DE69631975T2

DE69631975T2 - Discodermolide verbindungen und deren pharmazeutische zusammensetzungen zur krebstherapie

Info

Publication number: DE69631975T2
Application number: DE69631975T
Authority: DE
Inventors: E. Ross LONGLEY; P. Sarath GUNASEKERA; Shirley Pomponi
Original assignee: Harbor Branch Oceanographic Institution Inc
Current assignee: Harbor Branch Oceanographic Institution Inc
Priority date: 1995-12-05
Filing date: 1996-12-05
Publication date: 2005-01-20
Anticipated expiration: 2016-12-06
Also published as: JP2000501710A; EP0873332B1; DK0873332T3; CA2233716A1; WO1997020835A1; CA2233716C; DE69631975D1; EP0873332A1; ATE262515T1; US5681847A; ES2218608T3; PT873332E; JP3293833B2; US5840750A

Description

Die Erfindung betrifft organische Verbindungen und Zusmmanensetzungen, die brauchbare therapeutische Eigenschaften haben. Genauer gesagt betrifft die Erfindung neue Lactonverbindungen mit immunmodulatorischen Aktivitäten und Antitumoraktivitäten, pharmazeutische Zusammensetzungen, die solche Verbindungen enthalten, Verfahren zur Herstellung der neuen Verbindungen und Zusmmensetzungen und die Verwendung einer Discodermolidverbindung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines Menschen, der eine bestimmte Krebsart aufweist.
Hintergrund der Erfindung
In der Vergangenheit wurde ein beträchtliches Maß an Forschung und Ressourcen der Onkologie und Antitumormaßnahmen, einschließlich der Chemotherapie gewidmet. Während bestimmte Verfahren und chemische Zusammensetzungen entwickelt wurden, die bei der Hemmung, Remission oder Kontrolle des Wachstums von Tumoren helfen, werden neue Verfahren und chemische Antitumorzusammensetzungen benötigt.
Bei der Suche nach neuen biologisch aktiven Verbindungen wurde festgestellt, dass einige natürliche Produkte und Organismen potentielle Quellen für chemische Moleküle mit einer brauchbaren biologischen Aktivität und großer Diversität sind. Beispielsweise ist das Diterpen, das herkömmlich als Taxol bekannt ist und aus mehreren Arten des Eibenbaums isoliert wird, ein mitotisches Spindelgift, das die Mikrotubuli stabilisiert und ihre Depolymerisation in freies Tubulin hemmt (D.A. Fuchs, R.K. Johnson [1978] Cancer Treat. Rep. 62: 1219-1222, P.B. Schiff, J. Fant, S.B. Horwitz [1979] Nature (London) 22: 665-667). Von Taxol ist auch bekannt, dass es eine Antitumoraktivität aufweist und mehreren klinischen Studien unterzogen wurde, die dessen Wirksamkeit bei der Behandlung einer großen Vielzahl an Krebsarten gezeigt haben (E.K. Rowinski, R.C. Donehower (1995] N. Engl. J. Med. 332: 1004-1014). Siehe beispielsweise US 5 157 049 A , US 4 960 790 A und US 4 206 221 A .
Marine Schwämme haben sich auch als Quelle von biologisch aktiven chemischen Molekülen herausgestellt. Es wurden mehrere Publikationen herausgegeben, die organische Verbindungen beschreiben, die sich von marinen Schwämmen ableiten, einschließlich P.J. Scheuer (Herausgeber) Marine Natural Products, Chemical and Biological Perspectives, Academic Press, New York, 1978-1983, Band I-V, D. Uemura, K. Takahashi, T. Yamamoto, C. Katayama, J. Tanaka, Y. Okumura, Y, Hirata (1985), J. Am. Chem. Soc. 107; 4796-4798, L. Mingle et al., (1976) Fortschr. Chem. Org. Naturst. 33: 1-72, D.J. Faulkner (1987) Natural Products Reports 4: 539-576 und die hierin angegebenen Literaturangaben.
Die vorliegende Erfindung hat zum Fundus der Antitumorverbindungen durch die Auffindung neuer Klassen an organischen Verbindungen beigetragen, die unter anderem brauchbare Tubulin-polymerisierende Aktivitäten und Antitumoraktivitäten aufweisen. Diese Verbindungen können aus Extrakten des marinen Schwamms Discodermia dissoluta isoliert werden. Siehe beispielsweise US 4 939 168 A und US 5 010 099 A . Zusätzlich können diese Verbindungen durch bekannte Verfahen der organischen Chemie synthetisiert werden, die vom Fachmann leicht verstanden werden. J.B. Nerenberg et al., (1993), J. Amer. Chem. Soc. 115: 12621-12622.
Ein Hauptziel der Erfindung ist die Bereitstellung von neuen Zusammensetzungen an biologisch aktiven Lactonverbindungen, die vorteillhfterweise zur Behandlung von Krebs verwendet werden können. Genauer gesagt können die neuen Zusammensetzungen und Verwendungen vorteilhafterweise bei der Behandlung eines Patienten brauchbar sein, der Krebszellen beherbergt, wobei sie beispielsweise das Wachstum der Tumorzellen in einem Säugerwirt hemmen. Genauer gesagt können die vorliegenden Verbindungen, die hierin als Discodermolide bezeichnet werden, und Zusammensetzungen, die die Discodermolide enthalten, zur Hemmung des Wachstums von Tumorzel len, einschließlich Zellen von Tumoren der Brust, des Colons, des ZNS oder der Lunge in einem Menschen, wie auch von humanen Leukämie- oder Melanomzellen verwendet werden. Es ist verständlich, dass der Mechanismus zur Erreichung der Antikrebsaktivität durch die vorliegenden Verbindungen einen Fachmann dazu führen würde, die Anwendbarkeit der vorliegenden Verbindungen, Zusammensetzungen und Verwendungen in Bezug auf zusätzliche Krebsarten zu erkennen, wie dies hierin beschrieben ist.
