DE60108359T2

DE60108359T2 - Biologisch wirksame, analoge verbindungen von discodermoliden

Info

Publication number: DE60108359T2
Application number: DE60108359T
Authority: DE
Inventors: P. Sarath GUNASEKERA; E. Ross LONGLEY; Richard A. Toronto ISBRUCKER; Gopal K. Paul; A. Shirley POMPONI; E. Amy WRIGHT
Original assignee: Harbor Branch Oceanographic Institution Inc
Current assignee: Harbor Branch Oceanographic Institution Inc
Priority date: 2000-03-01
Filing date: 2001-02-28
Publication date: 2005-12-22
Anticipated expiration: 2021-03-01
Also published as: WO2001064663A3; US6495594B2; ES2236208T3; CA2401160A1; PT1259502E; ATE286890T1; US20010049387A1; CA2401160C; EP1259502A2; EP1259502B1; WO2001064663A2; JP2003525284A; AU2001247241A1; DE60108359D1

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft organische Verbindungen und Zusammensetzungen, die nützliche therapeutische Eigenschaften aufweisen. Insbesondere betrifft die Erfindung neue Discodermolidverbindungen, die Immunmodulator- und Antitumoraktivitäten aufweisen, pharmazeutische Zusammensetzungen, die solche Verbindungen umfassen, und Verfahren ihrer Verwendung für therapeutische Zwecke. Ein weiterer Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung betrifft die Identifizierung von Regionen des Discodermolidmoleküls, das verantwortlich ist für bestimmte Aspekte der Bioaktivität von Discodermolid.
Hintergrund der Erfindung
Von großer Bedeutung für den Menschen ist die Kontrolle oder Steuerung von pathologischer Zellproliferation, so wie die, die im Fall von Krebs auftritt. Umfangreiche Forschung und Ressourcen wurden der Onkologie und Antitumormaßnahmen gewidmet, einschließlich der Chemotherapie. Während gewisse Verfahren und chemische Zusammensetzungen entwickelt wurden, die bei der Hemmung oder Inhibition, Rückführung oder Bekämpfung oder Kontrolle des Wachstums von z. B. Tumoren helfen, werden neue Verfahren und chemische Antitumorzusammensetzungen benötigt.
Bei der Suche nach neuen biologisch wirksamen Verbindungen wurde gefunden, dass einige natürliche Produkte und Organismen potentielle Quellen sind für chemische Moleküle, die nützliche biologische Aktivität von großer Vielfalt aufweisen. Z. B. das Diperten, das allgemein als Taxol bekannt ist, das aus mehreren Spezies von Eibenbäumen isoliert wird, ist ein Mitose-Spindel-Gift, das Mikrotubuli stabilisiert und ihre Depolymerisation in freies Tubulin hemmt (D. A. Fuchs, R. K. Johnson [1978] Cancer Treat. Rep. 62: 1219 bis 1222; P. B. Schiff, J. Fant, S. B. Horwitz [1979] Nature (London) 22: 665 bis 667). Von Taxol ist auch bekannt, dass es Antitumoraktivität aufweist und eine große Anzahl von klinischen Tests durchlaufen hat, die gezeigt haben, dass es wirksam ist bei der Behandlung von einem weiten Bereich von Krebs-Arten (E. K. Rowinski, R. C. Donehower [1995] N. Engl. J. Med. 332: 1004 bis 1014). Siehe z. B. auch die US-Patente mit den Nummern US 5 157 049 A ; US 4 960 790 A und US 4 206 221 A .
Von Meeresschwämmen ist bewiesen, dass sie eine Quelle von biologisch wirksamen chemischen Molekülen sind. Eine Anzahl von Veröffentlichungen offenbaren organische Verbindungen, die aus Meeresschwämmen stammen, einschließlich P. J. Scheuer (Hrsg.) Marine Natural Products, Chemical and Biological Perspectives, Academic Press, New York, 1978 bis 1983, Band I–V; D. Uemura, K. Takahashi, T. Yamamoto, C. Katayama, J. Tanaka, Y. Okumura, Y. Hirata (1985): J. Am. Chem. Soc. 107: 4790 bis 4798; L. Minale et al. (1976) Fortschr. Chem. org. Naturst. 33 : 1 bis 72; D. J. Faulkner, (1998) Natural Products Reports 15: 113 bis 158; S. P. Gunasekera, M. Gunasekera, R. E. Longley und G. K. Schulte (1990) "Discodermolide: A new bioactive polyhydroxy lactone from the marine sponge Discodermia dissoluta", J. Org. Chem, 55: 4912 bis 4915 [Korrektur (1991) J. Org. Chem. 56: 1346]; Deborah T. Hung, Jenne B. Nerenberg, Stuart Schreiber (1994) "Distinct binding and cellular properties of synthetic(+)- and (–) discodermolides", Chemistry and Biology 1: 67 bis 71; Deborah T. Hung, Jie Cheng, Stuart Schreiber (1996) (+)-Discodermolide binds to microtubules in stoichiometric ratio to tubulin dimers, blocks Taxol binding and results in mitotic arrest", Chemistry and Biology 3: 287 bis 293; Jennie B. Nerenberg, Deborah T. Hung, Patricia K. Somers, Stuart L. Schreiber (1993) "Total synthesis of immunosuppressive agent (–)-discodermolide", J. Amer. Chem. Soc. 115: 12621 bis 12622; Amos B. Smith III, Yuping Qiu, David R. Jones, Karoru Kobayashi (1995) "Total synthesis of (–)-discodermolide", J. Amer. Chem. Soc. 117: 12011 bis 12012; Scott H. Harried, Ge Yang, Marcus A. Strawn, David C. Myles (1997) "Total synthesis of (–)-discodermolide: an application of a chelation-controlled alkylation reaction", J. Org. Chem. 62 6098 bis 6099; R. Balachandran, E. ter Haar, M. J. Welsh, S. G. Grant und B. W. Day (1998) "The potent microtubule-stabilizing agent (+)-discodermolide induces apoptosis in human breast carcinoma cellspreliminary comparisons to paclitaxel", Anticancer Drugs 9: 67 bis 76 und die darin zitierten Dokumente. Das US-Patent mit der Nummer 4 808 590 offenbart Verbindungen, die antivirale, Antitumor- und Antipilzeigenschaften aufweisen, die isoliert sind aus dem Meeresschwamm Theonella sp. (Internationale Patentanmeldung Nr. WO 98/24429 A; R. J. Kowalski, P. Giannakakou, S. P. Gunasekera et al. (1997) Mol. Pharmacol. 52: 613 bis 622; E. ter Haar, R. J. Kowalski, E. Hamel et al. (1996) Biochemistry 35: 243 bis 250; J. A. Stafford, und M. M. Mehrotra (1995) Chemtract: Org. Chem. 8: 41 bis 47 und US-Patent Nr. 5 789 605 A; US-Patent Nr. 4 939 168 A, M. Gunasekera et al., Discodermolide compounds, compositions containing saure and methods of preparation and use; und Internationale Patentanmeldung WO 97/20835 A, Harbor Branch Oceanographic Instit., Discodermolide compounds and pharmaceutical compositions containing the saure.
Kurze Zusammenfassung der Erfindung
Eine Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung neuer Zusammensetzungen von biologisch wirksamen Discodermolidanaloga, die vorteilhaft verwendet werden können für Immunmodulation und/oder Behandlung von Krebs. Die Verbindungen der vorliegenden Verbindung besitzen den Nutzen zur Verwendung bei der Behandlung von Krebs und als Tubulinpolymerisatoren und als Mikrotubulus stabilisierende Mittel.
Bei einer speziellen Ausführungsform können die neuen Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden bei der Behandlung von einem Lebewesen, das als Wirt Krebszellen aufweist, einschließlich z. B. Hemmung des Wachstums von Tumorzellen in oder bei einem Säugerwirt. Insbesondere können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden zur Hemmung des Wachstums von Tumorzellen bei oder in einem Menschen, einschließlich der Zellen von Brust-, Kolon-, ZNS-, Ovarial-, Nieren-, Prostata-, Leber-, Pankreas-, Uterus- oder Lungentumoren, sowie Humanleukämie- oder Melanomzellen. Die Mechanismen zur Erreichung der Antikrebsaktivität, die durch die Verbindungen der vorliegenden Erfindung erreicht werden, würden einen Durchschnittsfachmann dazu führen, die Anwendbarkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen, Zusammensetzungen und Verfahren an weitere oder zusätzliche Typen von Krebs, wie die hierin beschriebenen, zu erkennen.
Die vorliegende Erfindung stellt neue Analoga von Discodermolid bereit, die vorteilhafterweise nützliche biologische Aktivität besitzen gegen Tumore und andere Formen von Krebs. Ein weiterer Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung erstreckt sich auf die Identifizierung von Regionen des Discodermolidmoleküls, das verantwortlich ist für bestimmte Aspekte der Bioaktivität von Discodermolid.
Bei speziellen Ausführungsformen stellt die vorliegende Erfindung vier neue Analoga von Discodermolid bereit, das aus der Natur isoliert ist, und neun neue Analoga von Discodermolid, hergestellt durch organische Synthese. Die erfindungsgemäßen Verbindungen wurden weder zuvor aus einer natürlichen Quelle isoliert noch wurden sie zuvor synthetisiert. Diese Verbindungen zeigen die Effekte von biologischer Aktivität auf, verursacht durch 1) Modifizierung der Funktionalität, die sich an dem Lactonen de des Moleküls befindet; 2) Reduktion von ausgewählten Doppelbindungen, die in dem Molekül vorliegen und 3) den Beitrag der Carbamatfunktionalität hinsichtlich der biologischen Aktivität.
Eingeschlossen in diese Ausführungsformen sind Analoga, die hergestellt werden können durch Modifizierungen an fünf Regionen oder Bereichen des Discodermolidmoleküls, und zwar folgenden: 1) die C-1 bis C-7-Lacton- und Verbindungsregion, 2) die erste C-8 bis C-15 Haarnadel, 3) die zweite C-16 bis C-20 Haarnadel, 4) das C-21 bis C-24 Dien und 5) das Carbamat an C-19. Die Aktivität der Verbindungen ist verschieden gemäß dem/den Bereiche(en), die modifiziert sind. Die Strukturaktivitätsdaten bieten die C-8 bis C-15 und C-16 bis C-20 Haarnadelregionen als entscheidend an für die Aktivität des Discodermolidmoleküls durch Bereitstellung einer optimalen Raumbeziehung zwischen den C-11 Hydroxyl- und den C-17 Hydroxylfunktionalitäten, die in natürlichen und synthetischen Analoga gefunden werden, die wesentlich sind für die Induktion der Tubulinpolymerisation und Stabilisierung des Mikrotubulusnetzwerks, was eine Blockade in dem Zellzyklus an dem G₂/M Kontrollpunkt (Check point) verursacht. Außerdem stellt die C-1 bis C-7 Lacton- und Verbindungsregion einen Wasserstoffbindungsakzeptor bereit, wie eine Carbonylgruppe, und die C-21 bis C-24 Dienregion dient dazu, eine hydrophobe Gruppe bereitzustellen; beide Funktionalitäten, die in der gleichen räumlichen Beziehung angeordnet sind zu den C-11 und C-17 Hydroxylgruppen, wie sie in Discodermolid und aktiven Analoga gefunden wird.
