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Die vorliegende Erfindung betrifft
die Verwendung eines Paclitaxelderivats, das Antitu- moraktivität aufweist,
die größer ist
als die von Paclitaxel. Genauer gesagt, die vorliegende Erfindung
betrifft die Verwendung eines Antitumormittels, zunächst geformt
durch die Diesterifizierung der Alkoholgruppen, lokalisiert an den
Positionen 2' und
7 von Paclitaxel, gefolgt von selektiver Hydrolyse des Esters, lokalisiert
an der Position 2',
resultierend in einem 7-Acyltaxol.
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Stand der
Technik
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Zwischen den Jahren 1958 und 1980
wurden Extrakte von über
35.000 Pflanzenarten im Hinblick auf Antikrebsaktivität untersucht,
als Teil eines NCI-gesponsorten Programms. Die Chemiker Monroe E.
Wall und M. C. Wani isolierten zunächst ein rohes Extraktkonzentrat
aus Rinde und Holzproben des Yewbaums (Taxus brevifolia) im Jahr
1963. Erste Untersuchungen zeigten, dass das Extrakt ein potenzielles
Antikrebsmittel ist, mit einer sehr hohen Aktivität gegenüber einer
unüblich
breiten Vielzahl an Krebserkrankungen. Die Isolierung des aktiven
Bestandteils des rohen Extrakts benötigte einige Jahre aufgrund
der sehr geringen Konzentrationen an aktiven Bestandteilen, vorliegend
in den Pflanzen. Der aktive Bestandteil wurde identifiziert und
die Struktur wurde bestimmt und die Verbindung wurde im Jahre 1971
Taxol genannt, wobei diese Verbindung nun im Allgemeinen Paclitaxel
(1) genannt wird.
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Das natürlich vorkommende Diterpenoid
Paclitaxel (1) ist eine der aufregendsten Entdeckungen im Bereich
der Krebschemotherapie. Im Jahr 1979 etablierten Susan B. Horwitz
und ihre Mitarbeiter, dass, während
Paclitaxel ein antimiotischer Inhibitor ist, der zugrunde liegende
Mechanismus einzigartig dahingehend war, dass Mikrotubuli stabilisiert
werden und die Depolymerisierung zurück zu Tubulin inhibiert wird,
was gerade der gegenteilige Effekt ist, verglichen mit anderen antimiotischen
Mitteln, die alle an lösliches
Tubulin binden und die Polymerisation von Tubulin zur Formung von
Mikrotubuli inhibieren. In diesem Zusammenhang kann auf Nature,
227: 655–667
(1979) verwiesen werden. Also verlängert Taxol die Zeit, benötigt zur
Zellteilung, was wiederum Tumoraktivität inhibiert.
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Seit der Entdeckung von Paclitaxel
wurden über
einhundert Verbindungen mit dem Taxangerüst aus verschiedenen Taxus-Arten
isoliert, wobei unten einige wenige der repräsentativen Strukturen der wichtigeren taxolanalogen
Verbindungen aufgelistet sind.
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Trotz der ausgezeichneten Aktivität von Paclitaxel
in Modelltumorsystemen schritt die Forschung mit einer eher geringeren
Geschwindigkeit vor und jede Entwicklung war mit vielen Behinderungen
verbunden, umfassend Schwierigkeiten des Erhalts des Arzneimittels
(aufgrund der geringen Verbreitung von Yew-Gewebe), extrem geringe
Löslichkeit
in Wasser und Toxizität.
Probleme im Hinblick auf den Nachschub an Arzneimittel konnten inzwischen
größtenteils
ausgeräumt
werden, nicht nur als Resultat einer stärker effizienten Sammlung und
Extraktion von Pflanzenmaterial, sondern auch aufgrund von Fortschritten,
erzielt im Hinblick auf die vollständige Synthese und die Halbsynthese
der Verbindung Paclitaxel. Drei Totalsynthesen wurden bis heute
durchgeführt.
Die Gruppe von Holden und die Gruppe von Nicolaou publizierten ihre
Ansätze
im Jahr 1994 und kürzlich
berichteten Danishefsky und Mitarbeiter über ihren Ansatz zur Synthese
von Paclitaxel. In diesem Zusammenhang kann verwiesen werden auf
J. Am. Chem. Soc., 116: 1597–1599
(1994; Nature, 367: 630 (1994, J. Chem. Soc. chem. Commun., 295
(1994) und J. Am. chem. Soc., 116: 1591 (1994); und J. Am. Chem.
Soc., 118: 2843 (1996). Die Schwierigkeiten im Hinblick auf die
extrem geringe Löslichkeit
in Wasser und die Schwierigkeiten im Hinblick auf Toxizität verbleiben
allerdings und sind schwieriger zu überwinden.
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Paclitaxel ist ein komplexes Diterpenoid,
umfassend ein geräumiges,
verschmolzenes Ringsystem und eine ausgestreckte Seitenkette an
der Position C-13, benötigt
zum Erhalt der Aktivität.
Diese komplexe Struktur enthält
weiter 11 chirale Zentren mit 2048 möglichen diastereoisomeren Formen.