Gemäß der Erfindung umfassen Verfahren zur Hemmung von Tumoren in einem Wirt das Zusammenbringen von Tumorzellen mit einer wirksamen Menge der neuen pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung. Die durch die Erfindung gehemmten Tumorzellen sind die, die gegenüber den vorliegenden hierin beschriebenen Verbindungen oder diese Verbindungen enthalten Zusammensetzungen empfindlich sind.
Ein zusätzliches Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung von Verfahren zur Herstellung der neuen Verbindungen und Zusammensetzungen.
Andere Ziele und weitere Anwendungsmöglichkeiten der vorliegenden Erfindung werden aus der hierin bereitgestellten Beschreibung deutlich, wobei jedoch verständlich sein sollte, dass die detaillierten Beschreibungen nur zur Erläuterung angegeben werden, wobei sie die bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung beschreiben und verschiedene Veränderungen und Modifikationen innerhalb des Geists und des Schutzumfangs der Erfindung aus den Beschreibungen deutlich werden.
Kurze Beschreibung der Zeihnungen
Die 1A–1C zeigen antiproliferative Wirkungen, die durch GI₅₀, TGI und LC₅₀ der Discodermolide gegen eine Vielzahl an humanen Tumorzellen gemessen werden.
Die 2A–2C zeigen die Wirkung der Discodermolide auf die humanen GI-101A Brusttumorzellen gemäß der vorliegenden Erfindung.
Die 3A–3C zeigen die Wirkung von Discodermoliden auf humane A549 Lungenzellen gemäß der vorliegenden Erfindung.
Die 4A–4C zeigen die Wirkung der Discodermolide auf humane Jurkat Leukämiezellen.
Die 5 zeigt die Wirkung der Discodermolide (im Vergleich zu Taxol) auf die Tubulinpolymerisation gemäß der vorliegenden Erfindung.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer Discodermolidverbindung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines Patienten, der Krebszellen trägt, die dadurch gekennzeichnet ist, dass der Patient ein Mensch ist und der Krebs aus Lungenkrebs, Colonkrebs, ZNS Krebs, Melanom, Ovarkrebs, Nierenkrebs, Prostatakrebs und Brustkrebs ausgewählt ist.
In einer Ausführungsform der Erfindung werden die Ziele der Erfindung durch die Bereitstellung der biologisch aktiven Verbindungen erreicht, die eine Struktur gemäß der folgenden Formel (I) haben:

worin
R für -H, -A, -CH₂-Q, -COA oder -COZ steht,
A für Niederalkyl steht,
Z für monocyclisches Aryl stelit,
Q für Phenyl, Tolyl oder Xylyl stelit,
X für -H, -A, -Z oder -CH₂-Z stelit, und
Y für -H, -A, -Z, -CH₂-Z, -COA oder -COZ stelit,
und Säureadditionsalze hiervon.

Verbindungen, die Varianten der Struktur (I) sind, wurden auch aufgefunden und können die Octahydro-, Tetrahydro- und 23-24-Dihydroderivate der Verbindungen gemäß der obigen Formel umfassen. Die Verbindungen können ein einzelnes geometrisches Isomer oder Gemische hiervon sein (E oder Z Isomer). Diese Variantenverbindungen haben weniger Doppelbindungen im Rückgrad der Kohlenstoffkette. Es ist gut bekannt, dass die Doppelbindungen im Rückgrad der Kohlenstoffkette der Struktur (I) selektiv unter Bildung von beispielsweise Tetrahydro- oder Dihydroverbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung gesättigt werden. Bestmmte Strukturen sind im folgenden als Formeln (II) und (III) gezeigt

worin
R für -H, -A, -CH₂-Q, -COA oder -COZ stelit,
A für Niederalkyl steht,
Z für monocyclisches Aryl steht, Q für Phenyl, Tolyl oder Xylyl steht,
X für -H, -A, -Z oder -CH₂-Z steht, und
Y für -H, -A, -Z, -CH₂-Z, -COA oder -COZ stelit, und Säureadditionsalze hiervon.

Es können verschiedene Enantiomere der oben definierten Discodermolide vom Fachmann synthetisiert werden. Das natürliche aus marinen Schwämmen isolierte Discodermolid ist vorwiegend das (+)-Enantiomer.
Bevorzugte Verbindungen der Erfindung werden durch die folgende Formel dargestellt
worin R für -H, -OOOH₃ oder -CH₃ steht.
In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung sind die Verbindungen im wesentlichen rein, das heißt enthalten mindestens 95 % der Verbindung, wie dies durch etablierte analytische Verfahren bestimmt wird. In den am meisten bevorzugten Ausführungen der Verbindungen der Formeln (IV), (V) und (VI) stelit R für H.
Die Lactonverbindungen der vorliegenden Erfindung und Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen oder von Zusammensetzungen, die diese Verbindungen enthalten, sind in US 4 939 168 A und US 5 010 099 A beschrieben, die hiermit eingeführt sind.