Gemäß der vorliegenden Erfindung schließen Verfahren zur Hemmung oder Inhibition von Krebszellen bei einem Wirt ein Kontaktieren von Tumorzellen mit einer wirksamen Menge der neuen pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung ein. Die Krebszellen, die durch die Erfindung gehemmt werden, sind solche, die empfänglich sind für die in dieser Beschreibung beschriebenen erfindungsgemäßen Verbindungen oder Zusammensetzungen, die solche Verbindungen umfassen.
Weiter Gesichtspunkte der Erfindung schließen die Bereitstellung von Verfahren ein zur Herstellung der neuen Verbindungen und Zusammensetzungen.
Weitere Aufgaben und ein weiterer Bereich der Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung wird ersichtlich aus den Beschreibungen in Einzelheiten, die in dieser Beschreibung angegeben sind; es sollte jedoch verstanden werden, dass die Beschreibungen in Einzelheiten, während sie bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung angeben, nur zum Zweck der Veranschaulichung angegeben sind, da viele Veränderungen und Modifizierungen innerhalb des Geistes und Schutzbereichs der Erfindung aus solchen Beschreibungen ersichtlich sind.
Kurze Beschreibung der Figuren
Die 1 zeigt das Discodermolidmolekül, das unterteilt werden kann in fünf allgemeine Bereiche oder Regionen: Die C-1 bis C-7 Lacton- und Verbindungsregion, die erste C-8 bis C-15 Haarnadel, die zweite C-16 bis C-20 Haarnadel, das C-21 bis C-24 Dien und das Carbamat am C-19. Die Aktivität des Discodermolidmoleküls ist verschieden gemäß der/den Region(en), die modifiziert ist/sind. Die Strukturaktivitätsdaten geben die C-8 bis C-15 und C-16 bis C-20 Haarnadelregionen als entscheidend an für die Aktivität des Discodermolidmoleküls durch Bereitstellung einer optimalen räumlichen Beziehung für die C-11 Hydroxyl- und die C-17 Hydroxylfunktionalitäten, die gefunden werden in natürlichen und synthetischen Analoga, die entscheidend sind für die Induktion der Tubulinpolymerisation und Stabilisierung des Mikrotubulusnetzwerks, was eine Blockade im Zellzyklus an der G₂/M Kontrollstelle verursacht. Außerdem stellt die C-1 bis C-7 Lacton- und Verbindungsregion einen Wasserstoffbindungsakzeptor bereit, wie eine Carbonylgruppe, und die C-21 bis C-24 Dienregion dient wie eine Carbonylgruppe, und die C-21 bis C-24 Dienregion dient dazu, eine hydrophobe Gruppe bereitzustellen; beide Funktionalitäten sind in der gleichen räumlichen Beziehung oder dem räumlichen Verhältnis angebracht zu den C-11 und C-17 Hydroxylgruppen, wie sie gefunden wird in Discodermolid und aktiven Analoga.
Die 2 zeigt die Strukturen von Discodermolid und gewisse natürliche Analoga von Discodermolid (Verbindungen II bis V) der vorliegenden Erfindung.
Die 3A bis B zeigen die Strukturen von gewissen semisynthetischen Analoga von Discodermolid (Verbindungen VI bis XIV) der vorliegenden Erfindung.
Die 4 zeigt die Induktion von der Tubulinpolymerisation von gereinigtem Rinderhirn, wie sie bestimmt ist durch Aufzeichnung der Veränderungen in der optischen Dichte bei 350 nm während 61 min. Die Verbindungen wurden getestet bei 10 μM mit 1 mg/ml Tubulin. Die Temperatur wurde verändert während des Verlaufs des Experiments wie folgt: Das Experiment wurde begonnen mit einer Anfangstemperatur von 4°C und 1 min lang gehalten; die Temperatur wurde dann erhöht auf 35°C mit einer Geschwindigkeit von 1°C/min, 1 min lang bei 35°C gehalten, gesenkt auf 4°C mit einer Geschwindigkeit von 2°C/min und schließlich 14 min lang bei 4°C gehalten. Die gezeigten Kurven stehen für die Verbindungen: Discodermolid (I); 2-Desmethyldiscodermolid (II); 19-Desaminocarbonyldiscodermolid (III); 2-Epidiscodermolid (IV) und 3-Deoxy-2Δ-discodermolid (VI).
Die 5 zeigt die Induktion der Tubulinpolymerisation von gereinigtem Rinderhirn, wie sie bestimmt ist durch Aufzeichnung der Veränderungen in der optischen Dichte bei 350 nm während 61 min. Die Verbindungen wurden getestet bei 10 μM mit 1 mg/ml Tubulin. Die Temperatur wurde verändert während des Verlauf des Experiments wie folgt: Das Experiment wurde begonnen mit einer Anfangstemperatur von 4°C und 1 min lang gehalten; die Temperatur wurde dann erhöht auf 35°C mit einer Geschwindigkeit von 1°C/min, 1 min lang bei 35°C gehalten, auf 4°C gesenkt mit einer Geschwindigkeit von 2°C/min und schließlich 14 min lang bei 4°C gehalten. Die gezeigten Kurven stehen für Discodermolid (I); 8,21,23-Hexahydrodiscodermolid (XIII) und 7-Deoxy-8,21,23-hexahydrodiscodermolid (XIII).
Die 6A bis F zeigen Flusscytometerhistogramme, die Zellzykluseffekte zeigen bei unbehandelten gegenüber behandelten humanen A549 Lungenadenokarzinomzellen:
(6A) zeigt unbehandelte Kontrollzellen;
(6B) zeigt Zellen, die behandelt sind mit 100 nM Discodermolid (I);
(6C) zeigt Zellen, die behandelt sind mit 100 nM 8,21,23-Hexahydrodiscodermolid (XII);
(6D) zeigt Zellen, die behandelt sind mit 100 nM 7-Deoxy-8,21,23-hexahydrodiscodermolid (XIII);
(6E) zeigt Zellen, die behandelt sind mit 1.000 nM 7-Deoxy-8,21,23-hexahydrodiscodermolid (XIII) und
(6F) zeigt Zellen, die behandelt sind mit 1.000 nM 7-Deoxy-8,21,23-hexahydrodiscodermolid-3,11,17-triacetat (XIV).
Detaillierte Offenbarung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt neue Zusammensetzungen bereit von biologisch aktiven Discodermolidverbindungen, die nützlich sind für die Immunmodulation und/oder Behandlung von Krebs. Insbesondere können die neuen Verbindungen, Zusammensetzungen und Verfahren zur Verwendung vorteilhaft verwendet werden, um das Wachstum von Tumor- und anderen Krebszellen bei einem Säuger als Wirt zu hemmen. Wie in dieser Beschreibung beschrieben ist, weisen die Verbindungen der vorliegenden Erfindung die Nützlichkeit zur Verwendung bei der Behandlung von Krebs auf, als Tubulinpolymerisatoren und als Mikrotubulus stabilisierende Mittel. Insbesondere können die erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet werden zur Hemmung des Wachstums von Tumorzellen bei einem Menschen, einschließlich Zellen von Brust-, Kolon-, ZNS-, Ovarial-, Nieren-, Prostata-, Leber-, Pankreas-, Uterus- oder Lungentumoren, sowie Humanleukämie- oder Melanomzellen.
Gemäß der Erfindung schließen Verfahren zur Hemmung von Krebs bei einem Wirt ein das Kontaktieren von Krebszellen mit einer wirksamen Menge der neuen pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung. Die Tumorzellen, die durch die Erfindung gehemmt werden, sind solche, die empfänglich sind für die erfindungsgemäßen Verbindungen, die in dieser Beschreibung offenbart sind, oder Zusammensetzungen, die solche Verbindungen umfassen.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner Verfahren der Verwendung der neuen Verbindungen und Zusammensetzungen der Erfindung bereit, z. B. Verfahren zur Verbesserung der Immunantworten und Verfahren der Hemmung von Tumoren und anderen Krebszellen bei einem Lebewesen, vorzugsweise einem Säuger. Besonders bevorzugt umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Antitumorbehandlung eines Menschen, der einer solchen Behandlung bedarf, das heißt einem Menschen, der als Wirt Krebszellen aufweist, einschließlich Brust-, Kolon-, Leber-, Pankreas-, Uterus- oder Lungentumorzellen oder Leukämiezellen. Zusätzlich zu den Typen von Krebszellen, die oben aufgeführt sind, für welche die erfindungsgemäßen Discodermolide und Zusammensetzungen besonders nützlich sind, haben die erfindungsgemäßen Verbindungen auch gezeigt, dass sie nützlich sind für ihre antiproliferative Aktivität gegen gewissen ZNS-Krebszelllinien, Melanomzelllinien, Ovarialkrebszelllinien, Nierenkrebszelllinien und Prostatakrebszelllinien. Es würde erwartet werden, basierend auf der besonderen antiproliferativen Art und Weisen der Wirkung, die in dieser Beschreibung identifiziert ist, dass zusätzliche Krebszelllinien ebenso inhibiert werden durch solche Verbindungen.
Verschiedene Enantiomere der Discodermolide, wie oben definiert, können synthetisiert werden von Durchschnittsfachleuten. Das natürliche Discodermolid, das isoliert wird aus Meeresschwämmen, wird überwiegend als das (+)-Enantiomer gefunden.
Bei bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung sind die Verbindungen im Wesentlichen rein, das heißt sie enthalten mindestens 95% der Verbindung, wie durch herkömmliche analytische Verfahren bestimmt.
Discodermolidverbindungen und Verfahren zur Herstellung solcher Verbindungen oder Zusammensetzungen, die sie umfassen, sind beschrieben in den US-Patenten mit den Nummern US 4 939 168 A , US 5 010 099 A , US 5 681 847 A und US 5 840 750 A sowie US 6 127 406 A , die hiermit durch Bezugnahme einverleibt sind.
Bei weiteren bevorzugten Verfahren der Erfindung werden Salze innerhalb des Umfangs der Erfindung hergestellt durch die Addition von Mineralsäuren, z. B. HCl, H₂SO₄, oder starken organischen Säuren, z. B. Ameisensäure, Oxalsäure, in geeigneten Mengen, um das Säureadditionssalz der Stammverbindung oder ihres Derivats zu bilden. Auch Reaktionen vom Synthesetyp können verwendet werden gemäß den bekannten Verfahren, um verschiedene Gruppen zu addieren oder zu modifizieren bei den bevorzugten Verbindungen, um andere Verbindungen herzustellen innerhalb des Schutzbereichs der Erfindung.
Der Schutzbereich der Erfindung ist nicht beschränkt durch die speziellen Beispiele und vorgeschlagenen Verfahren und Verwendungen, die sich hierauf beziehen, da Modifizierungen innerhalb des Schutzbereichs gemacht werden können ausgehend von den Informationen, die durch diese Beschreibung den Fachleuten bereitgestellt wird.