Relativ hydrophile Domänen
existieren im Molekül
in der Nähe
der Kohlenstoffe C-7 bis C-10 und C-1' bis C-2'. Wie dem auch sei, die hydrophoben
Domänen
des Taxanrückgrats
und der Seitenkette tragen zur insgesamt gesehenen schlechten Löslichkeit
der Verbindung in Wasser bei. Um einem Menschen Dosen in einem vernünftigen
Volumen zu verabreichen, wird Paclitaxel gegenwärtig zur klinischen Verwendung
in einer Mischung aus wassertreiem Ethanol und polyethoxyliertem
Castor-Öl
(Cremophor EL®)
formuliert, einem klaren, öligen,
viskosen, gelben oberflächenaktiven
Mittel. Zusätzlich
zu potenziellen Problemen im Hinblick auf physikalische Instabilität ist das
größte Problem
der gegenwärtigen
klinischen Paclitaxelformulierung, dass das Cremophor EL®-Vehikel
pharmakologische Aktivität
aufweist. Während
eine Vielzahl von Arzneimitteln in Cremophor EL® verabreicht
wird, muss gesagt werden, dass die Dosis an Cremophor EL®,
die eine Dosis an Paclitaxel begleitet, am höchsten ist, bezogen auf irgendwelche
vermarkteten Arzneimittel. Es wurde beobachtet, dass Cremophor EL® der
Grund war für
schwere bzw. fatale Hyperempfindlichkeitsanfälle und die Toxizität des Vehikels
kann zum größten Teil
verantwortlich sein für
fatale oder lebensbedrohende anaphylaktische Reaktionen, beobachtet
bei der schnelle Infusion von Paclitaxel bei Tieren oder Menschen.
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Im Licht der schweren Risiken, assoziiert
mit der gegenwärtigen
intravenösen
Formulierung von Paclitaxel werden Anstrengungen unternommen, um
sichere, zufriedenstellen de und effiziente Paclitaxelformulierungen
zu entwickeln. Wie dem auch sei, der Hauptteil der gegenwärtigen Ansätze, zur
Lösung
der Probleme, assoziiert mit Paclitaxel, sind Syntheseansätze und
Evaluierungen einer zweiten Generation von paclitaxelanalogen Verbindungen.
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10-Deacetylbaccatin III (2) und Baccatin
III (3)
(2) 10-Deacetylbaccatin III,
R = H
(3) Baccatin III, R = Ac
sind Diterpene, die leichter
erhältlich
sind als Paclitaxel und von denen bekannt ist, dass sie synthetische
Vorläufer
von Paclitaxel und analogen Verbindung sind. Ihre strukturelle Komplexität ist geringer
als die von Paclitaxel und daher sind 10-Deacetylbaccatin III (2)
und Baccatin III (3) auch wertvolle Startmaterialien für strukturelle
Modifikationen am Diterpenteil des Paclitaxelmoleküls.
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10-Deacetylbaccatin III wurde als
Startmaterial für
die halbsynthetische Verbindung Docetaxel (4) eingesetzt, die üblicherweise
Taxotere® benannt
wird, entwickelt von französischen
Wissenschaftlern des Institut de Chemie de Substances Naturelles
und Rhône-Poulenc
Rorer, im Jahr 1981.
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Die laterale Seitenkette, lokalisiert
an der Position C-13, die verantwortlich ist für den cytotoxischen Effekt,
wird chemisch hinzugefügt.
Docetaxel unterscheidet sich strukturell von Paclitaxel an der Position
C-10 am Baccatinnng und an der Position C-3' an der lateralen Seitenkette. In diesem
Zusammenhang kann verwiesen werden auf "Biologically Active Taxol Analogues
with Deleted A-Ring Side Chain Substitueants and Variable C-2' Configuration", J. Med. Chem.,
34: 1176–1184
(1991); "Relationships
between the Structure of Taxol Analogues and TheirAntimitotic Activity", J. Med. Chem.,
34: 992–998
(1991). Docetaxel ist ein zweimal potenterer Inhibitor der Mikrotubulidepolymerisierung
als Paclitaxel. Die in vitro Cytotoxizität von Docetaxel in menschlichen
Tumorzelllinien und Murintumorzelllinien und seine in vivo-Aktivität in preklinischen
Studien in menschlichen Xenografien und Murinxenografien waren sehr
beeindruckend. Docetaxel hat eine höhere cytotoxische Aktivität gezeigt
als andere antineoplastische Mittel, wie Paclitaxel, cis-Platin,
Cyclophosphamid und Doxorubicin, bei den gleichen Tumormodellen.
Während
Docetaxel ein vielversprechendes Antitumormittel mit einem breiten
Spektrum ist, leidet es wie Paclitaxel, unter der geringen wässrigen
Löslichkeit.
Die Tatsache verbleibt allerdings, dass ein potentes Analogon von
Paclitaxel mit vielversprechender Aktivität entwickelt wurde durch Durchführen einfacher
Seitenkettenmodifikationen am 3'-Amid.
Bestärkt
durch dieses aufregende Resultat begannen andere Wissenschaftler
Modifikationen an jeder Position des Diterpenkerns durchzuführen, mit
der Hoffnung, ein strukturelles Analogon des Paclitaxel zu entwickeln,
das die Probleme überwindet, assoziiert
mit Paclitaxel. Wie dem auch sei, bis heute konnte kein derartiges
Analogon entwickelt werden.
