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Die
Erfindung betrifft organische Verbindungen und Zusmmanensetzungen,
die brauchbare therapeutische Eigenschaften haben. Genauer gesagt
betrifft die Erfindung neue Lactonverbindungen mit immunmodulatorischen
Aktivitäten
und Antitumoraktivitäten,
pharmazeutische Zusammensetzungen, die solche Verbindungen enthalten,
Verfahren zur Herstellung der neuen Verbindungen und Zusmmensetzungen
und die Verwendung einer Discodermolidverbindung zur Herstellung
eines Arzneimittels zur Behandlung eines Menschen, der eine bestimmte
Krebsart aufweist.
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Hintergrund der Erfindung
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In
der Vergangenheit wurde ein beträchtliches
Maß an
Forschung und Ressourcen der Onkologie und Antitumormaßnahmen,
einschließlich
der Chemotherapie gewidmet. Während
bestimmte Verfahren und chemische Zusammensetzungen entwickelt wurden,
die bei der Hemmung, Remission oder Kontrolle des Wachstums von
Tumoren helfen, werden neue Verfahren und chemische Antitumorzusammensetzungen
benötigt.
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Bei
der Suche nach neuen biologisch aktiven Verbindungen wurde festgestellt,
dass einige natürliche Produkte
und Organismen potentielle Quellen für chemische Moleküle mit einer
brauchbaren biologischen Aktivität
und großer
Diversität
sind. Beispielsweise ist das Diterpen, das herkömmlich als Taxol bekannt ist
und aus mehreren Arten des Eibenbaums isoliert wird, ein mitotisches
Spindelgift, das die Mikrotubuli stabilisiert und ihre Depolymerisation
in freies Tubulin hemmt (D.A. Fuchs, R.K. Johnson [1978] Cancer
Treat. Rep. 62: 1219-1222, P.B. Schiff, J. Fant, S.B. Horwitz [1979]
Nature (London) 22: 665-667). Von Taxol ist auch bekannt, dass es
eine Antitumoraktivität
aufweist und mehreren klinischen Studien unterzogen wurde, die dessen
Wirksamkeit bei der Behandlung einer großen Vielzahl an Krebsarten
gezeigt haben (E.K. Rowinski, R.C. Donehower (1995] N. Engl. J.
Med. 332: 1004-1014). Siehe beispielsweise
US 5 157 049 A ,
US 4 960 790 A und
US 4 206 221 A .
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Marine
Schwämme
haben sich auch als Quelle von biologisch aktiven chemischen Molekülen herausgestellt.
Es wurden mehrere Publikationen herausgegeben, die organische Verbindungen
beschreiben, die sich von marinen Schwämmen ableiten, einschließlich P.J.
Scheuer (Herausgeber) Marine Natural Products, Chemical and Biological
Perspectives, Academic Press, New York, 1978-1983, Band I-V, D.
Uemura, K. Takahashi, T. Yamamoto, C. Katayama, J. Tanaka, Y. Okumura,
Y, Hirata (1985), J. Am. Chem. Soc. 107; 4796-4798, L. Mingle et
al., (1976) Fortschr. Chem. Org. Naturst. 33: 1-72, D.J. Faulkner
(1987) Natural Products Reports 4: 539-576 und die hierin angegebenen
Literaturangaben.
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Die
vorliegende Erfindung hat zum Fundus der Antitumorverbindungen durch
die Auffindung neuer Klassen an organischen Verbindungen beigetragen,
die unter anderem brauchbare Tubulin-polymerisierende Aktivitäten und
Antitumoraktivitäten
aufweisen. Diese Verbindungen können
aus Extrakten des marinen Schwamms Discodermia dissoluta isoliert
werden. Siehe beispielsweise
US
4 939 168 A und
US
5 010 099 A . Zusätzlich
können
diese Verbindungen durch bekannte Verfahen der organischen Chemie
synthetisiert werden, die vom Fachmann leicht verstanden werden.
J.B. Nerenberg et al., (1993), J. Amer. Chem. Soc. 115: 12621-12622.
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Ein
Hauptziel der Erfindung ist die Bereitstellung von neuen Zusammensetzungen
an biologisch aktiven Lactonverbindungen, die vorteillhfterweise
zur Behandlung von Krebs verwendet werden können. Genauer gesagt können die
neuen Zusammensetzungen und Verwendungen vorteilhafterweise bei
der Behandlung eines Patienten brauchbar sein, der Krebszellen beherbergt,
wobei sie beispielsweise das Wachstum der Tumorzellen in einem Säugerwirt
hemmen. Genauer gesagt können
die vorliegenden Verbindungen, die hierin als Discodermolide bezeichnet
werden, und Zusammensetzungen, die die Discodermolide enthalten,
zur Hemmung des Wachstums von Tumorzel len, einschließlich Zellen
von Tumoren der Brust, des Colons, des ZNS oder der Lunge in einem
Menschen, wie auch von humanen Leukämie- oder Melanomzellen verwendet
werden. Es ist verständlich,
dass der Mechanismus zur Erreichung der Antikrebsaktivität durch
die vorliegenden Verbindungen einen Fachmann dazu führen würde, die
Anwendbarkeit der vorliegenden Verbindungen, Zusammensetzungen und
Verwendungen in Bezug auf zusätzliche
Krebsarten zu erkennen, wie dies hierin beschrieben ist.
