KR101830222B1 - 포도 줄기 껍질로부터 분리된 레스베라트롤 유도체 화합물을 포함하는 항암제 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 포도(vitis vinifera) 줄기 껍질 추출물 및 이로부터 분리 정제된 레스베라트롤 화합물인 비티시놀 C(vitisinol C), 비티시놀 E(vitisinol E), 시스-비티신 A(cis-vitisin A), 비티신 B(vitisin B), 비티신 C(vitisin C) 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 어느 하나를 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 함유하는 항암제 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 조성물은 폐암, 난소암, 흑색종, 중추신경계종양, 결장암, 백혈병 등 각종 악성종양의 예방 및 치료제로 사용될 수 있다.

Description

포도 줄기 껍질로부터 분리된 레스베라트롤 유도체 화합물을 포함하는 항암제 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR TREATING CANCERS COMPRISING RESVERATROL DERIVATIVES ISOLATED FROM GRAPE STEM PEEL}

본 발명은 항암 효과를 갖는, 포도 줄기 껍질의 유기 용매 추출물 또는 이로부터 분리 정제된 활성물질인 비티시놀 C(vitisinol C), 비티시놀 E(vitisinol E), 시스-비티신 A(cis-vitisin A), 비티신 B(vitisin B), 또는 비티신 C(vitisin C)를 유효 성분으로 함유하는 항암제 조성물에 관한 것이다.

포도(Vitis vinifera)는 갈매나무목(Rhamnales), 포도과(Vitaceae)에 속하는 덩굴성 식물로 주로 열대 및 아열대 지방에서 자생하지만, 온대 지방에도 일부 분포하고 있다.

본 발명은 포도 중에서도 특히 포도 줄기가 가지는 효과에 주목한 것이다. 포도 줄기는 설사, 골절 손상, 황달 및 간염 등에 효과가 있을 뿐만 아니라, 항산화, 항암, 항균 작용 등의 효능이 있는 것으로 알려져 있다(Food Chem. 2006, 95, 18). 포도 줄기의 화학 성분으로는 레스베라트롤 유도체(resveratrol derivatives)로서 비티시놀(vitisinol), 비니페린(viniferin), 암펠롭신(ampelopsin), 비니페날(viniferal) 등이 보고되어 있다(Planta Med . 2009; 75: 537540).

본 발명은 레스베라트롤 유도체인 비티시놀 C, 비티시놀 E, 시스-비티신 A, 비티신 B, 비티신 C, 이들의 약학적으로 허용되는 염 및 이성체, 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물 또는 이를 포함하는 포도 줄기 껍질 추출물에 관한 것으로, 포도 줄기 껍질로부터 분리한 비티신 B와 비티신 C 등을 비롯한 레스베라트롤 테트라머(tetramer)와 레스베라트롤 다이머(dimer) 화합물들이 인간 암세포주들에 대하여 강력한 세포 증식 저해 효과를 나타내어 함암제로서 유용하다는 사실은 아직 보고된 바가 없다.

Food Chem. 2006, 95, 18 Planta Med. 2009; 75: 537540

본 발명의 목적은 천연물로부터 분리된 화합물을 포함하는 항암제 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 비티시놀 C, 비티시놀 E, 시스-비티신 A, 비티신 B, 비티신 C, 이들의 약학적으로 허용되는 염 및 이성체, 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물 또는 이를 포함하는 포도 줄기 껍질 추출물을 유효 성분으로 함유하는 암의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 인체 유래 암세포주에 대해 우수한 세포 성장 저해 효과를 나타내므로 각종 암의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 비티시놀 C, 비티시놀 E, 시스-비티신 A, 비티신 B, 비티신 C, 이들의 약학적으로 허용되는 염 및 이성체, 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물 또는 이를 포함하는 포도 줄기 껍질 추출물을 유효 성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물로서, A549(인간 폐암 세포주), SK-OV-3(인간 난소암 세포주), SK-MEL-2(인간 흑색종 세포주), 그리고 HCT-15(인간 결장암 세포주) 등의 인체 유래 암세포주들에 대하여 탁월한 세포증식 저해 효과를 나타낸다.

