OPG(osteoprotegerin)를 생성한다. RANKL이 파골 전구세포(osteoclast progenitor cells) 표면에 있는 수용체 인 RANK(receptor activator of NF-κB)에 결합하면 파골 전구세포가 파골세포로 분화되어 골 흡수(resorption)가 일어난다. 자세하게는 RANKL 자극에 의한 세포내 칼슘 신호 전달로 파골 전구 세포에서 파골세포의 분화를 조절하는 핵심 전사인자로 알려져 있는 NFAT(nuclear factor of activated T cells: 이하 간단하게 ‘NFAT'라 함)의 발현이 유도되고, 그 후 세포외 신호조절인산화효소(extracellular signal-regulated kinase: ERK), NF-κB, p38 MAP kinase 등의 활성화가 NFAT의 자가증폭(autoamplification)을 유발하여 활성이 지속되는 것이다.

따라서 오래된 뼈의 흡수 또는 파괴는 상기와 같은 기작을 통해 파골세포에 의해 이루어지며, 이는 뼈에 구멍을 내어 적은 양의 칼슘이 혈류로 방출되어 신체기능을 유지하는데 사용된다. 파골세포는 실제적인 뼈의 흡수작용을 할 때는 다핵세포로 융합된 후 그 구조가 변하여 주름진 테두리를 형성하며, 골 기질 표면에 흡착하여 산성화 환경에서 카텝신(cathepsin) K 나 H⁺-ATPase 등 많은 효소의 작용으로 뼈를 흡수한다. 이에 반해, 조골세포는 교원질로 구멍을 채우고 칼슘과 인의 침적물 (hydroxyapatite)을 덮어서 단단한 새로운 뼈를 만들어 골격을 재건하게 된다.

성인의 경우 매년 골격의 약 10-30%가 이런 과정을 통하여 재형성되며, 파골속도와 조골속도가 동일해야만 전과 같은 골밀도를 유지할 수 있다. 정상 성인에서는 골흡수 양과 골형성 양 사이에는 항상 균형이 유지되고 있다. 이와 같이 중요한 뼈에 균형이 깨질 경우 많은 질병이 야기될 수 있는데, 이러한 질환을 하기에서는 ‘대사성 골 질환’이라 하였다.

대사성 골 질환 중 고령사회에서 큰 문제로 대두되고 있는 골다공증은 골의 화학적 조성에는 큰 변화 없이 단위 용적내의 골량이 감소하여 경미한 충격에도 쉽게 골절을 일으킬 수 있는 질환이다. 노인 특히 폐경 후 여성들의 경우 에스트로겐의 분비 부족으로 인하여 그 발생빈도가 높게 나타난다. 현재 에스트로겐이나 천연에 존재하면서 약한 에스트로겐 활성을 나타내는 식물 유래의 피토에스트로겐이 폐경 후 골다공증 예방에 매우 유용하다는 연구가 보고되었다. 그러나 이러한 방법은 폐경성 골다공증 이외의 원인에는 제한적으로 사용된다는 한계점을 가진다. 이 밖에 칼슘염, 우골분 등의 칼슘 보강제, 비타민 D 대사산물 요법 등이 비 폐경성 골다공증 치료에 이용되고 있으나, 이들은 용해성이나 흡수성, 미각적 측면에서 문제점을 가지고 있다. 또한 약물 투여에는 비스포스포네이트(bisphosphonates)나 칼시토닌 제제 등이 사용되며 골다공증의 치료에 유효하다고 알려져 있으나, 이러한 약물은 전문의약품이고, 식도에 협착될 수 있는 부작용이 있어 복용에 주의를 요하며, 이명, 두통, 식욕 부진 등의 부작용도 나타낼 수 있다고 보고된 바 있다.

한편, 금제제의 일종인 오라노핀은 류마티스 관절염 치료제로 이용되는 약물로서, 암을 비롯한 여러 질병에서 치료 약물로의 적용 가능성이 연구되고 있다. drug repositioning 연구는 약물 개발 과정에서 실패 위험을 줄이고 비용을 줄일 수 있다는 점에서 주목받고 있다. 이에, 본 발명자들은 오라노핀에서 항염증 효과 이외에 파골세포 분화 억제 효과와 이에 따른 골 손실 방지 효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다.

KR 10-1332074

본 발명의 목적은 금제제를 유효성분으로 포함하는 파골세포 분화 억제용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 금제제를 유효성분으로 포함하여 파골세포 분화에 기인한 대사성 골 질환의 개선, 예방, 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 금(gold)제제를 유효성분으로 포함하는 파골세포 분화 억제용 조성물 을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 금제제는 오라노핀(auranofin), 금티오말산 소듐(sodium aurothiomalate), 금티오글루코오스(aurothioglucose), 금티오황산 소듐(sodium aurothiosulfate), 및 금티오말산 이소듐(disodium aurothiomalate)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 조성물은 파골세포 전구체의 파골세포로의 분화를 억제하는 것일 수 있으며, 상기 파골세포 전구체는 수지상 세포 또는 대식세포일 수 있으나, 바람직하게는 골수 유래 대식세포일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조성물은 NFATc1의 발현을 억제하거나, IKK 및 IκBα의 인산화를 억제하는 것에 의해 파골세포 분화를 억제하는 것 일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조성물은 pro-IL1의 절단을 억제하여 IL-1β 분비를 차단하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 금제제를 유효성분으로 포함하는 대사성 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 대사성 골 질환은 폐경 또는 파골세포 분화에 의해 야기되는 질환일 수 있으며, 골다공증, 치주염, 골석회증, 및 뼈 전이암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 질병일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 뼈 전이암은 유방암 또는 전립선 암으로부터 전이되는 암일 수 있다.