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Gemäß der Erfindung
umfassen Verfahren zur Hemmung von Tumoren in einem Wirt das Zusammenbringen
von Tumorzellen mit einer wirksamen Menge der neuen pharmazeutischen
Zusammensetzungen der Erfindung. Die durch die Erfindung gehemmten
Tumorzellen sind die, die gegenüber
den vorliegenden hierin beschriebenen Verbindungen oder diese Verbindungen
enthalten Zusammensetzungen empfindlich sind.
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Ein
zusätzliches
Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung von Verfahren zur Herstellung
der neuen Verbindungen und Zusammensetzungen.
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Andere
Ziele und weitere Anwendungsmöglichkeiten
der vorliegenden Erfindung werden aus der hierin bereitgestellten
Beschreibung deutlich, wobei jedoch verständlich sein sollte, dass die
detaillierten Beschreibungen nur zur Erläuterung angegeben werden, wobei
sie die bevorzugten Ausführungsformen
der Erfindung beschreiben und verschiedene Veränderungen und Modifikationen
innerhalb des Geists und des Schutzumfangs der Erfindung aus den
Beschreibungen deutlich werden.
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Kurze Beschreibung der Zeihnungen
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Die 1A–1C zeigen
antiproliferative Wirkungen, die durch GI50,
TGI und LC50 der Discodermolide gegen eine
Vielzahl an humanen Tumorzellen gemessen werden.
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Die 2A–2C zeigen
die Wirkung der Discodermolide auf die humanen GI-101A Brusttumorzellen gemäß der vorliegenden
Erfindung.
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Die 3A–3C zeigen
die Wirkung von Discodermoliden auf humane A549 Lungenzellen gemäß der vorliegenden
Erfindung.
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Die 4A–4C zeigen
die Wirkung der Discodermolide auf humane Jurkat Leukämiezellen.
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Die 5 zeigt die Wirkung der
Discodermolide (im Vergleich zu Taxol) auf die Tubulinpolymerisation gemäß der vorliegenden
Erfindung.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer Discodermolidverbindung
zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines Patienten,
der Krebszellen trägt,
die dadurch gekennzeichnet ist, dass der Patient ein Mensch ist
und der Krebs aus Lungenkrebs, Colonkrebs, ZNS Krebs, Melanom, Ovarkrebs, Nierenkrebs,
Prostatakrebs und Brustkrebs ausgewählt ist.
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In
einer Ausführungsform
der Erfindung werden die Ziele der Erfindung durch die Bereitstellung
der biologisch aktiven Verbindungen erreicht, die eine Struktur
gemäß der folgenden
Formel (I) haben:
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- worin
- R für
-H, -A, -CH2-Q, -COA oder -COZ steht,
- A für
Niederalkyl steht,
- Z für
monocyclisches Aryl stelit,
- Q für
Phenyl, Tolyl oder Xylyl stelit,
- X für
-H, -A, -Z oder -CH2-Z stelit, und
- Y für
-H, -A, -Z, -CH2-Z, -COA oder -COZ stelit,
- und Säureadditionsalze
hiervon.
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Verbindungen,
die Varianten der Struktur (I) sind, wurden auch aufgefunden und
können
die Octahydro-,
Tetrahydro- und 23-24-Dihydroderivate der Verbindungen gemäß der obigen
Formel umfassen. Die Verbindungen können ein einzelnes geometrisches
Isomer oder Gemische hiervon sein (E oder Z Isomer). Diese Variantenverbindungen
haben weniger Doppelbindungen im Rückgrad der Kohlenstoffkette.
Es ist gut bekannt, dass die Doppelbindungen im Rückgrad der
Kohlenstoffkette der Struktur (I) selektiv unter Bildung von beispielsweise
Tetrahydro- oder
Dihydroverbindungen gemäß der vorliegenden
Erfindung gesättigt
werden. Bestmmte Strukturen sind im folgenden als Formeln (II) und
(III) gezeigt
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- worin
- R für
-H, -A, -CH2-Q, -COA oder -COZ stelit,
- A für
Niederalkyl steht,
- Z für
monocyclisches Aryl steht, Q für
Phenyl, Tolyl oder Xylyl steht,
- X für
-H, -A, -Z oder -CH2-Z steht, und
- Y für
-H, -A, -Z, -CH2-Z, -COA oder -COZ stelit,
und Säureadditionsalze
hiervon.
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Es
können
verschiedene Enantiomere der oben definierten Discodermolide vom
Fachmann synthetisiert werden. Das natürliche aus marinen Schwämmen isolierte
Discodermolid ist vorwiegend das (+)-Enantiomer.
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Bevorzugte
Verbindungen der Erfindung werden durch die folgende Formel dargestellt
worin
R für -H,
-OOOH
3 oder -CH
3 steht.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
der Erfindung sind die Verbindungen im wesentlichen rein, das heißt enthalten
mindestens 95 % der Verbindung, wie dies durch etablierte analytische
Verfahren bestimmt wird. In den am meisten bevorzugten Ausführungen
der Verbindungen der Formeln (IV), (V) und (VI) stelit R für H.
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Die
Lactonverbindungen der vorliegenden Erfindung und Verfahren zur
Herstellung dieser Verbindungen oder von Zusammensetzungen, die
diese Verbindungen enthalten, sind in
US 4 939 168 A und
US 5 010 099 A beschrieben,
die hiermit eingeführt
sind.
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Discodermolide
können
aus dein marinen Schwamm Discodermia dissoluta isoliert werden,
den man beim Tauchen in Lucay, Grand Bahama Island in einer Tiefe
von 33 Metern findet.
