KR20220066822A

KR20220066822A - 골 질환 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20220066822A
Application number: KR1020210116164A
Authority: KR
Inventors: 최제용; 김현주; 차상국; 김한; 이동교; 윤혜진
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2020-11-16
Filing date: 2021-09-01
Publication date: 2022-05-24

Abstract

본 발명은 골 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 골 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 건강기능식품 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 파골세포의 형성 또는 분화를 억제하고, 파골세포의 아폽토시스를 촉진하는 효과를 가지는 바, 이를 활용하여 파골세포 형성과 관련된 골 질환을 보다 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.

Description

골 질환 예방 또는 치료용 조성물{COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING BONE DISEASES}

본 발명은 골 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 파골세포의 형성 및 분화를 억제하고 파골세포의 아폽토시스를 촉진시켜 골 질환을 예방, 치료 또는 개선시킬 수 있는 조성물을 제공한다.

뼈(bone)는 뼈를 분해하는 파골세포(osteoclast) 및 뼈를 형성하는 조골세포(osteoblast) 사이의 동적 커뮤니케이션을 통해 지속적인 리모델링을 경험하는 매우 활동적인 조직이다. 그들의 세포 기능 간의 균형은 성인 골 질량(bone mass) 및 무결성(integrity) 유지에 매우 중요하다. 파골세포에 의한 골 흡수의 비정상적 상승은 이러한 균형을 깨뜨리고, 골다공증 및 염증성 관절염과 같은 병리학적 골 질환을 유발한다. 따라서, 파골세포의 분화, 기능, 및/또는 생존을 조절하는 것은 미란성(erosive) 골 장애를 치료하기 위한 유망한 전략이다.

파골세포는 대식세포 콜로니 자극인자(macrophage colony-stimulating factor, M-CSF) 및 핵인자-κB 리간드의 수용체 활성화제(receptor activator of nuclear factor-κB ligand, RANKL)의 제어 하에서 조혈 전구세포(hematopoietic progenitor cell)에서 생성된 거대 다핵세포(polykaryons)이다. 이의 수용체 RANK에 결합한 RANKL은 NF-κB, 미토겐-활성화 단백질 키나아제(mitogen-activated protein kinases, MAPKs), c-Jun N-터미날 키나아제(c-Jun N-terminal kinase, JNK), 세포외 신호조절 키나아제(kinase extracellular signal-regulated kinase, ERK), 및 p38을 포함하는 다운스트림 신호전달 경로의 활성화를 통해 파골세포 형성 과정을 촉발한다. 게다가, RANKL은 c-Fos의 유도를 매개하고, 면역글로불린 유사 수용체와의 협력을 통해 칼슘 신호전달을 활성화한다. 이러한 신호전달 캐스케이드는 궁극적으로 활성화 T 세포의 핵 인자 세포질 1(nuclear factor of activated T cells cytoplasmic 1, NFATc1)의 발현을 유도하고, 이는 차례로 파골세포 마커 유전자의 발현을 상향 조절한다.

ERRα, ERRβ, 및 ERRγ라고 하는 에스트로겐 관련 수용체(estrogen-related receptors, ERRs)는 핵 수용체 슈퍼패밀리에 속하는 고아 수용체(orphan receptors)이다. ERRα 및 ERRγ 대사 유전자 및 에너지 대사의 조절 역할을 하는 반면, ERRβ는 배아 줄기세포 전분화능(pluripotency)의 유지 역할로 알려져 있다. ERRs의 내인성 리간드는 현재까지 발견되지 않았지만, 그들의 활성 및 발현을 조절하는 합성 화합물이 개발되었다. 상기 화합물 중, 합성 저분자 GSK5182 (4-[(Z)-1-[4-(2-dimethylaminoethyloxy)phenyl]-hydroxy-2-phenylpent-1-enyl]phenol], a 4-hydroxy tamoxifen analogue)는 다른 핵 수용체에 결합하지 않는 ERRγ-특이적 역 작용제임이 확인되었다. GSK5182는 2형 당뇨병 마우스 모델에서 간 포도당 신생합성(hepatic gluconeogenesis)을 억제하여 항당뇨 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 또한, GSK5182가 활성 산소종이 중요한 역할을 하는 인간 유방암에서 항종양 활성을 가지는 것으로 나타났다. 골 대사에서 ERRγ의 역할이 보고되어왔으나, 대부분의 연구는 조골세포 및 연골에서의 기능에 초점을 맞추고 있으며, GSK5182의 파골세포 및 이와 관련된 골 질환에 대한 치료 효과에 대한 연구는 미미한 실정이다.