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Die WO 96/21658 offenbart bestimmte
hydrophobe Taxanderivate und ihre Verwendung zur Behandlung von
Krebserkrankungen.
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Tetrahedron Lett., Vol. 36, Nr. 12,
S. 2001–2004
(1995) und Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, Vol. 7, Nr.
14, S. 1829–1832
(1997) offenbaren Vertahren für
die Herstellung von Taxanderivaten.
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Im Hinblick auf die Tatsache, dass
mehr und mehr Zelllinien eine Resistenz gegenüber einer Vielzahl von Arzneimitteln
entwickeln, besteht der Bedart für
Medikamente zur Behandlung von mehrfach resistenten Zelllinien.
Es ist daher das Ziel der vorliegenden Erfindung solch ein Medikament
zur Verfügung
zu stellen.
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Dieses Ziel wird erreicht, wie in
Anspruch 1 definiert. Bevorzugte Ausführungsformen sind in den Unteransprüchen definiert.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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Die begleitenden Zeichnungen, die
hiermit eingefügt
sind und einen Teil der Beschreibung bilden, illustrieren einige
Aspekte der vorliegenden Erfindung und dienen, zusammen mit der
Beschreibung, zur Erläuterung
der Prinzipien der Erfindung.
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In all den Zeichnungen, die folgen
werden, gibt die horizontale Achse verschiedene Verdünnungen
der Testverbindung an, im Bereich von 10–4 bis
10–14 molar,
die mit einem spezifizierten Krebs in Kontakt gebracht wurden. Die
vertikale Achse (prozentuales Wachstum) zeigt das Wachstum der spezifizierten
Krebszelllinie, wenn diese einer spezifischen Konzentration der
getesteten Verbindung ausgesetzt wird, verglichen mit dem Wachstum
der gleichen Krebszelllinie, ohne Aussetzung gegenüber irgendeiner
Verbindung.
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1 zeigt
ein Schema, das verschiedene synthetische Routen illustriert, verwendet
bei der Herstellung der Zusammensetzungen, verwendet in der vorliegenden
Erfindung.
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1a zeigt
ein Schema, das ein bevorzugtes Verfahren der Herstellung der bevorzugten
in der vorliegenden Erfindung verwendeten Zusammensetzung zeigt.
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2a zeigt
die Dosisansprechungskurven, erzeugt durch Aussetzen verschiedener
Leukämiezelllinien
gegenüber
einer Vielzahl an Konzentrationen der in der vorliegenden Erfindung
verwendeten Zusammensetzung.
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2b zeigt
die Dosisansprechungskurven,erzeugt durch Aussetzung verschiedener
Leukämiezelllinien
gegenüber
verschiedenen Konzentrationen an Paclitaxel.
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3a zeigt
die Dosisansprechungskurven, erzeugt durch Aussetzen verschiedener
Lungenkrebszelllinien gegenüber
einer Vielzahl an Konzentrationen der in der vorliegenden Erfindung
verwendeten Zusammensetzung.
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3b zeigt
die Dosisansprechungskurven, erzeugt durch Aussetzung verschiedener
Lungenkrebszelllinien gegenüber
verschiedenen Konzentrationen an Paclitaxel.
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4a zeigt
die Dosisansprechungskurven,erzeugt durch Aussetzen verschiedener
Dickdarmkrebszelllinien gegenüber
einer Vielzahl an Konzentrationen der in der vorliegenden Erfindung
verwendeten Zusammensetzung.
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4b zeigt
die Dosisansprechungskurven,erzeugt durch Aussetzung verschiedener
Dickdarmkrebszelllinien gegenüber
verschiedenen Konzentrationen an Paclitaxel.
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5a zeigt
die Dosisansprechungskurven,erzeugt durch Aussetzen verschiedener
ZNS-Krebszelllinien gegenüber
einer Vielzahl an Konzentrationen der in der vorliegenden Erfindung
verwendeten Zusammensetzung.
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5b zeigt
die Dosisansprechungskurven,erzeugt durch Aussetzung verschiedener
ZNS-Krebszelllinien gegenüber
verschiedenen Konzentrationen an Paclitaxel.
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6a zeigt
die Dosisansprechungskurven,erzeugt durch Aussetzen verschiedener
Melanomkarzinomzelllinien gegenüber
einer Vielzahl an Konzentrationen der in der vorliegenden Erfindung
verwendeten Zusammensetzung.
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6b zeigt
die Dosisansprechungskurven, erzeugt durch Aussetzung verschiedener
Melanomkarzinomzelllinien gegenüber
verschiedenen Konzentrationen an Paclitaxel.
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7a zeigt
die Dosisansprechungskurven,erzeugt durch Aussetzen verschiedener
Eierstockkrebszelllinien gegenüber
einer Vielzahl an Konzentrationen der in der vorliegenden Erfindung
verwendeten Zusammensetzung.
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7b zeigt
die Dosisansprechungskurven,erzeugt durch Aussetzung verschiedener
Eierstockkrebszelllinien gegenüber
verschiedenen Konzentrationen an Paclitaxel.