Discodermolide können aus dein marinen Schwamm Discodermia dissoluta isoliert werden, den man beim Tauchen in Lucay, Grand Bahama Island in einer Tiefe von 33 Metern findet.
Discodermia dissoluta Schmidt, 1880 (Die Spongien des Meerbusens von Mexico (und des Caraibischen Meeres, III Abt. Tetractinelliden, Manactinelliden und Anhang, II Heft, G. Fischer, Jena, Seiten 35-90) ist ein amorpher bis gelappter Schwamm mit einem Durchmesser von 4 cm und einer Dicke bis zu 7 cm, einem dunkelbraunen Äußeren und einem cremefarbenen Inneren. Die Konsistenz ist fest aber komprimierbar. Die anderen Proben sind neue, nicht benannte Species. Discodermia sp. IA ist eine Ansammlung an Röhren mit einer Höhe von bis zu 15 cm, die an der Basis verbunden sind. Die Schwämme sind weiß oder pink-weiß und sind fest , aber leicht komprimierbar. Discodermia sp. IV ist eine unregelmäßige, gestielte, flache Schale mit einem Durchmesser von 5–10 cm und einer Höhe von 3–5 cm. Die Schwämme sind creme bis gelb und die Konsistenz ist fest und nicht komprimierbar. Für eine vollständige Beschreibung dieser Proben siehe M. Kelly-Borges, E. V. Robinson, S.P. Gunasekera, M. Gunasekera, N.K. Gulavita und S.A. Pomponi, 1994, Species differentiation in the marine sponge genus Discodermia (Demospongiae: Lithistida): The utility of ethanol extract profiles as species-specific chemotaxonomic markers, Biochemical Systematics and Ecology, 22(4): 353-365. Alle hierin zitierten Proben mit HBOM Katalognummern sind beim Harbor Branch Oceanographic Museum, Fort Pierce, Floida hinterlegt. Alle Proben sind in 70 % Ethanol mit einer erwarteten Haltbarkeit von mindestens 30 Jahren hinterlegt und für den Fachmann für taxonomische Identifizierungszwecke zugänglich.
In bevorzugten Ausführungsformen zur Herstellung der neuen Verbindungen durch Extraktion aus marinen Schwämmen usw., können geeignete organische Lösemittelsysteme zur Extraktion ausgewählt werden aus Methanol, Ethylacetat, Toluol, Heptan, Hexan, Isooctan, Aceton, Benzol, Diethylether, t-Butylmethylether, Ethanol, Isopropanol, 1,2-Dichlorethan und speziell Chloroform und Dichlormethan. Gemische aus zwei oder mehrerer solcher Lösemittel in verschiedenen Verhältnissen und Kombinationen sind vorteilhaft.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden durch verschiedene Fraktionierungs- und Chromatographietechniken aus den wie beschrieben erhaltenen Extrakten isoliert. Bevorzugte Isolierungsverfahren umfassen verschiedene Chromatographietechniken, beispielsweise Gegenstromchromatograpie mit geeigneten Säulen einschließlich Mehrschichtplanarschlangensäulen. Es ist eine Vielzahl an Lösemitteln zur Verwendung als einzelne oder gemischte Eluenten erhältlich, wie Methylenchlorid, Methanol, Ethylacetat, Acetonitril, n-Propanol, n- Butanol, Wasser und äquivalente Lösemittel. Weitere Reinigungen mittels solcher Verfahren können auch mit den gewonnenen Extraktionen ausgeführt werden. Bevorzugte Isolierungstechniken für eine weitere Reinigung umfassen chromatographische Operationen, wie Hochdruckflüssigchromatographie mit geeigneten Säulen mit einem geeigneten Lösemittel, insbesondere Methylenchlorid / Methanol oder Methanol / Wasser Gemischen.
Modifikationen der neuen Discodermolidverbindung können leicht durch den Fachmann ausgeführt werden.
Mit der Kenntnis der Verbindungen der vorliegenden Erfindung und ihrer Strukturen können Chemiker bekannte Verfahren zur Synthese dieser Verbinduugen aus verfügbaren Substraten verwenden. Beispielsweise sind Syntheseverfahren zur Herstellung von bestimmten Verbindungen in Nerenberg et al., obige Literaturstelle beschrieben.
In weiter bevorzugten Verfahren der Erfindung werden neue Salze innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung durch die Zugabe von Mineralsäuren, beispielsweise HCl, H₂SO₄ usw. oder starken organischen Säuren, beispielsweise Ameisensäure, Oxalsäure usw. in geeigneten Mengen unter Bildung des Säureadditionssalzes der Ausgangsverbindung oder deren Derivat hergestellt. Es können auch Synthesereaktionen anschließend an bekannte Verfahren verwendet werden, um verschiedene Gruppen in den bevorzugten Verbindungen unter Bildung von anderen Verbindungen innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung anzufügen oder zu modifizieren.
Der Schutzumfang der Erfindung ist nicht durch die bestimmten Beispiele und angegebenen Verfahren und Verwendungen beschränkt, da Modifikationen innerhalb des Umfangs aus der hierin in der Beschreibung angegebenen Information durch den Fachmann ausgeführt werden können.
Wie in der Beschreibung verwendet beziehen sich die Ausdrücke "Analoga", "Varianten" und "Derivate" auf Verbindungen, die im wesentlichen dieselben sind, wie eine andere Verbindung, die aber beispielsweise durch die Anfügung von zusätzlichen Aminosäuren oder Seitengruppen modifiziert wurden. Die Ausdrücke "Analoga", "Varianten" und "Derivate", wie sie in der Beschreibung verwendet werden können sich auch auf Verbindungen beziehen, die im wesentlichen dieselben sind, wie eine andere Verbindung, die aber atomare oder molekulare Substitutionen an bestimmten Stellen in der Verbindung aufweisen.
