KR20170076956A - 합토글로빈을 유효성분으로 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 합토글로빈을 유효성분으로 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 본 발명은 IFNβ의 발현을 증가시킴으로써 파골세포의 분화를 억제하여 골 흡수능을 저해할 뿐만 아니라 암세포의 골 전이로 인한 파골세포의 과도한 분화 및 활성으로 야기된 골 소실을 억제하여 골 감소를 방지하는 효과가 있는 합토글로빈을 유효성분으로 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 조성물, 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 골 질환의 치료방법 및 골 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 합토글로빈은 IFNβ의 발현을 증가시켜 파골세포의 분화를 억제하여 골 흡수능을 저해하고, 조골세포 및 파골세포에 대하여 세포독성을 나타내지 않아 안전하며, 암세포의 골 전이로 인한 파골세포의 과도한 분화 및 활성으로 야기된 골 소실을 현저하게 억제하여 골 감소를 방지하는 효과가 있으므로, 암세포의 골 전이에 의한 골 소실 질환 뿐 아니라, 다양한 골대사성 질환의 치료제로 사용될 수 있다.

Description

합토글로빈을 유효성분으로 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 조성물 {A composition for prevention or treatment of bone disease comprising haptoglobin}

본 발명은 합토글로빈을 유효성분으로 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 본 발명은 IFNβ의 발현을 증가시킴으로써 파골세포의 분화를 억제하여 골 흡수능을 저해할 뿐만 아니라 암세포의 골 전이로 인한 파골세포의 과도한 분화 및 활성으로 야기된 골 소실을 억제하여 골 감소를 방지하는 효과가 있는 합토글로빈을 유효성분으로 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 조성물, 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 골 질환의 치료방법 및 골 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.

골(뼈)은 신체를 지지하는 단단한 조직으로 내부 골격을 구성하고 장기를 보호하는 기능을 하는 곳으로, (뼈)은 신체를 지지하는 단단한 조직으로 내부 골격을 구성하고 장기를 보호하는 기능을 하는 곳으로 생리학적으로는 생체 내에서 혈중 칼슘농도가 일정하도록 항상성을 유지하는 중요한 조직이다. 이러한 항상성을 유지하기 위해서 골은 조골세포에 의한 골 형성과 파골세포에 의한 골 흡수가 순차적으로 유지되어야 하는데, 이러한 균형이 깨지면 골격계 질환이 유발된다. 골격계 질환중의 하나인 골다공증은 그 원인들 중에 파골세포의 과도한 활성이 골량의 감소와 골강도의 약화로 골절의 위험성을 증가시키는 요인으로 잘 보고되어 있다. 대한골대사학회(골다공증의 진단 및 치료 지침, 2013년)에 보고된 바에 따르면, 골다공증 대퇴골절후 약 50%의 환자는 골절전의 기동 능력과 독립성을 회복할 수 없고, 25%의 환자는 오랜 기간 보호가 필요하며, 1년내 사망률도 평균 20%에 이른다고 밝혔다. 때문에 골다공증의 치료법으로 대한골대사학회에서는 다양한 치료방법을 제시하고 있다. 먼저 여성호르몬요법의 경우, 폐경 후 에스트로겐 결핍으로 인해 유발되는 골다공증을 막기 위한 치료법으로 에스트로겐을 패치, 겔, 경구투여 방법으로 주입하여 골밀도가 유의하게 증가함을 보고하였으나 부종, 유방통, 담석증, 하지 경련 등을 유발하는 이상 반응도 보고하고 있다. 다음으로 전 세계적으로 가장 많이 처방되는 약제인 비스포스포네이트는 경구용과 정맥주사를 통한 주입방법이 있다. 비스포스포네이트는 인체에 존재하지 않는 합성 물질로 뼈로 이동하고 파골세포내로 들어가 분화 및 작용을 억제한다. 그러나 경구용 비스포스포네이트는 식도염, 위궤양이 생길수 있으며 장기간 사용시 턱뼈괴사를 일으킬수 있고, 정맥주사의 경우에도 두통, 근육통, 신기능 장애를 유발한다고 알려져 있다. 또 다른 치료제로 부갑상선 호르몬(PTH)이 있다. PTH는 84개의 아미노산으로 이루어져 있으나 치료제로는 아미노 말단의 34개의 아미노산으로 구성된 PTH1-34를 미국과 유럽, 국내에서 승인되어 사용되고 있다. PTH는 적은 용량으로 간헐적 투여시 골형성이 촉진되는 반면, 고농도로 유지할 경우 골흡수가 증가되므로 주의를 요하고 있다. 또한, 이상 반응으로 오심, 두통, 다리경련이 경미하게 생길수 있으며, 일시적으로 고칼슘혈증이 있을수 있다고 보고하였다. 이처럼 대한골대사학회에서 보고된 치료방법들은 골다공증 치료제로 사용되고 있으나, 이상반응도 동반될수 있기에 현재까지도 새로운 치료방법이 요구되고 있다.

골다공증은 직접적인 파골세포의 활성으로 인한 골감소 유발 외에도 암세포의 골전이로도 유발된다. 유방암, 전립선암, 대장암 등의 다양한 암세포들은 골(뼈)로도 전이되며, 폐, 간에 이어 골(뼈)은 세 번째로 흔한 전이 장소라고 알려져 있다. 이러한 암들의 골(뼈) 전이는 단순한 전이 뿐 아니라, 골수에서 골의 생성에 관여하는 조골세포와 골의 흡수에 관여하는 파골세포에 영향을 미쳐 궁극적으로는 과도한 골 흡수를 야기시키고, 이것이 다시 암세포에 영향을 주어 암세포의 증식을 촉진시키는 일련의 악순환 과정을 유도하게 된다(Yoneda T, Tanaka S, Hata K. Role of RANKL/RANK in primary and secondary breast cancer. World J Orthop 2013 18;4(4):178-85. doi: 10.5312/wjo.v4.i4.178).

IFNβ(인터페론β)는 내생(Endogenous)의 사이토카인으로, TypeⅠ 클래스에 해당하는 인터페론이다. IFNβ는 항염증 및 항바이러스 기능을 가진다고 알려져 있지만, 최근 파골세포 분화에 중추적인 c-fos 단백질의 발현을 억제함으로써, 파골세포의 전구세포인 대식세포로부터 파골세포로의 분화를 억제한다고도 보고된 바 있으며, 항염증 기능을 통하여 간접적으로 파골세포의 분화를 억제하고, stat1 단백질 신호전달을 통하여 조골세포 분화에도 영향을 주는 등, 골 대사 조절에도 관여한다고 보고된바 있다(Takayanagi H, Sato K, Takaoka A, Taniguchi T. Interplay between interferon and other cytokine systems in bone metabolism. Immunol Rev, 2005, 208:181-93). 때문에 파골세포의 전구세포인 대식세포에서 IFNβ를 증가시킬수 있는 치료제가 있다면 파골세포로의 분화를 억제하고 항염, 항바이러스 기능을 증가시킬 수 있을 것으로 전망된다.