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Discodermia
dissoluta Schmidt, 1880 (Die Spongien des Meerbusens von Mexico
(und des Caraibischen Meeres, III Abt. Tetractinelliden, Manactinelliden
und Anhang, II Heft, G. Fischer, Jena, Seiten 35-90) ist ein amorpher
bis gelappter Schwamm mit einem Durchmesser von 4 cm und einer Dicke
bis zu 7 cm, einem dunkelbraunen Äußeren und einem cremefarbenen
Inneren. Die Konsistenz ist fest aber komprimierbar. Die anderen
Proben sind neue, nicht benannte Species. Discodermia sp. IA ist
eine Ansammlung an Röhren
mit einer Höhe
von bis zu 15 cm, die an der Basis verbunden sind. Die Schwämme sind
weiß oder
pink-weiß und sind
fest , aber leicht komprimierbar. Discodermia sp. IV ist eine unregelmäßige, gestielte,
flache Schale mit einem Durchmesser von 5–10 cm und einer Höhe von 3–5 cm. Die
Schwämme
sind creme bis gelb und die Konsistenz ist fest und nicht komprimierbar.
Für eine
vollständige
Beschreibung dieser Proben siehe M. Kelly-Borges, E. V. Robinson,
S.P. Gunasekera, M. Gunasekera, N.K. Gulavita und S.A. Pomponi,
1994, Species differentiation in the marine sponge genus Discodermia
(Demospongiae: Lithistida): The utility of ethanol extract profiles
as species-specific chemotaxonomic markers, Biochemical Systematics
and Ecology, 22(4): 353-365. Alle hierin zitierten Proben mit HBOM
Katalognummern sind beim Harbor Branch Oceanographic Museum, Fort
Pierce, Floida hinterlegt. Alle Proben sind in 70 % Ethanol mit
einer erwarteten Haltbarkeit von mindestens 30 Jahren hinterlegt
und für
den Fachmann für
taxonomische Identifizierungszwecke zugänglich.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
zur Herstellung der neuen Verbindungen durch Extraktion aus marinen
Schwämmen
usw., können
geeignete organische Lösemittelsysteme
zur Extraktion ausgewählt
werden aus Methanol, Ethylacetat, Toluol, Heptan, Hexan, Isooctan,
Aceton, Benzol, Diethylether, t-Butylmethylether, Ethanol, Isopropanol,
1,2-Dichlorethan und speziell Chloroform und Dichlormethan. Gemische
aus zwei oder mehrerer solcher Lösemittel
in verschiedenen Verhältnissen
und Kombinationen sind vorteilhaft.
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Die
erfindungsgemäßen Verbindungen
werden durch verschiedene Fraktionierungs- und Chromatographietechniken
aus den wie beschrieben erhaltenen Extrakten isoliert. Bevorzugte
Isolierungsverfahren umfassen verschiedene Chromatographietechniken,
beispielsweise Gegenstromchromatograpie mit geeigneten Säulen einschließlich Mehrschichtplanarschlangensäulen. Es
ist eine Vielzahl an Lösemitteln
zur Verwendung als einzelne oder gemischte Eluenten erhältlich,
wie Methylenchlorid, Methanol, Ethylacetat, Acetonitril, n-Propanol,
n- Butanol, Wasser und äquivalente
Lösemittel.
Weitere Reinigungen mittels solcher Verfahren können auch mit den gewonnenen
Extraktionen ausgeführt
werden. Bevorzugte Isolierungstechniken für eine weitere Reinigung umfassen
chromatographische Operationen, wie Hochdruckflüssigchromatographie mit geeigneten Säulen mit
einem geeigneten Lösemittel,
insbesondere Methylenchlorid / Methanol oder Methanol / Wasser Gemischen.
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Modifikationen
der neuen Discodermolidverbindung können leicht durch den Fachmann
ausgeführt werden.
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Mit
der Kenntnis der Verbindungen der vorliegenden Erfindung und ihrer
Strukturen können
Chemiker bekannte Verfahren zur Synthese dieser Verbinduugen aus
verfügbaren
Substraten verwenden. Beispielsweise sind Syntheseverfahren zur
Herstellung von bestimmten Verbindungen in Nerenberg et al., obige
Literaturstelle beschrieben.
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In
weiter bevorzugten Verfahren der Erfindung werden neue Salze innerhalb
des Schutzumfangs der Erfindung durch die Zugabe von Mineralsäuren, beispielsweise
HCl, H2SO4 usw.
oder starken organischen Säuren,
beispielsweise Ameisensäure,
Oxalsäure
usw. in geeigneten Mengen unter Bildung des Säureadditionssalzes der Ausgangsverbindung
oder deren Derivat hergestellt. Es können auch Synthesereaktionen
anschließend
an bekannte Verfahren verwendet werden, um verschiedene Gruppen
in den bevorzugten Verbindungen unter Bildung von anderen Verbindungen
innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung anzufügen oder zu modifizieren.
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Der
Schutzumfang der Erfindung ist nicht durch die bestimmten Beispiele
und angegebenen Verfahren und Verwendungen beschränkt, da
Modifikationen innerhalb des Umfangs aus der hierin in der Beschreibung angegebenen
Information durch den Fachmann ausgeführt werden können.