본 발명의 포도 줄기 껍질 추출물은 포도 줄기 껍질 또는 이의 건조물을 용매 추출함으로써 제조할 수 있다. 구체적으로는, 음건(陰乾)하여 세절한 포도 줄기 껍질에 포도 줄기 껍질 부피의 2 내지 200배, 바람직하게는 10 내지 30배의 유기 용매를 가하고, 10 내지 30℃에서 1 내지 20일간, 바람직하게는 5 내지 10일간 추출하고 여과한 후 감압 농축함으로써 포도 줄기 껍질 추출물을 제조할 수 있다. 이때, 추출용매로는 메탄올, 메탄올 수용액, 에탄올, 에탄올 수용액, 부탄올, 다이클로로메탄, 에틸아세테이트 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 용매를 사용할 수 있으며, 80 내지 100%의 메탄올 또는 메탄올 수용액이 바람직하다.

이와 같이 얻어진 포도 줄기 껍질 추출물을 부탄올, 다이클로로메탄 또는 에틸아세테이트로 재추출할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 에틸아세테이트로 재추출할 수 있다. 본 발명의 바람직한 일례에 따르면, 포도 줄기 껍질 또는 이의 건조물을 100% 메탄올을 사용하여 7일간 냉침시킨 후 여과하고 여액을 감압 농축하여 메탄올 추출물을 얻고, 이 메탄올 추출물을 증류수에 현탁한 후 동량의 다이클로로메탄으로 분획하여 분리한 물층을 동량의 에틸아세테이트로 추출하고 감압 농축함으로써 포도 줄기 껍질 추출물을 얻을 수 있다.

본 발명에서는, 포도 줄기 껍질 추출물로부터, 인체 유래 암세포주에 대한 세포 증식 저해 효과를 나타내는 특정 활성성분을 크로마토그래피(chromatography)에 의해 분리 및 정제할 수 있다. 상기 크로마토그래피는 역상 또는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 1회 이상 수행하는 것이 바람직 하다. 이동상으로는 다이클로로메탄/메탄올(50:1 ~ 1:1) 또는 메탄올/물(20% MeOH ~ 100% MeOH)을 사용할 수 있다. 이때, 사용하는 용매를 비극성에서 극성으로, 또는 극성에서 비극성으로 순차적으로 올려주는 농도 구배 용출 방식(gradient elution)으로 용출 분리하며, 수집된 분리물의 인체 유래 암세포주에 대한 세포 증식 저해 효과를 측정하여 원하는 활성 분획을 얻을 수 있다.

인체 유래 암세포주에 대한 세포 증식 저해 효과를 나타낸 활성 분획을 다시 크로마토그래피로 정제함으로써 인체 유래 암세포주에 대한 세포 증식 저해 효과를 나타내는, 하기 화학식 1의 비티시놀 C, 하기 화학식 2의 비티시놀 E, 하기 화학식 3의 시스-비티신 A, 하기 화학식 4의 비티신 B, 및 하기 화학식 5의 비티신 C를 얻을 수 있다. 또한, 필요에 따라, 상기 비티시놀 C, 비티시놀 E, 시스-비티신 A, 비티신 B, 및 비티신 C는 화학적으로 합성될 수 있다.

상기 약학적으로 허용되는 염은 예를 들어 염산염, 브롬화수소산염, 황산염, 인산염, 아세테이트, 말레이트, 푸마레이트, 락테이트, 타르트레이트, 시트레이트, 글루코네이트, 베실레이트 및 캄실레이트 등이 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 암의 종류로서는 폐암, 난소암, 흑색종, 중추신경계종양, 결장암, 백혈병 등을 들 수 있으며, 바람직하게는 폐암, 난소암, 흑색종, 및 결장암을 들 수 있다.

활성성분으로서 포도 줄기 껍질 추출물, 이로부터 분리된 비티시놀 C, 비티시놀 E, 시스-비티신 A, 비티신 B, 비티신 C 또는 이들의 혼합물을 통상적인 방법에 따라 약제학적으로 허용되는 적절한 담체 또는 부형제와 혼합하거나 희석제로 희석하여 상기한 기능을 갖는 약학 조성물을 제조할 수 있다.

적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리쓰리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 상기 약학 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 제형은 정제, 알약, 분말, 새세이(sachet), 엘릭서(elixir), 현탁액, 에멀젼, 용액, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말 등의 형태일 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 통상적인 1일 투여량은 유효 성분을 기준으로 할 때 포도 줄기 껍질 추출물은 10 내지 100 ㎎/㎏ 체중, 바람직하게는 10 내지 30 ㎎/㎏ 체중의 범위이고, 비티시놀 C, 비티시놀 E, 시스-비티신 A, 비티신 B, 또는 비티신 C 또는 이들의 혼합물은 1 내지 30 ㎎/㎏ 체중, 바람직하게는 1 내지 10 ㎎/㎏ 체중의 범위이며, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 활성성분의 실제 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중, 및 질환의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명에서는, 상기 포도 줄기 껍질 추출물, 또는 이로부터 분리된 활성 성분인 비티시놀 C, 비티시놀 E, 시스-비티신 A, 비티신 B 또는 비티신 C, 또는 이들의 혼합물을 포함하는, 각종 암세포의 성장을 저해함으로써 암을 예방하거나 완화시킬 수 있는 건강 증진용 식품 또는 음료 조성물을 제공한다.