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8a zeigt
die Dosisansprechungskurven, erzeugt durch Aussetzen verschiedener
Nierenkrebszelllinien gegenüber
einer Vielzahl an Konzentrationen der in der vorliegenden Erfindung
verwendeten Zusammensetzung.
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8b zeigt
die Dosisansprechungskurven, erzeugt durch Aussetzung verschiedener
Nierenkrebszelllinien gegenüber
verschiedenen Konzentrationen an Paclitaxel.
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9a zeigt
die Dosisansprechungskurven, erzeugt durch Aussetzen verschiedener
Prostatakrebszelllinien gegenüber
einer Vielzahl an Konzentrationen der in der vorliegenden Erfindung
verwendeten Zusammensetzung.
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9b zeigt
die Dosisansprechungskurven,erzeugt durch Aussetzung verschiedener
Prostatakrebszelllinien gegenüber
verschiedenen Konzentrationen an Paclitaxel.
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10a zeigt
die Dosisansprechungskurven,erzeugt durch Aussetzen verschiedener
Brustkrebszelllinien gegenüber
einer Vielzahl an Konzentrationen der in der vorliegenden Erfindung
verwendeten Zusammensetzung.
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10b zeigt
die Dosisansprechungskurven, erzeugt durch Aussetzung verschiedener
Brustkrebszelllinien gegenüber
verschiedenen Konzentrationen an Paclitaxel.
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Beste Ausführungsform
der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung verwendet
ein Taxolderivat der Formel (7)
wobei R wie in den Ansprüchen definiert
ist, wobei die Synthese dieser Verbindung erreicht werden kann durch eine
große
Vielzahl an Verfahren.
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Wie in 1 gezeigt,
können
die Alkohole, lokalisiert an den Positionen 2' und 7 der Paclitaxelverbindung (1)
zu Estern umgewandelt werden, hergestellt durch die Zugabe eines
Reagenz, wie einer Carboxylsäure,
eines Säurehalogenids
oder eines Säureanhydrids,
mit der erwünschten
Gruppe R, zu einer Lösung
von Paclitaxel. Die notwendigen Reaktionsbedingungen zur Herstellung
von Estern aus Alkoholen sind gut bekannt und dem Fachmann klar.
Das resultierende Zwischenprodukt (6) wird anschließend aufgereinigt,
und der Ester, lokalisiert an der Position 2' wird entweder hydrolysiert oder reduziert,
was das Produkt (7) ergibt. In der bevorzugten Ausführungsform,
gezeigt in 1a, wird
eine Verbindung der Formel (5) hergestellt durch Mischen eines Säureanhydrids,
wie Hexansäure,
mit einer Mischung an Paclitaxel (1). Die Diesterifizierung der
Alkohole, lokalisiert an den Positionen 2' und 7 des Paclitaxels, resultiert in
einem Zwischenprodukt, nämlich
der Verbindung bis-2',7-Hexanoyltaxol.
Die selektive Entfernung der 2'-Hexanoatgruppe
durch Hydrolyse ergibt die erwünschte
7-Hexanoyltaxolverbindung
(5).
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Um die Cytotoxizität von 7-Hexanoyltaxol
zu bestimmen, verglichen mit Taxol, wurden Screeningassays durchgeführt. Die
dabei erhaltenen Aktivitätsresultate
sind in Tabelle I zusammengefasst (diese ist unten angegeben). Der
Screeningassay wird auf Mikrotiterplatten mit 96-Vertiefungen durchgeführt. Relativ
hohe ursprüngliche
Inokulierungsdichten werden verwendet, um die Messung von "Time-Zero"-Werten zu ennöglichen und
um die Fähigkeit
des Screeningvertahrens zu vergrößern, Unterschiede
zwischen antiproliferativen Ansprechungsparametern und cytotoxischen
Ansprechungsparametem zu detektieren und zur Verfügung zu
stellen. Die spezifischen Inokulierungsdichten (die im Bereich von
5.000 bis 40.000 Zellen/Vertiefung liegen), verwendet für jede Zelllinie,
sind die, die für
die entsprechende Zelllinie ein optisches Dichtesignal sowohl für den "Time-Zero"-Wert (bei 24 Stunden)
als auch den "No-Drug"-Kontrollwert (bei
72 Stunden) ergeben, welche oberhalb des Störsignalbereichs liegen und
innerhalb des linearen Bereichs des Endpunktassays (was zelluläres Protein
bestimmt). Die inokulierten Mikrotiterplatten werden für 24 Stunden
bei 37°C
vor der Arzneimittelzugabe inkubiert. Die fünf Arzneimittelverdünnungen,
die routinemäßig getestet
wurden, liegen im Bereich von 10–4 bis
10–8 molar.
Höhere
oder niedrigere Konzentrationsbereiche können ausgewählt werden, wenn eine geeignete
Löslichkeit
vorliegt und/oder wenn geeignete biologische Informationen oder
andere Screeningdaten vorlagen, die solche Verdünnungen erforderlich machen.
Die Versuche wurden für
alle Konzentrationen doppelt durchgeführt. Kontrolluntersuchungen
im Hinblick "Time-Zero"-Wert und "No-Drug"-Kontrollwert wurden
auch fürjeden
Test durchgeführt.