Analoga sind Verbindungen, die strukturell verwandt sind mit Discodermolid, einschließlich natürlicher und synthetischer Derivate, Metabolite und Intermediate.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde bestimmt, dass Analoga von Discodermolid, wo die linke Seite des Moleküls acetyliert ist, an den Positionen C-3 und C-7 größere Cytotoxizität aufweisen. Dies kann z. B. gesehen werden bei Discodermolid-3-acetat, Discodermolid-7-acetat und Discodermolid-3,7-diacetat. Siehe das US-Patent mit der Nummer US 6 127 406 A . Analoga mit Acetylgruppen an der Position C-11, z. B. Discodermolid-3,11-diacetat und Discodermolid-3,7,11-tiacetat, zeigen eine verringerte Cytotoxizität verglichen mit dem Stamm- oder Elternmolekül, wohingegen Verbindungen, die eine Acetylierung einschließen an der Position C-17 eine dramatische Reduzierung in der Aktivität der Analoga verursachen, wie ersichtlich bei Discodermolid-3,7,11,17-tetraacetat, Discodermolid-3,7,17-triacetat und Discodermolid-3,17-diacetat. Aus diesen Daten kann geschlossen werden, dass die C-11 und C-17 Hydroxylgruppen zu der Gesamtcytotoxizität des Discodermolidmoleküls beitragen.
Das Discodermolidmolekül kann unterteilt werden in fünf allgemeine Bereiche: Die C-1 bis C-7 Lacton- und Verbindungsregion, die erste C-8 bis C-15 Haarnadel, die zweite C-16 bis C-20 Haarnadel, das C-21 bis C-24 Dien und das Carbamat am C-19 (siehe 1). Die Aktivität des Discodermolidmolküls ist verschieden gemäß der/den Region(en), die modifiziert ist/sind. Die Strukturaktivitätsdaten geben die C-8 bis C-15 und C-16 bis C-20 Haarnadelregionen als entscheidend an für die Aktivität des Discodermolidmoleküls durch Bereitstellung einer optimalen räumlichen Beziehung für die C-11 Hydroxyl- und die C-17 Hydroxylfunktionalitäten, die gefunden werden in natürlichen und synthetischen Analoga, die wesentlich sind für die Induktion der Tubulinpolymerisation und Stabilisierung des Mikrotubulusnetzwerks, was eine Blockade in dem Zellzyklus an der G₂/M Kontrollstelle verursacht. Außerdem stellt die C-1 bis C-7 Lacton- und Verbindungsregion einen Wasserstoffbindungsakzeptor bereit, wie eine Carbonylgruppe, und die C-21 bis C-24 Dienregion dient dazu, eine hydrophobe Gruppe bereitzustellen; beide Funktionalitäten sind in der gleichen räumlichen Beziehung oder räumlichen Verhältnis angebracht zu den C-11 und C-17 Hydroxylgruppen, wie sie gefunden wird in Discodermolid und aktiven Analoga.
Materialien und Verfahren
Ein umfassenderes Verständnis der Erfindung kann erhalten werden durch Bezug auf die folgenden speziellen Beispiele von Verbindungen, Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung. Die folgenden Beispiele veranschaulichen Verfahren zur Ausführung der Erfindung. Diese Beispiele sollten nicht als beschränkend ausgelegt werden. Alle Prozentangaben beziehen sich auf das Gewicht und alle Lösemittelmischungsverhältnisse beziehen sich auf das Volumen, sofern es nicht anders angegeben ist. Den Fachleuten ist es ersichtlich, dass die Beispiele den Gebrauch von Materialien und Reagenzien einschließen, die kommerziell erhältlich sind von bekannten Quellen, z. B. Chemikalienherstellern, sodass keine Einzelheiten in Bezug darauf angegeben sind.
Beispiel 1
Isolierung und Strukturaufklärung von 2-Desmethyldiscodermolid (II)
sDas Schwammexemplar 23-XI-98-3-002, das identifiziert ist als Discodermia sp. (HBOI Katalog Nr. 003:00973) wurde gesammelt von einem bemannten Tauchboot vor Lucaya, Grand Bahama Island, Bahamas (Breite: 26° 30,727' N, Länge: 78° 35,026' W), in einer Tiefe von 515 Fuß und wurde bei –20°C gelagert bis zur Extraktion. Der nasse Schwamm (2000 g) wurde in Ethanol (EtOH) getränkt, und der konzentrierte EtOH-Extrakt verteilt zwischen Ethylacetat (EtOAc) und Wasser (H₂O). Die EtOAc-lösliche Fraktion wurde chromatographiert über Kieselgel unter Verwendung eines Stufengradienten von EtOAc-MeOH als Elutionsmittel. Die Fraktionen wurden überprüft durch Dünnschichtchromatographie und ¹H NMR Spektren hinsichtlich der Gegenwart von Discodermolid und Discodermolidanaloga. Die DC-Muster und das ¹H NMR-Spektrum der Fraktion, die mit 2 bis 5% MeOH/EtOAc eluiert wurde, zeigte die Gegenwart eines Discodermolidanalogons zusätzlich zu Discodermolid. Diese Fraktion ergab bei weiterer Reinigung durch HPLC (SiO₂, 5 μm, 250 × 10 mm) mit 7% MeOH/CH₂Cl₂ als Elutionsmittel 2-Desmethyldiscodermolid als weißen Feststoff (Ausbeute: 0,5 mg, 0,00002% des nassen Gewichts).
2-Desmethyldiscodermolid: [α]²¹D 10,2° (c 0,1, MeOH); IR (pur/NaCl) ν_max 3374, 1721, 1710, 1323, 1037 cm^–1; HRFABMS (Glycerin) m/z 580,3853, Δ 0,4 mmu für C₃₂H₅₃NO₈ (M + H)⁺. Siehe Tabellen 1 und 2 für die ¹H bzw. ¹³C NMR-Spektren.
Das ¹H NMR-Spektrum von 2-Desmethyldiscodermolid war sehr ähnlich zu dem von Discodermolid mit dem Hauptunterschied in dem Vorliegen von Resonanzen für nur sieben Methylgruppen anstelle der 8 Methylgruppen, die beobachtet werden, bei Discodermolid. Die detaillierte Analyse des ¹H NMR zeigte die Abwesenheit des Signals der C-2 Methylgruppe, die in der Regel im Tieffeld auftaucht aufgrund der Entschirmung durch die benachbarte Carbonylgruppe. Das DEPT-Spektrum zeigte den Ersatz des C-2 Methinkohlenstoffs durch einen Methylenkohlenstoff, der bei 40,3 ppm auftrat. Das COSY-Spektrum zeigte klar die Kopplung dieser neuen Methylenprotonen, die beobachtet wurden bei 2,52 und 2,56 ppm mit dem C-3 Hydroxymethin, das bei 3,95 ppm beobachtet wurde. Diese Daten zusammen mit den Daten des Massenspektrums bestätigten die Struktur von 2-Desmethyldiscodermolid.
Beispiel 2
Isolierung und Strukturaufklärung von 19-Desaminocarbonyldiscodermolid (III)
Das Schwammexemplar 23-XI-98-3-001, das identifiziert ist als Discodermia sp. (HBOI Katalog Nr. 003:00972) wurde gesammelt von einem bemannten Tauchboot vor Lucaya, Grand Bahama Island, Bahamas (Breite: 26° 30,727' N, Länge: 78° 35,026' W), in einer Tiefe von 515 Fuß und wurde bei –20°C gelagert bis zur Extraktion. Der nasse Schwamm (2480 g) wurde in EtOH getränkt, und der konzentrierte EtOH-Extrakt verteilt zwischen EtOAc und H₂O. Die EtOAc-lösliche Fraktion wurde chromatographiert über Kieselgel mit MeOH/EtOAc. Die Fraktionen wurden überprüft durch Dünnschichtchromatographie und ¹H NMR hinsichtlich der Gegenwart von Discodermolid und Discodermolidanaloga. Das ¹H NMR-Spektrum der Fraktion, die mit 0 bis 2% MeOH/EtOAc eluiert wurde, zeigte die Gegenwart eines Discodermolidanalogons zusätzlich zu Discodermolid. Diese Fraktion ergab bei weiterer Reinigung durch HPLC (SiO₂, 5 μm, 250 × 10 mm) mit 6% MeOH/CH₂Cl₂ als Elutionsmittel, gefolgt von HPLC auf der gleichen Säule unter Verwendung von 3% MeOH/CH₂Cl₂ als Elutionsmittel, 19- Desaminocarbonyldiscodermolid als weißen Feststoff (Ausbeute: 1,1 mg, 0,00006% des nassen Gewichts).
19-Desaminocarbonyldiscodermolid: [α]²¹D 18,0° (c 0,1, MeOH); IR (pur/NaCl) ν_max 3393, 1103, 1030 cm^–1; HRFABMS (Glycerin) m/z 551,3937, Δ 1,0 mmu für C₃₂N₅₄NO₇ (M + H)⁺. Siehe Tabellen 1 und 2 für die ¹H bzw. ¹³C NMR-Spektren.
Das ¹H NMR-Spektrum von 19-Desaminocarbonyldiscodermolid war nahezu identisch zu dem von Discodermolid. Das ¹H NMR-Spektrum zeigte die Abwesenheit des charakteristischen Signals von zwei Protonen für die Aminocarbonylgruppe, die bei Discodermolid als breites Signal auftritt bei 5,05 ppm. Das Aminocarbonyloxymethinproton, das bei Discodermolid bei 4,71 ppm auftritt, zeigte eine Hochfeldverschiebung zu 3,41 ppm, was die Gegenwart eines typischer durch Hydroxy substituierten Methinprotons anstelle eines Aminocarbonyloxymethinprotons an der C-19 Position anzeigte. Das ¹³C NMR-Spektrum zeigte die Abwesenheit eines Signals das dem Aminocarbonyloxykohlenstoff zugeordent wird, das in Discodermolid bei 158,4 ppm auftritt. Diese Daten bestätigten zusammen mit den Daten des Massenspektrums die Struktur von 19-Desaminocarbonyldiscodermolid.
Beispiel 3 (Referenzbeispiel)
Isolierung und Strukturbestimmung von 2-Epidiscodermolid (IV)
Das Schwammexemplar 23-XI-98-1-005, das identifiziert ist als Discodermia sp. (HBOI Museum Katalog Nr. 003:00971) wurde gesammelt von einem bemannten Tauchboot vor dem Bell Channel Buoy, Grand Bahama Island, Bahamas (Breite: 26° 30,662' N, Länge: 78° 34,976' W), in einer Tiefe von 482 Fuß und wurde bei –20°C gelagert bis zur Extraktion. Der nasse Schwamm (1931 g) wurde in EtOH getränkt, und der konzentrierte EtOH-Extrakt verteilt zwischen EtOAc und H₂O. Die EtOAc-lösliche Fraktion wurde chromatographiert über Kieselgel mit CH₂Cl₂, gefolgt von einem EtOAc-MeOH Gradienten. Die Fraktionen wurden überprüft durch Dünnschichtchromatographie und ¹H NMR hinsichtlich der Gegenwart von Discodermolid und Discodermolidanaloga. Die Fraktion, die eluiert wurde mit 5% MeOH/EtOAc, zeigte die Gegenwart eines Discodermolidanalogons, das bei weiterer Reinigung durch HPLC (SiO₂, 5 μm, 250 × 10 mm) mit 6% MeOH/CH₂Cl₂ als Elutionsmittel 2-Epidisocermolid als weißen Feststoff ergab (Ausbeute: 0,3 mg, 0,00001% des nassen Gewichts).