한편, 합토글로빈(Haptoglobin)은 급성기단백질 (Acute phase protein) 중의 하나로 주로 간에서 만들어져 혈액을 통해 이동하는 것으로 잘 보고되어 있으며, 생체 내 감염, 조직 손상, 수술, 면역 장애 등으로 인해 증가된다고 보고되어 있다 (Alper CA, Peters JH, Birtch AG, Gardner FH. Haptoglobin Synthesis. I. In Vivo Studies of the Production of Haptoglobin, Fibrinogen, and Gamma-Globulin by the Canine Liver. J Clin Invest. 1965;44:574-81, Dobryszycka W. Biological functions of haptoglobin--new pieces to an old puzzle. Eur J Clin Chem Clin Biochem. 1997;35:647-54). 상기에 보고된 논문들에서 말하는 합토글로빈의 생체 내 주요기능은 감염, 조직손상, 염증 등으로 인한 적혈구의 파괴는 용혈현상으로 인한 자유 헤모글로빈(Free hemoglobin)이 배출되고, 자유 헤모글로빈은 주위 조직에 염증을 및 괴사를 일으키게 된다. 이를 막기 위해 합토글로빈이 혈액 내에서 증가되어 헤모글로빈과 결합하여 CD163 수용체를 가지는 대식세포를 통해 자유 헤모글로빈을 분해하고 철분을 다시 간으로 보내 저장하는 역할을 함으로써, 자유 헤모글로빈으로 인한 산화 스트레스를 감소시킨다. 또한, 합토글로빈은 박테리아의 생장을 억제하고, 카텝신 B(cathepsin B) 단백질을 억제하여 염증성 조직의 손상을 예방하며, 항 염증 기능을 가지는 것으로도 알려져 있다. 이러한 합토글로빈은 유방암 환자를 포함한 각종 암 환자의 혈장에서 발현양이 증가된다는 것이 확인되어, 암 환자를 진단하는 생체표지자(biomarker)로의 이용 가능성도 제시되고 있다(Francisco Veas. Acute Phase Proteins - Regulation and Functions of Acute Phase Proteins. Intech, 2011, 10.5772/756. Chapter 10). 그러나 생체 내의 단백질인 합토글로빈이 골 질환, 특히, 골 소실 질환 또는 골 대사성 질환에 대한 예방 또는 치료를 위해 사용될 수 있다는 점에 대해서는 아직까지 밝혀진 바 없다.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 합토글로빈이 파골세포의 IFNβ 발현을 증가시킴으로써 파골세포의 분화를 억제하여 골 흡수능을 저해하고, 조골세포 및 파골세포에 대하여 세포독성을 전혀 나타내지 않아 안전하며, 암세포 전이로 인한 골 소실을 현저하게 감소시킬 뿐 아니라 골다공증에도 효과가 있어, 합토글로빈을 포함한 그 조성물이 암세포의 골 전이에 의한 골 소실 뿐 아니라, 다양한 골대사성 질환의 치료제로 사용될 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 합토글로빈(Haptoglobin)을 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 골 질환을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 합토글로빈(Haptoglobin)을 포함하는 골 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 실시양태는 합토글로빈(Haptoglobin)을 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어, "합토글로빈(Haptoglobin)"은 주로 간에서 합성되어 분비된다고 알려진 단백질로, 혈청α₂ 글로불린의 한 분획이며, 혈장단백질 중의 α₂-글로빈 분화 중에 헤모글로빈과 결합(Hp-Hb복합체)해서 존재한다. 상기 합토글로빈 단백질은 2개의 소단위인 α 체인과 β 체인이 결합하여 하나의 합토글로빈 서브유닛(subunit)을 구성하며, α₁β 및 α₂β의 2 종류로 이루어져 이러한 2 종류의 서브유닛이 단위체(monomer) 또는 다합체(multimer)를 구성하여 합토글로빈 단백질을 형성한다. 사람의 합토글로빈 유전자는 16번 염색체에 존재하며, 상기 염색체는 쌍으로 이루어져 있어 합토글로빈 단백질의 표현형(phenotype)은 합토글로빈 서브유닛 종류에 따라 α₁β 서브유닛만 가지고 있는 Hp 1-1, α₁β 서브유닛 및 α₂β 서브유닛 둘다를 가지고 있는 Hp 2-1, 및 α₂β 서브유닛만 가지고 있는 Hp 2-2의 3가지 형으로 나누어진다. 합토글로빈 단백질은 유리 헤모글로빈과 결합하여 헤모글로빈의 요배출을 저지하며, 헤모글로빈 내의 글로빈 부분과는 결합할 수 있으나, 헴과는 결합하지 않는다. 또한, 합토글로빈은 여러 가지 급성 염증성 질병에서 발현이 증가되고, 혈장에서 자유 헤모글로빈(Free hemoglobin)과 결합하여 CD163 수용체를 통해 자유 헤모글로빈을 제거하는 역할을 함으로써, 자유 헤모글로빈으로 인한 산화 스트레스를 감소시키며, 박테리아의 생장을 억제하고, 카텝신 B(cathepsin B) 단백질을 억제하여 염증성 조직의 손상을 예방함으로써, 항염증 기능을 가진다고 알려져 있다.

본 발명의 합토글로빈은 상기 세 가지 표현형의 합토글로빈 단백질을 모두 포함할 수 있다.

상기 합토글로빈 단백질은 서열번호 1로 표시되는 α₁β 서브유닛의 아미노산 서열 및 서열번호 2로 표시되는 α₂β 서브유닛으로 이루어지는 서브유닛 중 중복하여 2 개의 서브유닛을 포함하는 합토글로빈 단백질을 포함할 수 있으며, 이와 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 단백질도 포함할 수 있다. 상기 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 단백질에는 서열번호 1의 α₁β 서브유닛 및 서열번호 2로 표시되는 α₂β 서브유닛으로 이루어지는 서브유닛 중 중복하여 2 개의 서브유닛을 포함하는 합토글로빈 단백질과 그 기능적 동등물(functional equivalent) 및 기능적 유도체(functional derivative)를 포함할 수 있다.

상기 "기능적 동등물"에는 서열번호 1의 α₁β 서브유닛 또는 서열번호 2의 α₂β 서브유닛의 아미노산 서열 중 일부 또는 전부가 치환되거나, 아미노산의 일부가 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체로, 상기 합토글로빈 단백질과 실질적으로 동등한 생리활성을 갖는 것을 말한다.

상기 "기능적 유도체"는 상기 합토글로빈 단백질의 물리 화학적 성질을 증가 또는 감소시키기 위한 변형을 가한 단백질로서, 상기 합토글로빈 단백질과 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 것을 의미한다.

종래 생체 내 단백질인 합토글로빈이 항염증의 기능을 가지는 점에 대해서는 널리 알려져 있으나, 파골세포의 분화를 억제시켜 파골세포의 골 저해능을 억제함으로써, 골 질환을 예방 또는 치료하는 용도에 대해서는 전혀 알려진 바 없다.

본 발명의 일 실시예에서는, 본 발명의 합토글로빈이 파골세포의 분화를 억제시킴으로써 골 질환, 특히, 골 소실 질환 또는 골 대사성 질환에 대한 예방 또는 치료 용도가 있음을 확인하였다(도 1 내지 6).

본 발명에서 용어, "골 질환"은 골과 관련된 질환을 의미하는 것으로서, 구체적으로, 골 전이에 의한 골 소실 질환 또는 골 대사성 질환일 수 있다. 보다 구체적으로는, 상기 골 전이에 의한 골 소실 질환은 암세포의 골 전이에 의한 전이성 암질환일 수 있다.

상기 "암세포의 골 전이에 의한 전이성 암질환"은 암세포의 골 전이가 골수에서 조골세포와 파골세포에 영향을 미쳐 궁극적으로 과도한 골 흡수를 야기시켜 골 소실을 일으키고, 이것이 다시 암세포에 영향을 주어 암세포의 증식을 촉진시키는 일련의 악순환 과정을 유도하는 질환을 의미한다. 본 발명에서 상기 암질환은 전이성 유방암, 전이성 전립선암, 전이성 대장암, 전이성 폐암, 전이성 간암, 전이성 신장암, 전이성 방광암, 전이성 흑색종, 전이성 다발성 골수종, 또는 전이성 갑상선암일 수 있으나, 이에 한정된 것은 아니다.