또한, 본 발명은 금제제를 유효성분으로 포함하는 골 손실 억제 또는 골 밀도 향상용 식품 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 골 손실은 여성의 폐경 또는 파골세포 과분화에 의해 유도되는 것 일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 식품은 건강기능식품일 수 있다.

또한, 본 발명은 금제제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 대사성 골 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 투여는 경구 투여일 수 있다.

또한, 본 발명은 골 손실 억제용 약제의 제조를 위한 금제제의 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 대사성 골 질환 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한 금제제의 용도를 제공한다.

본 발명에 따른 금제제, 특히 오라노핀은 RANKL 자극에 의해 유발되는 파골세포의 분화를 억제하는 효과가 있으며, 파골세포 분화를 억제함으로써 궁극적으로 파골세포에 의한 골 흡수를 억제하여 파골세포의 분화에 의해 야기되는 대사성 골 질환의 예방 또는 치료에 이용될 수 있다.

또한, 본 발명은 난소적출시술에 의해 인위적으로 폐경을 유도한 마우스 모델에서 금제제의 일종인 오라노핀을 투여하여 골 밀도, 뼈의 미네랄 함량이 증가됨을 확인하였는바, 본 발명에 따른 조성물은 폐경기 이후 발생하는 골 소실을 억제하여 골다공증 등의 대사성 골 질환을 예방, 개선, 또는 치료하는데 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1a는 BMM 세포에서 RANKL에 의한 파골세포 분화 유도와 오라노핀의 처리에 따른 파골세포 분화 억제를 TRAP 염색을 통해 확인한 도면이다.
도 1b는 도 1a를 정량화한 그래프이다.
도 1c는 RANKL과 오라노핀을 처리한 BMM 세포에서 파골세포 분화 마커인 CSTK mRNA 발현 수준을 확인한 도면이다.
도 1d는 RANKL과 오라노핀을 처리한 BMM 세포에서 파골세포 분화 마커인 TRAP mRNA 발현 수준을 확인한 도면이다.
도 1e는 RANKL과 오라노핀을 처리한 BMM 세포에서 파골세포 분화 마커인 CSTK 단백질과 파골세포 분화에 필수적인 NFATc1 단백질 발현 수준을 확인한 도면이다.
도 1f는 RANKL과 오라노핀을 처리한 Raw264.7 세포에서 파골세포 분화에 필수적인 NFATc1 단백질 발현 수준을 확인한 도면이다.
도 1g는 오라노핀의 세포 독성을 MTT assay를 통해 확인한 도면이다.
도 2a는 NF-κB 리포터 유전자를 이용하여 오라노핀에 의한 NF-κB 리포터 활성 억제를 확인한 도면이다.
도 2b는 RANKL과 오라노핀을 처리한 Raw264.7 세포에서 c-Fos 발현 수준을 확인한 도면이다.
도 2c는 오라노핀 처리에 따라 nuclear p65의 발현이 저해됨을 확인한 도면이다.
도 2d는 RANKL과 오라노핀을 처리한 BMM 세포에서 p65의 분포를 확인한 도면이다.
도 2e는 RANKL과 오라노핀을 처리한 Raw264.7 세포에서 IKK의 인산화 수준을 확인한 도면이다.
도 2f는 RANKL과 오라노핀을 처리한 Raw264.7 세포에서 IκBα 서브유닛의 인산화 수준을 확인한 도면이다.
도 3a 및 도 3b는 LPS와 ATP로 염증조절복합체 의존성 IL-1β 분비가 유도된 BMM에 Nivocasan을 처리하여 pro-IL1β의 절단이 억제되고, BMM의 TRAP 양성 및 다핵 세포로의 분화가 차단됨을 확인한 도면이다.
도 3c는 LPS와 ATP로 염증조절복합체 의존성 IL-1β 분비가 유도된 BMDM에 Nivocasan을 처리하여, Nivocasan에 의한 NFATc1 및 CSTK 단백질 발현 억제를 확인한 도면이다.
도 3d 및 도 3e는 BMM과 J774.A1 세포에서 오라노핀을 처리하는 경우 pro-IL1β의 절단이 차단되어 IL-1β 분비가 억제됨을 확인한 그래프이다.
도 4a는 SHAM 대조군, OVX 대조군, 및 오라노핀 처리군의 체중변화를 기록한 그래프이다.
도 4b는 H&E 염색을 통해 OVX 마우스에서 오라노핀의 투여로 골 소실이 감소됨을 확인한 도면이다.
도 4c는 OVX 마우스에서 오라노핀의 투여로 양 대퇴골의 중량이 증가됨을 확인한 도면이다.
도 4d는 난소적출에 의해 혈청의 BALP 농도가 높아지나, 오라노핀의 투여로 BALP의 농도가 감소됨을 확인한 도면이다.
도 5a는 SHAM 대조군, OVX 대조군, 및 오라노핀 처리군의 마이크로 CT 이미지이다.
도 5b는 SHAM 대조군, OVX 대조군, 및 오라노핀 처리군의 골 부피를 나타낸 그래프이다.
도 5c는 SHAM 대조군, OVX 대조군, 및 오라노핀 처리군의 섬유주 패턴 인자를 나타낸 그래프이다.
도 5d는 SHAM 대조군, OVX 대조군, 및 오라노핀 처리군의 구조 모델 지수를 나타낸 그래프이다.
도 5e는 SHAM 대조군, OVX 대조군, 및 오라노핀 처리군의 해면질골의 두께를 나타낸 그래프이다.
도 5f는 SHAM 대조군, OVX 대조군, 및 오라노핀 처리군의 해면질골의 수를 나타낸 그래프이다.
도 5g는 SHAM 대조군, OVX 대조군, 및 오라노핀 처리군의 해면질골의 분리 정도를 나타낸 그래프이다.