2-Epidiscodermolid: [α]²¹D 10,7° (c 0,1, MeOH); IR (pur/NaCl) ν_max 3394, 1720, 1041, 1028 cm^–1; HRFABMS (3-Nitrobenzylalkohol) m/z 594,4003, Δ 0,2 mmu für C₃₃H₅₅NO₈ (M + H)⁺. Siehe Tabellen 1 und 2 für die ¹H bzw. ¹³C NMR-Spektren.
Die ¹H und ¹³C NMR-Spektren von 2-Epidiscodermolid waren sehr ähnlich zu denen von Discodermolid und zeigten geringere Unterschiede bei der chemischen Verschiebung und der Kopplungskonstanten bei der Lactonfunktionalität. Das NOESY-Spektrum von Discodermolid zeigte Korrelationen zwischen C-2-Me und C-3-H, dem C-2-H und C-3-H, dem C-4-Me und C-3-H und dem C-3-H und C-4-H, von denen alle mit der berichteten Struktur übereinstimmten, bei der es eine axiale Methylgruppe gibt an C-2, eine axiale Hydroxylgruppe bei C-3 und eine äquatoriale Methylgruppe bei C-4. Das NOESY-Spektrum von 2-Epidiscodermolid zeigte Korrelationen zwischen dem C-2-Me und C-3-H, dem C-2-H und C-4-H, dem C-4-Me und C-3-H und dem C-3-H und C-4-H. Die starke NOE-Korrelation zwischen C-2-H und C-4-H zeigte die eins-drei diaxiale Anordnung dieser Wasserstoffatome. Dies Daten bestätigten, dass das C-2-Me, das eine axiale Anordnung in Discodermolid aufweist, in eine äquatoriale Anordnung im 2- Epidiscodermolid geschnippt oder geklappt ist. Die obigen Daten bestätigten zusammen mit den Daten des hoch auflösenden Massenspektrums die Struktur von 2-Epidiscodermolid.
Beispiel 4 – Isolierung und Strukturbestimmung von Methyldiscodermolat (V)
Das Schwammmaterial Discodermia sp. (23-XI-98-1-003, HBOM Katalog Nr. 003:00970) wurde gesammelt am 23. November 1998 von einem bemannten Tauchboot vor Bell Channel Buoy, Grand Bahama Island, Bahamas (Breite: 26° 30,662' N, Länge: 78° 34,976' W), in einer Tiefe von 493 Fuß und wurde bei –20°C gelagert bis zur Extraktion. Der nasse Schwamm (3570 g) wurde in EtOH getränkt, und der konzentrierte EtOH-Extrakt verteilt zwischen EtOAc und H₂O. Die EtOAc-lösliche Fraktion wurde chromatographiert über Kieselgel mit einem MeOH/EtOAc Gradienten und Fraktionen wurden kontrolliert durch Dünnschichtchromatographie und ¹H NMR-Spektren in Bezug auf Discodermolid und Discodermolidanaloga. Das ¹H NMR-Spektrum der Fraktion, die eluiert wurde mit 0 bis 2% MeOH/EtOAc, zeigte die Gegenwart eines Discodermolidanalogons zusätzlich zu dem Discodermolid. Diese Fraktion ergab bei weiterer Reinigung durch HPLC (SiO₂, 5 μm, 250 × 10 mm) mit 7% MeOH/CH₂Cl₂, gefolgt von HPLC mit 4% MeOH/CH₂Cl₂ Methyldiscodermolat als einen weißen Feststoff in einer Menge von 1,1 mg (Ausbeute, 0,00003% des nassen Gewichts).
Methyldiscodermolat: [α]²¹D 14,6° (c 0,1, MeOH); IR (pur/NaCl) ν_max 3361, 1710, 1393, 1046 cm^–1; HRFABMS (Glycerin) m/z 626,4252, Δ 1,6 mmu für C₃₄H₅₉NO₉ (M + H)⁺. Siehe Tabelle 3 für die ¹H bzw. ¹³C NMR-Spektren.
Das ¹H NMR-Spektrum von Methyldiscodermolat war, wie erwartet, sehr ähnlich zu dem von Discodermolid. Das ¹H NMR-Spektrum zeigte ein zusätzliches Drei-Protonen Singulett für eine Methoxygruppe bei 3,63 ppm. Das C-5 Lactonproton, das in Discodermolid bei 4,46 ppm auftauchte, war zu einem hohen Feld verschoben zu 3,90 ppm, was das Vorliegen einer Hydroxygruppe in dieser Position anzeigt. Das ¹³C NMR-Spektrum zeigte eine 4,6 ppm Hochfeldverschiebung für das C-5 und ein Signal bei 52,2 ppm, das charakteristisch ist für eine Methoxygruppe. Das INAPT-Spektrum zeigte eine Drei-Bindungskorrelation für die Methoxyprotonen zu dem Estercarbonyl bei 176,7 ppm. Diese Daten bestätigen zusammen mit den Daten des nassen Spektrums die Struktur des Discodermolidmethylesters.
Beispiel 5 – Herstellung von 3-Deoxy-2Δ-discodermolid (VI)
Discodermolid-3-acetat (2,4 mg), hergestellt wie beschrieben im US-Patent mit der Nummer US 6127 406 A , wurde behandelt mit 2 ml gesättigtem wässrigen Na₂CO₃ in EtOH (1 : 9) und die Mischung wurde 24 h lang gerührt. Das Lösemittel wurde durch Destillation kontrolliert unter vermindertem Druck, und das Produkt wurde verteilt zwischen EtOAc und N₂O. Die EtOAc-lösliche Fraktion wurde konzentriert, und der Rückstand ergab nach Reinigung durch HPLC (SiO₂, 5 μm, 250 × 10 mm) mit 4,5% MeOH/CH₂Cl₂ als Elutionsmittel 3-Deoxy-2Δ-discodermolid als einen weißen Feststoff (1,2 mg, 50% Ausbeute).
Die ¹H und ¹³C NMR-Spektren von 3-Deoxy-2Δ-discodermolid (Tabelle 4 bzw. 6) waren ähnlich zu denen, die für Discodermolid beobachtet wurden. Das ¹H NMR-Spektrum zeigte Signale an für 8 Methylgruppen. Es zeigte jedoch das Vorliegen von zwei vinylischen Methyl-Singuletts im Vergleich zu einem vinylischen Methyl in Discodermolid. Der Vergleich des ¹H NMR-Spektrums von 3-Deoxy-2Δ-discodermolid mit dem von Discodermolid zeigte an, dass das ins Tieffeld verschobene Methyldublett, das dem C-2-Me in Discodermolid entspricht, verändert war zu einer vinylischen Methylgruppe in 3-Deoxy-2Δ-discodermolid. Das ¹H-¹H COSY-Spektrum zeigte eine Kopplung zwischen dem vinylischen Methyl bei 1,88 ppm mit dem neu gebildeten breiten olefinischen Singulett, das beobachtet wurde bei 6,33 ppm. Obwohl keine Kopplung gesehen wurde zwischen dem olefinischen Singulett bei 6,33 ppm und dem C-4-H, das bei 2,44 ppm beobachtet wurde, ergab die allylische Natur des letzteren Protons die Position der neuen ungesättigten Struktur. Der Rest des ¹H NMR-Spektrums war identisch zu dem von Discodermolid. Die COSY-Spektraldaten wurden verwendet, um die Werte der chemischen Verschiebung für alle Protonen in der Verbindung zuzuordnen. Diese Daten bestätigen die Struktur von 3-Deoxy-2Δ-discodermolid.
Beispiel 6 – Herstellung von 3-Deoxy-2Δ-discodermolid-17-acetat (VII) und 3-Deoxy-2Δ-discodermolid-11,17-diacetat (VIII)
Discodermolid-3,7,11,17-tetraacetat (4,0 mg), hergestellt wie beschrieben im US-Patent mit der Nummer US 6 127 406 A , wurde mit 2 ml gesättigtem wässrigen Na₂CO₃ in EtOH (1 : 9) behandelt, und die Mischung wurde 4 h lang bei 40°C gerührt. Das Lösemittel wurde bei vermindertem Druck konzent riert, und das Produkt wurde zwischen EtOAc und H₂O verteilt. Die EtOAc-lösliche Fraktion wurde konzentriert, und der Rückstand nach Reinigung durch HPLC (SiO₂, 5 μm, 250 × 10 mm, mit 3,5% MeOH/CH₂Cl₂ als Elutionsmittel) ergab 3-Deoxy-2Δ-discodermolid-17-acetat (1,0 mg) als weißen Feststoff und 3-Deoxy-2Δ-discodermolid-11,17-diacetat als weißen Feststoff (2,0 mg).
Das ¹H NMR-Spektrum von 3-Deoxy-2Δ-discodermolid-17-acetat (Tabelle 5) war sehr ähnlich zu dem von 3-Deoxy-2Δ-discodermolid (Tabelle 4) und 3-Deoxy-2Δ-discodermolid-11,17-diacetat (Tabelle 4). Das Spektrum zeigte jedoch die Gegenwart von einer Acetylgruppe bei 2,07 ppm, was andeutet, dass drei Acetylgruppen während der Reaktion eine Hydrolyse durchlaufen haben. Die Gegenwart des vinylischen Methyls bei 1,88 ppm zusammen mit dem olefinischen Singulett bei 6,32 zeigte die Gegenwart der 3-Deoxy-2Δ-funktionalität, wie in 3-Deoxy-2Δ-discodermolid. Die Hochfeldverschiebung des C-7-H (beobachtet bei 4,72 ppm) um 0,89 ppm und des C-11-H (beobachtet bei 3,12 ppm) um 1,49 ppm, im Vergleich mit dem C-7-H und dem C-11-H von Discodermolidtetraacetat, zeigte die Abwesenheit von Acetylgruppen an diesen Positionen an. Der Rest des ¹H-Spektrums glich dem von Discodermolid-3,7,11,17-tetraacetat. Eine sorgfältige Analyse des COSY-Spektrums ordnete die Werte der chemischen Verschiebungen den verbleibenden Protonen in der Verbindung zu. Die ¹³C NMR-Daten sind in der Tabelle 6 berichtet. Diese Daten bestätigten die Struktur von 3-Deoxy-2Δ-discodermolid-17-acetat.