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Wie
in der Beschreibung verwendet beziehen sich die Ausdrücke "Analoga", "Varianten" und "Derivate" auf Verbindungen,
die im wesentlichen dieselben sind, wie eine andere Verbindung,
die aber beispielsweise durch die Anfügung von zusätzlichen
Aminosäuren
oder Seitengruppen modifiziert wurden. Die Ausdrücke "Analoga", "Varianten" und "Derivate", wie sie in der
Beschreibung verwendet werden können
sich auch auf Verbindungen beziehen, die im wesentlichen dieselben
sind, wie eine andere Verbindung, die aber atomare oder molekulare
Substitutionen an bestimmten Stellen in der Verbindung aufweisen.
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Wie
beschrieben umfasst eine bevorzugte Ausführungsform der Discodermolidverbindungen
die in den Strukturen (IV), (V) und (VI) gezeigte Struktur, worin
R für H
steht.. Jedoch können
Analoga oder Derivate dieser bevorzugten Ausführungsform leicht mittels bekannter
Standardreaktionen hergestellt werden. Diese Standardreaktionen
sind unter anderem Hydrierungs-, Methylierungs-, Acetylierungs-
und Ansäuerungsreaktionen.
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Ein
Beispiel für
ein Analogon, das gemäß der vorliegenden
Erfindung hergestellt werden kann, ist Octahydrodiscodermolid. Um
diese Verbindung herzustellen wird Discodermolid (2,0 mg) in EtOH
(4,0 ml) mit einer katalytischen Menge an Pt-(IV)-oxid behandelt
und unter Ballondruck bei Raumtemperatur für 14 Stunden hydriert. Das
Produkt wird filtriert und unter verringertem Druck in einem Rotationsverdampfer
konzentriert, der bei Raumtemperatur gehalten wird, um ein Gemisch
an hydrierten Produkten zu erhalten. Das rohe Gemisch wird durch
HPLC (SiO2, 5 μm, 250 × 10 mm, 3,5 % MeOH / CN2Cl2) unter Bildung
von reinem Octahydrodiscodermolid 20SG721 und dessen C14 Epimers
20SG724 aufgetrennt. Die Ausbeute für 20SG721 beträgt 0,1 mg,
während
die Ausbeute für
20SG724 0,7 mg beträgt.
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20SG721
und 20SG724 (Octahydrodiscodermolid) Octahydrodiscodermolid (zwei
C14 Epimere, 20SG721 und 20SG724): Weiße Feststoffe,
Molekularformel C33H63NO8 1H NMR (CDCl3 und 10 % CD3OD): δ 4,58 (1H,
dt, J = 1,3, 8,8 Hz, H5), 4,54 (1H, dd, J = 8,5, 2,6 Hz, H19), 3,90
(1H, M, H7), 3,63 (1H, t, J= 3,5, H3), 3,21 (1H, dd, J= 7,4, 3,8
Hz, H17), 3,09 (1H, dd, J = 8,6, 2,7 Hz, H11), 2,64 (1H, m, H20),
1,85-1,60 (CH und CH2 Gruppen), 1,26 (3H,
d, J = 7,6 Hz, CH3), 1,25–1,05 (CH
und CH2 Gruppen), 1,01 (3H, d, J = 6,8 Hz,
CH3), 0,92 (3H, d, J = 6,6 Hz, CH3), 0,83 (3H, t, J = 7,3 Hz, H24), 0,83 (6H,
d , J = 7,2 Hz, 2 × CH3), 0,82 (3H, J = 7,0 Hz, CH3),
0,81 (3H, d, J = 7,2 Hz, CH3), 0,76 (3H,
d, J = 6,6 Hz, HC3). 13C
NMR δ 174,8
(s), 157,8 (s), 79,8 (d), 79,3 (d), 77,5 (d), 77,4 (d), 73,0 (d),
67,5 (d), 43,1 (d), 40,9 (t), 40,7 (t), 36,9 (d), 35,9 (d), 35,5
(d), 35,4 (d), 34,6 (t), 31,7 (d), 31,6 (d), 31,5 (t), 29,6 (t),
29,1 (t), 28,5 (t), 27,3 (d), 22,8 (t), 20,6 (q), 16,0 (q), 15,7
(q), 15,6 (q), 14,0 (q), 13,1 (q), 12,6 (q), 11,4 (q), 9,1 (q).
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Die
Octahydrodiscodermolidverbindungen werden auf biologische Aktivität getestet
und man erhält
die folgenden Ergebnisse:
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Darüberhinaus
betrifft die Erfindung eine Verbindung der Formel II.
worin
A für -H,
-A, -CH
2-Q, -COA oder -COZ stelit, A für Niederalkyl
stelit, Z für
monocycyclisches Aryl steht, Q für
Phenyl, Tolyl oder Xylyl steht, X für -H, -A, -Z oder -CH
2-Z steht, und Y für -H, -A, -Z, -CH
2-Z,
-COA oder -COZ steht, oder ein Säureadditionsalz
hiervon, vorzugsweise eine solche Verbindung der Formel II, worin
R für H
stelit, COCH
3 oder CH
3 steht
und X und Y jeweils für
H stehen und bevorzugter, worin R für H steht. Zusätzlich liefert
die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung,
die eine Verbindung der Formel VII enthält
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Wie
hierin dargestellt und ausführlich
beschrieben umfasst die Erfindung auch die Verwendung der neuen
Verbindungen und Zusammensetzungen der Erfindung, beispielsweise
die Verwendung solcher Verbindungen und Zusammensetzungen zur Herstellung
eines Arzneimittels zur Behandlung eines Patienten, der Krebszellen
trägt,
das dadurch gekennzeichnet ist, dass der Patient ein Mensch ist
und der Krebs ausgewählt ist
aus Lungenkrebs, Colonkrebs, ZNS Krebs, Melanom, Ovarkrebs, Nierenkrebs,
Prostatakrebs und Brustkrebs. Am bevorzugtesten umfassen die Krebszellen
Brust-, Colon- oder Lungentumorzellen oder Leukämiezellen.