상기 암세포로서는 바람직하게는 폐암 세포, 난소암 세포, 흑색종 세포 및 결장암 세포를 들 수 있다.

상기 효과를 나타내기 위하여 본 발명의 포도 줄기 껍질 추출물, 이로부터 분리된 활성 성분 또는 활성 성분의 혼합물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들면 각종 식품류, 음료수, 스넥류, 과자류, 껌류, 아이스크림류, 티백차, 인스턴트차, 과립, 향료, 비타민 복합제, 및 그 밖의 건강 보조 식품류 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 포도 줄기 껍질 추출물, 이로부터 분리된 활성 성분 또는 활성 성분의 혼합물을 식품 제조시 원료 물질에 첨가하거나 조리된 식품에 적절히 혼합하여 상기한 건강 증진용 식품 또는 음료를 제조할 수 있으며, 이 경우 최종적으로 제조된 식품 또는 음료 중에 포도 줄기 껍질 추출물, 이로부터 분리된 활성 성분 또는 활성 성분의 혼합물의 함량은 각각 0.01 내지 30 중량% 범위일 수 있다.

본 발명의 약학 조성물, 또는 건강 증진용 식품 또는 음료는 목적하는 효과를 상승시키거나 보완하기 위해 약학적으로 허용되는 다른 생약재 또는 이의 추출물을 추가로 포함할 수 있으며, 그러한 생약재의 대표적인 예로는 파고지, 희렴, 초두구, 연자육 및 정향피 등을 들 수 있다. 상기 생약재는 조성물의 총 중량을 기준으로 각각 0.01 내지 50 중량%의 양으로 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 한정하지는 않는다.

실시예

실시예 1: 포도 줄기 껍질 추출물의 제조 및 활성성분의 분리

건조된 포도 줄기 껍질 10 kg을 상온에서 메탄올 50 L에 일주일간 냉침시킨 후 여과하고 여액을 감압 농축하여 메탄올 추출물 708.8 g을 얻었다. 상기 메탄올 추출물을 증류수 10 L에 현탁시킨 후, 동량의 다이클로로메탄으로 분획하였다. 물층을 다시 동량의 에틸아세테이트로 재추출하고 추출액을 감압 농축하여 에틸아세테이트 재추출물 463.8 g을 얻었으며, 남은 물층을 동결 건조시켰다.

상기 에틸아세테이트 재추출물 463.8 g을, 다이클로로메탄/메탄올 혼합 용액을 이동상으로서 50 ml/분의 유속으로 흘려주면서 다이클로로메탄/메탄올의 혼합비를 50:1에서부터 1:1까지 순차적으로 올려주는 농도 구배 용출방식의 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography)를 실시하여 총 6개의 분획(제1분획 내지 제6분획)으로 나누었다. 이 중 제 2분획 및 3분획을 재차 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(이동상으로서 다이클로로메탄/메탄올 40:1 - 1:1, 유속 5 ml/분)를 실시하여 비티시놀 C(vitisinol C), 비티시놀 E(vitisinol E), 비티신 B(vitisin B), 비티신 C(vitisin C)를 분리하였다. 또한, 제 5분획을 재차 실리카겔 컬럼과 RP-18 컬럼 크로마토그래피 기법을 이용하여 시스-비티신 A(cis-vitisin A)를 분리하였다. 이들의 구조는 ¹H-NMR, ¹³C-NMR, MASS의 분광학적인 데이터와 문헌을 비교하여 구조를 확인하였다.

< 비티시놀 C>

¹H-NMR (300 MHz, acetone-d ₆) δ: 7.38 (2H, d, J=8.5 Hz, H-2b, 6b), 6.93 (1H, d, J=16.0 Hz, H-8a), 6.90 (2H, d, J=8.5 Hz, H-2a, 6a), 6.83 (2H, d, J=8.5 Hz, H-3b, 5b), 6.80 (1H, d, J=16.0 Hz, H-7a), 6.67 (2H, d, J=8.5 Hz, H-3a, 5a), 6.64 (1H, s, H-3), 6.16 (2H, d, J=2.0 Hz, H-2c, 6c), 6.13 (1H, m, H-4c), 3.21-3.00 (6H, m, H-1, 5, 6, 7).