본 발명자들은 금제제의 일종인 오라노핀의 RANKL 자극에 의한 파골세포 분화를 효과적으로 억제함을 확인하여 본 발명을 완성하였다. 보다 구체적으로, 오라노핀은 파골세포 분화와 관련되는 신호 전달 경로에 있어서 보다 상위에 위치하는 NFATc1의 발현을 억제하고 IKK-IκBα의 인산화를 방해하여 NF-κB 활성화를 차단함으로써 파골세포 분화를 억제하는 기능을 수행하며, 또한 염증조절복합체 매개의 IL-1β 분비를 차단함으로써 파골세포 분화를 억제할 수 있음을 확인하였다. 아울러, 난소를 적출하여 인위적으로 폐경을 유도한 마우스에서 오라노핀을 투여하여, 오라노핀이 골 소실을 억제하고 골 밀도를 향상시키는 효과가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 명세서에서 "금제제"란 금(gold)과 다른 원소(성분)가 일정 비율로 구성된 화합물 즉, 금의 화합물(gold compound)을 의미하고, 금(I) 화합물 및 금(Ⅲ) 화합물을 모두 포함할 수 있다. 상기 금제제의 비제한적인 예로 오라노핀(Auranofin), 금티오말산 소듐(sodium aurothiomalate), 금티오글루코오스(aurothioglucose), 금티오황산 소듐(sodium aurothiosulfate), 금티오말산 이소듐(disodium aurothiomalate) 등이 있으며, 본 발명에서 금제제는 바람직하게는 오라노핀, 금티오말산 소듐, 또는 금티오글루코오스일 수 있고, 보다 바람직하게는 오라노핀일 수 있다.

본 명세서에서 “오라노핀”은 ‘2,3,4,6-테트라-오-아세틸-1-티오-베타-디-글루코피라노사토-에스-[트리에틸포스핀]금((2, 3, 4, 6-tetra-O-acetyl-1-thio-β-D-glucopyranosato-S-[triethylphosphine] gold))’으로, 하기 화학식 1의 구조를 갖는다.

[화학식 1]

한편, “대사성 골 질환”이란 파골세포(osteoclast)에 의한 골 흡수과 조골세포(osteoblast) 에 의한 골 형성의 불균형으로부터 야기되는 질병으로서, 뼈 전이암(bone metastasis), 원발성(Primary)으로 뼈에 생성된 종양(예, 다발성 골수종), 류마티스성 또는 퇴행성 관절염, 치주질환을 야기하는 세균에 의해 발생하여 치조골의 파괴가 일어난 치주질환, 치과용 임프란트를 식립한 후에 야기된 염증성 치조골 흡수 질환, 정형외과 영역에서 뼈를 고정하기 위하여 식립된 임프란트에 의해 야기된 염증성 뼈 흡수 질환, 각종 유전적인 소인에 의해 발생하는 파게트 질병(Paget's disease) 등이 있으나, 파골세포 과분화에 의해 발생하는 질병으로는 골 경화증, 치주염 및 골다공증과 함께 유방암, 전립선 암 등의 종양이 뼈로 전이된 골 전이 병변(뼈 전이암) 등이 대표적이다.

따라서, 본 명세서에서 대사성 골 질환은 파골세포 분화 억제를 통해 개선, 예방, 또는 치료 효과를 얻을 수 있는 질환이라면 제한되지 아니하나, 바람직하게는 골 경화증, 치주염, 골다공증, 및 뼈 전이암일 수 있다.

성숙된 파골세포는 각 세포의 핵이 세포융합에 의해 다핵체 세포로 변화하고 엑틴고리(actin ring)로 융합된 세포들이 묶인 형태이다. 파골세포의 전구체(progenitors) 세포는 골수성 세포 계열(myeloid cell lineage)에 속한다. 골수세포에 M-CSF(macrophage-colony stimulating factor)를 처리하면 전구세포(preosteoclast)인 수지상세포(dendritic cell) 및 대식세포(macrophages)로 분화하고, 파골세포 분화의 마스터 조절자(master regulator)인 RANKL(Receptor activator of NK-kB ligand)를 처리하면 수용체인 RANK에 결합하여 다양한 신호전달을 만든다. 이에 따라 세포 안 칼슘 오실레이터(oscillator)의 변화로 Ca²⁺-의존 키나아제(Ca² ⁺-dependent kinase)가 활성화되고, 전사인자 NFAT-c1을 활성화하여 파골세포 분화에 필요한 여러 단백질을 발현하게 된다. 또한, TGF-β, IGF, IFN-γ, TNF-α 및 SemaD와 같이 조골세포 또는 파골세포에서 발현하여 파골세포 분화의 양과 속도를 조절하는 세포 커뮤니케이션 인자(cell- communication(coupling) factors)들도 RANKL과 같이 작용하여 항상성과 병적상태에서 파골세포의 분화와 사멸을 조절한다.

따라서, 본 명세서에서 “파골세포 분화 억제”는 골수 세포의 파골세포 전구세포(수지상 세포 또는 대식세포)로의 분화를 억제하거나, 파골세포 전구세포의 파골세포로의 분화를 억제의 의미를 포함하며, 바람직하게는 대식세포의 파골세포로의 분화 억제를 의미하며, 보다 바람직하게는 골수 유래 대식세포의 RANKL 자극에 의한 파골세포 분화를 억제하는 것을 의미한다.