대한민국 공개특허 제10-2009-0128454호 (2009년12월15일 공개)

본 발명의 목적은 파골세포의 형성 또는 분화 조절에 우수한 효과를 가진 화합물을 포함하는 골 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 골 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 골 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 파골세포 형성 또는 분화 억제용 시약 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 시험관 내(in vitro)에서 골수 세포에 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 처리하는 단계를 포함하는 파골세포 형성 또는 분화 억제 방법을 제공한다.

<화학식 1>

본 발명에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 에스트로겐 관련 수용체의 작용제로서 기능하며, 파골세포의 형성 또는 분화를 억제하고, 파골세포의 아폽토시스를 촉진하는 효과를 가지는 바, 이를 활용하여 파골세포 형성과 관련된 골 질환을 보다 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.

도 1은 에스트로겐 관련 수용체 감마(Estrogen-related receptor gamma, ERRγ) 조절제가 파골세포 형성에 미치는 영향에 관한 것으로, 도 1A는 GSK5182 처리에 따른 ERRγ 단백질 수준의 정량 분석 결과, 도 1B는 GSK4716 처리에 따른 ERRγ 단백질 수준의 정량 분석 결과 그래프로, 이는 3개의 독립적인 실험값을 나타낸다. 도 1C는 TRAP에 염색된 세포 이미지이고, 도 1D는 상기 TRAP 양성 다핵 세포(MNCs)를 계수하여 나타낸 그래프이며, 도 1E는 TRAP 활성을 정량화하여 나타낸 그래프이다. 도 1F는 MTS 분석을 통해 세포 생존율을 확인한 그래프이다. A, B, D 및 E의 데이터 값은 평균 ± SD 값이며, vehicle-처리 대조군(Con)에 대해 *P < 0.05, **P < 0.001 이다.
도 2는 GSK5182의 파골세포 형성 마커에 미치는 영향에 관한 것으로, 도 2A는 GSK5182 처리에 따른 파골세포 분화와 관련된 전사인자의 발현 수준을 측정한 그래프이며 (대조군(control)에 대해 *P < 0.05, **P < 0.001 이다), 도 2B 내지 2D는 이를 웨스턴 블로팅으로 확인한 결과이다.
도 3은 GSK5182의 RANKL 신호전달 케스케이드(cascade)에 대한 영향에 관한 것으로, 도 3A는 MAPKs (JNK, ERK, p38) 인산화 및 전체 형태를 면역 블로팅에 의해 검출한 결과이고, 도 3B는 인산화된 IκBα 항체로 세포 용해물을 면역 블로팅한 결과이며, 도 3C는 GSK5182 처리된 세포에서 IκBα의 면역 블로팅 분석한 결과이다. 또한, 도 3D는 RAW264.7 세포를 NF-κB 루시퍼라제 리포터 단독으로 형질감염한 것이고, 도 3E는 ERRγ 발현 플라스미드와 함께 NF-κB 루시퍼라제로 공동 형질감염시킨 것으로, 루시퍼라제 리포터 분석 시스템(dual-luciferase reporter assay system)으로 측정하였다 (**P < 0.001)
도 4는 GSK5182의 파골세포 세포사멸, 아폽토시스(apoptosis)에 대한 영향에 관한 것으로, 도 4A는 세포를 고정하고 TRAP로 염색한 이미지이며, 파골세포의 세포사멸은 별표(asterisks)로 표시하였다. 도 4B는 파골세포의 생존을 TRAP-양성 MNCs의 백분율로 나타낸 것이고 (**P < 0.001), 도 4C는 파골세포의 세포사멸을 ELISA로 측정한 것이며 (**P < 0.001), 도 4D는 전체 세포 용해물을 cleaved caspase (cas)-3 및 caspase-9에 대한 특이적 항체로 면역 블로팅한 것으로, β-Actin은 로딩 대조군으로 사용되었다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명하기로 한다.

고아 핵 수용체 패밀리(orphan nuclear receptor family)의 구성원인 에스트로겐 관련 수용체 감마(Estrogen-related receptor gamma, ERRγ)는 세포 대사 과정 및 에너지 항상성의 핵심 매개체이다. 따라서, ERRγ는 다양한 대사 장애를 치료하기 위한 매력적인 표적이 되었다. 본 발명자들은 최근 ERRγ가 핵인자-κB 리간드의 수용체 활성화제(RANKL) 유도 파골세포 형성의 음성 조절자(negative regulator)로 작용한다고 보고하였고, 특정 ERRγ 역 작용제로 확인된 GSK5182를 사용하여 파골세포 분화 및 생존에 ERRγ 조절의 영향을 조사하였다.