Das ¹H NMR-Spektrum von 3-Deoxy-2Δ-discodermolid-11,17-diacetat (Tabelle 4) glich sehr stark dem von 3-Deoxy-2Δ-discodermolid (Tabelle 4). Das Spektrum zeigte jedoch die Gegenwart von zwei Acetylgruppen, die beobachtet wurden bei 2,08 und 2,04 ppm, was andeutet, dass zwei Acetylgruppen eine Hydrolyse während der Reaktion durchlaufen hatten. Die Gegenwart den vinylischen Methyls bei 1,88 ppm zusammen mit dem olefinischen Singulett bei 6,32 zeigte die Gegenwart der 3-Deoxy-2Δ-funktionalität, wie in 3-Deoxy-2Δ-discodermolid. Die Hochfeldverschiebung von C-7-H (beobachtet bei 4,66 ppm) um 0,95 ppm im Vergleich zu dem C-7-H von Discodermolidtetraacetat (beobachtet bei 5,61 ppm) zeigte die Abwesenheit einer Acetylgruppe in dieser Position. Der Rest des ¹H-Spektrums glich dem von Discodermolid-3,7,11,17-tetraacetat. Eine sorgfältige Analyse des COSY-Spektrums ordnete die Werte der chemischen Verschiebung den verbleibenden Protonen in der Verbindung zu. Diese Daten bestätigten die Struktur von 3-Deoxy-2Δ-discodermolid-11,17-diacetat.
Beispiel 7 – Herstellung von 3-Deoxy-2Δ-discodermolid-7,11,17-triacetat (IX)
3-Deoxy-2Δ-discodermolid-11,17-diacetat (1,0 mg) wurde in trockenem Pyridin (0,5 ml) gelöst und mit 20 ml Essigsäureanhydrid behandelt. Die Mischung wurde 4 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Destillation des Lösemittels unter vermindertem Druck ergab 3-Deoxy-2Δ-discodermolid-7,11,17-triacetat als weißen Feststoff (1,0 mg, % Ausbeute – 100%). Das ¹H NMR-Spektrum von 3-Deoxy-2Δ- discodermolid-7,11,17-triacetat (Tabelle 5) glich sehr stark dem von 3-Deoxy-2Δ-discodermolid-11,17-diacetat (Tabelle 4). Das ¹H-Spektrum zeigte die Gegenwart von drei Acetylgruppen, die beobachtet wurden bei 2,08, 2,01 und 1,99 ppm, was die Acytilierung anzeigte von der C-7-OH Gruppe in 3-Deoxy-2Δ-discodermolid-11,17,diacetat. Die Gegenwart des vinylischen Methyls bei 1,88 ppm zusammen mit dem olefinischen Singulett bei 6,30 ppm zeigte die Gegenwart von der 3-Deoxy-2Δ-funktionalität, wie bei dem 3-Deoxy-2Δ-discodermolid-11,17-diacetat. Die Tieffeldverschiebung des C-7-H zu 5,64 ppm von 4,66 ppm in der Ausgangsverbindung zeigte die Acetylierung der C-7-OH Gruppe. Die verbleibenden Signale in dem ¹H-Spektrum glichen dem von 3-Deoxy-2Δ-discodermolid-11,17-diacetat. Die chemischen Verschiebungswerte für die verbleibenden Protonen wurden zugeordnet durch Analyse von dem COSY-Spektrum der Verbindung. Die ¹³C NMR-Daten werden in der Tabelle 6 gezeigt. Diese Daten bestätigten die Struktur von 3-Deoxy-2Δ-discodermolid-7,11,17-triacetat.
Beispiel 8 – Herstellung von 3-Deoxy-2Δ-discodermolid-11-acetat (X)
Discodermolid-3,7,11-triacetat (3,0 mg) wurde behandelt mit 2 ml gesättigtem wässrigen Na₂CO₃ in EtOH (1 : 9), und die Mischung wurde 24 h lang bei 25°C gerührt. Das Lösemittel wurde durch Destillation unter vermindertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde verteilt zwischen CH₂Cl₂ und H₂O. Die CH₂Cl₂-lösliche Fraktion wurde konzentriert, und der Rückstand ergab bei Reinigung durch HPLC (SiO₂ ,5 μm, 250 × 10 mm) unter Verwendung von 2,5% MeOH/CH₂Cl₂ als Elutionsmittels 3-Deoxy-2Δ-discodermolid-11-acetat als weißen Feststoff als das Hauptprodukt (1,5 mg).
Das ¹H NMR-Spektrum von 3-Deoxy-2Δ-discodermolid-11-acetat (Tabelle 5) glich stark dem von 3-Deoxy-2Δ-discodermolid (Tabelle 4). Das ¹H-Spektrum zeigte die Gegenwart von einer Acetylgruppe, die beobachtet wurde bei 2,08 ppm, was ein monoacetyliertes Produkt anzeigt. Der Vergleich des ¹H NMR-Spektrums dieser Verbindung mit der von 3-Deoxy-2Δ-discodermolid zeigte die Gegenwart eines Acetats bei C-11. Das C-11-H Acetoxymethinproton tauchte auf bei 4,72 ppm, was eine Tieffeldverschiebung anzeigte von 1,55 ppm, verglichen mit dem Signal, das beobachtet wurde für das C-11-H in 3-Deoxy-2Δ-discodermolid. Die verbleibenden Signale in dem ¹H-Spektrum glichen dem von 3-Deoxy-2Δ-discodermolid. Durch Analyse des COSY-Spektrums wurden die Werte der chemischen Verschiebungen allen Protonen in der Verbindung zugeordnet. Die ¹³C NMR-Daten sind in der Tabelle 6 berichtet. Diese Daten bestätigten die Struktur von 3-Deoxy-2Δ-discodermolid-11-acetat.
Beispiel 9 – Herstellung von 3-Deoxy-2Δ-discodermolid-7-succinat (XI)
Discodermolid (10 mg) wurde gelöst in 4 ml von trockenem Pyridin und behandelt mit 2 mg Bernsteinsäureanhydrid. Die Mischung wurde 1 Woche lang bei Raumtemperatur gerührt und dann eine weitere Woche lang bei 40°C. Das Lösemittel wurde verdampft unter einem Strom von Stickstoff, um einen weißen Feststoff (–10 mg) zu ergeben. Die Mischung wurde durch HPLC getrennt unter Verwendung einer SiO₂-Semiprep-Säule (Phenomenex Luna Säule, 5 μ, 250 × 10 mm) mit 7% MeOH in CH₂Cl₂ als Elutionsmittel, um drei Fraktionen zu ergeben: eine nicht polare Mischung; 2-Epidiscodermolid (~1 mg) und nicht umgesetztes Discodermolid (5 mg). Die nicht polare Mischung wurde nochmals chromatographiert durch HPLC unter Verwendung einer SiO₂ Semiprep Säule (Phenomenex Luna Säule, 5 μ, 250 × 10 mm) mit 5% MeOH in CH₂Cl₂ als Elutionsmittel, um drei Fraktionen zu ergeben: eine zweite nicht polare Mischung, 3-Deoxy-2Δ-discodermolid (2 mg) und 3-Deoxy-2Δ-discodermolid-7-succinat (1 mg).
Der Vergleich der ¹H und ¹³C NMR-Daten von 3-Deoxy-2Δ-discodermolid-7-succinat (Tabelle 7), mit denen von 3-Deoxy-2Δ-discodermolid (Tabelle 4) zeigte große Ähnlichkeiten und zeigte die mögliche Dehydration der C-3 Hydroxylgruppe während der Reaktion. Die Abwesenheit des C-25 Methyldubletts sowie des C-3-H Hydroxymethinprotons zusammen mit der Beobachtung einer neuen olefinischen Methylgruppe (δ 1,80, 3H, s) und eines olefinischen Protons (δ 6,40, 1H, s) in den Spektren dieser Verbindung bestätigten diese Annahme. Die Gegenwart von zwei zusätzlichen Carbonylgruppen (δ 173,8, s; 17,3, s) und zwei zusätzliche Methylengruppen (δ 2,51, 4H, m; ¹³C δ 30,0, t; 29,2, t) zeigten die Bildung des Succinats an. Die Tieffeldverschiebung des 7-Hydroxymethinprotons, das bei 5,68 ppm beobachtet wurde, verglichen mit 4,76 ppm in 3-Deoxy-2Δ-discodermolid, bestätigte die Struktur als 3-Deoxy-2Δ-discodermolid-7-succinat.
Beispiel 10 – Herstellung von 8,21,23-Hexahydrodiscodermolid (XII) und 7-Deoxy-8,21,23-hexahydrodisco-dermolid (XIII)
Discodermolid (34,0 mg), gelöst in EtOH (20 ml) wurde hydriert mit H₂ in Gegenwart des PtO₂ Katalysators während 0,5 h unter Vorlagedruck. Der Katalysator wurde durch Filtration entfernt, und die erhaltene Lösung unter einem Strom von Stickstoff konzentriert, um eine Mischung von hydrierten Produkten zu ergeben. Das Gemisch wurde getrennt durch HPLC unter Verwendung einer SiO₂-Semiprep-Säule (Phenomenex, 5 μ, 250 × 10 mm) mit 7% MeOH in CH₂Cl₂ als Elutionsmittel, um 8,21,23-Hexahydrodiscodermolid (9,0 mg) zu ergeben; [α]²¹D –29,20° (c 1,2, MeOH) und 7-Deoxy-8,21,23-hexahydrodiscodermolid (2,3 mg), [α]²¹D –19,8° (c 0,3, MeOH). Die Tabellen 8 und 9, unten, zeigen di_e ¹H bzw. ¹³C NMR-Daten für diese zwei Analoga.
Beispiel 11 – Herstellung von 7-Deoxy-8,21,23-hexahydrodiscodermolid-3,11,17-triacetat (XIV)
7-Deoxy-8,21,23-hexahydrodiscodermolid (2 mg) wurde gelöst in 0,5 ml von trockenem Pyridin und behandelt mit 2 μl Essigsäureanhydrid. Die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösemittel wurde verdampft unter einem Strom von Stickstoff, um einen weißen Feststoff ~2 mg zu ergeben. Die Mischung wurde getrennt durch HPLC unter Verwendung einer SiO₂-Semiprep-Säule (Phenomenex Luna Säule, 5 μ, 250 × 10 mm) mit 3% MeOH in CH₂Cl₂ als Elutionsmittel, um reines 7-Deoxy-8,21,23-hexahydrodiscodermolid-3,11,17-triacetat (1,5 mg) zu ergeben. Die ¹H NMR-Daten dieser Verbindung sind in der Tabelle 10 gezeigt.
Beispiel 12 – In vitro Antitumoreffekte von Discodermolid und Discodermolidanaloga.