또한, 본 명세서에서 “과분화”는 파골세포의 골 흡수과 조골세포의 골 형성의 균형이 깨지도록 파골세포가 다량 분화되거나, 조골세포의 형성 또는 활성이 부족하여 골 형성의 정도보다 골 흡수의 정도가 더 크게 된 것을 포함하는 의미이다.

암세포의 골전이는 파골세포에 의해 유도된다. 파골세포가 암세포를 끌어들여 골전이가 이루어지고 파골세포와 암세포가 호르몬 등의 신호전달 과정을 통해 서로 더욱 활성화되어 골전이가 악화될 수 있는데, 본 발명의 조성물은 이러한 파골세포의 분화를 억제함으로써 암세포의 골전이를 효과적으로 억제할 수 있다. 특히, 유방암과 전립선암은 거의 대부분의 경우에서 골전이가 발생하기 때문에, 본 발명의 약학적 조성물을 이러한 유방암과 전립선암에 사용하면 보다 우수한 효과를 기대할 수 있다.

또한, 다핵성 파골세포의 골흡수능으로 인해 골용해(osteolysis)가 발생한다. 본 발명의 약학적 조성물은 파골세포의 분화를 억제하고, 단핵 파골세포의 융합에 의해 다핵성 파골세포가 형성되는 것을 억제하며, 다핵성 파골세포의 골흡수능도 감소시킬 수 있으므로, 골용해를 효과적으로 억제할 수 있다.

한편, 치주염은 세균에 의해 발생하는 염증성 질환으로 염증 조건에서 파골세포의 형성이 증가하여 뼈의 파괴가 증가하게 된다. 본 발명의 조성물은 파골세포의 분화를 억제하고, 단핵 파골세포의 융합에 의해 다핵성 파골세포가 형성되는 것을 억제하며, 다핵성 파골세포의 골흡수능도 감소시킬 수 있으므로, 치주염을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.

일반적으로 폐경기는 여성에게 있어 월경출혈의 최종 현상으로서 정의된다. 그러나 이 용어는 생식기까지와 월경출혈의 최종 현상을 경과하는 사이의 이행 기간을 포함하여 여성 갱년기의 시기로 언급되는데 통상 사용된다. 또한 이 시기는 폐경기 근처 또는 갱년기로서도 언급되기도 한다. 이러한 시기 동안에는 각종 내분비, 체세포 및 생리적 변화 및 난소 기능의 손실이 점차적으로 진행된다. 또한, 폐경기 근처에서 쇠퇴하는 에스트로겐 수준과 관련된 증상으로는 전신열감 및 발한, 위축질염, 두통, 현기증, 관절통, 불면증, 무감정, 권태, 근육약화, 심계항진 및 분위기 변화, 울병, 기억 및 집중력 저하, 이상 감응 및 성적 기능과 관련된 문제와 같은 심리적 증상이 포함되며, 특히 에스트로겐 농도의 급속한 감소는 파골세포의 활성을 증가시켜 골 흡수(골 손실)가 증가하게 되며, 종국에는 골다공증과 같은 대사성 골 질환을 초래하게된다.

본 발명의 약학적 조성물은 금제제, 특히 오라노핀과 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 1종 이상의 공지 물질을 추가로 포함할 수 있으며, 조골세포의 골 생성을 활성화하거나 조골세포 분화를 촉진시키는 1종 이상의 공지 물질을 추가로 포함할 수 있고, 항염증제를 추가로 포함할 수도 있다.

한편, 본 발명에서 "예방"은 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 대사성 골 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"는 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 대사성 골 질환에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, "개선"이란 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.

또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 이때, 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세 결정성 셀룰로스, 폴리비닐 피로리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 금제제는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산 (free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류와 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, 하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함한다.

본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면, 상기 화학식 1로 표시되는 고리형 펜타뎁시펩타이드를 과량의 산 수용액 중에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다. 또한, 이 혼합물에서 용매나 과량의 산을 증발시켜서 건조하거나 또는 석출 된 염을 흡입 여과시켜 제조할 수도 있다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 음염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.

본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 다른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로 본 발명의 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1kg 당 100 내지 500 mg을 매일 또는 격일 투여하거나, 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 명세서에서 "식품"이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체내조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미하며, 이는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있고, 기능성 식품 및 건강기능성 식품을 포함하는 의미이다.

본 발명의 식품 조성물은 대사성 골 질환의 예방 또는 개선을 위하여 해당 질환의 발병 단계 이전 또는 발병 후, 치료를 위한 약제와 동시에 또는 별개로서 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있으며, 상기 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

상기 조성물의 양은 전체 식품 중량의 0.001 중량% 내지 90 중량%로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 0.1 중량% 내지 40 중량%로 포함할 수 있고, 장기간 섭취 용도일 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으나, 유효성분이 안전성 면에서 아무런 문제가 없어 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있기 때문에 상기 범위에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 약학적/식품 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 대사성 골 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실험방법]

1. 실험 재료

금제제 중에서는 오라노핀을 선택하였으며, 오라노핀(BML-EI206-0100)은 Enzo Life Science (Lausen, Switzerland)에서 구입하여 사용하였으며, cathepsin K (E-7), NFATc1 (7A6), 및 p65에 대한 1차 항체는Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA)에서 구입하여 사용하였다. Lamin A/C, IKK, IκBα, 및 Phospho-IκBα (Ser32) 특이적 항체는 Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)에서 구입하였으며, IKKβ에 대한 항체는 Abcam (Cambridge, MA, USA)에서 구입하여 사용하였다. TRAP(Tartrate-resistant acid phosphatase) 염색 키트(386A-1KT)와 MTT(3-(4,5-dimethylth-iazole-2-yl)-2,5-dipenyltetrazolium bromide)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고, Murine M-CSF는 Peprotech (Rocky Hill, NJ, USA)에서 공급받아 사용하였다.