¹³C-NMR (125 MHz, acetone-d ₆) δ: 201.7 (C-4), 159.2 (C-4a, 3c), 156.6 (C-5c), 155.2 (C-4b, 2), 148.8 (C-1c), 136.9 (C-1b), 135.6 (C-7a), 131.7 (C-3), 129.8 (C-2a, 6a), 129.5 (C-2b, 6b, 1a), 129.3 (C-8a), 116.5 (C-3a, 5a), 115.8 (C-3b, 5b), 107.2 (C-2c, 6c), 101.6 (C-4c), 52.6 (C-7), 50.5 (C-5), 46.5 (C-6), 34.7 (C-1).

< 비티시놀 E>

¹H-NMR (DMSO-d ₆, 500 MHz) δ: 7.30 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-2b), 6.98 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-8b), 6.85 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-2a, 6a), 6.72 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-3b, 5b), 6.61 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-7b), 6.59 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-3a, 5a), 6.34 (1H, s, H-10b), 5.92 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-12a), 5.89 (2H, d, J = 2.0 Hz, H-10a, 14a), 4.16 (1H, s, H-13b), 3.86 (1H, d, J = 11.0 Hz, H-8a), 3.69 (3H, s, COOMe), 3.15 (1H, dd, J = 11.0, 13.0 Hz, H-7a), 2.95 (1H, dd, J = 13.0, 17.7 Hz, H-12b-b), 2.27 (1H, d, J = 17.7 Hz, H-12b-a);

¹³C-NMR (DMSO-d ₆, 125 MHz) δ: 43.6 (C-7a), 47.9 (C-12b), 49.1 (C-13b), 51.6 (C-8a), 52.9 (OCH3), 100.8 (C-12a), 105.8 (C-10a, 14a), 115.0 (C-3a, 5a), 115.7 (C-3b, 5b), 127.2 (C-1b), 128.1 (C-2a,6a), 128.2 (C-8b), 128.9 (C-2b,6b), 130.3 (C-10b), 134.3 (C-7b), 134.6 (C-1a), 145.7 (C-9a), 148.0 (C-9b), 155.6 (C-4a), 158.0 (C-11a, 13a), 158.4 (C-4b), 172.7 (C-14b), 200.9(C=O).

< 시스 - 비티시놀 A>

¹H-NMR (300 MHz, 아세톤-d ₆) δ: 7.11 (2H, d, J = 8.8 Hz, H-2a, 6a), 7.10 (2H, d, J = 8.8 Hz, H-2c, 6c), 7.03 (2H, d, J = 8.1 Hz, H-2d, 6d), 6.83 (2H, d, J = 8.8 Hz, H-3a, 5a), 6.75 (2H, d, J = 8.8 Hz, H-3a, 5a), 6.67 (1H, dd, J = 8.1, 2.2 Hz, H-6b), 6.65 (2H, d, J = 8.1 Hz, H-3a, 5a), 6.52 (1H, d, J = 8.1 Hz, H-5b), 6.27 (1H, d, J = 2.2 Hz, H-12b), 6.19 (1H, t, J = 2.2 Hz, H-12a), 6.18 (1H, d, J = 2.2 Hz, H-14c), 6.17 (1H, d, J = 2.2 Hz, H-14b), 6.11 (1H, d, J = 2.2 Hz, H-12c), 6.10 (1H, d, J = 2.2 Hz, H-14d), 6.08 (1H, d, J = 2.2 Hz, H-12d), 6.02 (2H, d, J = 2.2 Hz, H-10a, 14a), 5.94 (1H, d, J = 2.2 Hz, H-2b), 5.81 (1H, d, J = 11.7 Hz, H-7c), 5.79 (1H, br s, H-7b), 5.79 (1H, br s, H-8b), 5.50 (1H, d, J = 3.7 Hz, H-8d), 5.34 (1H, d, J = 3.7 Hz, H-7d), 5.26 (1H, d, J = 5.1 Hz, H-7a), 4.22 (1H, d, J = 11.7 Hz, H-8c), 4.07 (1H, d, J = 5.1 Hz, H-8a).