상기 "골 대사성 질환"은 구체적으로, 골다공증, 치주질환, 골절 또는 파제트병(Paget's disease)일 수 있으나, 이에 한정된 것은 아니다.

상기 "골다공증(osteoporosis)"은 골 조직의 석회가 감소되어 뼈의 치밀질이 엷어지고 그로 인해 골수강(骨髓腔)이 넓어지는 상태로, 증세가 진전됨에 따라 뼈가 약해지기 때문에 작은 충격에도 골절되기 쉬운 상태를 의미한다.

상기 "치주질환"은 세균에 의해 야기되는 치아지지 조직의 염증상태를 말하며, 치은염 및 치주염으로 분리할 수 있다. 발병원인은 불량한 구강 생상태로 인한 구강 세균이 치면 세균막을 형성하는데 있으며, 치면 세균막이란 침에 있는 끈끈한 물질을 접착제로 이용하여 세균이 치아 표면에 달라붙은 후 증식한 세균덩어리를 말한다. 치면 세균막은 그냥 방치해 두면, 염증이 생겨 가끔 잇몸에서 피가 나고, 구취가 나는 경우가 있으며 이러한 증상을 치은염이라고 한다. 치은염이 더 진행되면, 치아와 잇몸사이의 벌어진 틈이 더 깊어져서 치주낭이 생기고, 여기에 치주질환을 일으키는 세균들이 번식하여 치주염이 발생 된다. 치주염이 진행되면 칫솔질과 같은 약한 자극에도 잇몸에서 피가 나기도 하며 붓고, 종종 급성염증으로 변화되어 통증을 유발한다. 이러한 염증은 골을 만드는 기능은 저하시키고, 골을 흡수하는 작용이 높아져서 치조골이 점점 낮아지게 되어 치조골이 파괴되고 결국 치아를 상실하게 된다.

상기 "골절"은 뼈나 골단판 또는 관절면의 연속성이 비정상적으로 끊어진 상태로, 뼈의 깨짐을 일컫는다. 골절을 유발하는 원인으로는 교통사고 등의 외상, 산업장애에서 일어나는 안전사고, 골다공증, 골암, 대사이상증 등의 질병으로 인한 뼈의 변화 및 스포츠나 하중으로 인한 반복적인 뼈에 대한 스트레스 등이 있다. 또한, 골절 상태는 골절선(골 절단에 의해 발생된 뼈끝단을 따른 선)에 근거하여, 균열 골절, 그린스틱(greenstick) 골절, 횡상 골절, 사상 골절, 나선상 골절, 분절 골절, 분쇄골절, 견열 골절, 압박 골절, 함몰 골절 등으로 분류된다.

본 발명에서 용어, "파제트 병"은 골 재형성이 과도하게 항진되어 광범위한 부위의 골격계가 침범되는 국소성 골 질환을 의미한다. 파제트병의 병리학적인 기전은 뼈를 청소하는 기능을 가진 파골 세포(osteoclast)에 의한 골 흡수의 과다한 증가와 이에 따른 보상작용으로 뼈를 만드는 기능을 가진 조골 세포(osteoblast)에 의한 새로운 골 형성의 증가가 결합된 것으로 알려져 있으며, 또한, 골 파제트병에서 새롭게 형성된 뼈는 구조적으로 무질서하고 뼈 변형과 골절에 매우 취약한 상태로 알려져 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 암세포의 골 전이로 인한 골 소실에 본 발명의 합토글로빈이 미치는 영향을 확인하기 위해, 생후 7주령 수컷 생쥐의 경골에 전이성 유방암 세포주 4T1을 4X10⁴만큼 5μl의 인산완충식염수(PBS)에 풀어 해밀턴 주사기로 직접 주사하고 합토글로빈을 2일 간격으로 주사한 후, 경골을 적출하여 마이크로 전산단층촬영(micro-CT)으로 분석하였다.

그 결과, 도 5의 (a)에서 확인할 수 있는 바와 같이, 유방암 세포주 4T1을 주사하지 않은 음성대조군에 비해, 4T1을 경골 주사한 생쥐의 경골 소주골(Trabecular bone)이 확연히 감소되었음을 알 수 있었으며, 4T1을 경골 주사한 생쥐들 중, 합토글로빈을 복강주사하지 않은 양성 대조군에 비해, 합토글로빈을 복강 주사한 실험군에서, 경골의 소주골 감소가 억제됨을 확인할 수 있었다. 또한, 도 5의 (b) 및 (c)에서도 도 5의 (a)와 같은 경향을 보임을 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과는 본 발명의 합토글로빈이 골전이로 인한 골 소실을 크게 억제하여 골 질환, 특히, 골 소실 질환에 대하여 예방 또는 치료효과가 있음을 뒷받침하는 것이다(도 5의 (a) 내지 (c)).

또한, 본 발명의 다른 실시예에서는, 본 발명의 합토글로빈이 골다공증에 미치는 영향을 알아보기 위해, 7주령 된 야생형 수컷생쥐와 합토글로빈 결손 수컷생쥐에 RANKL 1ug을 인산완충식염수(PBS) 150μl에 녹여 복강주사 한 후, 생쥐를 희생하여 대퇴골을 적출하고, 마이크로 전산단층촬영(micro-CT)으로 분석하였다. 그 결과 도 6의 (a)에서 확인할 수 있는 바와 같이, RANKL이 복강주사 되지 않은 야생형 생쥐에 비해, RANKL이 복강주사 된 야생형 생쥐의 대퇴골 소주골이 크게 감소되었으며, 실험군으로 사용된 RANKL이 복강주사 되지 않은 합토글로빈 결손 생쥐의 대퇴골 소주골이, RANKL이 복강주사 되지 않은 야생형 생쥐의 대퇴골 소주골과 비교하여, 골량이 감소되었음을 확인할 수 있었다. 또한, RANKL이 복강주사 된 생쥐들을 야생형 생쥐와 비교하여 본 결과, 합토글로빈 결손 생쥐의 대퇴골 소주골의 골량이 크게 감소되었음을 확인할 수 있었다. 아울러, 도 6의 (b) 및 (c)에서도 상기 도 6의 (a)와 비슷한 경향을 나타내었다. 이를 통해서도, 본 발명의 합토글로빈은 골 소실 질환 뿐 아니라, 골 대사성 질환, 특히, 골다공증의 예방 또는 치료에도 이용될 수 있음을 뒷받침하는 것이다(도 6의 (a) 내지 (c)).

따라서 본 발명의 조성물은 골 질환, 특히, 골 전이에 의한 골 소실 질환 또는 골 대사성 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있으며, 특히, 조골세포 및 파골세포의 불균형으로 인해 유발되는 골 관련 질환에 제한 없이 사용될 수 있다.

본 발명에서 용어, "예방"은 상기 합토글로빈을 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용하여 골 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다.

본 발명에서 용어, "치료"는 상기 합토글로빈을 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용하여 골 질환의 증상 등을 다스리거나 낫게 하는 모든 행위를 말한다.

본 발명의 합토글로빈은 파골세포의 분화를 억제시킬 수 있다.