Wie beschrieben umfasst eine bevorzugte Ausführungsform der Discodermolidverbindungen die in den Strukturen (IV), (V) und (VI) gezeigte Struktur, worin R für H steht.. Jedoch können Analoga oder Derivate dieser bevorzugten Ausführungsform leicht mittels bekannter Standardreaktionen hergestellt werden. Diese Standardreaktionen sind unter anderem Hydrierungs-, Methylierungs-, Acetylierungs- und Ansäuerungsreaktionen.
Ein Beispiel für ein Analogon, das gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt werden kann, ist Octahydrodiscodermolid. Um diese Verbindung herzustellen wird Discodermolid (2,0 mg) in EtOH (4,0 ml) mit einer katalytischen Menge an Pt-(IV)-oxid behandelt und unter Ballondruck bei Raumtemperatur für 14 Stunden hydriert. Das Produkt wird filtriert und unter verringertem Druck in einem Rotationsverdampfer konzentriert, der bei Raumtemperatur gehalten wird, um ein Gemisch an hydrierten Produkten zu erhalten. Das rohe Gemisch wird durch HPLC (SiO₂, 5 μm, 250 × 10 mm, 3,5 % MeOH / CN₂Cl₂) unter Bildung von reinem Octahydrodiscodermolid 20SG721 und dessen C₁₄ Epimers 20SG724 aufgetrennt. Die Ausbeute für 20SG721 beträgt 0,1 mg, während die Ausbeute für 20SG724 0,7 mg beträgt.
20SG721 und 20SG724 (Octahydrodiscodermolid) Octahydrodiscodermolid (zwei C₁₄ Epimere, 20SG721 und 20SG724): Weiße Feststoffe, Molekularformel C₃₃H₆₃NO₈ ¹H NMR (CDCl₃ und 10 % CD₃OD): δ 4,58 (1H, dt, J = 1,3, 8,8 Hz, H5), 4,54 (1H, dd, J = 8,5, 2,6 Hz, H19), 3,90 (1H, M, H7), 3,63 (1H, t, J= 3,5, H3), 3,21 (1H, dd, J= 7,4, 3,8 Hz, H17), 3,09 (1H, dd, J = 8,6, 2,7 Hz, H11), 2,64 (1H, m, H20), 1,85-1,60 (CH und CH₂ Gruppen), 1,26 (3H, d, J = 7,6 Hz, CH₃), 1,25–1,05 (CH und CH₂ Gruppen), 1,01 (3H, d, J = 6,8 Hz, CH₃), 0,92 (3H, d, J = 6,6 Hz, CH₃), 0,83 (3H, t, J = 7,3 Hz, H24), 0,83 (6H, d , J = 7,2 Hz, 2 × CH₃), 0,82 (3H, J = 7,0 Hz, CH₃), 0,81 (3H, d, J = 7,2 Hz, CH₃), 0,76 (3H, d, J = 6,6 Hz, HC₃). ¹³C NMR δ 174,8 (s), 157,8 (s), 79,8 (d), 79,3 (d), 77,5 (d), 77,4 (d), 73,0 (d), 67,5 (d), 43,1 (d), 40,9 (t), 40,7 (t), 36,9 (d), 35,9 (d), 35,5 (d), 35,4 (d), 34,6 (t), 31,7 (d), 31,6 (d), 31,5 (t), 29,6 (t), 29,1 (t), 28,5 (t), 27,3 (d), 22,8 (t), 20,6 (q), 16,0 (q), 15,7 (q), 15,6 (q), 14,0 (q), 13,1 (q), 12,6 (q), 11,4 (q), 9,1 (q).
Die Octahydrodiscodermolidverbindungen werden auf biologische Aktivität getestet und man erhält die folgenden Ergebnisse:
Darüberhinaus betrifft die Erfindung eine Verbindung der Formel II.
worin A für -H, -A, -CH₂-Q, -COA oder -COZ stelit, A für Niederalkyl stelit, Z für monocycyclisches Aryl steht, Q für Phenyl, Tolyl oder Xylyl steht, X für -H, -A, -Z oder -CH₂-Z steht, und Y für -H, -A, -Z, -CH₂-Z, -COA oder -COZ steht, oder ein Säureadditionsalz hiervon, vorzugsweise eine solche Verbindung der Formel II, worin R für H stelit, COCH₃ oder CH₃ steht und X und Y jeweils für H stehen und bevorzugter, worin R für H steht. Zusätzlich liefert die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Verbindung der Formel VII enthält
Wie hierin dargestellt und ausführlich beschrieben umfasst die Erfindung auch die Verwendung der neuen Verbindungen und Zusammensetzungen der Erfindung, beispielsweise die Verwendung solcher Verbindungen und Zusammensetzungen zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines Patienten, der Krebszellen trägt, das dadurch gekennzeichnet ist, dass der Patient ein Mensch ist und der Krebs ausgewählt ist aus Lungenkrebs, Colonkrebs, ZNS Krebs, Melanom, Ovarkrebs, Nierenkrebs, Prostatakrebs und Brustkrebs. Am bevorzugtesten umfassen die Krebszellen Brust-, Colon- oder Lungentumorzellen oder Leukämiezellen.