¹³C-NMR (125 MHz, 아세톤-d ₆) δ: 133.7 (C-1a), 127.8 (C-2a, 6a), 116.0 (C-3a, 5a), 158.0 (C-4a), 93.7 (C-7a), 56.5 (C-9a), 147.1 (C-10a), 106.6 (C-10a, 14a), 159.5 (C-11a, 13a), 101.8 (C-12a), 128.4 (C-1b), 132.7 (C-2b), 132.5(C-3b), 154.3 (C-4b), 114.5 (C-5b), 127.1 (C-6b), 125.3 (C-7b), 132.0 (C-8b), 136.8 (C-9b), 119.85 (C-10b), 162.1 (C-11b), 96.4 (C-12b), 158.5 (C-13b), 109.0 (C-14b), 130.9 (C-1c), 129.9 (C-2c, 6c), 115.8 (C-3c, 5c), 158.4 (C-4c), 88.3 (C-7c), 49.3 (C-8c), 142.1 (C-9c), 120.5 (C-10c), 158.4 (C-11c), 100.9 (C-12c), 156.8 (C-13c), 104.8 (C-14c), 135.4 (C-1d), 128.7 (C-2d, 6d), 115.3 (C-3d, 5d), 155.8 (C-4d), 40.8 (C-7d), 41.2 (C-8d), 141.1 (C-9d), 119.94 (C-10d), 157.8 (C-11d), 96.0 (C-12d), 160.1 (C-13d), 110.1 (C-14d).

< 비티신 B>

¹H-NMR (300 MHz, 아세톤-d ₆) δ: 7.13 (2H, d, J = 8.4 Hz, H-2a, 6a), 6.76 (2H, d, J = 8.4 Hz, H-3a, 5a), 5.36 (1H, d, J = 6.2 Hz, H-7a), 4.33 (1H, d, J = 6.2 Hz, H-8a), 6.14 (2H, d, J = 1.5 Hz, H-10a, 14a), 6.13 (1H, t, J = 1.5 Hz, H-12a), 6.58 (2H, d, J = 8.8 Hz, H-2a, 6a), 6.52 (1H, d, J = 8.8 Hz, H-3b, 5b), 5.42 (1H, d, J = 5.1 Hz, H-7b), 4.25 (1H, d, J = 5.1 Hz, H-8b), 6.28 (1H, d, J = 2.2 Hz, H-12b), 6.09 (1H, d, J = 2.2 Hz, H-14b), 6.65 (1H, d, J = 1.8 Hz, H-2c), 6.68 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-5c), 6.98 (1H, dd, J = 8.4, 1.8 Hz, H-6c), 6.50 (1H, d, J = 16.5 Hz, H-7c), 6.68 (1H, d, J = 16.5 Hz, H-8b), 6.24 (1H, d, J = 1.8 Hz, H-12c), 6.58 (1H, br s, H-14c), 7.18 (2H, d, J = 8.8 Hz, H-2d, 6d), 6.82 (2H, d, J = 8.8 Hz, H-3d, 5d), 5.33 (1H, d, J = 4.8 Hz, H-7d), 4.36 (1H, d, J = 4.8 Hz, H-8d), 5.98 (2H, d, J = 2.2 Hz, H-10d, 14d), 6.06 (1H, t, J = 2.2 Hz, H-12d).

¹³C-NMR (125 MHz, 아세톤-d ₆) δ: 133.9 (C-1a), 128.2 (C-2a, 6a), 116.3 (C-3a, 5a), 158.5 (C-4a), 94.8 (C-7a), 58.2 (C-9a), 147.2 (C-10a), 107.5 (C-10a, 14a), 160.0 (C-11a, 13a), 102.3 (C-12a), 132.7 (C-1b), 127.8 (C-2b, 6b), 116.0 (C-3b, 5b), 158.0 (C-4b), 92.2 (C-7b), 53.0 (C-8b), 142.5 (C-9b), 120.0 (C-10b), 162.7 (C-11b), 96.7 (C-12b), 160.5 (C-13b), 107.5 (C-14b), 132.7 (C-1c), 125.5 (C-2c), 132.3 (C-3c), 160.2 (C-4c), 110.7 (C-5c), 126.8 (C-6c), 124.2 (C-7c), 130.5 (C-8c), 136.8 (C-9c), 120.1 (C-10c), 162.8 (C-11c), 96.9 (C-12c), 159.6 (C-13c), 104.6 (C-14c), 134.6 (C-1d), 127.8 (C-2d, 6d), 116.5 (C-3d, 5d), 158.3 (C-4d), 94.7 (C-7d), 57.9 (C-8d), 147.7 (C-9d), 107.0 (C-10d, 14d), 160.1 (C-11d, 13d), 102.5 (C-12d).