본 발명에서 용어, "파골세포(osteoclast)"는 대식세포 전구체(macrophage precursor)로부터 파생되는 세포로서, 파골세포 전구 세포들은 대식세포 콜로니 자극인자(macrophage colony stimulating factor, M-CSF), NF-B의 수용체 활성 인자 리간드(RANKL) 등에 의해 파골세포로 분화되며 융합을 통해 다핵파골세포(multinucleated osteoclast)를 형성한다. 파골세포는 v3 인테그린(integrin) 등을 통해 골(bone)에 결합하며 산성 환경을 조성하는 한편 각종 콜라게네이즈(collagenase) 및 프로테아제(protease)를 분비하여 골 흡수(bone resorption)를 일으킨다. 파골세포는 완전히 분화된 세포로 증식하지 않으며 약 2주간의 수명이 다하면 세포 사멸(apoptosis)를 일으킨다.

본 발명의 일 실시예에서는, 합토글로빈이 파골세포 분화 억제에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 획득한 대식세포와 인간 말초혈액단핵세포의 파골세포 분화 배양액에 합토글로빈을 각 농도별로 처리(0, 1, 5, 10, 또는 20μg/ml)한 다음, 5일간 배양하여 파골세포로의 분화를 유도하였다. 이후, 분화된 파골세포를 포르말린으로 고정한 다음 TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase) 염색하여 광학현미경(X100) 아래에서 TRAP 양성인 다핵의 파골세포를 분석하였다. 그 결과, 도 1 및 도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 합토글로빈을 처리하지 않은 양성 대조군에 비해, 합토글로빈을 처리한 실험군에서는 합토글로빈 10μg/ml 이상의 농도에서 TRAP 양성인 다핵의 파골세포수가 크게 감소하였다. 이와 같은 결과는 본 발명의 합토글로빈이 대식세포 및 인간 말초혈액단핵세포의 파골세포로의 분화를 강하게 억제하는 것을 나타내는 것이다(도 1 및 도 2).

본 발명의 합토글로빈을 포함하는 조성물은 IFNβ의 발현을 증가시킨다. 보다 구체적으로, 상기 합토글로빈을 포함하는 조성물은 IFNβ의 발현을 증가시켜 파골세포의 분화를 억제함으로써, 파골세포의 골 저해능을 억제한다.

본 발명에서 용어, "IFNβ"는 내생(Endogenous)의 사이토카인으로, TypeⅠ 클래스에 해당하는 인터페론이다. IFNβ는 항염증 및 항바이러스 기능을 가진다고 알려져 있지만, 파골세포 분화에 중추적인 c-fos 단백질의 발현을 억제함으로써, 파골세포의 분화를 억제한다고도 보고된 바 있으며, 항염증 기능을 통하여 간접적으로 파골세포의 분화를 억제하고, stat1 단백질 신호전달을 통하여 조골세포 분화에도 영향을 주는 등, 골 대사 조절에 관여한다고 보고된 바 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 합토글로빈이 IFNβ의 발현에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 생쥐 대식세포의 파골세포 분화 배양액에 합토글로빈을 첨가 또는 첨가하지 않고 배양한 후, 세포의 IFNβ 전령 RNA 발현양과 파골세포가 배양액으로 분비한 IFNβ 단백질 양을 확인하였다. 그 결과, 도 4의 (a)에서 확인할 수 있는 바와 같이, RANKL에 의해 파골세포의 IFNβ 전령 RNA 양과 배양액으로 분비한 IFNβ 단백질의 양이 증가하는 조건에서, 합토글로빈에 의해서 IFNβ 전령 RNA 양과 IFNβ 단백질 양이 더욱 증가함을 확인할 수 있었으며, RANKL과 합토글로빈을 같이 처리한 세포에서는, IFNβ 전령 RNA 양과 IFNβ 단백질의 양이 더욱 더 크게 증가함을 확인할 수 있었다. 이를 통해, 본 발명의 합토글로빈은 파골세포의 IFNβ 발현양을 단독으로 대량 증가시키고, RANKL과 상조하여 IFNβ의 발현양을 더욱 크게 증가시킨다는 것을 확인할 수 있었다(도 4의 (a)).

또한, 본 발명의 다른 실시예에서는, 상기 파골세포 분화 억제 매커니즘이 합토글로빈으로 인해 증가되는 IFNβ에 의한 것인지를 확인하기 위하여, 생쥐 대식세포의 파골세포 분화 배양액에 합토글로빈 및 항-IFNβ 항체를 처리하여 5일간 배양한 뒤 파골세포를 획득하여 염색한 후, 광확현미경(X100)으로 분석하였다.

그 결과, 도 4의 (b) 내지 (d)에서 확인할 수 있는 바와 같이, 합토글로빈에 의해 억제된 파골세포 분화가 항-IFNβ 항체가 같이 처리됨으로써 구조(Resque)됨을 확인할 수 있었으며, 이로부터 본 발명의 합토글로빈은 파골세포의 IFNβ 발현양을 증가 킴으로써, 파골세포의 분화를 억제한다는 것을 확인할 수 있었다(도 4의 (b) 내지 (d)).

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"는 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는, 멸균, 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 하나 이상의 성분을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정군제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.

본 발명에서, 상기 담체는 비자연적 담체 (non-naturally occuring carrier)를 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 하나의 실시양태는 상기 합토글로빈을 유효성분으로 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 골 질환의 치료방법을 제공한다.

본 발명에서 용어, "합토글로빈", "골 질환", "예방" 및 "치료"는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명에서 용어, "개체"란 골 관련 질환이 발병되었거나 또는 발병될 수 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미하고, 본 발명의 약학적 조성물을 개체에게 투여함으로써 골 질환의 발병을 효과적으로 예방 또는 개선할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나, 기존의 골 질환의 예방 또는 개선용 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.

본 발명의 용어 "투여"란 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 상기 조성물의 투여경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡술제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 조성물 이외에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로스, 또는 락토오즈, 젤라틴 등을 섞어 조제한다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 우제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드, 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 하는 것이 바람직하다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 우제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수도 있다. 바람직한 투여방식 및 제제는 정맥 주사제, 피하 주사제, 피내 주사제, 근육 주사제, 점적 주사제 등이다. 주사제는 생릭식염액, 링겔액 등의 수성 용제, 식물유, 고급 지방산 에스테르(예, 올리인산에칠 등), 알코올 류(예, 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜, 글리세린 등) 등의 비수성 용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 변질 방지를 위한 안정화제(예, 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, 피로아황산 나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등), 유화제, pH조절을 위한 완충제, 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제(예, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알코올 등) 등의 약학적 담체를 포함할 수 있다.

상기 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 단일 또는 다중 투여될 수 있다.

본 발명에서 용어, "약학적으로 유효가능한 양"은 의학적 예방 또는 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 예방 또는 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

본 발명의 또 다른 하나의 실시양태는 합토글로빈을 유효성분으로 포함하는 골 질환의 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어, "합토글로빈" 및 "골 질환"은 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명의 조성물의 유효성분인 합토글로빈은 이미 안정성이 확인되었으므로, 평소의 식습관에 따라 장기간 동안 상식할 경우, 골 질환의 발병을 예방함은 물론 이미 발병된 골 질환을 개선시키는 효과를 나타낼 수 있다.

본 발명에서 용어, "예방"은 상기 합토글로빈을 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용하여 골 질환의 발병을 억제시키거나 지연시키는 모든 행위를 말한다.

본 발명에서 용어, "개선"은 상기 합토글로빈을 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용하여 골 질환의 발병의 의심 및 이미 발병된 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 하는 모든 행위를 말한다.