Zusätzlich zu den oben angeführten Krebszelltypen, für die die vorliegenden Discodermolide und Zusammensetzungen besonders brauchbar sind, wurde von den vorliegenden Verbindungen auch gezeigt, dass sie mit ihrer antiproliferativen Aktivität auch gegen bestimmte ZNS Krebszelllinien, Melanomzelllinien, Ovarkrebszelllinen, Nierenkrebszelllinien und Prostatakrebszelllinien brauchbar sind. Es wird aufgrund der bestimmten hierin identifizierten antiproliferativen Wirkarten erwartet, dass zusätzliche Krebszelllinien auch durch diese Verbindungen gehemmt werden.
Ein umfassenderes Verständnis der Erfindung kann durch Bezugnahme auf bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung erhalten werden, die durch die folgenden spezifischen Beispiele an Verbindungen, Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung erläutert werden. Die folgenden Beispiele erläutern Verfahren zur Durchführung der Erfindung. Alle Prozentsätze sind in Gewicht angegeben und alle Lösemittelgemischanteile sind in Volumen angegeben, falls nichts anderes angegeben ist. Es ist für den Fachmann verständlich, dass die Beispiele die Verwendung von Materialien und Reagenzien umfassen, die m Handel aus bekannten Quellen erhältlich sind, beispielsweise chemischem Fachhandel, obwohl keine Details hierzu angegeben sind.
Beispiel 1 - Effekt von Discodermolid auf die konstitutive Proliferation von lymphoiden und nicht-lymphoiden Zelllinien der Maus und des Hamsters
Die Wirkungen von Discodermolid auf die Hemmung der konstitutiven Proliferation von mehreren lymphoiden und nicht-lymphoiden Zelllinien von der Maus oder dein Menschen werden untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst.
Tabelle 1: Wirkungen von Discodermolid auf die konstitutive Proliferation von Zelllinien der Maus und des Menschen
Discodermolid hemmt die Prolifertion von lymphoiden und nicht-lymphoiden Zelllinien der Maus mit HK₅₀ Werten von 3 bis 60 nM. Die Proliferation der humanen, nicht lymphoiden Zellen (Vorhautfibroblasten) wird ebenfalls durch Discodermolid gehemmt (HK₅₀ = 15 nM), aber die Erholung der lebenden Zellen (Toxizität) wird bei Konzentrationen der Verbindung bis zu 3,0 μM nicht beeinflusst.
Beispiel 2 - Antiproliferative Effekte von Discodermolid auf humane Tumorzellinien
Discodermolid wird zusätzlich auf seine antiproliferativen Effekte mittels des in vitro Tumorzellliniensatzes des National Cancer Institute's evaluiert. Die Ergebnisse dieser Analysen sind in den Mittelwertkurven gezeigt, die in den 1A–1C gezeigt sind. Die Daten werden dargestellt mittels bekannter und anerkannter Messungen der "Wachstumshemmung 50" (GI₅₀), worin das Wachstum von 50 % der Zellen gehemmt wird, "Totaler Wachstumshemmung" (TGI), worin das Wachstum aller Zellen gehemmt wird, das heißt Cytostase und "Lethale Konzentration 50" (LC₅₀), worin 50 % der Zellen getötet werden. Von den etwa 60 getesteten Zelllinien zeigt Discodermolid eine selektive Cytotoxizität (wie dies durch die Balken rechts von der Mittellinie gezeigt wird) bei 32 Zelllinien für GI₅₀ und 18 Zelllinien für TGI. Gemäß LC₅₀ Messungen für die NCl Zelllinien ist die getestete Verbindung besonders gegen humanen nicht-kleinzelligen Lungenkrebs (NCl-H23), humane Colonkrebsarten (COLO 205 und HCC-2998), humanes Melanom (M14), zwei von sechs ZNS Krebszelllinien (SF 295 und SF 539) und zwei von acht Brustkrebszelllinien (MDA-MB-435 und MDA-N) wirksam. Eine statistische Analyse dieses selektiven Toxizitätsmusters (der COMPARE Algorithmus) zeigt, dass das Cytotoxizitätsmuster von Discodermolid dem von mehreren vorher getesteten interaktiven Mikrotubulusmitteln gleicht, einschließlich dein von Taxol erzeugten Muster.
Beispiel 3 - Effekt von Discodermolid auf den Zellzyklusfortschritt von humanen GI-101A Brustzellen, humanen A549 Lungenzellen und humanen Jurkat-Leukämiezellen im Vergleich zu Taxol
Es werden Zellzyklusuntersuchungen gestartet, um eine spezifische Phase im Zellzyklus festzulegen, bei der Discodermolid seine antiproliferative Wirkung ausübt. Humane GI-101A Brustzellen und humane A549 Lungenzellen werden als Zellzyklusziele verwendet, um die Wirkungen von Discodermolid und Taxol auf die Pertubation des Zellzyklus zu vergleichen. Die Zellzyklusanalysen werden folgendermaßen ausgeführt: GI-101A und A549 Zellen werden bei 37°C in 10 % CO₂ in Luft in Gegenwart oder Abwesenheit von verschiedenen Konzentrationen an Discodermolid oder Taxol (bezogen von Molecular Probes, Eugene, OR) für 48 Stunden inkubiert. Die Zellen werden geerntet, in Ethanol fixiert und mit. 0,5 mg/ml Propidiumiodid (P.I.) zusmmen mit 0,1 mg/ml RNase A gefärbt. Dieses Verfahren perimabilisiert lebende Zellen und erlaubt den Eintritt von P.I., um die DNA zu färben. Die gefärbten Präparationen werden auf einen COULTER EPICS ELITE mit einer Anregung von 488 nm analysiert, wobei die toten Zellen durch Zurücksetzen von P.I. Präparationen ohne Detergenz in vorwärts und seitwärts Streuhistogrammen ausgeschlossen werden. Die Fluoreszenzmessungen und die entstehenden DNA Histogramme werden aus zumindest 5000 P.I. gefärbten Zellen mit einer Emissionswellenlänge von 690 mn gewonnen. Die rohen Histogrammdaten werden weiter mittels eines Zellzyklusanalyseprogramms analysiert (Multicycle, Phoenix Flow Systems). Die Ergebnisse dieser Experimente sind in den 2A–2C und 3A–3C gezeigt.