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Zusätzlich zu
den oben angeführten
Krebszelltypen, für
die die vorliegenden Discodermolide und Zusammensetzungen besonders
brauchbar sind, wurde von den vorliegenden Verbindungen auch gezeigt,
dass sie mit ihrer antiproliferativen Aktivität auch gegen bestimmte ZNS
Krebszelllinien, Melanomzelllinien, Ovarkrebszelllinen, Nierenkrebszelllinien
und Prostatakrebszelllinien brauchbar sind. Es wird aufgrund der
bestimmten hierin identifizierten antiproliferativen Wirkarten erwartet,
dass zusätzliche
Krebszelllinien auch durch diese Verbindungen gehemmt werden.
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Ein
umfassenderes Verständnis
der Erfindung kann durch Bezugnahme auf bevorzugte Ausführungsformen
der Erfindung erhalten werden, die durch die folgenden spezifischen
Beispiele an Verbindungen, Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung
erläutert
werden. Die folgenden Beispiele erläutern Verfahren zur Durchführung der
Erfindung. Alle Prozentsätze
sind in Gewicht angegeben und alle Lösemittelgemischanteile sind
in Volumen angegeben, falls nichts anderes angegeben ist. Es ist
für den
Fachmann verständlich, dass
die Beispiele die Verwendung von Materialien und Reagenzien umfassen,
die m Handel aus bekannten Quellen erhältlich sind, beispielsweise
chemischem Fachhandel, obwohl keine Details hierzu angegeben sind.
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Beispiel 1 - Effekt von
Discodermolid auf die konstitutive Proliferation von lymphoiden
und nicht-lymphoiden Zelllinien der Maus und des Hamsters
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Die
Wirkungen von Discodermolid auf die Hemmung der konstitutiven Proliferation
von mehreren lymphoiden und nicht-lymphoiden Zelllinien von der
Maus oder dein Menschen werden untersucht. Die Ergebnisse sind in
Tabelle 1 zusammengefasst.
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Tabelle
1: Wirkungen von Discodermolid auf die konstitutive Proliferation
von Zelllinien der Maus und des Menschen
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Discodermolid
hemmt die Prolifertion von lymphoiden und nicht-lymphoiden Zelllinien
der Maus mit HK50 Werten von 3 bis 60 nM.
Die Proliferation der humanen, nicht lymphoiden Zellen (Vorhautfibroblasten) wird
ebenfalls durch Discodermolid gehemmt (HK50 =
15 nM), aber die Erholung der lebenden Zellen (Toxizität) wird
bei Konzentrationen der Verbindung bis zu 3,0 μM nicht beeinflusst.
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Beispiel 2 - Antiproliferative
Effekte von Discodermolid auf humane Tumorzellinien
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Discodermolid
wird zusätzlich
auf seine antiproliferativen Effekte mittels des in vitro Tumorzellliniensatzes
des National Cancer Institute's
evaluiert. Die Ergebnisse dieser Analysen sind in den Mittelwertkurven gezeigt,
die in den 1A–1C gezeigt sind. Die Daten
werden dargestellt mittels bekannter und anerkannter Messungen der "Wachstumshemmung
50" (GI50), worin das Wachstum von 50 % der Zellen
gehemmt wird, "Totaler
Wachstumshemmung" (TGI),
worin das Wachstum aller Zellen gehemmt wird, das heißt Cytostase
und "Lethale Konzentration
50" (LC50), worin 50 % der Zellen getötet werden.
Von den etwa 60 getesteten Zelllinien zeigt Discodermolid eine selektive
Cytotoxizität
(wie dies durch die Balken rechts von der Mittellinie gezeigt wird)
bei 32 Zelllinien für
GI50 und 18 Zelllinien für TGI. Gemäß LC50 Messungen
für die
NCl Zelllinien ist die getestete Verbindung besonders gegen humanen
nicht-kleinzelligen Lungenkrebs (NCl-H23), humane Colonkrebsarten
(COLO 205 und HCC-2998), humanes Melanom (M14), zwei von sechs ZNS
Krebszelllinien (SF 295 und SF 539) und zwei von acht Brustkrebszelllinien
(MDA-MB-435 und MDA-N) wirksam. Eine statistische Analyse dieses
selektiven Toxizitätsmusters
(der COMPARE Algorithmus) zeigt, dass das Cytotoxizitätsmuster von
Discodermolid dem von mehreren vorher getesteten interaktiven Mikrotubulusmitteln
gleicht, einschließlich
dein von Taxol erzeugten Muster.
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Beispiel 3 - Effekt von
Discodermolid auf den Zellzyklusfortschritt von humanen GI-101A
Brustzellen, humanen A549 Lungenzellen und humanen Jurkat-Leukämiezellen
im Vergleich zu Taxol
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Es
werden Zellzyklusuntersuchungen gestartet, um eine spezifische Phase
im Zellzyklus festzulegen, bei der Discodermolid seine antiproliferative
Wirkung ausübt.