Die Minimalmenge an Verbindung, benötigt für eine I-Zeitevaluierung im
Routinescreening kann berechnet werden, ausgehend von der Tatsache,
dass jeder Test eine Gesamtmenge von ungefähr 40 ml (0,04 l) Zellkulturmedium
benötigt,
enthaltend die höchste
erwünschte
Arzneimittelkonzentration. Also ist die Menge (Gramm) an erforderlicher
Probe (unter Annahme einer oberen Testkonzentration von 10–4 M)
wie folgt: Molekulargewicht der Verbindung × 10–4 × 0,04.
Nach einer 48-stündigen Inkubierung (37°C) mit den
Testverbindungen wurden die Zellen in situ auf dem Grund der Mikrotitervertiefungen
fixiert, durch Zugabe 50 μl
entweder von 50%iger Trichloroessigsäure (für anheftende Zelllinien) oder
80%-iger Trichloroessigsäure
(für gesetzte
Zellsuspensionslinien), gefolgt von Inkubierung für 60 Minuten
bei 4°C.
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Das zelluläre Protein in der Vertiefung
wurde untersucht unter Einsatz einer Sulfahodamin B-(SRB)-Anfärbungsprozedur.
Genauer gesagt, nach Abgießen
der obenstehenden Flüssigkeiten
wurden die Mikrotiterplatten 5mal mit deionisiertem Wasser gewaschen
und an Luft getrocknet. Einhundert Mikroliter einer SRB-Lösung (0,4%
w/v in 1% Es sigsäure)
werden jeder Mikrotitervertiefung zugegeben und dann wird für 10 Minuten
bei Raumtemperatur inkubiert. Ungebundenes SRB wird entfernt durch
5maliges Waschen mit 1%-iger Essigsäure. Die Platten werden luftgetrocknet
und Bindungsanfärbung
wird mit Tris-Puffer solubilisiert und die optischen Dichten werden
bei 515 nm abgelesen. SRB ist ein heller, rosafarbener anionischer
Farbstoff, der, in verdünnter
Essigsäure,
elektrostatisch an die basischen Aminosäuren der TCA-fixierten Zellen
bindet. Lager aller Zelllinien werden behalten unter cryogener Tiefkühlung und
Kulturen, verwendet für
die Screeningvertahren, werden aus den gelagerten Linien ersetzt,
nach nicht mehr als zwanzig Durchgängen im Screeninglabor. Das
Zelllinienpaneel besteht aus 60 Linien, geordnet in neun störungsverwandte
Unterpaneele, umfassend Leukämie,
Non-Small-Cell-Lungenkrebs,
Dickdarmkrebs, ZNS-Krebs, Melanomkarzinom, Eierstockkrebs, Nierenkrebs,
Prostatakrebs und Brustkrebs.
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Die Ansprechparameter GI50 und
LC50 sind interpolierte Werte, die Konzentrationen
darstellen, bei denen das prozentuale Wachstum (PG) +50 bzw. –50 beträgt:
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GI50 ist
die Konzentration, bei der PG = +50 ist. Bei diesem Wert ist der
Anstieg, ausgehend von der Zeit tzero, im
Hinblick auf die Anzahl oder das Gewicht der Zellen in der Testvertiefung
lediglich 50% so groß wie der
korrespondierende Anstieg in der Kontrollvertiefung während dieser
Dauer des Experiments. Ein Effekt eines Arzneimittels dieser Intensität wird als
primäre
Wachstumsinhibierung interpretiert.
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TGl ist die Konzentration, bei der
PG = 0 ist. Bei diesem Wert entspricht die Anzahl bzw. das Gewicht der
Zellen in der Vertiefung am Ende des Experiments der Anzahl bzw.
dem Gewicht der Zellen in der Vertiefung zur Zeit tzero.
Ein Effekt eines Arzneimittels dieser Intensität wird als cytostatisch (cytostasis)
betrachtet.
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LC50 ist
die Konzentration, bei der PG = –50 ist. Bei diesem Wert ist
die Anzahl bzw. ist das Gewicht der Zellen in der Testvertiefung
am Ende des Experiments lediglich halb so groß wie zur Zeit tzero.
Dies wird als Cytotoxizität
interpretiert.
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Die 7-Hexanoyltaxolverbindung, verwendet
in der vorliegenden Erfindung, ist in den meisten Fällen ebenso
potent und in einigen Fällen
stärker
potent als Paclitaxel. Die in Tabelle 1 dargestellten Daten sind
graphisch in den 2a und 2b bis 10a und 10b dargestellt.
Dosisansprechungskurven, abgebildet in den obengenannten Figuren
werden erhalten durch Aussetzung verschiedener Krebszelllinien gegenüber Verbindungen
mit einer bekannten Konzentration ([log10M]),
wie oben detailliert diskutiert, und anschließendes Plotten des prozentualen
Wachstums jeder Zelllinie bei jeder Konzentration. Prozentuales
Wachstum wird bestimmt durch Teilen der Anzahl bzw. des Gewichts
der Zellen in der Testvertiefung durch die Anzahl bzw. das Gewicht der
Zellen in einer Kon trollvertiefung. Im Folgenden wird ein Beispiel
dafür gegeben,
wie die Information aus Tabelle 1 und aus den Figuren interpretiert
werden kann.