Die Kontrollkulturen von GI-101A Brustzellen zeigen ein charakteristisches Muster des Zellzyklus. Etwa 56 % der Kontrollzellen umfassen die G, Phase des Zellzyklus und 30 % umfassen die S Phase. Nur etwa 14 % der Zellen befinden sich nachweisbar zu jeder Zeit in der G₂/M Phase in nicht synchronisierten Kulturen aufgrund ihrer hohen Proliferationsrate (2A). 24 Stuuden nach einem Kulturstart mit 100 ng/ml Discodermolid nimmt der Prozentsatz der Zellen in der G, Phase auf 22 % ab. Der Prozentsatz der S Phasenzellen erhöht sich von 30 % auf 41 %, während der Prozentsatz an Zellen in G₂/M dramatisch von 14 % in der Kontrolle auf 38 % in den mit Discodermolid behandelten Zellen ansteigt (2B), was einen Block in der G₂/M Phase des Zellzyklus anzeigt. GI-101A Zellen, die für 24 Stunden mit Taxol behandelt wurden, zeigen fast identische Effekte. Der Prozentsatz an Zellen in G, nimmt von 56 % für die Kontrolle auf 27 % in Kulturen ab, die mit. Taxol behandelt wurden. Der Prozentsatz an S-Phasenzellen nimmt von 30 % auf 37 % zu, während der Prozentsatz an G₂/M Phasenzellen von 14 % in der Kontrolle auf 37 % in mit Taxol behandelten Kulturen zunimmt, was einen Block bei G₂/M anzeigt ( 2C). Diese Ergebnisse zeigen, dass sowohl Discodermolid als auch Taxol ähnliche Effekte auf die Proliferation von GI-101A Zellen ausüben, nämlich die Blockierung der Zellproliferation an der G₂/M Phase des Zellzyklus.
Discodermolid und Taxol werden bezüglich ihrer Effekte auf die Proliferation der humanen A549 Lungenzellen verglichen. Die Zellkulturen werden ähnlich in Gegenwart und Abwesenheit von verschiedenen Konzentrationen von Discodermolid oder Taxol gestartet und bei 37°C bei 10 % CO₂ in Luft für 48 Stunden inkubiert. Die Zellen werden geerntet, gefärbt und im Durchflusscytometer wie oben angegeben analysiert. Die Kontrollkulturen von A549 Zellen zeigen ein normales Zyklusmuster für diese Linie mit etwa 77 % der Zellen in G₁, 19 % in der S Phase und nur 4 % in der G₂/M Phase des Zellzyklus (3A). Die Behandlung der Zellen mit 100 ng/ml Discodermolid führt zu einer Verringerung des Prozentsatzes der Zellen in G₁ von 77 % in der Kontrolle auf 18 % bei mit Discodermolid behandelten Zellen und eine dramatische Erhöhung des Prozentsatzes an Zellen in G₂/M von 4 % in der Kontrolle auf 67 % in mit Discodermolid behandelten Zellen (3B). Die Taxolbehandlung von A549 Zellen führt zu fast identischen Ergebnissen , wobei der Prozentsatz an Zellen in G, von 77 % in der Kontrolle auf 11 % in mit Taxol behandelten Zellen abnimmt und der Prozentsatz an Zellen in G₂/M von 4 % in der Kontrolle auf 77 % in mit Taxol behandelten Zellen zunimmt (3C). Der Prozentsatz der Zellen in der S-Phase verändert sich in beiden Gruppen nicht signifikant. Diese Ergebnisse zeigen, dass Discodermolid und Taxol ähnliche G₂/M Blockierungseffekte auf humane A549 Lungenzellen haben.
Discodermolid und Taxol werden bezüglich ihrer Effekte auf die Proliferation von humanen Jurkat Leukämiezellen verglichen. Die Zellkulturen werden ähnlich in Gegenwart und Abwesenheit von verschiedenen Konzentrationen an Discodermolid oder Taxol gestartet und bei 37°C in 10 % CO₂ in Luft für 48 Stunden inkubiert. Die Zellen werden geerntet und gefärbt und auf einem Durchflusscytometer mittels Standardverfahren analysiert. Die Kontrollkulturen der Jurkat Zellen zeigen normale Zellzyklusmuster für diese Linie, wobei etwa 68 % der Zellen in G,, 25 % in der S-Phase und 7 % in der G₂/M Phase des Zellzyklus sind (4A). Die Behandlung von Zellen mit 100 ng/ml Discodermolid führt zu einer Abnahme des Prozentsatzes an Zellen in G₁, von 68 % in der Kontrolle auf 35 % bei den mit Discodermolid behandelten Zellen und zu einer dramatischen Zunahme des Prozentsatzes an Zellen in G₂/M von 7 % in der Kontrolle auf 27 % bei den mit Discodermolid behandelten Zellen (4B). Die Taxolbehandlung von Jurkatzellen führt zu fast identischen Ergebnissen, wobei der Prozentsatz an Zellen in G₁ von 68 % in der Kontrolle auf 34 % in den mit Taxol behandelten Zellen abnimmt und der Prozentsatz an Zellen in G₂/M von 7 % in der Kontrolle auf 28 % bei mit Taxol behandelten Zellen zunimmt (4C). Der Prozentsatz der Zellen in der S-Phase in beiden Gruppen erhöht sich von 25 % in der Kontrolle auf 38 % sowohl in den mit Discodermolid als auch in den mit Taxol behandelten Zellen. Diese Ergebnisse zeigen, dass Discodermolid und Taxol ähnliche G₂/M Blockierungseffekte auf die humanen Jurkat Leukämiezellen haben.