A. Effekte von Discodermolid und Analoga bei der in vitro Proliferation von Tumorzelllinien
Discodermolid und Discodermolidanaloga wurden analysiert hinsichtlich ihrer Effekte auf die Profliferation von humanen A549 Adenokarzinom- und P388 Murinleukämiezelllinien. P388-Zellen wurden erhalten von Dr. R. Camalier, National Cancer Institute, Bethesda, MD, und A549-Zellen wurden erhalten von American Type Culture Collection, Rockville, MD. Alle Zelllinien wurden in einem Gewebekulturmedium gehalten (TCM; Roswell Park Memorial Institute RPMI 1640, ergänzt mit 100 U/ml Penicillin, 100 mg/ml Streptomycin, 60 mg/ml 1-Glutamin, 18 mM HEPES, 0,05 mg/ml Gentamicin (Life Technologies, Gaithersburg, MD) und 10% Fötusrinderserum) und kultiviert in Kunststoffgewebekulturkolben bei 37°C in befeuchteter Luft, die 5% CO₂ enthielt. Stammkulturen von P388-Zellen wurden subkultiviert 1 : 20 in frischem TCM alle 2 bis 3 Tage. Stammkulturen von A549-Zellen wurden subkultiviert 1 : 10 alle 3 bis 4 Tage. Um die antiproliferativen Effekte von Mitteln gegen die Zellen zu testen, wurden 200 ml Kulturen (Gewebekulturplatten mit 96 Gefäßen, Nunc, Dänemark) angelegt mit 1 × 10⁵ Zellen/ml in TCM oder TCM, das das Testmittel enthielt bei 0,03 bis 5,0 μg/ml. Nach einem Durchlauf von 48 h wurden P388-Zellen nummeriert unter Verwendung von 3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT), wie in der Literatur beschrieben (M. C. Alley, et al., Cancer Res. 48: 589, 1988). A549-Zellen wurden spezifiziert auf die gleiche Art und Weise nach einem Verlauf von 72 h. Die Ergebnisse wurden ausgedrückt als % Inhibition oder Hemmung, verglichen zu der negativen (kein Arzneimittel) Kontrolle. Positive Arzneimittelkontrollen von verschiedenen Verdünnungen von 5-Fluoruracil und Adriamycin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) wurden eingeschlossen, um die Empfindlichkeit der Zelllinie gegenüber einem Arzneimittel zu kontrollieren.
Um die Effekte auf die Zellproliferation und die erhaltenen IC₅₀-Werte zu quantifizieren, werden zu jedem Gefäß 75 ml warme Wachstumsmedien, die 5 mg/ml MTT enthielten, gegeben, die Kulturen in den Inkubator zurückgegeben und 3 h ungestört stehengelassen. Um die Bildung von reduziertem Formazan spektrophotometrisch zu quantifizieren, wurden die Platten zentrifugiert (500 × g, 10 min), die Kulturflüssigkeiten durch Aufsaugen entfernt, und 200 μl von angesäuertem Isopropanol (2 ml konzentriertes HCl/Liter Isopropanol) pro Gefäß zugegeben. Die Absorption der erhaltenen Lösungen wird gemessen in einem Plattenleser (TECAN Spectra SLT; TECAN U.S., Research Triangle Park, NC) bei 570 nm und einem 650 nm Referenzfilter. Die Absorption der Testgefäße wird geteilt durch die Absorption von Gläschen ohne Arzneimittel, und die Konzentration des Mittels, die zu einer 50% Absorption von unbehandelten Kulturen (IC₅₀) führt, wird bestimmt durch lineare Regression der Logit-transformierten Daten (D. J. Finney, Statistical Method in Biological Assay, 3. Ausgabe, Seiten 316 bis 348, Charles Griffin Co., London, 1978). Eine lineare Beziehung zwischen der Anzahl der Tumorzellen und der Formazanbildung wurde routinemäßig beobachtet über den Bereich der Zelldichten, die in diesen Experimenten beobachtet wurden. Die zwei Standardarzneimittelkontrollen (oben angegeben) sind in jedem Assay (Untersuchung) eingeschlossen als eine Kontrolle, um die Arzneimittelempfindlichkeit von jeder der Zelllinien zu untersuchen, und die IC₅₀-Werte werden bestimmt für jede Kombination von Arzneimittel-Zelle.
Eine Zusammenfassung der Ergebnisse in diesen Untersuchungen verglichen mit Discodermolid (I) für die Verbindungen II bis V kann in der Tabelle 11 gefunden werden. Die Ergebnisse für die Verbindungen VI bis XIV können in der Tabelle 12 gefunden werden.
B. Effekte von Discodermolid und Analoga auf Mikrotubulus-Bündelungsmuster („Microtubule Bundling" Pattern) in Tumorzellen, wie durch Immunfluoreszenz bestimmt
Discodermolid und Discodermolidanaloga wurden bewertet hinsichtlich ihrer Effekte auf die Morphologie des Mikrotubulusnetzwerks von Zellen unter Verwendung des monoklonalen Maus-Anti-alpha-Tubulin Antikörpers. Mit Discodermolid behandelte Zellen zeigen routinemäßig eine abnormale Bildung von mehrfach centriolar-strahlenden Mikrotubuli mit extensiven Clustern von assoziierten mikrotubulären Bündeln" („Bundles") anstatt des feinen "Netzes" („mesh") von individuellen Mikrotubuli, die das Cytoskelettnetzwerk aufbauen bei unbehandelten Kontrollzellen.
Am Tag 1 wurden 7 × 10⁴ adhärente humane A549 Adenokarzinomtumorzellen über Nacht kultiviert in TCM bei 37°C in 5% CO₂ auf 22 mm² Deckgläschen auf Mikrotiterplatten mit 6 Gefäßen. Am Tag 2 wurde TCM entfernt und ersetzt durch 10 bis 1000 nM Discodermolid oder ein Analogon in TCM oder TCM ohne Arzneimittel (Kontrolle) und über Nacht inkubiert bei 37°C in 5% CO₂. Am Tag 3 wurde TCM entfernt, und die Zellen, die an den Deckgläschen befestigt waren, wurden fixiert mit einer 3,7% Formaldehydlösung in Dulbecco's PBS über einen Zeitraum von 10 min bei Raumtemperatur. Die Zellen wurden permeabilisiert mit einer 2% Triton X-100 Lösung, 2 ml pro Gläschen, 5 min lang bei Raumtemperatur und zweimal gewaschen in Dulbecco's PBS vor einem Färben.
Jedem Gefäß, das Zellen enthielt, die befestigt waren an Deckgläschen, wurde ein 2 ml Volumen von monoklonalem Maus-Anti-alpha-Tubulin Antikörper (Katalog Nr. T-5168, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) 1 : 1000 verdünnt in Dulbecco's Phosphat gepufferter Salzlösung (D-PBS) zugegeben, und die Zellen wurden 45 min lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Deckgläschen wurden einmal mit D-PBS gewaschen. Ein 2 ml Volumen von Ziegen-Antimaus-IgG-FITC, konjugiert im Antikörper (Katalog Nr. T-5262, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 1 : 1000 verdünnt in D-PBS wurde zugegeben, und die Zellen wurden 45 min lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Deckgläschen wurden einmal in D-PBS gewa schen, und die DNS wurde angefärbt mit 0,02 mg/ml Propidiumiodid zusammen mit 0,1 mg/ml Ribonuclease A (RNAse) A in D-PBS bei 37°C über einen Zeitraum von 30 min. Die Deckgläschen wurden dreimal gewaschen mit sterilem destillierten Wasser, an Luft getrocknet und auf Objektträgern befestigt mit SlowFade^TM Antibleichlösung (Molecular Probes, Eugene, OR) und unter dem Mikroskop beobachtet unter Verwendung einer Epifluoreszenzbeleuchtung hinsichtlich der Gegenwart von abnormalen Polstrahlen- und Mikrotubulusbündelbildungen.
Eine Zusammenfassung der Ergebnisse in dieser Untersuchung im Vergleich mit Discodermolid (I) für die Verbindungen II bis V kann in der Tabelle 11 gefunden werden. Die Ergebnisse für die Verbindungen VI bis XIV können in der Tabelle 12 gefunden werden.
C. Effekt von Discodermolid und Analoga auf die Tubulinpolymerisation
Die Polymerisation von gereinigtem Rinderhirntubulin (Cytoskeleton Inc., Denver, CO) wurde befolgt durch Veränderungen in der optischen Dichte von Tubulinlösungen bei 350 nm in einem Hitachi U-3010 Spektrometer, das ausgestattet war mit einem elektronisch thermostatisierten Zellhalter SPR-10. Stammlösungen von Tubulin wurden auf Eis verdünnt in einem G-PEM-Puffer (1 mM GTP, 80 mM PIPES, 1 mM EGTA, 0,5 mM Magnesiumchlorid, pH 6,8) auf eine Endkonzentration von 1 mg/ml. Das Instrument wurde auf 0 gestellt bei dieser Lösung bei 4°C. Discodermolid und seine Analoga wurden dann zugegeben zu der Tubulinlösung bis zu einer Endkonzentration von 10 μM, schnell gemischt, und die Absorption wurde kontrolliert über einen Zeitraum von 61 min. Innerhalb dieses Zeitraums wurde die Temperatur des thermoelektrischen Zellhalter 1 min lang bei 4°C gehalten, auf 35°C erhöht mit einer Geschwindigkeit von 1°C/min, zurück erniedrigt auf 4°C mit einer Geschwindigkeit von 2°C/min und für weitere 14 min bei 4°C gehalten.
Eine Zusammenfassung der Ergebnisse in dieser Untersuchung, verglichen mit Discodermolid (I) für die Verbindungen II bis V kann in der Tabelle 11 gefunden werden. Die Ergebnisse für die Verbindungen VI bis XIV können in der Tabelle 12 gefunden werden. Die 4 zeigt die Polymerisationskurven für die Verbindungen I bis IV und VI. Die 5 zeigt die Polymerisationskurven für die Verbindungen I, XII und XIII.
D. Effekt von Discodermolid und Analoga auf die Zellzyklusprogression von A549 Humanlungenzellen
Zellzyklusuntersuchungen wurden gestartet, um eine spezielle Phase innerhalb des Zellzyklus genau festzulegen, in dem Discodermolidanaloga ihren antiproliferativen Effekt ausübten. A549 Humanlungenzellen wurden verwendet als Zellzyklusziele, um die Effekte von Discodermolid und Discodermolidanaloga zu vergleichen auf die Perturbation des Zellzyklus. Zellzyklusanalysen wurden durchgeführt wie folgt: A549 Zellen wurden inkubiert bei 37°C in 5% CO₂ in Luft in Gegenwart oder Abwesenheit von verschiedenen Konzentrationen von Discodermolid oder Discodermolidanaloga während 24 h. Die Zellen wurden geerntet, in Ethanol fixiert, gewaschen und mit 0,2 mg/ml von Propidiumiodid (P. I.) zusammen mit 0,1 mg/ml von RNAse A gefärbt. Die gefärbten Präparationen oder Zubereitungen wurden analysiert auf einem Coulter EPICS ELITE Flusscytometer mit 488 nM Exzitation. Fluoreszenzmessungen und erhaltene DNS-Histogramme wurden gesammelt aus mindestens 10.000 mit P. I. gefärbten Zellen bei einer Emissionswellenlänge von 690 nnm Rohe Histogrammdaten wurden ferner analysiert unter Verwendung eines Zellzyklusanalyseprogramms (Multicycle, Phoenix Flow Systems).