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Im Hinblick auf die Leukämiezelllinie
CCRF-CEM kann in 2a und 2b ein erster Vergleich durchgeführt werden
zwischen der Verbindung, verwendet in der vorliegenden Erfindung,
7-Hexanoltaxol, bzw. Paclitaxel. Eine erste Betrachtung betrifft
die Konzentrationen der beiden Arzneimittel, notwendig zur Inhibierung von
Wachstum, graphisch dargestellt in 2a und 2b als die Konzentration,
notwendig zum Erreichen eines Werts von +50. Wie zuvor diskutiert,
liegen die fünf
routinemäßig getesteten
Arzneimittelverdünnungen
im Bereich von 10–4 bis 10–8 molar.
Daher werden Konzentrationen von weniger als oder mehr als 10–8 bzw.
10–4 molar,
notwendig zum Erreichen eines erwünschten Resultats, nicht bestimmt.
Unter Verweis auf 2a kann nun
ausgeführt
werden, dass eine Konzentration von ungefähr 10–7 molar
notwendig ist, um primäre
Wachstumsinhibierung zu erreichen, für die in der vorliegenden Erfindung
verwendete Verbindung. Geringere Konzentrationen wurden allerdings
für Paclitaxel
bestimmt und die Konzentration, bei der primäre Wachstumsinhibierung auftritt,
unter Einsatz von Paclitaxel, ist –11,61 molar, siehe 2b. Die Konzentration, bei
der 7-Hexanoyltaxol als cytostatisch betrachtet wird, d. h., die
Konzentration, bei der das prozentuale Wachstum gleich 0 ist, beträgt –6,1 molar,
während
eine äquivalente
Intensität
beim Einsatz von Paclitaxel bei einer Konzentration von mehr als –4,00 molar
erreicht wird. Cytotoxizität,
d. h. eine Konzentration, bei der das prozentuale Wachstum gleich –50 ist,
tritt bei beiden Arzneimitteln bei einigen Konzentrationen von größer als –4,00 molar auf.
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Die Potenz von 7-Hexanoyltaxol (5),
verwendet in der vorliegenden Erfindung, verglichen mit Paclitaxel,
variiert von Zelllinie zu Zelllinie. Wie dem auch sei, insgesamt
betrachtet wurde gefunden, dass die Potenz von 7-Hexanoyltaxol äquivalent
zu und in vielen Fällen
sogar größer war
als von Paclitaxel. Die Mittelwerte, sowohl für 7-Hexanoyltaxol als auch für Paclitaxel
sind am Ende der Tabelle 1 aufgelistet. Werden diese Zahlen interpretiert,
ist es allerdings wichtig zu berücksichtigen,
dass Werte oberhalb 10–8 und unterhalb 10–4 nicht
bestimmt wurden und dieser Faktor ist in diesem Bereich mit berücksichtigt.
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Die in der vorliegenden Erfindung
verwendete Verbindung wurde weiter getestet bei mehrfach resistenten
Zelllinien. Die Resistenz von Krebszelllinien gegenüber mehreren chemotherapeutischen
Arzneimitteln, die strukturell nicht miteinander verwandt sind,
wird Mehrfachresistenz genannt. In den vergangenen Jahren wurden
verschiedene Mechanismen der Mehrfachresistenz beschrieben, einschließlich der
Expression einer Zelloberflächenmultidrugeffluxpumpe
(P-Glycoprotein oder ein Multidrug-Transporter), veränderter
Glutathionmetabolismus, reduzierte Aktivität der Topoisomerase II und
verschiedene weitere weniger klar definierte Veränderungen bei Zellproteinen.
Aufgrund der Nachweise, dass Expression von P-Glycoprotein assoziiert
mit Arzneimittelresistenz bei Krebszelllinien ist, wurde P-Glycoprotein
intensiv studiert im Hinblick auf Biochemie und Aktionsmechanismus,
um Inhibitoren zu entwickeln, die klinisch eingesetzt werden können, um
Arzneimittelresistenz in Patienten mit Krebs zu überwinden. Die klinische Signifikanz
der anderen Mechanismen der Mehrfachresistenz ist weniger gut etabliert,
aber viele Modellsysteme zeigen an, dass sie bei zur klinischen Resistenz
beitragen.
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Überraschenderweise
ist die in der vorliegenden Erfindung verwendete Verbindung effektiv
bei der Behandlung von Krebszelllinien, die Mehrfachresistenz zeigen.
Um den Effekt von 7-Hexanoyltaxol (5) zu bestimmen, verglichen mit
Paclitaxel, bei mehrfach resistenten Zelllinien, wurden Screeningassays
durchgeführt.