Beispiel 4 - Effekt von Discodermolid auf humane Brustcarzinomzellen
Es wird die Wirkung von Discodermolid auf zwei humane Brustcarzinomzelllinien, nämlich Östrogenrezeptor-positive MCF-7 Zellen und Östrogenrezeptor-negative MDA-MB-231 Zellen bestimmt. Die Ergebnisse werden mit denen verglichen, die durch Behandlung mit Taxol erhalten werden. Beide Linen werden auf Arzneimitteleffekte bezüglich des Wachstums und durch indirekte Immunfluoreszenz auf Effekte auf das Mikrotubuluscytoskelett untersucht. Die Ergebnisse sind für beide Linien ähnlich. Die HK₅₀ für Discodermolid beträgt 2,4 nM, was zum 2,1 nM Wert ähnlich ist, der mit Taxol erhalten wird. Die Immunfluoreszenzmuster von Zellen, die mit Discodermolid behandelt sind, zeigen eine bemerkenswerte Umlagerung von zellulären Mikrotubuli, was die Förderung einer Ansmmlung von Mikrotubuli und eine Taxol ähnliche Wirkung anzeigt. Diese Muster treten bei Konzentrationen von bis zu 10 nM auf. Ähnliche aber weniger ausgeprägte Veränderungen treten mit einer Taxolbehandlung auf aber nur bei einer viel höheren Arzneimittelkonzentration (1μM).
Beispiel 5 - Effekte von Discodermolid auf die Tubulinpolymerisation und Stabilisierung
Discodermolid wird auf die Wechselwirkungen mit Tubulin untersucht. Die Tubulinpolymerisation wird turbidometrisch bei 350 nm mit einem elektronischen Temperaturkontrollgerät verfolgt. Die Reaktionsgemische enthalten 0,1 M 4-Morpholinethansulfonat (pH 6,9), 1,0 mg/ml (10μM) elektrophoretisch homogenes Tubulin aus dem Rinderhirn, das von ungebundenen Nukleotiden durch Gelfiltration befreit wurde, 0,5 mg/ml hitzebehandelte MAPs, 100 μM GTP und 4 % (V/V) Dimethylsulfoxid. Eine Konzentration von 10 μM Discodermolid (Kurve 3) wird mit derselben Konzentration an Taxol (Kurve 2) und ohne Arzneimittel (Kurve 1) verglichen, wie dies in 5 gezeigt ist. Diese Ergebnisse zeigen, dass die schnelle Polymerisation unmittelbar beginnt, wenn Discodermolid zum Tubulin enthaltenden Reaktionsgemisch bei 0°C gegeben wird, wobei die Rektion fast vollständig ist. Das Taxol-enthaltende Gemisch beginnt keine Zusammenlagerung bis die Temperatur 10 °C erreicht, während die Kontrolle (kein Arzneimittel) bei 37°C die Zusammelagerung beginnt. Beim Zurückkehren auf 0°C zerfällt das Kontrollgemisch, wie erwartet und es findet eine leichte Abnahme der Zusammenlagerung des Taxolgemisches statt, aber das Discodermolidgemisch bleibt stabil. Es wurde auch in anderen Studien beobachtet, dass Discodermolid die Zusammenlagerung von Tubulin ohne MAPs oder GTP induziert und diese Reaktionen sind noch dramatischer im Vergleich zu denen, die mit Taxol beobachtet wurden, speziell bei niedrigen Temperaturen. Es wurde in zusätzlichen Studien festgestellt, dass der EC₅₀ Wert für die Polymerisation von Tubulin durch Discodermolid 2,7 μM im Vergleich zu 23 μM für Taxol beträgt.
Elektronenmikroskopische Aufnahmen von Polymeren von Tubulin, die sich in Gegenwart von Discodermolid, Taxol und der Kontrolle bilden, zeigen sehr ähnliche Eigenschaften, das Vorkommen von Polymeren, Mikrotubuli und Lagen, wobei die durch Taxol induzierten Polymere etwas länger sind, als die, welche mit Discodermolid induziert wurden und die Kontrollpolymere sind sogar noch länger als die der mit Discodermolid oder Taxol induzierten Präparationen.
Die Ergebnisse aus dieser Studie legen nahe, dass der Wirkmechanismus von Discodermolid in Bezug auf die Stabilisierung von Mikrotubuli dein von Taxol überlegen ist.