< 비티신 C>

¹H-NMR (300 MHz, 아세톤-d ₆) δ: 6.94 (2H, d, J = 8.8 Hz, H-2a, 6a), 6.74 (2H, d, J = 8.8 Hz, H-3a, 5a), 5.19 (1H, d, J = 4.9 Hz, H-7a), 3.60 (1H, d, J = 4.9 Hz, H-8a), 5.87 (2H, d, J = 2.4 Hz, H-10a, 14a), 6.10 (1H, t, J = 2.4 Hz, H-12a), 6.98 (2H, d, J = 8.8 Hz, H-2b, 6b), 6.66 (2H, d, J = 8.8 Hz, H-3b, 5b), 5.18 (1H, d, J = 9.8 Hz, H-7b), 4.27 (1H, d, J = 9.8 Hz, H-8b), 6.25 (1H, d, J = 2.4 Hz, H-12b), 6.13 (1H, d, J = 2.4 Hz, H-14b), 6.60 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2c), 6.64 (1H, d, J = 8.3 Hz, H-5c), 6.99 (1H, dd, J = 8.3, 2.0 Hz, H-6c), 6.55 (1H, d, J = 16.1 Hz, H-10a, 7c), 6.74 (1H, d, J = 16.1 Hz, H-8c), 6.25 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-12c), 6.60 (1H, d, 2.0 Hz, H-14c), 7.14 (2H, d, 8.8 Hz, H-2d, 6d), 6.76 (2H, d, J = 8.8 Hz, H-3d, 5d), 5.35 (1H, d, J = 5.9 Hz, H-7d), 4.36 (1H, d, J = 5.9 Hz, H-8d), 6.14 (2H, d, J = 2.4 Hz, H-10d, 14d), 6.17 (1H, t, J = 2.4 Hz, H-12d).

¹³C (125MHz, 아세톤-d ₆) δ: 134.0 (C-1a), 128.1 (C-2a, 6a), 116.3 (C-3a, 5a), 158.4 (C-4a), 94.5 (C-7a), 56.9 (C-8a), 147.7 (C-9a),107.2 (C-10a, 14a), 159.9 (C-11a, 13a), 102.2 (C-12a), 132.2 (C-1b), 128.7 (C-2b, 6b), 116.4 (C-3b, 5b), 158.8 (C-4b), 95.0 (C-7b), 55.2 (C-8b), 140.7 (C-9b), 121.9 (C-10b), 162.6 (C-11b), 96.9 (C-12b), 160.4 (C-13b), 108.2 (C-14b), 132.3 (C-1c), 125.8 (C-2c), 131.6 (C-3c), 161.1 (C-4c), 110.4 (C-5c), 126.6 (C-6c), 124.3 (C-7c), 130.7 (C-8c), 137.0 (C-9c), 119.9 (C-10c), 162.8 (C-11c), 96.9 (C-12c), 159.7 (C-13c), 105.0 (C-14c), 134.0 (C-1d), 128.2 (C-2d, 6d), 116.3 (C-3d, 5d), 158.5 (C-4d), 94.8 (C-7d), 58.2 (C-8d), 147.5 (C-9d), 107.4 (C-10d, 14d), 160.0 (C-11d, 13d), 102.2 (C-12d).

시험예 1: 포도 줄기 껍질 추출물 및 이로부터 분리된 활성성분들의 인체 유래 암세포주에 대한 세포 증식 저해 효과 시험

상기 실시예 1에서 얻은, 포도 줄기 껍질의 메탄올 추출물 및 에틸아세테이트 재추출물, 비티시놀 C, 비티시놀 E, 시스-비티신 A, 비티신 B, 또는 비티신 C 각각의 인체 유래 암세포주에 대한 세포 증식 저해 효과를 측정하였다.

A549(인간 폐암 세포주), SK-OV-3(인간 난소암 세포주), SK-MEL-2(인간 흑색종 세포주), 및 HCT-15(인간 결장암 세포주) 등 4종의 인체 유래 암세포주를 미국 NCI(국립암연구센터)로부터 분양받아 계대배양하여 사용하였으며, 암세포 증식 저해효과는 미국 NCI 및 기타 여러 검정기관에서 약물의 일차적 항암 효과의 측정방법으로 가장 널리 사용하는 SRB(sulfrhodamine B) 방법(Skehan, P. et al., (1990) J. Natl . Cancer . Inst., 82, 1107)에 준하여 다음과 같이 측정하였다.