2. in vitro 파골세포 분화 분석

마우스 파골세포(Murine osteoclasts)는 C57BL/6 마우스 골수로부터 획득하였다. 구체적으로, 상기 골수세포는 배양접시에서 30ng/mL M-CSF(macrophage colony stimulating factor), 10% FBS(fetal bovine serum), 및 αMEM(α-minimum essential medium) 존재하에 3일간 배양하였다. 상기 배양접시에서 부유하는 세포를 제거하고, 접시에 부착된 세포를 파골세포 전구체(osteoclast precursor: Bone Marrow-Derived Macrophage: BMM)로 이용하였다. 파골세포 생성을 위하여, 상기 BMM을 6-well plate에 10⁶ cell/well로 분주하고, 30ng/mL M-CSF 및 100ng/mL RNAKL을 첨가하여 7일간 배양하였으며, 배지는 3일마다 교환하였다. 이후, 분화된 BMM은 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 고정하고, TRAP를 염색하여, 3개 이상의 핵을 가진 TRAP 양성 다핵세포(TRAP-positive multinucleate cells: TRAP+ MNCs)를 파골세포로 계수하였다.

3. 면역조직화학적 방법(Immunocytochemsitry method: ICC method)

Raw264.7 대식세포주에서 p65가 핵으로 이동하는 것에 오라노핀이 미치는 영향을 평가하기 위하여 면역조직화학적 방법이 이용되었다. 구체적으로, Raw264.7 cell에 3μM의 오라노핀을 처리하고 4% 파라포름알데하이드로 15분 동안 고정시킨 후 0.2 % Triton X-100가 포함된 PBS로 10분 동안 3회 세척하였다. 이어서, 1% 말 혈청이 포함된 PBS로 차단한 후 항-p65 단일클론 항체와 Alexa-488 접합된 goat anti-mouse IgG antibody (A-21202, Invitrogen, Carlsbad, CA)로 처리하고, prolong gold antifade mountant 와 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole, Thermo Scientific, Rochester, USA)로 세포를 대조 염색하였다. 대조군은 오라노핀 대신 vehicle을 처리하였다.

4. 동물 및 실험 설계

8주령 ICR 암컷 마우스는 오리엔트바이오 (성남, 경기도)로부터 분양받아 2주간 적응시킨 후 온도 21±2℃, 습도 50±5%, 12시간 광주기 조건하에서 사육하였다. tribromoethanol (Avertin)로 마취한 마우스에 난소 적출 수술을 시행하여 난소적출모델(OVX; n=12)을 제작하였으며, 대조군(sham-operated: SHAM; n=6)은 겉보기 수술을 수행하여 제작하였다. 수술 4주 후 OVX 마우스는 OVX 대조군과 오라노핀군으로 구분하였으며, 오라노핀군은 43일 동안 10mg/kg의 오라노핀을 식염수와 함께 투여하였고, SHAM과 OVX 대조군은 동일한 부피의 식염수를 경구 투여하였다. 이어서, 마우스를 희생시키고 혈정 생화학 분석(serum biochemistry analysis)을 위하여 혈액 샘플을 수득하고, 원위 대퇴골를 수득하여 75% 에탄올에 밤새 고정한 후 골 질량을 측정하였다. 본 동물실험은 성균관대학교 동물윤리위원회의 규정에 따라 수행하였다.

5. 혈청 생화학 분석

BALP(bone alkaline phosphatase) 활성은 시판 중인 키트를 이용하여 제조사의 지침에 따라 측정하였다. BALP은 골 재형성 과정에서 방출되는 인산화 효소로서, BALP 활성도는 골 전환율(bone turnover) 상태를 반영하는 대표적인 생화학적 파라미터 이다.

6. 마이크로 CT (Microcomputed tomography: micro CT: mCT) 분석

Skyscan 1172 micro-CT scanner (Kontich, Belgium)를 사용하여 mCT 이미지를 획득하고, 상기 이미지로부터 좌측 대퇴골의 형태와 구조적 특성 파라미터를 분석하였다. 마이크로 CT는 0.5 mm 알루미늄 필터와 11μm pixel^-1의 해상도로 50 kV 및 201 μA에서 고해상도 Skyscan 1172 시스템 (Skyscan, Kontich, Belgium)을 사용하여 스캔하였다. 이미지는 180 ° 범위에서 0.7 °마다 캡쳐하였다. BMD(bone mineral density), Tb.N(trabecular number), BV/TV(bone volume/total volume ratio), Tb. Th(trabecular thickness), Tb.Pf(trabecular pattern factor), 및 SMI(structure model index)를 사용하여 Skyscan NRecon 프로그램에서 정량적 데이터를 생성하고, 상기 데이터는 Skyscan CTAN 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.

7. 골 조직 형태학적 분석 (Bone histomorphometric analysis)

수집한 경골(tibias)을 4% 파라포름알데하이드로 고정하고, 4℃에서 2주동안 5.5% EDTA 완충액으로 석회질을 제거하였다. 상기 샘플을 점진적으로 탈수시키고, 파라핀으로 포매하여 4mm 두께로 종축 절단하였다. 절단한 블록을 크실렌(xylene)으로 탈파라핀화 하고, H&E(hematoxylin and eosin) 염색을 수행하였다.