그 결과, GSK5182는 ERRγ 작용제로 알려진 GSK4716과 유사하게 ERRγ의 단백질 함량을 증가시켰고, 세포독성 없이 골수 유래 대식세포로부터 파골세포의 형성을 억제하였다. 또한, GSK5182는 파골세포 형성의 중추적인 전사인자인 RANKL-매개 c-Fos 및 활성 T 세포의 핵 인자(NFATc1)의 발현을 약화시켰으며, IκBα, JNK, 및 ERK의 활성화를 강력하게 차단하였고, 용량 의존적으로 NF-κB 프로모터 활성을 억제하였다. 더불어, 파골세포의 형성 외에도, GSK5182는 caspase-3 활성을 통해 성숙된 파골세포의 세포사멸(apoptosis)을 가속화하는 것으로 나타난 바, GSK5182가 골 흡수 관련 장애의 치료에 잠재력을 가질 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 골 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

상기 약학 조성물은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유할 수 있다.

<화학식 1>

상기 화합물은 4-[(Z)-1-[4-(2-디메틸아미노에틸옥시)페닐]-하이드록시-2-페닐펜트-1-에닐]페놀 [4-[(Z)-1-[4-(2-dimethylaminoethyloxy)phenyl]-hydroxy-2-phenylpent-1-enyl]phenol]로 명명될 수 있다.

상기 화합물은 이와 동일한 효능을 갖는 범위 내에서 약학적 또는 식품학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용할 수 있다.

본 명세서에서, "약학적 또는 식품학적으로 허용가능한"이란, 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없어, 인간에게 투여하기에 적합한 안전성 및 효능 프로파일을 갖는 염을 의미한다.

상기 염은 약학적 또는 식품학적으로 허용가능한 염기성 염 또는 산성염 중 어느 하나의 형태로 사용할 수 있다. 염기성염은 유기 염기염, 무기 염기염 중 어느 하나의 형태로 사용할 수 있으며, 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염, 리튬염, 마그네슘염, 세슘염, 아미늄염, 암모늄염, 트리에칠아미늄염 및 피리디늄염으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

산성염은 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 유리산으로는 무기산과 유기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 황산, 아황산, 인산, 이중 인산, 질산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 구연산, 초산, 말레산, 말산, 퓨마르산, 글루코산, 메탄설폰산, 벤젠설폰산, 캠퍼설폰산, 옥살산, 말론산, 글루타릭산, 아세트산, 글리콘산, 석신산, 타타르산, 4-톨루엔설폰산, 갈락투론산, 엠본산, 글루탐산, 시트르산, 아스파르탄산, 스테아르산 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않고 당업계에서 통상적으로 사용되는 다양한 무기산 및 유기산을 이용하여 형성되는 염이 모두 포함될 수 있다.

또한, 상기 화합물은 상기 염뿐만 아니라, 통상의 방법에 의해 제조될 수 있는 모든 염, 수화물, 용매화물, 유도체 등을 모두 포함할 수 있다. 부가염은 통상의 방법으로 제조할 수 있고, 수혼화성 유기용매, 예를 들면 아세톤, 메탄올, 에탄올, 또는 아세토니트릴 등에 녹여 과량의 유기염기를 가하거나 무기염기의 염기 수용액을 가한 후 침전시키거나 결정화시켜서 제조할 수 있다. 또는 이 혼합물에서 용매나 과량의 염기를 증발시킨 후 건조시켜서 부가염을 얻거나 또는 석출된 염을 흡인 여과시켜 제조할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물은 에스트로겐 관련 수용체 감마(estrogen-related receptor gamma, ERRγ)의 단백질 함량을 증가시키고, 파골세포의 형성 또는 분화를 억제하며, 파골세포의 아폽토시스(apoptosis)를 촉진시킬 수 있다.