상기 골 질환은 골과 관련된 질환을 의미하는 질환을 의미하는 것으로, 구체적으로, 골 전이에 의한 골 소실 질환 또는 골 대사성 질환일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 골 전이에 의한 골 소실 질환은 암세포의 골 전이에 의한 전이성 암질환일 수 있으며, 상기 암질환은 전이성 유방암, 전이성 전립선암, 전이성 대장암, 전이성 폐암, 전이성 간암, 전이성 신장암, 전이성 방광암, 전이성 흑색종, 전이성 다발성 골수종, 또는 전이성 갑상선암일 수 있으나, 이에 한정된 것은 아니다. 또한, 상기 골 대사성 질환은 골다공증, 치주질환, 골절 또는 파제트병(Paget disease) 등과 같은 병리학적 골 질환으로 골 파괴를 촉진하는 질환이 포함되나, 상기 골 대사성 질환에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 합토글로빈을 유효성분으로 포함하는 조성물을 식품 첨가물로 사용하는 경우, 식품 또는 음료에 상기 조성물을 그래도 첨가하거나 또는 다른 식품 첨가물과 함께 조합하여 사용할 수 있다. 본 발명의 식품 첨가물을 식품 또는 음료의 제조시에 첨가할 경우, 이의 첨가량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 첨가량은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

아울러, 상기 식품 또는 음료의 종류는 특별히 이에 제한되지 않으나, 통상적인 의미에서의 식품 또는 음료를 모두 포함하고, 바람직하게는 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등을 포함한다.

이제 본 발명의 합토글로빈을 유효성분으로 포함하는 식품 첨가물을 식품에 첨가할 경우에는, 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜 등의 보조성분과 함께 첨가될 수 있고, 상기 보조성분의 함량은 특별히 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 합토글로빈을 유효성분으로 포함하는 식품 첨가물을 음료에 첨가할 경우에는, 통상의 음료와 같이 여러 가지 감미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 포함할 수 있다. 이 때, 상기 감미제는 특별히 이에 제한되지 않으나, 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있고, 상기 천연 탄수화물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 단당류(예를 들어, 포도당, 과당 등), 이당류(예를 들어, 말토오스, 수크로스 등), 다당류(예를 들어, 덱스트린, 사이클로덱스트린 등), 당알콜(예를 들어, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등) 등을 사용할 수 있으며, 상기 천연 탄수화물의 함량은 특별히 제한되지 않는다.

상기 건강식품 조성물은 정제, 캅셀제, 분말제, 액상제 및 환제로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 형태로 가공될 수 있다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 합토글로빈은 IFNβ의 발현을 증가시켜 파골세포의 분화를 억제하여 골 흡수능을 저해하고, 조골세포 및 파골세포에 대하여 세포독성을 나타내지 않아 안전하며, 암세포의 골 전이로 인한 파골세포의 과도한 분화 및 활성으로 야기된 골 소실을 현저하게 억제하여 골 감소를 방지하는 효과가 있으므로, 암세포의 골 전이에 의한 골 소실 질환 뿐 아니라, 다양한 골대사성 질환의 치료제로 사용될 수 있다.

도 1은 합토글로빈이 대식세포의 파골세포로의 분화를 억제하는 것을 나타낸 것이다. 구체적으로, 도 1의 (a)는 RANKL이 함유된 파골세포에 합토글로빈을 첨가하여 형성된 파골세포를 관찰한 것이고, 도 1의 (b)는 RANKL이 함유된 파골세포에 합토글로빈을 첨가하여 형성된 파골세포를 수를 나타낸 것이다.
도 2는 합토글로빈이 인간 말초혈액단핵세포(hPBMC)의 파골세포로의 분화를 억제하는 것을 나타낸 것이다. 구체적으로, 도 2의 (a)는 hPBMC에 각각 RANKL과 합토글로빈을 첨가하여 형성된 파골세포를 관찰한 것이고, 도 2의 (b)는 염색된 파골세포 수를 나타낸 것이다.
도 3은 조골세포 및 파골세포에서 합토글로빈의 세포독성을 확인한 것이다. 구체적으로, 도 3의 (a)는 조골세포에 합토글로빈을 첨가하여 배양한 뒤의 시간경과에 따른 세포독성을 측정한 것이고, 도 3의 (b)는 파골세포에 합토글로빈을 첨가하여 배양한 뒤의 시간경과에 따른 세포독성을 측정한 것이다.
도 4는 합토글로빈이 항 염증성 사이토카인인 IFNβ를 통해 파골세포 분화를 억제함을 나타낸 것이다. 구체적으로, 도 4의 (a)는 파골세포에 RNAKL 또는 합토글로빈을 첨가한 뒤 측정한 IFNβ의 메신저 RNA 발현 양을 나타낸 것이고, 도 4의 (b)는 파골세포에 RNAKL 또는 합토글로빈을 첨가한 뒤, 배양액에 분비된 IFNβ의 양을 측정한 것이며, 도 4의 (c)는 파골세포에 RANKL을 첨가한 뒤, IFNβ 항체 또는 합토글로빈을 첨가하여 형성된 파골세포를 관찰한 것이고, 도 4의 (d)는 염색된 파골세포 수를 나타낸 것이다.
도 5는 생쥐 모델에서 암세포 전이에 의한 골 소실에 대해 합토글로빈이 항골흡수(anti-resorptive)효과를 가짐을 나타낸 것이다. 구체적으로, 도 5의 (a)는 골 소실이 유도된 전이성 유방암 세포주 4T1에 합토글로빈을 주사하였을 때, 합토글로빈이 4T1에 의한 골 소실을 억제함을 나타낸 것이고, 도 5의 (b) 및 (c)는 경골 내 소주골의 골 부피, 두께, 수 및 분리 양상을 나타낸 것이다.
도 6은 합토글로빈 결손 쥐에서 RANKL에 의한 골 소실이 더욱 증가됨을 나타낸 것이다. 구체적으로, 도 6의 (a)는 RANKL을 주사하여 골 소실이 유도된 야생형 생쥐와 합토글로빈 결손 쥐에서, 합토글로빈 결손 쥐가 야생형 쥐에 비해 RANKL에 의한 골 소실이 증가됨을 나타낸 것이고, 도 6의 (b) 및 (c)는 대퇴골내 소주골의 골 부피, 두께, 수 및 분리양상을 나타낸 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 세포준비 및 배양법

1-1. 대식세포 및 조골세포 준비

생후 6주인 ICR 수컷 생쥐(오리엔트바이오, 성남, 경기도)를 이용하여 대식세포를 획득하였다. 구체적으로 생후 6주된 ICR 수컷 생쥐 뒷다리 부위의 경골과 대퇴골을 무균적으로 분리한 다음, 분리된 골 조직에서 연골 및 지방조직을 깨끗이 제거하였다. 그 후, 1ml 주사기를 이용하여 대퇴골과 경골의 골수세포를 얻었다. 획득된 골수세포는 1,600rpm으로 5분간 원심분리를 통해 침전시킨 뒤, ACK 완충액을 1분간 처리하여 적혈구 및 기타 지방세포 등을 제거하였다. 이후, 1600rpm으로 5분간의 원심분리를 통해 침전시켜 생쥐 골수세포를 획득하였다. 획득한 골수세포를 100mm 배양접시에 배양하고, 대식세포 생장인자인 M-CSF(macrophage colony stimulating factor)를 20ng/ml 처리하였다. 24시간이 지난 뒤, 비 부착성 골수세포만을 분리하여 100mm 페트리접시에 배양한 뒤, M-CSF를 60ng/ml 처리하였다. 3일 뒤, 배양된 대식세포를 비-효소성 분리용액(머크 밀리포어, 독일)을 이용하여 획득하였다.