Humane GI-101A Brustzellen und humane A549 Lungenzellen werden als
Zellzyklusziele verwendet, um die Wirkungen von Discodermolid und
Taxol auf die Pertubation des Zellzyklus zu vergleichen. Die Zellzyklusanalysen
werden folgendermaßen
ausgeführt: GI-101A
und A549 Zellen werden bei 37°C
in 10 % CO2 in Luft in Gegenwart oder Abwesenheit
von verschiedenen Konzentrationen an Discodermolid oder Taxol (bezogen
von Molecular Probes, Eugene, OR) für 48 Stunden inkubiert. Die
Zellen werden geerntet, in Ethanol fixiert und mit. 0,5 mg/ml Propidiumiodid
(P.I.) zusmmen mit 0,1 mg/ml RNase A gefärbt. Dieses Verfahren perimabilisiert
lebende Zellen und erlaubt den Eintritt von P.I., um die DNA zu
färben.
Die gefärbten
Präparationen
werden auf einen COULTER EPICS ELITE mit einer Anregung von 488
nm analysiert, wobei die toten Zellen durch Zurücksetzen von P.I. Präparationen
ohne Detergenz in vorwärts
und seitwärts
Streuhistogrammen ausgeschlossen werden. Die Fluoreszenzmessungen
und die entstehenden DNA Histogramme werden aus zumindest 5000 P.I.
gefärbten
Zellen mit einer Emissionswellenlänge von 690 mn gewonnen. Die
rohen Histogrammdaten werden weiter mittels eines Zellzyklusanalyseprogramms
analysiert (Multicycle, Phoenix Flow Systems). Die Ergebnisse dieser
Experimente sind in den 2A–2C und 3A–3C gezeigt.
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Die
Kontrollkulturen von GI-101A Brustzellen zeigen ein charakteristisches
Muster des Zellzyklus. Etwa 56 % der Kontrollzellen umfassen die
G, Phase des Zellzyklus und 30 % umfassen die S Phase. Nur etwa 14
% der Zellen befinden sich nachweisbar zu jeder Zeit in der G2/M Phase in nicht synchronisierten Kulturen aufgrund
ihrer hohen Proliferationsrate (2A).
24 Stuuden nach einem Kulturstart mit 100 ng/ml Discodermolid nimmt
der Prozentsatz der Zellen in der G, Phase auf 22 % ab. Der Prozentsatz
der S Phasenzellen erhöht
sich von 30 % auf 41 %, während
der Prozentsatz an Zellen in G2/M dramatisch
von 14 % in der Kontrolle auf 38 % in den mit Discodermolid behandelten
Zellen ansteigt (2B),
was einen Block in der G2/M Phase des Zellzyklus
anzeigt. GI-101A
Zellen, die für
24 Stunden mit Taxol behandelt wurden, zeigen fast identische Effekte.
Der Prozentsatz an Zellen in G, nimmt von 56 % für die Kontrolle auf 27 % in
Kulturen ab, die mit. Taxol behandelt wurden. Der Prozentsatz an
S-Phasenzellen nimmt von 30 % auf 37 % zu, während der Prozentsatz an G2/M Phasenzellen von 14 % in der Kontrolle
auf 37 % in mit Taxol behandelten Kulturen zunimmt, was einen Block
bei G2/M anzeigt ( 2C). Diese Ergebnisse zeigen, dass sowohl
Discodermolid als auch Taxol ähnliche
Effekte auf die Proliferation von GI-101A Zellen ausüben, nämlich die
Blockierung der Zellproliferation an der G2/M
Phase des Zellzyklus.
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Discodermolid
und Taxol werden bezüglich
ihrer Effekte auf die Proliferation der humanen A549 Lungenzellen
verglichen. Die Zellkulturen werden ähnlich in Gegenwart und Abwesenheit
von verschiedenen Konzentrationen von Discodermolid oder Taxol gestartet
und bei 37°C
bei 10 % CO2 in Luft für 48 Stunden inkubiert. Die
Zellen werden geerntet, gefärbt
und im Durchflusscytometer wie oben angegeben analysiert. Die Kontrollkulturen
von A549 Zellen zeigen ein normales Zyklusmuster für diese
Linie mit etwa 77 % der Zellen in G1, 19
% in der S Phase und nur 4 % in der G2/M
Phase des Zellzyklus (3A).
Die Behandlung der Zellen mit 100 ng/ml Discodermolid führt zu einer
Verringerung des Prozentsatzes der Zellen in G1 von
77 % in der Kontrolle auf 18 % bei mit Discodermolid behandelten
Zellen und eine dramatische Erhöhung
des Prozentsatzes an Zellen in G2/M von
4 % in der Kontrolle auf 67 % in mit Discodermolid behandelten Zellen
(3B). Die Taxolbehandlung
von A549 Zellen führt
zu fast identischen Ergebnissen , wobei der Prozentsatz an Zellen
in G, von 77 % in der Kontrolle auf 11 % in mit Taxol behandelten
Zellen abnimmt und der Prozentsatz an Zellen in G2/M
von 4 % in der Kontrolle auf 77 % in mit Taxol behandelten Zellen
zunimmt (3C). Der Prozentsatz der
Zellen in der S-Phase verändert
sich in beiden Gruppen nicht signifikant. Diese Ergebnisse zeigen,
dass Discodermolid und Taxol ähnliche
G2/M Blockierungseffekte auf humane A549
Lungenzellen haben.