본 발명의 일 실험예에 따르면, 파골세포 형성과정 동안 하향 조절되는 ERRγ의 발현이 GSK5182의 처리에 따라 ERRγ의 발현이 증가됨을 확인할 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실험예에 따르면, GSK5182는 RANKL 매개 파골세포 분화의 주요 결정인자인 c-Fos 및 NFATc1의 mRNA 및 단백질의 발현 및 활성을 억제시키고, NFATc1 표적 유전자인 TRAP 및 cathepsin K (CTSK)의 발현도 약화시켰으며, RANKL 신호전달과 관련된 NF-κB, JNK 및 ERK의 활성화를 억제함을 확인할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 골 질환은 골다공증(osteoporosis), 골관절염(osteoarthritis), 골용해(osteolysis), 골괴사(osteronecrosis) 및 골소실(bone loss)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있고, 바람직하게는 골다공증일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 약학 조성물은 제형에 따라 약학적으로 허용가능한 적절한 담체와 배합될 수 있고, 필요에 따라, 부형제, 희석제, 분산제, 유화제, 완충제, 안정제, 결합제, 붕해제, 용제 등을 더 포함하여 제조될 수 있다. 상기 적절한 담체 등은 본 발명에 따른 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 활성 및 특성을 저해하지 않는 것으로, 투여 형태 및 제형에 따라 달리 선택될 수 있다.

상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제, 희석제 등으로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등이 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.

상기 약학 조성물은 어떠한 제형으로도 적용될 수 있고, 상세하게는 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여에 적합한 단위투여형의 제제로 제형화시켜 사용될 수 있다.

보다 상세하게는, 상기 경구형 제형 중 고형 제형은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등의 형태로, 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스, 락토오스, 솔비톨, 만니톨, 셀룰로오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있고, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 포함될 수 있다. 또한, 캡술제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를 더 포함할 수 있다.

상기 경구형 제형 중 액상 제형은 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

상기 비경구 제형은 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 주사제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 이에 제한되지 않고, 당업계에 널리 공지된 적합한 제제를 모두 사용 가능하다.

또한, 상기 약학 조성물은 치료 효능의 증진을 위해 항산화제를 더 첨가할 수 있다. 상기 항산화제로는 티아민(thiamin, 비타민 B1), 리보플라빈(riboflavin, 비타민 B2), 나이아신(niacin, 비타민 B3), 판토펜산(pantothenic acid, 비타민 B5), 피리독신(pyridoxine, 비타민 B6) 및 코발라민(cobalamin, 비타민 B12) 등의 비타민 B군의 화합물과 비타민 C, 비타민 D, 비타민 E 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 당업계에 널리 공지된 적합한 제제를 모두 사용 가능하다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다.

본 명세서에서, "약학적으로 유효한 양"이란, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미한다.

상기 약학 조성물의 유효 용량 수준은 사용 목적, 환자의 연령, 성별, 체중 및 건강 상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 달리 결정될 수 있다. 예를 들어, 일정하지는 않지만 일반적으로 0.001 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 0.01 내지 10mg/kg을 일일 1회 내지 수회 투여될 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

상기 약학 조성물은 골 질환이 발생할 수 있는 임의의 동물에 투여될 수 있고, 상기 동물은 예를 들어, 인간 및 영장류뿐만 아니라 소, 돼지, 말, 개 등의 가축 등을 포함할 수 있다.

상기 약학 조성물은 제제 형태에 따른 적당한 투여 경로로 투여될 수 있고, 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다. 투여 방법은 특히 한정할 필요 없이, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피부 도포, 호흡기내 흡입, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracere-broventricular) 주사 등의 통상적인 방법으로 투여될 수 있다.

상기 약학 조성물은 골 질환의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로 사용될 수 있고, 수술 또는 다른 약물치료 등과 병용하여 사용될 수 있다.

본 발명은 골 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

상기 건강기능식품 조성물은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유할 수 있다.

<화학식 1>

이에 상응하는 특징들은 상술된 부분에서 대신할 수 있다.

본 발명에 따른 건강기능식품 조성물에 있어서, 상기 건강기능식품은 골 질환의 예방 또는 개선 목적으로, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽 또는 음료 등으로 제조될 수 있다. 상기 건강기능식품이 취할 수 있는 형태에는 제한이 없으며, 상기 약학 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가될 수 있다.

상기 건강기능식품 조성물에 있어서, 상기 건강기능식품은 통상적인 의미의 식품을 모두 포함할 수 있다. 예를 들어, 음료 및 각종 드링크, 과실 및 그의 가공식품(과일통조림, 잼 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(햄, 베이컨 등), 빵류 및 면류, 쿠키 및 스낵류, 유제품(버터, 치즈 등) 등이 가능하며, 통상적인 의미에서의 기능성 식품을 모두 포함할 수 있다. 또한, 동물을 위한 사료로 이용되는 식품도 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 건강기능식품 조성물은 당업계에서 통상적으로 사용되는 식품학적으로 허용가능한 식품 첨가제(식품 첨가물) 및 적절한 기타 보조 성분을 더 포함하여 제조될 수 있다. 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전처에 승인된 식품첨가물공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정할 수 있다. 상기 '식품첨가물공전'에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료 제제, 타르색소제제 등의 혼합 제제류 등을 들 수 있다.