8. 웨스턴 블롯

SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)로 단백질을 분리하고, 분리된 단백질을 니트로셀루로오스 종이에 옮겨 Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate (CB1001, Merck Millipore, Billerica, MA)을 사용하여 면역 복합체를 검출하였다. 단백질 농도는 Multi Gauge, V3.0 (FUJIFILM, Tokyo, Japan)으로 정량화 하였다.

9. MTT assay

MTT assay를 통해 세포 생존력을 확인하였다. 1 mg/ml MTT (5 mg/mL의 농도로 PBS에 희석)를 96-well plate의 각 웰에 담지하고 2시간 동안 세포를 배양하였다. 상기 배양액을 파이펫으로 제거하고 남아 있는 세포를 100μM DMSO로 용해하였다. Tirstar microplate reader (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germany)를 사용하여 490nm에서 흡광도를 측정하였다.

10. 리포터 유전자 분석(Reporter gene assay)

Raw264.7 세포를 48-well plate에 도말하고, 70% 컨플루언시에서 Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 리포터 플라스미드(1μg pNF-κB-luciferase 및 0.3 μg pRL-SV40)로 형질감염(transfection)시켰다. 형질감염된 세포는 1 또는 3 μM 오라노핀을 처리하고 24시간 후에 용해시켰다. 루시퍼라아제 활성은 dual-luciferase reporter assay kit (E1960, Promega, Madison, MI)을 이용하여 측정하였고, NF-κB 프로모터의 활성은 이와 대응되는 renilla 활성으로 정상화하였다.

11. qPCR (quantitative real time polymerase chain reaction)

총 RNA는 Trizol® 시약 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)을 이용하여 분리하고, 올리고(dT) 프라이머와 역전사효소(reverse transcriptase)(iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 파골세포 분화 마커인 TRAP와 CSTK(cathepsin K)의 mRNA 발현량은 SYBR Select Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, Calif)와 Bio-Rad CFX Manager™ Software (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 이용한 실시간 qPCR에 의해 정량화하였다. 18s rRNA 단백질 mRNA는 mRNA 수준을 정상화하기 위한 기준 유전자로 사용되었다. 이용된 프라이머 정보는 하기 표 1에 나타내었다.

TRAP	sense primer (서열번호 1)	5’- GCAGTATCTTCAG GACGAGAAC-3′
TRAP	antisense primer (서열번호 2)	5′- TCCATAGTGAAACCGCAAGTAG-3′
CSTK	sense primer (서열번호 3)	5′-CGAAAAGAGCCTAGCGAACA-3′
CSTK	antisense primer (서열번호 4)	5′- TGGGTAGCAGCAGAAACTTG -3′
S18 ribosomal protein (S18r) 유전자	sense primer (서열번호 5)	5′- GTAACCCGTTGAACCCCATT -3′
S18 ribosomal protein (S18r) 유전자	antisense primer (서열번호 6)	5′-CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3′

12. ELISA

배양 배지에서 IL-1β의 농도를 측정하기 위하여 마우스 IL-1β(interleukin-1β) ELISA 키트(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 사용하였다.

13. 통계 분석

모든 실험은 최소 3회 반복하였으며, Student’s t-test를 사용하여 통계적 유의성을 결정하였다(p<0.05).

[실험결과]

실시예 1. 금제제에 의한 RANKL 유도의 파골세포 분화 억제 확인

BMM에 100 ng/mL RANKL 및 30 ng/mL M-CSF을 처리하여 7일 동안 배양한 결과 BMM 세포는 파골세포 유사의 거대 TRAP 양성 다핵 세포로 분화되었다(도 1a 참조). 그러나, 1 또는 3 μM의 오라노핀을 처리한 경우 분화된 BMM 세포가 감소하였으며, 특히 다핵세포의 수는 오라노핀의 농도 의존적으로 감소하였다(도 1b 참조).

CSTK 및 TRAP는 파골세포 특이적 마커 유전자이며, RANKL에 의해 그 발현이 유도된다. qPCT 결과에서도 나타나는 바와 같이, 오라노핀(1 및 3 μM)의 처리는 파골세포 마커 유전자의 발현을 완벽하게 억제함을 알 수 있었다(도 1c 및 1d 참조).

또한, NFATc1(nuclear factor of activated T-cells 1)은 파골세포 분화에 필수적인 인자로서, RANKL에 의해 활성화된다. RANKL에 노출된 BMM에서 NFATc1과 CSTK 단백질의 발현 수준을 측정한 결과, 오라노핀의 처리는 상기 양 단백질의 발현을 억제함을 확인하였다(도 1e 참조). 아울러, Raw264.7 세포에서 동일한 실험을 반복한 결과, 세포에 처리한 오라노핀의 농도 의존적으로 NFATc1의 발현이 억제됨을 확인하였다(도 1f 참조).

또한, MTT assay 결과 1 및 3 μM의 오라노핀은 BMM과 Raw264.7 세포에서 독성을 나타내지 않았는바, 오라노핀에 의한 파골세포 형성 감소가 오라노핀 자체의 세포 독성에 기인한 것이 아님을 알 수 있다(도 1g 참조).

실시예 2. 금제제에 의한 IKK / IκBα 활성화 억제 확인

NF-κB는 NFATc1의 발현을 조절하며, c-Fos를 포함한 AP-1 그룹은 NFATc1을 생산하고 이와 협력하여 전사 조절 캐스케이드(cascade)을 촉발시키고, C-Fos는 파골세포 분화에 중추적인 역할을 수행하는 것으로서 c-Fos가 결핍된 마우스는 파골세포 분화가 발생하지 아니하여 골석회화증이 나타남이 알려져 있다.