또한, 생쥐에서 일차 조골세포를 획득하기 위해, 생후 1일된 ICR 생쥐(오리엔트바이오, 성남, 경기도)의 두개골을 분리하여 골막 및 결합조직을 깨끗이 제거하였다. 이후, 두개골을 0.1% 콜라겐 분해효소(collagenase, Gibco)와 0.2% 디스파제(dispase, Boehringer Mannheim)를 넣고 37℃에서 10분간 5회 처리하였다. 2회 처리 시부터 얻은 세포를 수집한 뒤, 1,300rpm으로 5분간 원심 분리하여 침전된 일차 조골세포를 획득하였다.

1-2. 인간 말초혈액단핵세포 준비

인간 혈액 20ml을 준비한 뒤, 인산완충식염수(PBS) 20ml을 섞었다. 이 후, histopaque 용액(Sigma Aldrich) 15ml을 조심스럽게 위쪽으로 덮고, 900g을 30분간 원심분리한 뒤, 위에서부터 두 번째 분홍색 층만 따로 분리하였다. 분리된 용액을 다시 1,700rpm으로 5분간 원심분리하여 침전된 인간 말초혈액단핵세포를 획득하였다.

1-3. 세포 배양법

준비된 대식세포 및 인간 말초혈액단핵세포로부터 파골세포의 분화를 유도하기 위하여, 일반적으로 알려진 분화유도 사이토카인을 이용하여 배양하였다. 구체적으로, 실시예 1-1과 1-2에서 획득한 생쥐의 대식세포 및 인간 말초 혈액 단핵세포를 M-CSF 60ng/ml와 RANKL 100ng/ml가 처리된 조건 하에서, 10%의 FBS(Fetal bovine serum)과 페니실린 50units/ml 및 스트렙토마이신 50mg/ml이 함유된 alpha-MEM(Minimum essential medium) 배지를 사용하여 배양하였다. 상기 배지는 3일마다 교환해 주었으며, 배양 5일째에 생쥐 대식세포로부터는 파골세포를, 배양 9일째에는 인간 말초혈액단핵세포로부터 파골세포를 획득하였다.

조골세포의 경우는 10%의 FBS(Fetal bovine serum)과 페니실린 50units/ml 및 스트렙토마이신 50mg/ml이 함유된 alpha-MEM(Minimum essential medium) 배지를 사용하여 배양하였고, 전이성 유방암 세포주인 4T1은 10%의 FBS(Fetal bovine serum)과 페니실린 50units/ml 및 스트렙토마이신 50mg/ml이 함유된 DMEM(Dulbecco's modified eagle's medium)을 이용하여 배양하였다.

실시예 2. 합토글로빈이 파골세포 분화 억제에 미치는 영향

2-1. 합토글로빈이 생쥐 대식세포로부터 파골세포로의 분화를 억제하는 효과 확인

생쥐의 대식세포에 파골세포로의 분화를 유도하는 사이토카인을 처리하여 파골세포로 분화되는 시스템을 확인하였다. 이러한 시스템에서 합토글로빈이 파골세포로의 분화를 억제하는지를 Kim 등(Biochemical pharmacology, 2004, 1;67(9):1647-56)에 보고된 방법으로 실험을 수행하였다.

합토글로빈이 파골세포 분화 억제에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 실시예 1-1의 방법을 이용하여 대식세포를 획득하였고, 대식세포의 파골세포 분화 배양액에 합토글로빈을 각 농도별로 처리(0, 1, 5, 10, 또는 20μg/ml)한 다음, 5일간 배양하여 파골세포로의 분화를 유도하였다. 이때 음성 대조군으로는 파골세포 분화 사이토카인 RANKL를 처리하지 않은 대식세포를 이용하였으며, 양성 대조군으로는 합토글로빈을 처리하지 않고 분화 유도된 파골세포를 사용하였다. 분화된 파골세포를 고정하기 위하여 10%의 포르말린을 10분간 처리하였다. 이후, 포르말린을 제거하고 0.1%의 트립톤 X-100(Triton X-100, Sigma aldrich)을 5분간 처리한 다음, 트립톤 X-100 용액을 제거하고 10분간 TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase) 염색을 하였다. TRAP 염색은 백혈구 산 포스파타제 키트(LEUKOCYTE ACID PHOSPHATASE KIT, Sigma aldrich)를 사용하였다. TRAP 염색용액을 제거하고, 증류수로 2번 수세하여 건조시킨 다음, 광학현미경(X100) 아래에서 TRAP 양성인 다핵의 파골세포를 분석하였다.

그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 합토글로빈을 처리하지 않은 양성 대조군에 비해, 합토글로빈을 처리한 실험군에서는 합토글로빈의 10μg/ml 이상의 농도에서 TRAP 양성인 다핵의 파골세포수가 크게 감소하였다. 이를 통해, 합토글로빈이 대식세포의 파골세포로의 분화를 강하게 억제하는 것을 확인할 수 있었다(도 1).

2-2. 합토글로빈이 인간 말초혈액단핵세포로부터 파골세포로의 분화를 억제하는 효과 확인

인간 말초혈액단핵세포에 파골세포로의 분화를 유도하는 사이토카인을 처리하여 파골세포로 분화되는 시스템을 확인하였다. 이러한 시스템에서 합토글로빈이 파골세포로의 분화를 억제하는지를 Kwak 등(Biochemical and Biophysical Research Communications, 2005, 20;330(4):1080-6)에 보고된 방법으로 실험을 수행하였다.

합토글로빈이 파골세포 분화 억제에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 실시예 1-2의 방법을 이용하여 인간 말초혈액단핵세포를 획득하였고, 인간 말초혈액단핵세포의 파골세포 분화 배양액에 합토글로빈을 처리(20μg/ml) 또는 처리하지 않은(0μg/ml) 다음, 9일간 배양하여 파골세포로의 분화를 유도하였다. 이때, 음성 대조군으로는 파골세포 분화 사이토카인 RANKL를 처리하지 않은 대식세포를 이용하였으며, 양성 대조군으로는 합토글로빈을 처리하지 않고, 분화 유도된 파골세포를 사용하였다. 분화된 파골세포를 고정하기 위하여 10%의 포르말린을 10분간 처리하였다. 이후, 포르말린을 제거하고 0.1%의 트립톤 X-100(Triton X-100, Sigma aldrich)을 5분간 처리한 다음, 트립톤 X-100 용액을 제거하고 10분간 TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase) 염색을 하였다. TRAP 염색은 백혈구 산 포스파타제 키트(LEUKOCYTE ACID PHOSPHATASE KIT, Sigma aldrich)를 사용하였다. TRAP 염색용액을 제거하고 증류수로 2번 수세하여 건조시킨 다음, 광학현미경(X100) 아래에서 TRAP 양성인 다핵의 파골세포를 분석하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 합토글로빈을 처리하지 않은 양성 대조군에 비해, 합토글로빈을 처리한 실험군에서는 TRAP 양성인 다핵의 파골세포수가 크게 감소하였다. 이를 통해, 합토글로빈은 생쥐 대식세포 뿐 아니라, 인간 말초혈액단핵세포의 파골세포로의 분화 또한 강하게 억제함을 확인할 수 있었다(도 2).