1) 계대 중의 암세포들을 트립신-CDTA 용액으로 처리하여 용기 부착면으로부터 분리시키고, 96-웰 편평 바닥 마이크로 플레이트(Falcon사제)에 각 웰당 세포수가 각각 5×10³(A549, HCT-15), 1×10⁴(SK-MEL-2) 및 2×10⁴(SKOV-3)이 되도록 희석하여 분주하였다. 이들을 CO₂ 배양기속에서 24시간 배양하여 세포가 웰의 바닥면에 부착(anchor)되도록 한 후 흡입기로 배지를 제거하고 배지에 녹여둔 검체를 농도별로 각각의 웰속에 넣어주고 48 시간동안 계속 배양하였다.

2) 48시간 동안의 배양을 마친 후 각 웰속의 배지를 흡입 제거하고 10% 트리클로로아세트산(TCA) 용액을 각 웰당 10 ㎕씩 가하고 1 시간동안 상온에서 방치하여 세포들을 고정시킨 다음 물로 5-6회 세척하여 과잉의 TCA 용액을 완전히 제거하고 건조시켰다.

3) 각 웰당 100 ㎕씩의 SRB 염색 용액(1% 아세트산 중의 0.4% 설포로다민)을 가하여 30분간 염색하고 과잉의 염색액은 1% 아세트산으로 5 내지 6회 반복 세척하여 제거한 후 상온에서 건조시켰다.

4) 각 웰당 100 ㎕씩의 10 mM 트리스마 염기(Trisma base (unbuffered)) 용액을 가한 후 타이터 플레이트 진탕기(titerplate shaker)로 10분간 진탕하여 세포에 염색된 염색액을 용출시키고 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 520 nm에서의 흡광도 값(absorbance)을 측정하였다.

5) 검체용액을 넣어준 검체군의 암세포 증식율(% cell growth, 항암활성 의 역)은 다음 수식에 따라 산출하였다. 즉 검체용액 대신 동량의 배지를 넣어준 대조군의 세포수(C)와 0 시간(zero time)의 세포수(Tz) 및 검체군의 세포수(T)를 각각 각군의 흡광도 값으로부터 환산하였다. 검체군의 암세포 증식율(% cell growth)이 Tz>T인 경우에는 수학식 1로, Tz<T인 경우에는 수학식 2로 계산하였다

[수학식 1]

[수학식 2]

6) 각각의 농도에서 측정한 검체군의 암세포 증식율을 바탕으로하여 로터스(LOTUS) 프로그램의 데이터 회귀(data regression)를 사용하여 검체가 해당 암세포의 증식을 50% 저해하는 농도(ED₅₀)를 계산하였다.

그 결과 얻어진 각 암세포주에 대한 50% 증식저해 농도(ED₅₀)를 표 1에 나타내었으며 대조약물로는 현재 임상에서 널리 쓰이고 있는 에토포시드(etoposide)를 사용하였다.

표 1의 결과와 같이, 포도 줄기 껍질의 메탄올 추출물 및 에틸아세테이트 재추출물, 이로부터 분리정제된 비티시놀 C, 비티시놀 E, 시스-비티신 A, 비티신 B, 또는 비티신 C는 모두 인체 유래 암세포주에 대하여 농도 의존적으로 세포 성장을 저해하고 있어 각종 암의 예방 및 치료 효과를 기대할 수 있다.

제제 실시예

제제화를 위해, 실시예 1에서 얻어진 포도 줄기 껍질의 추출물을 그대로 또는 건조시켜 사용하였다.

< 제조예 1> 산제

하기 성분을 혼합한 후 통상의 산제 제조 방법에 따라서 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다:

포도 줄기 껍질 건조 추출물

또는 이로부터 분리정제된 활성성분 2 g

유당 1 g

< 제조예 2> 정제

하기 성분을 혼합한 후 통상의 정제 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다:

포도 줄기 껍질 건조 추출물

또는 이로부터 분리정제된 활성성분 100 ㎎

옥수수 전분 100 ㎎

유당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

< 제조예 3> 캡슐제

하기 성분을 혼합한 후 통상의 캡슐제 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다:

포도 줄기 껍질 건조 추출물

또는 이로부터 분리정제된 활성성분 100 ㎎

옥수수 전분 100 ㎎

유당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

< 제조예 4> 주사제

통상의 주사제 제조방법에 따라 활성성분을 주사용 증류수에 용해하고 pH를 약 7.5로 조절한 다음 하기 나머지 성분 전체를 주사용 증류수로 2 ㎖ 용량의 앰플에 충진하고 멸균시켜서 주사제를 제조하였다:

포도 줄기 껍질 건조 추출물

또는 이로부터 분리정제된 활성성분 100 ㎎

주사용 증류수 적량

pH 조절제 적량

< 제조예 5> 선식

현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 만들었다. 검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 만들었다.