오라노핀에 의한 NF-κB 활성 억제가 파골세포 분화를 차단하는지 확인하기 위하여, pNF-κB-luciferase reporter를 이용하여 리포터 유전자 분석을 수행하였다. 그 결과, NF-κB 결합 영역을 포함하는 리포터 구조물로 형질감염된 Raw264.7 세포에서 오라노핀은 RANKL 유도의 NF-κB 리포터 활성을 억제함을 확인하였다(도 2a 참조). 또한, 3μM의 오라노핀을 처리한 Raw264.7 세포에서 RANKL에 의한 c-Fos 발현이 감소됨을 확인하였다(도 2b 참조).

이어서, 오라노핀의 낮은 농도범위에서도 파골세포 전구체의 NF-κB 발현과 그 활성을 효과적으로 저해함을 확인하였는바, 오라노핀의 RANKL 유도의 NF-κB 활성 억제 기작을 알아보고자 p65 단백질 발현 수준과 세포내 위치를 확인하였다. p65는 RANKL에 의한 NF-κB 활성화에 중요한 전사 인자로서, 100ng/mL의 RANKL을 처리한 결과 5 내지 15분 사이에 p65 단백질의 발현 증가하였으나, 3μM의 오라노핀 처리에 따라 RANKL의 p65 발현 촉진이 차단됨을 확인하였다(도 2c 참조). 또한, RANKL는 Raw264.7 세포에 p65의 핵으로의 이동을 유도하는 것으로 보이나, 3μM 오라노핀의 처리에 따라 그 이동이 차단됨을 확인할 수 있었다(도 2d 참조).

이어서, RANKL을 처리한 Raw264.7 세포에서 오라노핀이 NF-κB 신호 전달 경로의 상단에서 기능하는지 확인하고자 하였다. TRAF(TNF receptor-associated factors)는 RANK에 의해 IKK 의존성 IκBα 인산화를 포함한 다양한 인산화 캐스케이드(cascade)를 활성화시킨다. 또한, TAK1(TGF-β-activated kinase 1)에 의한 IKK의 인산화는 염증성 사이토카인과 RANKL에 의한 NF-κB 신호 전달 경로를 활성화 시키는데 중추적인 역할을 수행한다. 또한, IκBα 서브유닛의 인산화 및 분해와 함께 TAK1 의존적 IKK 복합체가 활성화된다. 웨스턴 블롯팅 결과, Raw264.7 세포에 오라노핀을 처리한 경우, RANKL만 처리한 경우 보다 IKKβ 인산화가 감소되었으며(도 2e 참조), 오라노핀은 RANKL에 의한 IκBα 서브유닛의 인산화 및 분해를 효과적으로 억제하는 것을 확인할 수 있었다(도 2f 참조). 상기로부터, 오라노핀에 의한 NFATc1의 하향조절은 TAK1/IKK/IκBα 의존적 NF-κB 활성화를 억제에 의한 것임을 알 수 있다.

실시예 3. 금제제에 의한 IL- 1β 분비 억제 확인

IL-1β는 염증성 사이토카인으로서, 골수 스트로마 세포에서 RANKL 발현을 촉진시키고 파골세포 형성을 직접적으로 유도하는 것으로 알려져 있다. IL-1β는 염증성 자극에 의해 조혈 세포(hematopoietic cell)에서 31kDa 전구체(pro-IL-1)로 발현되며, 수용체와 결합하기 위해서는 17kDa의 형태로 전환되어야 한다. BMDM에서 IL-1β의 분비는 2 단계 신호 전달 경로에 의해 조절되며, 첫 번째 신호는 NF-κB 의존적 NLRP3 및 pro-IL-1의 합성을 유도하는 TLR(Toll-like receptor)의 활성화 이후의 다양한 PAMP에 의해 촉발되며, 두번째 신호는 염증조절복합체(inflammasome)에 의해 활성화 되는 caspase-1-catalyzed IL-1β 프로세스이다.

이에, 염증조절복합체 의존성 IL-1β 분비가 BMM의 파골세포로의 분화에 관여하는지 확인하기 위하여, pan-caspase 억제제인 nivocasan (GS-9450)를 처리하여 파골세포 분화에 미치는 영향을 확인하였다. Nivocasan은 caspase-1를 비가역적으로 억제하고, IL-1β 분비에 중요한 역할을 하는 caspase-8 활성을 억제한다. BMM에 Nivocasan 처리와 함께 LPS와 ATP를 노출시켜 NLRP3 염증조절복합체 의존성 IL-1β 분비를 유도한 결과, Nivocasan(10mM)가 pro-IL1β의 절단을 방해하고, BMDM의 TRAP 양성 및 다핵 세포로의 분화를 차단함을 알 수 있었다(도 3a 및 3b 참조). 아울러, Nivocasan은 NFATc1과 CSTK의 단백질 발현도 억제함을 확인할 수 있었는바(도 3c 참조), 상기로부터 염증조절복합체 시그널링이 BMDM의 파골세포로의 분화에 적극적으로 관여함을 알 수 있다.

다음으로, 오라노핀이 염증조절복합체 매개의 IL1β 분비를 억제함으로써 BMM의 분화를 차단할 수 있는 것인지 확인하기 위해, Nivocasan 대신 오라노핀을 처리하여 상기 실험을 반복하였다. 그 결과, BMM과 J774.A1 세포 (ASC-positive mouse monocyte/macrophage cell line)에서 오라노핀의 처리는 염증조절복합체 매개의 IL-1β 분비를 억제함을 확인할 수 있었다(도 3d 및 3e 참조). 한편, 낮은 농도(0.3 및 1 μM)에서 오라노핀의 IL1β 분비 억제 효과로부터, 오라노핀의 IL-1β 분비 억제 활성은 염증조절복합체 활성 억제에 부분적으로 의존함을 알 수 있다.