Beispiel 6 - Formulierung und Verabreichun
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind für verschiedene nicht-therapeutische und therapeutische Zwecke brauchbar. Es ist aus den Tests ersichtlich, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen für die Hemmung des Zellwachstums wirksam sind. Aufgrund der andproliferativen Eigenschaften der Verbindungen sind sie auch zur Verhinderung von unerwünschtem Zellwachstum bei einer großen Vielzahl an Situationen brauchbar, einschließlich in vitro Verwendungen. Sie sind auch als Standards und für Lehrdemonstrationen brauchbar. Sie können auch als ultraviolette Schutzmoleküle in der Plastikindustrie verwendet werden, da sie UV Strahlen sehr wirksain absorbieren. Wie hierin beschrieben, sind sie auch prophylaktisch und therapeutisch zur Behandlung von Krebszellen bei Tieren und Menschen brauchbar.
Die therapeutische Anwendung der neuen Verbindungen und der Zusammensetzungen, die sie enthalten, kann durch jedes geeignete therapeutische Verfahren und jede Technik erreicht werden, die derzeit oder in Zukunft dem Fachmann bekannt ist. Darüberhinaus haben die erfindungsgemäßen Verbindungen eine Verwendung als Ausgangsmaterialien oder Zwischenprodukte zur Herstellung von anderen brauchbaren Verbindungen und Zusammensetzungen.
Die Dosisverabreichung an einen Wirt bei den obigen Indikationen hängt von der Identität der Krebszellen, dem Typ des involvierten Wirts, dessen Alter, Gewicht, Gesundheitszustand, der Art der derzeitigen Behandlung, falls eine erfolgt, der Häufigkeit der Behandlung und des therapeutischen Verhältnisses ab.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können gemäß bekannter Verfahren zur Herstellung von pharmazeutisch brauchbaren Zusammensetzungen formuliert werden. Die Formulierungen werden im Detail in mehreren Quellen beschrieben, die dem Fachmann gut bekannt und leicht zugänglich sind. Beispielsweise beschreibt Remington's Pharmaceutical Science von E. W. Martin Formulierugen, die in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Im allgemeinen werden die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung so formuliert, dass eine wirksame Menge der bioaktiven Verbindungen) mit einem geeigneten Träger kombiniert wird, um die effektive Verabreichung der Zusammensetzung zu erleichtern.
Gemäß der Erfindung enthalten pharmazeutische Zusammensetzungen als Wirkstoff eine wirksame Menge einer oder mehrerer der neuen Verbindungen und ein oder mehrere nicht toxische pharmazeutisch annehmbare Träger oder Verdünnungsmittel. Beispiele für solche Träger zur Verwendung in der Erfindung umfassen Ethanol, Dimethylsulfoxid, Glycerin, Siliziumdioxid, Aluminiumoxid, Stärke und äquivalente Träger und Verdünnungsmittel.
Um für die Verabreichung solcher Dosierungen für die gewünschte therapeutische Behandlung zu sorgen, umfassen neue pharmazeutische Zusammensetzungen der Erfindung vorteilhafterweise zwischen etwa 0,1 % und 45 % und speziell 1 und 15 Gewichtsprozent an einer oder mehrerer der neuen Verbindungen auf der Grundlage des Gewichts der Gesamtzusammensetzung einschließlich Träger oder Verdünnungsmittel. Beispielsgemäß können die Dosierungsmengen der verabreichten Wirkstoffe sein: Intravenös 0,01 bis etwa 20 mg/kg, intraperitoneal 0,01 bis etwa 100 mg/kg, subkutan 0,01 bis etwa 100 mg/kg, intramuskulär 0,01 bis etwa 100 mg/kg, oral 0,01 bis etwa 200 mg/kg und vorzugsweise etwa 1 bis 100 mg/kg, intranasale Einbnngung 0,01 bis etwa 20 mg/kg und durch Aerosol 0,01 bis etwa 20 mg/kg des Körpergewichts.

Claims

Verwendung einer Discodermolidverbindung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines Patienten, der Krebszellen trägt, dadurch gekennzeichnet, dass der Patient ein Mensch ist und der Krebs aus Lungenkrebs, Colonkrebs, ZNS Krebs, Melanom, Ovarkrebs, Nierenkrebs, Prostatakrebs und Brustkrebs ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 1, worin die Discodermolidverbindung ausgewählt ist aus denen der Formeln I, II und III
worin R für -H, -A, -CH₂-Q, -COA oder -COZ steht, A für Niederalkyl steht, Z für monocyclisches Aryl steht, Q für Phenyl, Tolyl oder Xylyl steht, X für -H, -A, -Z oder -CH₂-Z stelit, und Y für -H, -A, -Z, -CH₂-Z, -COA oder -COZ steht, oder ein Säureadditionsalz hiervon.
Verwendung nach Anspruch 2, worin R für H, COCH₃ oder CH₃ steht und X und Y jeweils für H stehen.
Verwendung nach Anspruch 2, worin die Discodermolidverbindung die der Formel I ist und R, X und Y jeweils für H stehen.
Verwendung nach Anspruch 1, worin die Discodermolidverbindung Octahydrodiscodermolid ist.
Verwendung nach einem vorangehenden Anspruch, worin der Krebs ausgewählt ist aus Lungenkrebs, Colonkrebs, ZNS Krebs, Melanom und Brustkrebs.
Verbindung der Formel II nach Anspruch 2.
Verbindung nach Anspruch 7, worin R für H, COCH₃ oder CH₃ steht und X und Y jeweils für H stehen.
Verbindung nach Anspruch 8, worin R für H steht.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Verbindung nach einem der Ansprüche 7 bis 9 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger enthält.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Verbindung der Formel VII enthält.