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Discodermolid
und Taxol werden bezüglich
ihrer Effekte auf die Proliferation von humanen Jurkat Leukämiezellen
verglichen. Die Zellkulturen werden ähnlich in Gegenwart und Abwesenheit
von verschiedenen Konzentrationen an Discodermolid oder Taxol gestartet
und bei 37°C
in 10 % CO2 in Luft für 48 Stunden inkubiert. Die
Zellen werden geerntet und gefärbt
und auf einem Durchflusscytometer mittels Standardverfahren analysiert.
Die Kontrollkulturen der Jurkat Zellen zeigen normale Zellzyklusmuster
für diese
Linie, wobei etwa 68 % der Zellen in G,, 25 % in der S-Phase und
7 % in der G2/M Phase des Zellzyklus sind
(4A). Die Behandlung
von Zellen mit 100 ng/ml Discodermolid führt zu einer Abnahme des Prozentsatzes
an Zellen in G1, von 68 % in der Kontrolle
auf 35 % bei den mit Discodermolid behandelten Zellen und zu einer
dramatischen Zunahme des Prozentsatzes an Zellen in G2/M
von 7 % in der Kontrolle auf 27 % bei den mit Discodermolid behandelten
Zellen (4B). Die Taxolbehandlung
von Jurkatzellen führt
zu fast identischen Ergebnissen, wobei der Prozentsatz an Zellen
in G1 von 68 % in der Kontrolle auf 34 %
in den mit Taxol behandelten Zellen abnimmt und der Prozentsatz
an Zellen in G2/M von 7 % in der Kontrolle
auf 28 % bei mit Taxol behandelten Zellen zunimmt (4C). Der Prozentsatz der Zellen in der
S-Phase in beiden Gruppen erhöht
sich von 25 % in der Kontrolle auf 38 % sowohl in den mit Discodermolid
als auch in den mit Taxol behandelten Zellen. Diese Ergebnisse zeigen,
dass Discodermolid und Taxol ähnliche
G2/M Blockierungseffekte auf die humanen
Jurkat Leukämiezellen
haben.
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Beispiel 4 - Effekt von
Discodermolid auf humane Brustcarzinomzellen
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Es
wird die Wirkung von Discodermolid auf zwei humane Brustcarzinomzelllinien,
nämlich Östrogenrezeptor-positive
MCF-7 Zellen und Östrogenrezeptor-negative
MDA-MB-231 Zellen bestimmt. Die Ergebnisse werden mit denen verglichen,
die durch Behandlung mit Taxol erhalten werden. Beide Linen werden
auf Arzneimitteleffekte bezüglich
des Wachstums und durch indirekte Immunfluoreszenz auf Effekte auf
das Mikrotubuluscytoskelett untersucht. Die Ergebnisse sind für beide
Linien ähnlich.
Die HK50 für Discodermolid beträgt 2,4 nM,
was zum 2,1 nM Wert ähnlich
ist, der mit Taxol erhalten wird. Die Immunfluoreszenzmuster von
Zellen, die mit Discodermolid behandelt sind, zeigen eine bemerkenswerte
Umlagerung von zellulären
Mikrotubuli, was die Förderung
einer Ansmmlung von Mikrotubuli und eine Taxol ähnliche Wirkung anzeigt. Diese
Muster treten bei Konzentrationen von bis zu 10 nM auf. Ähnliche
aber weniger ausgeprägte
Veränderungen
treten mit einer Taxolbehandlung auf aber nur bei einer viel höheren Arzneimittelkonzentration
(1μM).
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Beispiel 5 - Effekte von
Discodermolid auf die Tubulinpolymerisation und Stabilisierung
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Discodermolid
wird auf die Wechselwirkungen mit Tubulin untersucht. Die Tubulinpolymerisation
wird turbidometrisch bei 350 nm mit einem elektronischen Temperaturkontrollgerät verfolgt.
Die Reaktionsgemische enthalten 0,1 M 4-Morpholinethansulfonat (pH
6,9), 1,0 mg/ml (10μM)
elektrophoretisch homogenes Tubulin aus dem Rinderhirn, das von
ungebundenen Nukleotiden durch Gelfiltration befreit wurde, 0,5
mg/ml hitzebehandelte MAPs, 100 μM
GTP und 4 % (V/V) Dimethylsulfoxid. Eine Konzentration von 10 μM Discodermolid (Kurve
3) wird mit derselben Konzentration an Taxol (Kurve 2) und ohne
Arzneimittel (Kurve 1) verglichen, wie dies in 5 gezeigt ist. Diese Ergebnisse zeigen,
dass die schnelle Polymerisation unmittelbar beginnt, wenn Discodermolid
zum Tubulin enthaltenden Reaktionsgemisch bei 0°C gegeben wird, wobei die Rektion
fast vollständig
ist. Das Taxol-enthaltende Gemisch beginnt keine Zusammenlagerung
bis die Temperatur 10 °C
erreicht, während
die Kontrolle (kein Arzneimittel) bei 37°C die Zusammelagerung beginnt.