실시예 3. 합토글로빈의 세포독성 측정

생쥐의 대식세포와 조골세포의 세포독성에 합토글로빈이 미치는 영향을 알아보기 위하여, 배양액에 합토글로빈을 각 농도별로 처리(0, 1, 5, 10, 20, 또는 50μg/ml)한 후, 상기 세포를 배양하였다. 세포독성을 측정하기 위하여, Ez-Cytox 용액(대일, 한국)을 사용하였으며, 사용법에 나와 있는 방법으로 세포독성을 측정하였다. 구체적으로, 96 웰(well) 배양접시에 세포를 1 × 10⁴만큼 200μl의 배양액에 배양한 다음, 날짜별로(0, 1, 2, 및 3일) Ez-Cytox 용액(대일, 한국) 20μl를 처리하고, 2시간이 지난 뒤 흡광도 405nm로 측정하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 합토글로빈은 처리한 어떤 농도에서도 세포의 세포독성이 나타내지 않았다. 이를 통해, 본 발명의 합토글로빈은 생쥐 대식세포와 인간 혈액말초세포의 파골세포로의 분화를 억제하는 농도에서 세포독성을 나타내지 않는 안전한 조성물임을 확인할 수 있었다(도 3).

실시예 4. 합토글로빈의 파골세포 억제 매커니즘

4-1. 합토글로빈이 IFN β의 발현 증가에 미치는 영향 확인

합토글로빈의 파골세포 분화 억제 매커니즘을 확인하기 위하여, 파골세포 분화에 영향을 미친다고 알려진 인자들의 발현양을 광범위하게 검사하여 보았다. 그 결과, 기존 보고된 인자들 중 합토글로빈은 항-염증성 사이토카인인 IFNβ의 발현(Takayanagi 등, Nature, 2002, 18;416(6882):744-9)에 영향을 미침을 확인할 수 있었다.

구체적으로, 합토글로빈이 IFNβ의 발현에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 실시예 1-3의 방법으로 생쥐 대식세포의 파골세포 분화 배양액에 합토글로빈을 첨가(20μg/ml) 또는 첨가하지 않고(0μg/ml) 하루동안 배양하여, 세포의 IFNβ 전령 RNA 발현양을 실시간 중합효소 연쇄 반응법(Real-time PCR) 방법으로 분석하였다. 또한, 같은 실험에서 세포 배양액을 분리하여, 파골세포가 배양액으로 분비한 IFNβ 단백질 양을 효소면역분석법(ELISA) 방법으로 분석하였다. 이때, 음성 대조군으로는 RANKL를 처리하지 않은 생쥐 대식세포를 사용하였으며, 양성 대조군으로는 RANKL만 처리한 생쥐 대식세포를 사용하였다.

그 결과, 도 4의 (a)에서 확인할 수 있는 바와 같이, RANKL에 의해 파골세포의 IFNβ 전령 RNA 양과 배양액으로 분비한 IFNβ 단백질의 양이 증가하는 조건에서, 합토글로빈에 의해서 IFNβ 전령 RNA 양과 IFNβ 단백질 양이 더욱 증가함을 확인할 수 있었다. 이 뿐 아니라, RANKL과 합토글로빈을 같이 처리한 세포에서는, IFNβ 전령 RNA 양과 IFNβ 단백질의 양이 더욱 더 크게 증가함을 확인할 수 있었다. 이를 통해, 본 발명의 합토글로빈은 파골세포의 IFNβ 발현양을 단독으로 대량 증가시키고, RANKL과 상조하여 IFNβ의 발현양을 더욱 크게 증가시킨다는 것을 확인할 수 있었다(도 4의 (a)).

4-2. 합토글로빈이 IFN β의 발현증가를 통해 파골세포의 분화를 억제함을 확인

합토글로빈의 파골세포 분화 억제 매커니즘이 합토글로빈으로 인해 증가되는 IFNβ에 의한 것인지를 확인하기 위하여, 실시예 1-3의 방법으로 생쥐 대식세포의 파골세포 분화 배양액에 합토글로빈 20ug/ml 및 항-IFNβ 항체 10μg/ml을 처리하여 5일간 배양한 뒤 파골세포를 획득하였다. 항-IFNβ 항체의 경우, 세포 배양액 내의 IFNβ를 중화하기 위해 사용되었다. 획득된 파골세포는 실시예 2-1의 방법으로 고정 및 염색하여 광확현미경(X100)으로 분석하였다.

그 결과, 도 4의 (b) 내지 (d)에서 확인할 수 있는 바와 같이, 합토글로빈에 의해 억제된 파골세포 분화가 항-IFNβ 항체를 같이 처리하여 줌으로써 구조(Resque)됨을 확인하였다. 이와 같은 결과는 합토글로빈이 파골세포 분화를 억제하는 매커니즘에서 합토글로빈에 의해 증가된 IFNβ가 주요하게 작용함을 의미하는 것이다. 이에 따라, 본 발명의 합토글로빈은 파골세포의 IFNβ 발현양을 증가 킴으로써, 파골세포의 분화를 억제한다는 것을 확인할 수 있었다(도 4의 (b) 내지 (d)).

실시예 5. 합토글로빈이 골 전이로 인한 골 소실에 미치는 영향 확인

암세포의 골 전이로 인한 골 소실에 합토글로빈이 미치는 영향을 확인하기 위해, Lee 등(Biochemical pharmacology, 2014, 1;91(1):51-60. doi: 10.1016/j.bcp.2014.06.005)에 보고된 방법으로 실험하여 확인하였다.

구체적으로, 생후 7주령 수컷 생쥐(오리엔트, 성남, 경기도)의 경골에 전이성 유방암 세포주인 4T1을 4 X 10⁴만큼 5μl의 인산완충식염수(PBS)에 풀어 해밀턴 주사기로 직접 주사하였다. 이후, 합토글로빈 150μg을 인산완충식염수(PBS) 150μl에 녹여 복강주사 방법을 이용하여 주사기로 주사하였다. 상기 합토글로빈은 2일 간격으로 주사되었다. 유방암 세포주 4T1을 경골주사하고 10일이 경과한 뒤, 생쥐를 희생하여 경골을 적출하였다. 적출된 경골은 마이크로 전산단층촬영(micro-CT)을 통해 분석하였다. 이때, 음성 대조군으로는 경골주사 및 복강주사 모두 인산완충식염수(PBS)가 주사된 생쥐를 사용하였으며, 양성 대조군으로는 4T1을 경골주사하고, 인산완충식염수(PBS)를 복강주사한 생쥐를 사용하였다.

그 결과를 도 5에 나타내었으며, 적출된 경골을 마이크로 전산단층촬영(micro-CT)로 촬영한 이미지를 도 5의 (a)에, 분석 프로그램(TRI 3D-BON)을 이용하여 분석한 것을 도 5의 (b) 및 (c)에 나타내었다. 도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 유방암 세포주 4T1을 주사하지 않은 음성대조군에 비해, 4T1을 경골 주사한 생쥐의 경골 소주골(Trabecular bone)이 확연히 감소되었음을 알 수 있었으며, 4T1을 경골 주사한 생쥐들 중, 합토글로빈을 복강주사하지 않은 양성 대조군에 비해, 합토글로빈을 복강 주사한 실험군에서, 경골의 소주골 감소가 억제됨을 확인할 수 있었다. 또한, 그래프 분석 결과를 나타내는 도 5의 (b) 및 (c)에서도, 골부피/총부피(BV/TV), 소주골 두께(Tb.Th), 소주골 수(Tb.N), 및 소주골 분리(Tb.Sp) 모두 상기 도 5의 (a)와 같은 경향을 보였다. 이를 통해, 본 발명의 합토글로빈은 골전이로 인한 골 소실을 크게 억제한다는 것을 확인할 수 있었다(도 5의 (a) 내지 (c)).

실시예 6. 합토글로빈이 골 대사성 질환인 골다공증에 미치는 영향 확인

합토글로빈이 골다공증에 미치는 영향을 알아보기 위해, 야생형 생쥐(Wild type)와 합토글로빈 결손 생쥐(HP knock-out)를 이용하였다. Tomimori 등(Journal of Bone Mineral Research, 2009, 24(7):1194-205)에 보고된 방법으로 골다공증 동물모델을 수립하여 실험을 진행하였다.