상기 기타 보조 성분은 예를 들어, 향미제, 천연 탄수화물, 감미제, 비타민, 전해질, 착색제, 펙트산, 알긴산, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산화제 등을 추가로 함유할 수 있다. 특히, 상기 천연 탄수화물로는 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 수크로오스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜을 사용할 수 있으며, 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.

상기 건강기능식품 조성물에 함유된 상기 화합물 또는 이의 염의 유효용량은 골 질환 예방 또는 개선 등 그 사용 목적에 따라 적절하게 조절될 수 있다.

상기 건강기능식품 조성물은 식품을 원료로 하여 일반 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 골 질환 예방 또는 개선을 위한 보조제로 섭취될 수 있다.

또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 파골세포 형성 또는 분화 억제용 시약 조성물을 제공한다.

<화학식 1>

또한, 본 발명은 시험관 내(in vitro)에서 골수 세포에 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 처리하는 단계를 포함하는 파골세포 형성 또는 분화 억제 방법을 제공한다.

<화학식 1>

이에 상응하는 특징들은 상술된 부분에서 대신할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

<실험방법>

1. 시약 및 항체

GSK5182는 이전에 설명된 대로 합성되었다 (Bioorg Med Chem Lett 16, 821-824, Chao EY , Collins JL , Gaillard S et al (2006)). 재조합 쥐(murine) RANKL 및 human M-CSF는 R&D Systems (Minneapolis, MN, USA)로부터 획득하였다. IκBα, JNK, p38, ERK, phospho-IκBα, phospho-JNK, phospho-p38, 및 phospho-ERK에 대한 특이적 1차 항체는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA); ERRγ는 R&D Systems; NFATc1은 BD Pharmingen (San Diego, CA, USA); c-Fos는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA); RANK는 Abcam (Cambridge, UK)에서 구입하였다.

2. 파골세포 분화

파골세포는 이전에 설명한 대로 쥐의 골수 세포에서 준비되었다 (Mol Cells 43, 340-349, Kim HJ , et al (2020)). C57/BL6 수컷 쥐의 대퇴골(femurs) 및 경골(tibiae)로부터의 전체 골수를 α-최소 필수 배지(α-minimum essential media, α-MEM)로 씻어 낸 후, 적혈구를 제거하고 골수 세포를 M-CSF의 공급원으로 10% FBS 및 10% CMG 14-12 배양 배지를 포함하는 α-MEM와 함께 페트리 디쉬에서 3일 동안 배양하였다. 부착 세포는 골수 유래 대식세포(bone marrow-derived macrophages, BMMs)로 선택되었다. 파골세포를 유도하기 위해, 전구체 세포 (BMMs)를 RANKL (20 ng/ml) 및 M-CSF (20 ng/ml)이 포함된 α-MEM 에서 4 또는 5일 동안 배양하였다. 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 세포를 고정시킨 후, 타르타르산염-저항성 산성 인산분해효소(tartrate-resistant acid phosphatase, TRAP)로 염색하였다.

3. 세포 생존율(Cell viability) 분석

BMMs을 96웰 플레이트에 웰 당 5×10³세포 농도로 시딩하고, M-CSF (30 ng/ml) 존재하에서 다양한 용량의 GSK5182와 함께 배양하였다. 3일 후, 세포를 MTS (Promega, Madison, WI, USA)를 포함하는 CellTiter 96 AQueous One Solution Reagent을 웰 당 20μl로 하여 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 세포 생존율을 490 nm에서 흡광도를 측정하여 정량화하였다.

4. 실시간 PCR

ABI 7500 Real-Time PCR system (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)에서 SYBR Green 염료를 사용하여 정량적 실시간 PCR(quantitative real-time PCR)을 수행하였다.

하기 표 1은 PCR에 사용된 프라이머이다.

primer	sequence	서열번호
ERRγ	5’-GCTAAGTGCCAGAATTCAAACCA-3’	1
ERRγ	5’-ATCGACTCCTATGGATCAGGACTTT-3’	2
c-Fos	5’-AGGCCCAGTGGCTCAGAGA-3’	3
c-Fos	5’-GCTCCCAGTCTGCTGCATAGA-3’	4
NFATc1	5’-ACCACCTTTCCGCAACCA-3’	5
NFATc1	5’-TTCCGTTTCCCGTTGCA-3’	6
TRAP	5’-TCCCCAATGCCCCATTC-3’	7
TRAP	5’-CGGTTCTGGCGATCTCTTTG-3’	8
Cathepsin K	5’-GGCTGTGGAGGCGGCTAT-3’	9
Cathepsin K	5’-AGAGTCAATGCCTCCGTTCTG-3’	10
RANK	5’-TCTGCAGCTCTTCCATGACACT-3’	11
RANK	5’-GAAGAGGAGCAGAACGATGAGACT-3'	12
c-Fms	5’-CCTGAATCTCCCGGAAGCA-3’	13
c-Fms	5’-CAAGCTCGGTACAACGGTAGGT-3’	14