Die Resultate sind in Tabelle 2 unten zusammengefasst. Tabelle
2
| Bemerkung
Mean IC50 | Mittlere
Wachstumsinhibierung IC50-Wert, 26 Cell line (μg/ml), 48 Stunden Arzneimittelbehandlung,
Sulforhodaminanfärbung. |
| Min
IC50 | Geringster
beobachteter IC50-Wert im 26 Cell-linescreen |
| MR | Verhältnis der
beiden IC50-Werte, wobei der Zähler eine
MDR-Zelllinie ist. Höhere
Zahlen entspricht eine geringere Effektivität, verglichen mit MDR-Zellen (mehrfach
resistenten Zellen). |
| rho | Mittlerer
graphischer Korrelationskoeffizient, wobei 1 ein identisches Muster
wie Taxol bedeutet, 0,85–0,95 eine
dichte Annäherung
bedeutet; 0,75–0,85
eine gute Annäherung
bedeutet und ein Wert von ≤ 0,75 eine
schlechte Annäherung
bedeutet. |
| Tubulin
ED50 | Konzentration
an Taxan, die hervorruft, dass 50% an aufgereinigtem Kalbgehirntubulin
polymerisiert, verglichen mit der maximalen Polymerisation, hervorgerufen
durch die GRP-Kontrolle (1 mM). |
| G2/M-Arrest | Minimale
Konzentration an Taxan, die ergibt, dass 60% der CCRF-CEM-Zellen
in G2-M festgehalten werden. |
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Die in der vorliegenden Erfindung
verwendete 7-Hexanoyltaxolverbindung (5) ist sehr viel stärker effektiv
als Paclitaxel gegen mehrfach resistente Zelllinien.
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Das folgende Beispiel stellt ein
spezifisches Verfahren mit einer hohen Ausbeute für die Herstellung von
7-Hexanoyltaxol zur Verfügung.
Alle wissenschaftlichen und technischen Ausdrücke haben die Bedeutungen,
die dem Fachmann klar sind. Die synthetische Beschreibung und die
spezifischen Beispiele, die folgen, dienen nur dem Zweck der Illustrierung
und sollen nicht in irgendeiner Art und Weise die Herstellungsverfahren von
in der vorliegenden Erfindung verwendeten Verbindungen beschränken. Die
Verfahren können
einigen Variationen unterzogen werden, um Verbindungen herzustellen,
die durch diese Erfindung mitumschlossen, aber nicht spezifisch
offenbart sind. Weiter werden Variationen der Verfahren zur Herstellung
der gleichen Verbindungen in abgewandelter Art dem Fachmann klar
sein.
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Alle Temperaturen betreffen die Temperatur
in Grad Celsius (°C),
wenn nicht anders angegeben. Kernresonanzspektren (NMR) betreffen
chemische Verschiebungen δ,
dargestellt in parts per million (ppm) in Bezug auf Tetramethylsilan
(TMS) als Referenzstandard. 1H- und 13C-NMR-Spektren wurden auf einem Varian Gemini-400-
bzw. einem JEOL Eclipse-400-Gerät
aufgenommen. Die relative Flächen,
berichtet für
die verschiedenen Verschiebungen im Protonen-NMR, korrespondieren
der Anzahl an Wasserstoffatomen der jeweiligen funktionellen Gruppe
im Molekül.
Die Natur der Verschiebungen ebenso wie die Multiplizität ist angegeben
als breites Singulet (bs), breites Doublet (bd), breites Triplet
(bt), breites Quartet (bq), Singulet (s), Multiplet (m), Doublet
(d), Quartet (q), Triplet (t), Doublet eines Doublets (dd), Doublet
eines Triplets (dt) und Doublet eines Quartets (dq). Die Lösungsmittel,
verwendet bei der Aufnahme der NMR-Spektren, sind DMSO-ds (Perdeuterodimethylsulfoxid),
D2O (deuteriertes Wasser), CDCl3 (Deuterochloroform)
und andere konventionelle deuterierte Lösungsmittel. Die chemischen
Verschiebungen sind in ppm dargestellt, relativ zum Referenzstandard
CDCLs oder DMSO. Deuterierte Lösungsmittel
wurden von Aldrich Chemical Co. bezogen. Die Infrarotspektren (IR)
wurden auf einem KVB Analect Diamond-20 FT-IR-Spektrometer aufgenommen,
wobei dieses Spektrometer ein XAD-Plus-Laserpräzisionsmikroskop aufwies. Elektronenspraymassenspektren
wurden aufgenommen mit einem VG Platform HPLC-MASS-Spektrometer. Dünnschichtchromatografieplatten
mit Silicagel 60F254 wurden von E. M. Merck bezogen und in einem
verschlossenen Container über
Drierite® vor
der Verwendung aufbewahrt. Schmelzpunkte wurden mit einem MEL-TEMP
11-Apparat bestimmt, ausgerüstet
mit einem digitalen Barnant 100 Thermocouple-Thermometer und die
Werte sind nicht korrigiert. HPLC wurde mit einem Hitachi-Chromatografiespektrometer
durchgeführt
(L-6200A Intelligent Pump, D-6000 Intertace, L-4000 UV-Detektor
und AS-4000 Intelligent Auto Sampler). Kombinationen von CH3CN und H2O in unterschiedlichen Konzentrationen
werden als HPLC-Lösungsmittelsysteme
verwendet. Alle Lösungsmittel
wurden vor Verwendung destilliert. Kommerziell erhältliche
Chemikalien wurden ohne weitere Aufreinigung eingesetzt. Verschiedene
Verfahren der Aufreinigung der Produkte, verwendet in der vorliegenden
Erfindung, sind bekannt und dem Fachmann klar und die Reinigungsvertahren,
hergestellt in den Beispielen, sind lediglich illustrierend gedacht.