Eine Zusammenfassung der Ergebnisse dieser Untersuchung im Vergleich zu Discodermolid (I) für die Verbindungen II bis V kann in Tabelle 11 gefunden werden. Die Ergebnisse für die Verbindungen VI bis XIV können in Tabelle 12 gefunden werden. Die 6A bis 6F zeigen Beispiele der flusscytometrischen Histrogramme, die beobachtet wurden für unbehandelte Kontrollzellen und die Verbindungen I, XII, XIII und XIV.
Beispiel 13 – Biologische Aktivität von 2-Desmethyldiscodermolid (II) Mikrotubulusbündelung in A549 Humantumorzellen
Bei 1000 nM waren die morphologischen Veränderungen äquivalent zu solchen, die beobachtet wurden in Zellen, die 1000 nM Discodermolid ausgesetzt wurden. Es gab viel weniger Zellen als in dem Lösemittelkontrollbeispiel. Die Mehrzahl der Zellen war (ab)gerundet oder rund mit extensiver Mikrotubulusbündelung. Nicht (ab)gerundete oder nicht runde Zellen zeigten, dass die Mehrzahl der Mikrotubulusmatrix kondensiert war in perinukleare Bündel. Es gab wenig Polynukleation oder morphologischen Beweis von Zellen, die einer Apoptose unterlagen. Bei 100 nM waren die beobachteten morphologischen Effekte ähnlich zu solchen von Zellen, die 20 bis 50 nM Discodermolid ausgesetzt wurden. Etwas dünne oder kurze periphere Mikrotubulusbündelung wurde beobachtet. Mikronukleationseigenschaften der Apoptose waren extensiv und viele Zellen wiesen mehrfache Polstrahlenbildungen auf. Außerdem wiesen viele Zellen eine dünne und verlängerte Morphologie auf, die nicht charakteristisch war für die Discodermolidbehandlung.
Tubulinpolymerisation
Dieses Analogen induzierte die Polymerisation von Tubulin beginnend bei etwa 9°C. Das polymerisierte Tubulin war stabil bei 4°C. Diese Verbindung zeigte Effekte, die fast äquivalent waren zu denen der Stamm- oder Elternverbindung Discodermolid, da die Zugabe von Discodermolid nur eine geringe Zunahme in der optischen Dichte verursachte.
Zellzykluseffekte
Diese Verbindung induzierte sehr starke apoptotische (Sub-G₁ Peak-)Effekte sowie eine Zunahme in dem Prozentsatz von Zellen, die in der G₂/M Phase des Zellzyklus verblieben.
Diese biologischen Aktivitäten sind in der Tabelle 11 zusammengefasst.
Beispiel 14 – Biologische Aktivität von 19-Desaminocarbonyldiscodermolid (III) Mikrotubulusbündelung in A549 Humantumorzellen
Bei 1000 nM gab es weniger Zellen als in der negativen Kontrollgruppe. Die Mehrzahl der Zellen war (ab)gerundet und abgehoben von der Oberfläche und wies häufig mehrfache Polstrahlenbildungen auf. Die verbleibenden Zellen wiesen eine mittlere Menge an Mikrotubulusbündelung auf, die dazu neigte zentral und perinukleär in der Anordnung zu sein. Es gab etwas Polynukleation sowie Kernabbau, was auf Apoptose hinwies aber nicht extensiv war. Die morphologischen Veränderungen waren äquivalent zu denen, die induziert wurden durch 50 bis 100 nM Discodermolid. Bei 100 nM gab es mehr Zellen als bei der 1000 nM Gruppe, aber weniger als bei der Negativkontrolle. Es gab etwas Mikrotubulusbündelung, die dazu neigte, peripher zu sein, radial und häufig in kürzerer Länge als sie gesehen wird bei 100 nM Konzentrationen von Discodermolid. Auf Apoptose hinweisende Polynukleation sowie Kernabbau waren beide extensiv durch diese Population von Zellen. Zellen mit mehrfachen Polstrahlenbildungen wurden auch leicht gefunden. Die morphologischen Veränderungen waren äquivalent zu denen, die induziert wurden durch 10 bis 20 nM Discodermolid.
Tubulinpolymerisation
Dieses Analogen induzierte niedrige Werte an Tubulinpolymerisation beginnend bei etwa 25°C. Die maximale Polymerisation betrug nur 30 bis 50%, die induziert wurde durch Discodermolid, und die Polymere waren relativ stabil, wenn die Probe bei 4°C gehalten wurde.
Zellzykluseffekte

Starke Apoptose; mittlere G₂/M Blockade.

Diese biologischen Aktivitäten sind in der Tabelle 11 zusammengefasst.
Beispiel 15 – Biologische Aktivität von 2-Epidiscodermolid (IV) Mikrotubulusbündelung in A549 Humantumorzellen
Bei 1000 nM waren die morphologischen Veränderungen zu diesen Zellen ungefähr äquivalent zu denen von 20 nM Discodermolid. Etwas geringere, periphere Polymerisation von der Mikrotubulusmatrix wurde beobachtet, aber diese war nicht extensiv. Die Mikronukleationseigenschaft der Apoptose war weit größer als sie auftrat in Lösemittelkontrollzellen. Es gab eine große Anzahl von Zellen mit mehrfachen Polstrahlenbildungen. Bei 100 nM sieht die Mehrzahl der Zellen aus, wie die negative Kontrollprobe. Es gab keine Mikrotubulusmatrixbündelung und keine beobachtbaren Veränderungen in der Zellverteilung oder Morphologie. Einige wenige Zellen wurden gefunden mit mehrfachen Polstrahlenbildungen, aber dieses machte weniger als 10% der Population aus, die einer Mitose unterlagen. Es gab keine merkliche Zunahme am Auftreten von polynukleierten Zellen oder solchen mit den morphologischen Änderungen, die auf eine Apoptose hinweisen.
Tubulinpolymerisation
Dieses Analogen induzierte niedrige Werte an Tubulinpolymerisation beginnend bei etwa 12°C. Die maximale Polymerisation betrug nur 30 bis 50%, die durch Discodermolid induziert wurde, und die Polymere waren relativ stabil, wenn die Probe bei 4°C gehalten wurde.
Zellzykluseffekte

Apoptose und schwache G₂/M Blockade.

Diese biologischen Aktivitäten sind in der Tabelle 11 zusammengefasst.
Beispiel 16 – Biologische Aktivität von 3-Deoxy-2Δ-discodermolid-7-succinat (XI) Mikrotubulusbündelung in A549 Humantumorzellen
Bei 1000 nM erschienen Zellen, die abgeflacht waren mit einzelnen Kernen; Mikrotubuli waren angeordnet in einem feinen Netz ohne Bündelung, mehrfachen Sternen oder Polynukleation. Bei 100 nM und 10 nM war das morphologische Auftreten nicht unterscheidbar von dem von den unbehandelten (Kontroll-)Zellen.
Tubulinpolymerisation
Wegen der Ähnlichkeit der behandelten Zellen zu denen der Kontrolle wurde die Polymerisation von gereinigtem Tubulin nicht getestet.
Zellzykluseffekte
Bei der höchsten getesteten Konzentration (3000 nM) wurden keine Zellzykluseffekte festgestellt. Es schien eine geringe Induktion von Apoptose aufgetreten zu sein und eine allgemeine Nekrose angezeigt gewesen zu sein. Bei 1000 nM, 100 nM und 10 nM waren die Effekte nicht unterscheidbar von den unbehandelten (Kontroll-)Zellen.
Diese biologischen Aktivitäten sind in der Tabelle 12 zusammengefasst.
Beispiel 17 – Biologische Aktivität von 8,21,23-Hexahydrodiscodermolid (XII) Mikrotubulusbündelung in A549 Humantumorzellen
Es gab weniger Zellen als bei der Kontrolle oder mit Discodermolid behandelten Gruppen sowohl bei 1000 nM als auch 100 nM. Die Mikrotubulusbündelung war ersichtlich bei beiden Konzentrationen, die getestet wurden, obwohl sie nicht so extensiv war, wie sie bei Discodermolid bei diesen gleichen Konzentrationen sein würde. Die Mehrzahl der Zellen war (ab)gerundet und wies mehrfache Polstrahlen auf oder waren in der mitotischen Phase des Zellzyklus. Von den wenigen Zellen, die angehaftet und verteilt waren, schien es keine bemerkenswerte Zunahme zu geben bei der Mikronukleationseigenschaft der Apoptose. Bündel, die gebildet wurden, waren häufig gebogen entlang der Peripherie der Zellen.
Tubulinpolymerisation
8,21,23-Hexahydrodiscodermolid induzierte starke Tubulinpolymerisation, beginnend bei etwa 16°C. Die maximale Polymerisation betrug etwa 80% von der, die durch Discodermolid induziert wurde, und die Polymere waren relativ stabil, wenn die Probe bei 4°C gehalten wurde. Dies ist in 5 gezeigt.
Zellzykluseffekte
Bei 100 nM gab es eine geringe prozentuale Zunahme an den Zellen, die in der G₂/M Phase akkumuliert waren. Diese Konzentration induzierte einen höheren Prozentsatz der Apoptose. Dies ist in 6C gezeigt.
Diese biologischen Aktivitäten sind in der Tabelle 12 zusammengefasst.
Beispiel 18 – Biologische Aktivität von 7-Deoxy-8,21,23-hexahydrodiscodermolid (XIII) Mikrotubulusbündelung in A549 Humantumorzellen
Bei 10 nM gab es keinen sichtbaren Effekt auf die Mikrotubulusmatrix und nur die gewöhnliche Zelle wurde gesehen mit mehrfachen Polstrahlenbildungen. Zellen, die 100 nM ausgesetzt wurden, von dem Analogon wiesen Effekte auf, die vergleichbar waren zu Zellen, die 10 nM von Discodermolid ausgesetzt waren. Ein hoher Prozentsatz an M-Phasenzellen wies mehrfache Polstrahlenbildungen auf, es gab eine geringe Menge von Mikrotubulusbündelung, die sichtbar war bei einigen Zellen, und es gab ein großes Auftreten von Zellen mit Kernabbau charakteristisch für Apoptose. Zellen, die inkubiert wurden mit 1000 nM des Analogons zeigten starke Mikrotubulusbündelung, die äquivalent war zu den morphologischen Veränderungen, die induziert wurden durch 100 nM von Discodermolid. Es gab einen hohen Prozentsatz an Zellen, die einer Apoptose unterlagen, wie es ersichtlich ist durch den Kernabbau, und die meisten abgerundeten Zellen wiesen mehrfache Sternbildungen auf.
Tubulinpolymerisation
7-Deoxy-8,21,23-hexahydrodiscodermolid induzierte niedrige Werte an Tubulinpolymerisation, beginnend bei etwa 24°C. Die maximale Polymerisation betrug 39% von der, die induziert wurde durch Discodermolid, und die Polymere waren relativ stabil, wenn die Probe bei 4°C gehalten wurde. Dies ist in 5 gezeigt.