5. 웨스턴 블로팅

Vehicle 또는 화합물 처리된 세포를 수확하여 프로테아제-포스파타제 억제제(protease-phosphatase inhibitor)가 보충된 RIPA buffer (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)에서 용해시켰다. BCA 단백질 분석 키트 (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA)를 사용하여 단백질 농도를 측정한 후, 동일한 양의 단백질로 SDS-PAGE 및 웨스턴 불로팅 분석을 하였다. 면역 반응성 단백질을 ECL Plus kit (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA)로 검출하고 a LAS4000 luminescent image analyzer (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)로 이미지화하였다.

6. 루시퍼라제 분석( luciferase assay)

RAW264.7 대식세포를 48 웰 플레이트 웰 당 1×10⁵ 세포에 10% FBS를 포함한 둘베코 수정 이글배지(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)에서 배양하였다. 다음 날, FuGENE HD transfection reagent (Promega, Madison, WI, USA)을 사용하여 세포를 NF-κB reporter plasmid (250 ng)와 함께 형질감염시켰다.

또 다른 분석에서, RAW264.7 세포를 Dr. Hueng-Sik Choi (Chonnam National University, Gwangju, Korea)가 제공한 NF-κB luciferase reporter (250 ng) 및 ERRγ expression plasmid (250 ng)로 공동 형질감염시켰다. 형질감염 24시간 후, 세포를 24시간 동안 다양한 농도의 GSK5182와 함께 배양한 다음 24시간 동안 RANKL (100 ng/ml)로 자극하였다. NF-κB 루시퍼라제 활성을 제조업체의 프로토콜에 따라 dual-luciferase reporter assay system (Promega)을 사용하여 결정하였다.

7. 세포사멸( apoptosis ) 분석

성숙한 파골세포를 vehicle 또는 GSK5182 존재하에 하루 동안 배양하였다. 파골세포 세포사멸은 세포질 히스톤 관련 DNA 단편을 정량적으로 검출하는 Cell Death Detection ELISAPLUS Kit (Roche, Mannheim, Germany)로 분석하였다.

8. 통계 분석

통계 분석은 Microsoft Excel 2016 (Microsoft, USA)을 사용하여 수행되었다. 통계적 유의성은 P < 0.05가 유의한 것으로 간주하여 Student’s t-test에 의해 결정되었다. 결과는 평균 ± 표준편차(SD)로 표시되었다.

<실험결과>

1. ERRγ 조절제 GSK5182의 ERRγ 단백질 함량 증진

먼저, ERRγ 단백질 발현에서 합성 ERRγ 조절제, GSK5182 및 GSK4716의 효과를 확인하였다. 골수 유래 대식세포(BMMs)를 분리하여 두 가지 다른 농도의 ERRγ 조절제로 배양하였다.

ERRγ 특이적 항체를 이용한 면역블로팅 분석은 GSK5182 처리가 용량 의존적으로 ERRγ 단백질 수준을 유의적으로 증가시켰음을 보여주었다 (도 1A). 잘 알려진 ERRγ 작용제 화합물인 GSK4716 또한, 두 농도 모두에서 ERRγ 단백질 함량을 증가시킴을 보여주었다 (도 1B).

2. GSK5182의 RANKL에 의해 유도된 파골세포 형성의 차단

파골세포 형성에 대한 GSK5182의 영향을 확인하기 위해, RANKL, M-CSF, 및 다양한 용량의 GSK5182 또는 vehicle의 존재하에서 BMMs를 4일 동안 배양하였다.

그 결과, vehicle-처리 대조군과 비교하여, GSK5182의 노출은 용량 의존적으로 BMMs로부터 TRAP-발현 다핵 파골세포의 형성을 현저하게 억제하는 것으로 나타났다 (도 1C, D). GSK5182는 10 μM 농도에서 파골세포의 형성을 완전히 차단하였으며 (도 1D), 파골세포 수의 감소와 일치하게, 배양 상청액을 사용하여 결정된 TRAP 활성 또한 GSK5182 존재하에 용량 의존적으로 감소하는 것으로 나타났다 (도 1E).