구체적으로, 7주령된 야생형 수컷생쥐와 합토글로빈 결손 수컷생쥐에 RANKL 1μg을 인산완충식염수(PBS) 150μl에 녹여 복강주사 하였다. 상기 복강주사는 1일마다 1번씩 총 3번 주사되었다. 첫 번째 복강주사를 실시한 후 3일 뒤, 생쥐를 희생하여 대퇴골을 적출하였다. 상기 적출된 대퇴골은 마이크로 전산단층촬영(micro-CT)으로 분석하였다. 이때, 음성 대조군으로는 RANKL이 복강주사 되지 않은 야생형 생쥐를 사용하였으며, 양성 대조군으로는 RANKL이 복강주사 된 야생형 생쥐를 사용하였다.

그 결과를 도 6에 나타내었으며, 적출된 대퇴골을 마이크로 전산단층촬영(micro-CT)로 촬영한 이미지를 도 6의 (a)에, 분석 프로그램(TRI 3D-BON)을 이용하여 분석한 것을 도 6의 (b) 및 (c)에 나타내었다. 도 6에서 확인할 수 있는 바와 같이, 음성 대조군으로 사용된 RANKL이 복강주사 되지 않은 야생형 생쥐에 비해, 양성 대조군으로 사용된 RANKL이 복강주사 된 야생형 생쥐의 대퇴골 소주골이 크게 감소되었음을 확인할 수 있었으며, 실험군으로 사용된 RANKL이 복강주사 되지 않은 합토글로빈 결손 생쥐의 대퇴골 소주골이, RANKL이 복강주사 되지 않은 야생형 생쥐의 대퇴골 소주골과 비교하여, 골량이 감소되었음을 확인할 수 있었다. 또한, RANKL이 복강주사 된 생쥐들을 야생형 생쥐와 비교하여 본 결과, 합토글로빈 결손 생쥐의 대퇴골 소주골의 골량이 크게 감소되었음을 확인할 수 있었다(도 6의 (a)).

그래프 분석 결과를 나타내는 도 6의 (b) 및 (c)에서도 상기 도 6의 (a)와 비슷한 경향을 나타내었다. 구체적으로, 골부피/총부피(BV/TV), 소주골 두께(Tb.Th), 소주골 수(Tb.N), 및 소주골 분리(Tb.Sp) 모두 RANKL이 복강주사 되지 않은 생쥐에서 합토글로빈 결손 생쥐가 야생형 생쥐에 비해 감소되었으며, RANKL이 복강주사 된 생쥐에서, 합토글로빈 결손 생쥐가 야생형 생쥐에 비해 더욱 더 감소되었음을 확인할 수 있었다. 이를 통하여, 본 발명의 합토글로빈이 골 대사성 질환, 특히, 골다공증의 치료에도 이용될 수 있음을 확인할 수 있었다(도 6의 (a) 내지 (c)).

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> Seoul National University R&DB Foundation <120> A composition for prevention or treatment of bone disease comprising haptoglobin <130> KPA151247-KR <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ser Ala Leu Gly Ala Val Ile Ala Leu Leu Leu Trp Gly Gln Leu 1 5 10 15 Phe Ala Val Asp Ser Gly Asn Asp Val Thr Asp Ile Ala Asp Asp Gly 20 25 30 Cys Pro Lys Pro Pro Glu Ile Ala His Gly Tyr Val Glu His Ser Val 35 40 45 Arg Tyr Gln Cys Lys Asn Tyr Tyr Lys Leu Arg Thr Glu Gly Asp Gly 50 55 60 Val Tyr Thr Leu Asn Asp Lys Lys Gln Trp Ile Asn Lys Ala Val Gly 65 70 75 80 Asp Lys Leu Pro Glu Cys Glu Ala Asp Asp Gly Cys Pro Lys Pro Pro 85 90 95 Glu Ile Ala His Gly Tyr Val Glu His Ser Val Arg Tyr Gln Cys Lys 100 105 110 Asn Tyr Tyr Lys Leu Arg Thr Glu Gly Asp Gly Val Tyr Thr Leu Asn 115 120 125 Asn Glu Lys Gln Trp Ile Asn Lys Ala Val Gly Asp Lys Leu Pro Glu 130 135 140 Cys Glu Ala Val Cys Gly Lys Pro Lys Asn Pro Ala Asn Pro Val Gln 145 150 155 160 Arg Ile Leu Gly Gly His Leu Asp Ala Lys Gly Ser Phe Pro Trp Gln 165 170 175 Ala Lys Met Val Ser His His Asn Leu Thr Thr Gly Ala Thr Leu Ile 180 185 190 Asn Glu Gln Trp Leu Leu Thr Thr Ala Lys Asn Leu Phe Leu Asn His 195 200 205 Ser Glu Asn Ala Thr Ala Lys Asp Ile Ala Pro Thr Leu Thr Leu Tyr 210 215 220 Val Gly Lys Lys Gln Leu Val Glu Ile Glu Lys Val Val Leu His Pro 225 230 235 240 Asn Tyr Ser Gln Val Asp Ile Gly Leu Ile Lys Leu Lys Gln Lys Val 245 250 255 Ser Val Asn Glu Arg Val Met Pro Ile Cys Leu Pro Ser Lys Asp Tyr 260 265 270 Ala Glu Val Gly Arg Val Gly Tyr Val Ser Gly Trp Gly Arg Asn Ala 275 280 285 Asn Phe Lys Phe Thr Asp His Leu Lys Tyr Val Met Leu Pro Val Ala 290 295 300 Asp Gln Asp Gln Cys Ile Arg His Tyr Glu Gly Ser Thr Val Pro Glu 305 310 315 320 Lys Lys Thr Pro Lys Ser Pro Val Gly Val Gln Pro Ile Leu Asn Glu 325 330 335 His Thr Phe Cys Ala Gly Met Ser Lys Tyr Gln Glu Asp Thr Cys Tyr 340 345 350 Gly Asp Ala Gly Ser Ala Phe Ala Val His Asp Leu Glu Glu Asp Thr 355 360 365 Trp Tyr Ala Thr 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Claims (9)

1. 합토글로빈(Haptoglobin)을 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 골 질환은 골 전이에 의한 골 소실 질환 또는 골 대사성 질환인 것인, 약학적 조성물.
   
3. 제2항에 있어서, 상기 골 전이에 의한 골 소실 질환은 암세포의 골 전이에 의한 전이성 암질환인 것인, 약학적 조성물.
   
4. 제3항에 있어서, 상기 전이성 암질환은 전이성 유방암, 전이성 전립선암, 전이성 대장암, 전이성 폐암, 전이성 간암, 전이성 신장암, 전이성 방광암, 전이성 흑색종, 전이성 다발성 골수종, 또는 전이성 갑상선암인 것인, 약학적 조성물.
   
5. 제2항에 있어서, 상기 골 대사성 질환은 골다공증, 치주질환, 골절 또는 파제트병인 것인, 약학적 조성물.
   
6. 제1항에 있어서, 상기 합토글로빈은 파골세포의 분화를 억제하는 것인, 약학적 조성물.
   
7. 제1항에 있어서, 상기 합토글로빈은 IFNβ의 발현을 증가시키는 것인, 약학적 조성물.
   
8. 합토글로빈(Haptoglobin)을 포함하는 골 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
   
9. 제8항에 있어서, 상기 골 질환은 골 전이에 의한 골 소실 질환 또는 골 대사성 질환인 것인, 식품 조성물.
   

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