본 발명의 포도 줄기 껍질 추출물을 진공 농축기에서 감압 농축하고, 분무 열풍건조기로 건조하여 얻은 건조물을 분쇄기로 입도 60 메쉬로 분쇄하여 포도 줄기 껍질 추출물 건조 분말을 얻었다.

상기에서 제조한 곡물류, 종실류 및 포도 줄기 껍질 추출물의 건조 분말을 다음의 비율로 배합하여 과립을 만들었다.

곡물류 : 현미 30 중량%, 율무 15 중량%, 보리 20 중량%, 찹쌀 9 중량%,

종실류 : 들깨 7 중량%, 검정콩 8 중량%, 검정깨 7 중량%,

포도 줄기 껍질 추출물 건조 분말 3 중량%, 영지 0.5 중량%, 지황 0.5 중량%

< 제조예 6> 츄잉껌

껌 베이스 20 중량%, 설탕 76.9 중량%, 향료 1 중량% 및 물 2 중량%와 본 발명의 포도 줄기 껍질 추출물 0.1 중량%를 배합하여 통상의 방법으로 츄잉껌을 제조하였다.

< 제조예 7> 캔디

설탕 60 중량%, 물엿 39.8 중량% 및 향료 0.1 중량%와 본 발명의 포도 줄기 껍질 추출물 0.1 중량%를 배합하여 통상의 방법으로 캔디를 제조하였다.

< 제조예 8> 비스켓

박력 1급 25.59 중량%, 중력 1급 22.22 중량%, 정백당 4.80 중량%, 식염 0.73 중량%, 포도당 0.78 중량%, 팜쇼트닝 11.78 중량%, 암모늄 1.54 중량%, 중조 0.17 중량%, 중아황산나트륨 0.16 중량%, 쌀가루 1.45 중량%, 비타민 B₁0.0001 중량%, 비타민 B₂0.0001 중량%, 밀크향 0.04 중량%, 물 20.6998 중량%, 전지분유 1.16 중량%, 대용분유 0.29 중량%, 제1인산칼슘 0.03 중량%, 살포염 0.29 중량% 및 분무유 7.27 중량%와 본 발명의 포도 줄기 껍질 추출물 1 중량%를 배합하여 통상의 방법으로 비스켓을 제조하였다.

< 제조예 9> 건강 음료

꿀 0.26 중량%, 치옥토산아미드 0.0002 중량%, 니코틴산아미드 0.0004 중량%, 염산리보플라빈나트륨 0.0001 중량%, 염산피리독신 0.0001 중량%, 이노시톨 0.001 중량%, 오르트산 0.002 중량% 및 물 98.7362 중량%와 본 발명의 포도 줄기 껍질 추출물 1 중량%를 배합하여 통상의 방법으로 건강 음료를 제조하였다.

< 제조예 10> 건강보조식품

스피루리나 55 중량%, 구아검효소 분해물 10 중량%, 비타민 B₁염산염 0.01 중량%, 비타민 B6 염산염 0.01 중량%, DL-메티오닌 0.23 중량%, 스테아린산 마그네슘 0.7 중량%, 유당 22.2 중량% 및 옥수수전분 1.85 중량%와 본 발명의 포도 줄기 껍질 추출물 10 중량%를 배합하여 통상의 방법으로 정제형 건강보조식품을 제조하였다.

Claims (8)

1. 비티시놀 C(vitisinol C), 비티시놀 E(vitisinol E), 시스-비티신 A(cis-vitisin A), 비티신 B(vitisin B) 및 비티신 C(vitisin C)를 포함하는 포도 줄기 껍질 추출물을 유효 성분으로 함유하는 암 치료용 약학 조성물에 있어서,
   상기 암은 폐암, 난소암, 흑색종, 또는 결장암인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
   
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 포도 줄기 껍질 추출물이 포도 껍질을 메탄올, 메탄올 수용액, 에탄올, 에탄올 수용액, 부탄올, 다이클로로메탄, 에틸아세테이트 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 유기 용매로 추출하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
   
3. 삭제
4. 비티시놀 C, 비티시놀 E, 시스-비티신 A, 비티신 B 및 비티신 C를 포함하는 포도 줄기 껍질 추출물을 유효성분으로 함유하며 암세포 성장 저해효능을 가진 건강 증진용 식품에 있어서,
   상기 암세포는 폐암 세포, 난소암 세포, 흑색종 세포, 또는 결장암 세포인 것을 특징으로 하는 건강 증진용 식품.
   
5. 제 4 항에 있어서,
   상기 식품이 음료의 형태인 것을 특징으로 하는 건강 증진용 식품.
   
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제