M-CSF (30 ng/ml) 존재하에 표시된 농도의 GSK5182와 함께 BMMs를 3일 동안 배양하여 MTS 분석을 통해 세포 생존율을 확인한 결과, 본 실험에 사용된 GSK5182 농도가 BMMs의 세포독성 또는 증식에 영향을 미치지 않음을 확인하였다 (도 1F).

3. GSK5182의 파골세포 형성 마커의 유도 약화

GSK5182가 파골세포의 형성을 억제함에 따라, GSK5182가 파골세포 형성-관련 마커의 유전자 발현에 미치는 영향을 평가하였다. GSK5182 (10 μM)의 부재 또는 존재하에서 RANKL 및 M-CSF와 함께 BMMs를 배양하였다.

그 결과, 대조군 BMMs에서 RANKL 자극은 RANKL 매개 파골세포 분화의 주요 결정인자인 c-Fos 및 NFATc1의 mRNA 발현 수준을 증가시켰으나, GSK5182는 상기 두 전사인자의 mRNA 유도를 유의적으로 약화시켰다 (도 2A). 이러한 화합물의 억제 효과는 웨스턴 블로팅 분석에 의해 더 명확해졌다. GSK5182는 시간 및 용량 의존적으로 c-Fos 및 NFATc1의 단백질 발현을 강하게 감소시켰다 (도 2B 및 2C).

NFATc1 수준에서 관찰된 감소를 반영하여, NFATc1 표적 유전자, TRAP 및 cathepsin K (CTSK)의 발현도 GSK5182에 대한 반응으로 약화되었다 (도 2A 및 B). 또한, GSK5182가 RANKL 수용체 RANK의 mRNA 발현을 억제하였으나, M-CSF 수용체 c-Fms는 억제하지 않음을 확인하였다 (도 2A). 웨스턴 블로팅에서도 유사한 결과를 얻었으며, 이는 RANK의 단백질 수준이 GSK5182 처리에 의해 유의적으로 감소됨을 보여준다 (도 2D).

4. GSK5182의 NF - κB , JNK , 및 ERK의 RANKL -자극 활성화 억제

RANKL-유도 파골세포 형성에서 GSK5182의 억제 효과에 대한 메커니즘을 더 이해하기 위해, RANKL 신호전달 케스케이드(cascade)에 대한 GSK5182의 영향을 평가하였다. BMMs을 6시간 동안 혈청 결핍시킨 후, GSK5182 또는 vehicle로 전처리한 다음, RANKL (30 ng/ml)로 자극시켜 이에 대한 반응으로 MAPK 패밀리의 활성화를 분석하였다.

예상한 대로, 대조군 세포에서 RANKL 노출은 JNK, ERK, 및 p38을 포함하는 MAPKs를 활성화하였다. 대조적으로, BMMs의 GSK5182로의 전처리는 JNK 및 ERK의 RANKL-자극 인산화를 중단시켰다 (도 3A). 한편, RANKL에 의한 p38의 활성화는 GSK5182의 존재하에서 변경되지 않았다.

파골세포 형성에 대한 또 다른 주요 RANKL 신호전달 케스케이드는 NF-κB 신호전달 경로의 활성화를 통한 것이다. RANKL 자극은 vehicle-처리된 대조군 BMMs에서 인산화된 IκBα의 수준을 상승시키는 반면, GSK5182의 첨가는 RANKL-유도 IκBα의 인산화를 강하게 억제하였다 (도 3B). 따라서, IκBα 단백질 양은 두 농도 모두에서 GSK5182 노출된 세포에서 증가하였다 (도 3C).

또한, RANKL은 NF-κB의 전사 활성의 유도를 유발한다. 따라서, RAW264.7 대식세포에서 RANKL-매개 NF-κB 프로모터 활성에 미치는 GSK5182의 영향을 결정하였다. RAW264.7 세포에 NF-κB 루시퍼라제 리포터 단독, 또는 ERRγ 발현 플라스미드와 함께 NF-κB 루시퍼라제로 공동 형질감염시킨 후, GSK5182 또는 vehicle로 24시간 처리한 다음, RANKL(100ng/ml)로 24시간 동안 자극하였다.

RANKL 노출은 NF-κB 루시퍼라제 활성을 증가시킨 반면, GSK5182는 RANKL 자극에 따른 NF-κB 활성의 용량 의존적 감소를 유도하였다 (도 3D). NF-κB 프로모터 활성의 유도는 ERRγ 과발현에 의해 유의적으로 약화되었다 (도 3E). 특히, GSK5182의 처리는 용량 의존적으로 NF-κB 프로모터에 대한 ERRγ의 감소 효과를 가속화하였다 (도 3E).