실시예 4. 난소적출모델에서 금제제의 골 손실 방지 효과 확인

난소적출 마우스(OVX)에서 오라노핀의 골 손실 방지 효과를 확인하기 위하여, OVX 마우스에 10mg/kg의오라노핀을 43일 동안 경구투여 하였고, 매일 마우스의 체중을 측정하였다. OVX 대조군은 동량의 vehicle을 투여하였다. SHAM 대조군, OVX 대조군, 및 오라노핀 투여군의 체중은 초기에 거의 동일하였으나, 이후 오라노핀 투여군의 체중이 조금 감소하는 양상을 보였다(도 4a 참조). 상기로부터 오라노핀이 위장관에 작용하여 부작용으로 설사를 동반하는 것을 알 수 있었다.

이어서, H&E 염색 결과, 오라노핀 투여는 OVX 마우스에서 골 소실을 억제함을 알 수 있었다(도 4b 참조). 43일 동안의 오라노핀 투여는 좌우 대퇴골의 중량 감소를 방지하였으며, SHAM 대조군보다 더 높은 골 중량을 가짐을 확인할 수 있었다(도 4c 참조). 다음으로, 혈청 생화학 분석 결과, OVX 대조군의 혈청에서 BALP 농도가 높았으나, 오라노핀의 투여가 난소 적출에 의해 증가된 BALP 농도를 감소시키는 것을 확인하였다(도 4d 참조).

상기 결과는, 생체내에서 오라노핀의 파골세포 분화 억제를 통한 골 손실 억제 효과를 시사하는 것으로서, 미아크로 CT 이미지를 통해 보다 명확하게 알 수 있었다. OVX 대조군에서 보정된 골 미네랄 밀도(BMD)의 유의한 감소는 확인되지 않았으나, 마이크로 CT의 단면 이미지로부터 오라노핀 투여에 따라 골 밀도가 개선됨을 확인할 수 있었다(도 5a 참조). 또한, 오라노핀은 난소적출에 따른 골 밀도, 골 중량, 해면질골(bone trabecular)의 두께 및 수의 변화를 억제하여, 난소적출 마우스에서 2-3 차원의 구조적 골 손실을 방지함을 알 수 있었다(도 5b 내지 5g 참조). 또한, 오라노핀 투여군에서 섬유주(trabecular) 패턴 인자와 구조 모델 지수에서 특별한 변화를 확인할 수 없었으나, 매우 낮은 섬유주 분리 수로부터 오라노핀이 생체 내에서 골 손실을 효과적으로 방지함을 알 수 있다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가지는 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> Composition for inhibiting osteoclast differentiation comprising gold compound as an active ingredient <130> MP18-175 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRAP_sense primer <400> 1 gcagtatctt caggacgaga ac 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRAP_antisense primer <400> 2 tccatagtga aaccgcaagt ag 22 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CSTK_sense primer <400> 3 cgaaaagagc ctagcgaaca 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CSTK_antisense primer <400> 4 tgggtagcag cagaaacttg 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S18r gene_sense primer <400> 5 gtaacccgtt gaaccccatt 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S18r gene_antisense primer <400> 6 ccatccaatc ggtagtagcg 20

Claims

금(gold)제제를 유효성분으로 포함하는, 파골세포 분화 억제용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 금제제는 오라노핀(auranofin), 금티오말산 소듐(sodium aurothiomalate), 금티오글루코오스(aurothioglucose), 금티오황산 소듐(sodium aurothiosulfate), 및 금티오말산 이소듐(disodium aurothiomalate)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 파골세포 분화 억제용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 골수유래 대식세포의 파골세포로의 분화를 억제하는 것을 특징으로 하는, 파골세포 분화 억제용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 NFATc1(nuclear factor of activated T-cells 1)의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는, 파골세포 분화 억제용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 IKK(IκB kinase) 및 IκBα(inhibitor of kappa B)의 인산화를 억제하는 것을 특징으로 하는, 파골세포 분화 억제용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 IL-1β(interleukin-1β)분비를 차단하는 것을 특징으로 하는, 파골세포 분화 억제용 조성물.
금(gold)제제를 유효성분으로 포함하는, 대사성 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
상기 대사성 골 질환은 폐경 또는 파골세포 분화에 의해 야기되는 질환인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제7항에 있어서,
상기 금제제는 오라노핀(auranofin), 금티오말산 소듐(sodium aurothiomalate), 금티오글루코오스(aurothioglucose), 금티오황산 소듐(sodium aurothiosulfate), 및 금티오말산 이소듐(disodium aurothiomalate)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 대사성 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제7항에 있어서,
상기 대사성 골 질환은 골다공증, 치주염, 및 뼈 전이암으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질병인 것을 특징으로 하는, 대사성 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제9항에 있어서,
상기 뼈 전이암은 유방암 또는 전립선암으로부터 전이되는 암인 것을 특징으로 하는, 대사성 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
금(gold)제제를 유효성분으로 포함하는, 골 손실 억제용 식품 조성물.
제11항에 있어서,
상기 금제제는 오라노핀(auranofin), 금티오말산 소듐(sodium aurothiomalate), 금티오글루코오스(aurothioglucose), 금티오황산 소듐(sodium aurothiosulfate), 및 금티오말산 이소듐(disodium aurothiomalate)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 골 손실 억제용 식품 조성물.
제11항에 있어서,
상기 골 손실은 폐경 또는 파골세포 과분화에 의해 유도되는 것을 특징으로 하는, 골 손실 억제용 식품 조성물.