Beim Zurückkehren auf
0°C zerfällt das
Kontrollgemisch, wie erwartet und es findet eine leichte Abnahme
der Zusammenlagerung des Taxolgemisches statt, aber das Discodermolidgemisch
bleibt stabil. Es wurde auch in anderen Studien beobachtet, dass
Discodermolid die Zusammenlagerung von Tubulin ohne MAPs oder GTP
induziert und diese Reaktionen sind noch dramatischer im Vergleich
zu denen, die mit Taxol beobachtet wurden, speziell bei niedrigen
Temperaturen. Es wurde in zusätzlichen
Studien festgestellt, dass der EC50 Wert
für die
Polymerisation von Tubulin durch Discodermolid 2,7 μM im Vergleich
zu 23 μM
für Taxol
beträgt.
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Elektronenmikroskopische
Aufnahmen von Polymeren von Tubulin, die sich in Gegenwart von Discodermolid,
Taxol und der Kontrolle bilden, zeigen sehr ähnliche Eigenschaften, das
Vorkommen von Polymeren, Mikrotubuli und Lagen, wobei die durch
Taxol induzierten Polymere etwas länger sind, als die, welche
mit Discodermolid induziert wurden und die Kontrollpolymere sind
sogar noch länger
als die der mit Discodermolid oder Taxol induzierten Präparationen.
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Die
Ergebnisse aus dieser Studie legen nahe, dass der Wirkmechanismus
von Discodermolid in Bezug auf die Stabilisierung von Mikrotubuli
dein von Taxol überlegen
ist.
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Beispiel 6 - Formulierung
und Verabreichun
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Die
erfindungsgemäßen Verbindungen
sind für
verschiedene nicht-therapeutische und therapeutische Zwecke brauchbar.
Es ist aus den Tests ersichtlich, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen
für die
Hemmung des Zellwachstums wirksam sind. Aufgrund der andproliferativen
Eigenschaften der Verbindungen sind sie auch zur Verhinderung von
unerwünschtem
Zellwachstum bei einer großen
Vielzahl an Situationen brauchbar, einschließlich in vitro Verwendungen.
Sie sind auch als Standards und für Lehrdemonstrationen brauchbar.
Sie können
auch als ultraviolette Schutzmoleküle in der Plastikindustrie
verwendet werden, da sie UV Strahlen sehr wirksain absorbieren.
Wie hierin beschrieben, sind sie auch prophylaktisch und therapeutisch zur
Behandlung von Krebszellen bei Tieren und Menschen brauchbar.
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Die
therapeutische Anwendung der neuen Verbindungen und der Zusammensetzungen,
die sie enthalten, kann durch jedes geeignete therapeutische Verfahren
und jede Technik erreicht werden, die derzeit oder in Zukunft dem
Fachmann bekannt ist. Darüberhinaus
haben die erfindungsgemäßen Verbindungen
eine Verwendung als Ausgangsmaterialien oder Zwischenprodukte zur
Herstellung von anderen brauchbaren Verbindungen und Zusammensetzungen.
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Die
Dosisverabreichung an einen Wirt bei den obigen Indikationen hängt von
der Identität
der Krebszellen, dem Typ des involvierten Wirts, dessen Alter, Gewicht,
Gesundheitszustand, der Art der derzeitigen Behandlung, falls eine
erfolgt, der Häufigkeit
der Behandlung und des therapeutischen Verhältnisses ab.
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Die
Verbindungen der vorliegenden Erfindung können gemäß bekannter Verfahren zur Herstellung von
pharmazeutisch brauchbaren Zusammensetzungen formuliert werden.
Die Formulierungen werden im Detail in mehreren Quellen beschrieben,
die dem Fachmann gut bekannt und leicht zugänglich sind. Beispielsweise
beschreibt Remington's
Pharmaceutical Science von E. W. Martin Formulierugen, die in Zusammenhang mit
der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Im allgemeinen werden
die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung so formuliert,
dass eine wirksame Menge der bioaktiven Verbindungen) mit einem geeigneten
Träger
kombiniert wird, um die effektive Verabreichung der Zusammensetzung
zu erleichtern.
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Gemäß der Erfindung
enthalten pharmazeutische Zusammensetzungen als Wirkstoff eine wirksame Menge
einer oder mehrerer der neuen Verbindungen und ein oder mehrere
nicht toxische pharmazeutisch annehmbare Träger oder Verdünnungsmittel.
Beispiele für
solche Träger
zur Verwendung in der Erfindung umfassen Ethanol, Dimethylsulfoxid,
Glycerin, Siliziumdioxid, Aluminiumoxid, Stärke und äquivalente Träger und Verdünnungsmittel.
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Um
für die
Verabreichung solcher Dosierungen für die gewünschte therapeutische Behandlung
zu sorgen, umfassen neue pharmazeutische Zusammensetzungen der Erfindung
vorteilhafterweise zwischen etwa 0,1 % und 45 % und speziell 1 und
15 Gewichtsprozent an einer oder mehrerer der neuen Verbindungen
auf der Grundlage des Gewichts der Gesamtzusammensetzung einschließlich Träger oder
Verdünnungsmittel. Beispielsgemäß können die
Dosierungsmengen der verabreichten Wirkstoffe sein: Intravenös 0,01 bis
etwa 20 mg/kg, intraperitoneal 0,01 bis etwa 100 mg/kg, subkutan
0,01 bis etwa 100 mg/kg, intramuskulär 0,01 bis etwa 100 mg/kg,
oral 0,01 bis etwa 200 mg/kg und vorzugsweise etwa 1 bis 100 mg/kg,
intranasale Einbnngung 0,01 bis etwa 20 mg/kg und durch Aerosol
0,01 bis etwa 20 mg/kg des Körpergewichts.