이러한 결과는 GSK5182가 ERRγ와 유사한 NF-κB의 전사활성화를 억제함을 보여주며, 이는 GSK5182가 ERRγ에 작용하는 방식으로 작용할 수 있음을 나타낸다.

5. GSK5182의 파골세포 세포사멸의 가속화

파골세포의 골 흡수 능력(bone resorptive capacity) 또한 세포 생존율에 의해 좌우되기 때문에, 파골세포 생존에 대한 GSK5182의 영향을 조사하였다. 이를 위해, 성숙한 파골세포를 GSK5182 존재 또는 부재하에서 24시간 동안 배양한 다음, TRAP로 염색하였다 (도 4A). GSK5182는 TRAP-양성 파골세포의 생존율을 강하게 감소시켰다 (도 4B).

관찰된 세포 생존율의 감소가 GSK5182 처리된 세포에서 세포사멸을 동반하는 지 조사하기 위하여, ELISA에 의해 세포사멸 DNA 단편화 분석을 수행하였다.

그 결과, GSK5182의 첨가는 성숙한 파골세포의 세포사멸을 현저히 향상시켰다 (도 4C). 세포사멸 유발 효과와 일치하게, GSK5182는 caspase-3 및 caspase-9 활성 모두를 가속화하였다 (도 4D).

결론적으로, GSK5182는 파골세포 형성을 억제하고 및 성숙 파골세포의 세포사멸사를 촉진하며, NF-κB, JNK, 및 ERK 신호전달 및 두 주요 전사인자인 c-Fos 및 NFATc1의 억제를 통해 파골세포의 분화를 억제하는 바, GSK5182가 골 흡수 관련 질환의 치료에 유익한 효과가 있을 것임을 보여준다.

더불어, GSK5182-매개 ERRγ 단백질 함량의 증가가 파골세포의 분화의 장애를 초래할 수 있음을 보여주며, ERRγ에 의해 억제된 NF-κB의 프로모터 활성이 GSK5182에 의해 가속화됨을 통해 GSK5182가 ERRγ 작용제로서 기능함을 확인할 수 있다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.

<110> KYUNGPOOK NATIONAL UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING BONE DISEASES <130> ADP-2021-0227 <150> KR 10-2020-0152482 <151> 2020-11-16 <160> 14 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ERR gamma <400> 1 gctaagtgcc agaattcaaa cca 23 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ERR gamma <400> 2 atcgactcct atggatcagg acttt 25 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> c-Fos <400> 3 aggcccagtg gctcagaga 19 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> c-Fos <400> 4 gctcccagtc tgctgcatag a 21 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NFATc1 <400> 5 accacctttc cgcaacca 18 <210> 6 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NFATc1 <400> 6 ttccgtttcc cgttgca 17 <210> 7 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRAP <400> 7 tccccaatgc cccattc 17 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRAP <400> 8 cggttctggc gatctctttg 20 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cathepsin K <400> 9 ggctgtggag gcggctat 18 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cathepsin K <400> 10 agagtcaatg cctccgttct g 21 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RANK <400> 11 tctgcagctc ttccatgaca ct 22 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RANK <400> 12 gaagaggagc agaacgatga gact 24 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> c-Fms <400> 13 cctgaatctc ccggaagca 19 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> c-Fms <400> 14 caagctcggt acaacggtag gt 22

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 골 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물:
<화학식 1>
제 1 항에 있어서,
상기 약학 조성물은,
에스트로겐 관련 수용체 감마(estrogen-related receptor gamma, ERRγ)의 단백질 함량을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 약학 조성물은,
파골세포의 형성 또는 분화를 억제하는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 약학 조성물은,
파골세포의 아폽토시스(apoptosis)를 촉진시키는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 골 질환은,
골다공증(osteoporosis), 골관절염(osteoarthritis), 골용해(osteolysis), 골괴사(osteronecrosis) 및 골소실(bone loss)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 골 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물:
<화학식 1>
제 6 항에 있어서,
상기 골 질환은,
골다공증(osteoporosis), 골관절염(osteoarthritis), 골용해(osteolysis), 골괴사(osteronecrosis) 및 골소실(bone loss)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 건강기능식품 조성물.
하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 파골세포 형성 또는 분화 억제용 시약 조성물:
<화학식 1>
시험관 내(in vitro)에서 골수 세포에 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 처리하는 단계를 포함하는 파골세포 형성 또는 분화 억제 방법:
<화학식 1>