Zellzykluseffekte
Etwa 50% der Zellpopulation wurde akkumuliert in der G₂/M Phase, folgend auf eine 24 h Inkubation mit 1000 nM 7-Deoxy-8,21,23-hexahydrodiscodermolid. Niedrigere Konzentrationen produzierten keine Zellzykluseffekte. Dies ist in den 6D und 6E gezeigt.
Diese biologischen Aktivitäten sind in der Tabelle 12 zusammengefasst.
Beispiel 19
Biologische Aktivität von 7-Deoxy-8,21,23-hexahydrodiscodermolid-3,11-17-triacetat (XIV) Mikrotubulusbündelung in A549 Humantumorzellen
Bei 10 nM bis 1000 nM passte das Auftreten der Zellen zu dem der unbehandelten/Kontrollzellen; einzelne Kerne waren zentriert in der Zelle, Mikrotubuli waren fein, unterscheidbar und netzartig; keine Bündelung wurde gesehen; keine mehrfachen Sterne; keine apoptotischen Kerne; keine Mehrfachnukleation oder Polynukleation.
Tubulinpolymerisation
Die Tubulinpolymerisationsuntersuchungen wurden nicht durchgeführt an dieser Verbindung, da es den Anschein hatte, dass sie keinen Effekt auf irgendeinen der anderen getesteten Parameter hat.
Zellzykluseffekte
Keine Zellzykluseffekte wurden festgestellt bei 10 nM, 100 nM oder 1000 nM. Der Prozentsatz von Zellen in jeder Phase des Zellzyklus schien ähnlich zu sein zu der Kontrolle (keine Behandlung). Dies ist in 6F gezeigt.
Diese biologischen Aktivitäten sind in der Tabelle 12 zusammengefasst.
Beispiel 20 – Formulierung und Verabreichung
Die Verbindungen der Erfindung sind nützlich für verschiedene nicht therapeutische und therapeutische Zwecke. Es ist aus den Tests ersichtlich, dass die Verbindungen der Erfindung wirksam sind zur Hemmung des Zellwachstums. Wegen der antiproliferativen Eigenschaften der Verbindungen sind sie nützlich, um ungewolltes Zellwachstum zu verhindern bei einer großen Vielzahl von Bedingungen, einschließlich in vitro Anwendungen. Sie sind auch nützlich als Standards und für Lehrdemonstrationszwecke. Sie können auch verwendet werden als Ultraviolett-Screener oder Testverbindungen in der Kunststoffindustrie, da sie wirksam UV-Strahlen absorbieren. Wie in dieser Beschreibung offenbart, sind sie auch prophylaktisch und therapeutisch nützlich zur Behandlung von Krebszellen bei Tieren und Menschen.
Die therapeutische Anwendung der neuen Verbindungen und Zusammensetzungen, die sie enthaften, können erreicht werden durch irgendein geeignetes therapeutisches Verfahren und Techniken, die gegenwärtig oder zukünftig den Fachleuten bekannt sind/werden. Ferner sind die Verbindungen der Erfindung nützlich als Ausgangsmaterialien oder Zwischenstufen für die Herstellung von anderen geeigneten Verbindungen und Zusammensetzungen.
Die Dosierungsverabreichung an einen Wirt bei den obigen Indikationen wird abhängig sein von dem Typ oder der Identität der Krebszellen, dem Typ es jeweiligen Wirts, seines Alters, Gewichts, Gesundheit, Art der begleitenden Behandlung, wenn eine vorliegt, Häufigkeit der Behandlung und dem therapeutischen Zweck.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können formuliert werden gemäß den bekannten Verfahren zur Herstellung pharmazeutisch nützlicher Zusammensetzungen. Formulierungen sind in Einzelheiten beschrieben in einer Anzahl von Quellen, die bekannt und den Fachleuten leicht zugänglich sind. Z. B. beschreibt Remington's Pharmaceutical Science von E. W. Martin Formulierungen, die verwendet werden können in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung. Im Allgemeinen werden die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung formuliert, sodass eine wirksame Menge der bioaktiven Verbindungen) kombiniert wird/werden mit einem geeigneten Träger, um eine wirksame Verabreichung der Zusammensetzung zu vereinfachen.
Gemäß der Erfindung umfassen pharmazeutische Zusammensetzungen als wirksamen Inhaltsstoff eine wirksame Menge von einer oder mehreren der neuen Verbindungen) und einen oder mehrere nicht toxische, pharmazeutisch annehmbare Träger oder Verdünnungsmittel. Beispiele von solchen Trägern zur Verwendung in der Erfindung schließen Ethanol, Dimethylsulfoxid, Glycerin, Silica oder Siliciumoxid, Aluminiumoxid, Stärke und äquivalente Träger und Verdünnungsmittel ein.
Um die Verabreichung von solchen Dosierungen bereitzustellen für die gewünschte therapeutische Behandlung, umfassen neue pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung zwischen etwa 0,1% und 45% und insbesondere 1% und 15% nach Gewicht der Gesamtmenge von einer oder mehreren neuen Verbindungen, bezogen auf das Gewicht der Gesamtzusammensetzung, einschließlich Träger- oder Verdünnungsmittel. Veranschaulichend können Dosierungskonzentrationen der verabreichten aktiven oder wirksamen Inhaltsstoffe sein: intravenös: 0,01 bis etwa 20 mg/kg; intraperitoneal: 0,01 bis etwa 100 mg/kg; subkutan: 0,01 bis etwa 100 mg/kg, intramuskulär: 0,021 bis etwa 100 mg/kg; oral: 0,01 bis etwa 200 mg/kg und vorzugsweise etwa 1 bis 100 mg/kg; intranasale Instillation: 0,01 bis etwa 20 mg/kg und Aerosol: 0,01 bis etwa 20 mg/kg des (Körper) Gewichts des Lebewesens.
Es sollte beachtet werden, dass die Beispiele und Ausführungsformen, die in dieser Beschreibung offenbart sind, nur zu den Zwecken der Veranschaulichung aufgeführt sind und dass verschiedene Veränderungen oder Modifikationen im Licht davon den Fachleuten vorgeschlagen werden und innerhalb des Geistes der Erfindung und des Gegenstands oder Geltungsbereichs dieser Anmeldung und dem Schutzbereich der beigefügten Ansprüche liegen.

Claims

Verwendung einer Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus 2-Desmethyldiscodermolid (II); 19-Desaminocarbonyldiscodermolid (III); Methyldiscodermolat (V), 3-Deoxy-2Δ-discodermolid (VI); 3-Deoxy-2Δ-discodermolid-17-acetat (VII); 3-Deoxy-2Δ-discodermolid-11,17-diacetat (VIII); 3-Deoxy-2Δ-discodermolid-7,11,17-triacetat (IX); 3-Deoxy-2Δ-discodermolid-11-acetat (X); 3-Deoxy-2Δ-discodermolid-7-succinat (XI); 8,21,23-Hexahydrodiscodermolid (XII); 7-Deoxy-8,21,23-hexahydrodiscodermolid (XIII) und 7-Deoxy-8,21,23-hexahydrodiscodermolid-3,11,17-triacetat (XIV) für die Herstellung eines Arzneimittels zur Hemmung des Wachstums von Krebszellen.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung für 2-Desmethyldiscodermolid (II) steht.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung für 19-Desaminocarbonyldiscodermolid (III) steht.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung für Methyldiscodermolat (V) steht.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung für 3-Deoxy-2Δ-discodermolid (VI) steht.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung für 8,21,23-Hexahydrodiscodermolid (XII) steht.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung für 7-Deoxy-8,21,23-hexahydrodiscodermolid (XIII) steht.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Krebszellen ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus humaner Leukämie, Lungenkrebs, Kolonkrebs, ZNS-Krebs, Melanom, Ovarialkrebs, Nierenkrebs, Prostatakrebs, Brustkrebs, Leberkrebs, Pankreaskrebs und Uteruskrebs.
Verbindung zur Hemmung des Wachstums von Krebszellen, wobei die Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus 2-Desmethyldiscodermolid (II); 19-Desaminocarbonyldiscodermolid (III); Methyldiscodermolat (V), 3-Deoxy-2Δ-discodermolid (VI); 3-Deoxy-2Δ-discodermolid-17-acetat (VII); 3-Deoxy-2Δ-discodermolid-11,17-diacetat (VIII); 3-Deoxy-2Δ-discodermolid-7,11,17-triacetat (IX); 3-Deoxy-2Δ-discodermolid-11-acetat (X); 3-Deoxy-2Δ-discodermolid-7-succinct (XI); 8,21,23-Hexahydrodiscodermolid (XII); 7-Deoxy-8,21,23-hexahydrodiscodermolid (XIII); 7-Deoxy-8,21,23-hexahydrodiscodermolid-3,11,17-triacetat (XIV).
Verbindung nach Anspruch 9, wobei die Verbindung für 2-Desmethyldiscodermolid (II) steht.
Verbindung nach Anspruch 9, wobei die Verbindung für 19-Desaminocarbonyldiscodermolid (III) steht.
Verbindung nach Anspruch 9, wobei die Verbindung für Methyldiscodermolat (V) steht.
Verbindung nach Anspruch 9, wobei die Verbindung für 3-Deoxy-2Δ-discodermolid (VI) steht.
Verbindung nach Anspruch 9, wobei die Verbindung für 8,21,23-Hexahydrodiscodermolid (XII) steht.
Verbindung nach Anspruch 9, wobei die Verbindung für 7-Deoxy-8,21,23-hexahydrodiscodermolid (XIII) steht.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus 2-Desmethyldiscodermolid (II); 19-Desaminocarbonyldiscodermolid (III); Methyldiscodermolat (V), 3-Deoxy-2Δ-discodermolid (VI); 3-Deoxy-2Δ-discodermolid-17-acetat (VII); 3-Deoxy-2Δ-discodermolid-11,17-diacetat (VIII); 3-Deoxy-2Δ-discodermolid-7,11,17-triacetat (IX); 3-Deoxy-2Δ-discodermolid-11-acetat (X); 3-Deoxy-2Δ-discodermolid-7-succinat (XI); 8,21,23-Hexahydrodiscodermolid (XII); 7-Deoxy-8,21,23-hexahydrodiscodermolid (XIII); 7-Deoxy-8,21,23-hexahydrodiscodermolid-3,11,17-triacetat (XIV).
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 16, wobei die Verbindung für 2-Desmethyldiscodermolid (II) steht.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 16, wobei die Verbindung für 19-Desaminocarbonyldiscodermolid (III) steht.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 16, wobei die Verbindung für Methyldiscodermolat (V) steht.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 16, wobei die Verbindung für 3-Deoxy-2Δ-discodermolid (VI) steht.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 16, wobei die Verbindung für 8,21,23-Hexahydrodiscodermolid (XII) steht.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 16, wobei die Verbindung für 7-Deoxy-8,21,23-hexahydrodiscodermolid (XIII) steht.