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Beispiel 1
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(I) Herstellung von bis-2',7-Hexanoyltaxol:
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Hexansäureanhydrid (4,47 ml, 19,325
mmol) wurde einer Lösung
von Paclitaxel (3,30 g, 3,865 mmol) und DMAP (0,047 g, 0,386 mmol)
in 30 ml CH2Cl2 bei
0°C zugegeben.
Die Reaktionsmischung wurde in einem Temperaturbereich von ungefähr 0–25°C für 18 Stunden
gerührt.
Die Reaktionsmischung wurde mit 5%-igem NaHCO3 gequentscht
und 3 × mit
25 ml CH2Cl2 extrahiert.
Die kombinierten organischen Schichten wurden mit Wasser gewaschen,
dann mit Lake und anschließend über wassertreiem
Magnesiumsulfat getrocknet. Das rohe Produkt wurde in zwei Chargen
durch Silicagelsäulenchromatografie
gereinigt (4 × 25
cm Silicasäulen, 2,5
MeOH/CH2Cl2), um
4,24 g (104%) reines bis-2',7-Hexanoyltaxol
und 0,6 g (15%) eines mit einem langsameren Spot verunreinigten
Produkts zur Verfügung
zu stellen. Der Massenüberschuss
beruht auf einem Rest an Anhydrid und auf Säureverunreinigungen. Die reine
Fraktion wurde in 30 ml CH2Cl2 gelöst und mit
einer 5%-igen NaHCO3-Lösung gewaschen. Die wässrige Schicht
wurde 3 × mit
15 ml CH2Cl2 extrahiert.
Die organische Phase wurde über
wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum aufkonzentriert,
um 3,146 g (78 %) bis-2',7-Hexanoyltaxol
in der Form eines weißen
Feststoffes zur Vertügung
zu stellen: Schmelzpunkt 124–128°C; 1H NMR (400 MHZ), CDCl3 δ 0,84–0,90 (m,
12H), 1,14 (s, 3H), 1,18 (s, 3H(, 1,23–1,33 (m, 16H(, 1,53–1,68 (m,
8H), 1,56 (s, 3H), 1,78 (s, 3H), 1,79 (m, 1H), 1,98 (s, 3H), 2,12–2,24 (m,
1H), 2,30–2,44 (m,
10H), 2,42 (s, 3H), 2,59 (m, 1H), 3,93 (d, J = 7,0 Hz, 1H, 4,16
(d, J = 8,4 Hz, 1H), 4,31 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 4,94 (dd, J = 1,0,
8,0 Hz, 1H), 5,52 (d, 3,3 Hz, 1H), 5,57 (dd, J = 7,0, 10,2 Hz, 1H),
5,66 (d, J = 6,6 Hz, 1H), 5,92 (dd, J = 3,7, 9,0 Hz, 1H), 6,20 (dd,
J = 8,8, 8,8 Hz, 1H), 6,26 (s, 1H), 6,88 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,32–7,42 (m,
7H), 7,48–7,52
(m, 3H), 7,59 (m, 1H), 7,73 (m, 2H), 8,10 (m, 2H) – im Produkt
verblieb etwas Rest an Hexanlösungsmittel.
LRMS (Elektrospray) M/Z, beobachtet für C59H71NO16Na (M + Na):
1072,9.
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(II) Hydrolyse der 2'-Hexanoatgruppe:
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NaHCO3 (12,54
g, 149,8 mmol) wurde einer Mischung von bis-2',7-Hexanoyltaxol (3,15 g, 3,0 mmol), H2O2 (30 &, 10,08 ml) und
THF (122 ml) zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde für 8 Stunden
bei Raumtemperatur gerührt
und in einem Kühl schrank über Nacht
gelagert. Dann wurde die Mischung für weitere 2 Stunden gerührt. Da
das Startmaterial noch nicht vollständig hydrolysiert war, wurden
etwa 100 ml Wasser zugegeben und die Mischung wurde für weitere
6 Stunden gerührt.
Die Reaktionsmischung wurde mit 5% Citronensäure vorsichtig gequentscht.
Die wässrige
Phase wurde 3 × mit
100 ml CH2Cl2 extrahiert.
Die kombinierten organischen Phasen wurden mit 20%-igem Na2S2O3 und
Lake gewaschen, über
wassertreiem Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum aufkonzentriert,
um ein rohes Produkt zu ergeben. Wiederholte Blitzsilicagelsäulenchromatografie
(2% McOH/CH2Cl2 für die erste
Säule,
10–20%
EtOAc/CH2Cl2 für die zweite
Säule)
ergab ungefähr
1 g (ungefähr
35%) unreines 7-Hexanoyltaxol
und 1,5 g (ungefähr
53%) reines 7-Hexanoyltaxol in der Form eines weißen Feststoffes:
Schmelzpunkt 149–154°C; 1H NMR (400 MHZ, CDCL3) δ 0,86 (5,
7,0 Hz, 3H), 1,16 (m, 4H), 1,13 (m, 5H), 1,56 (m, 2H), 1,180 (s,
3H), 1,82 (m, 1H), 1,82 (s, 3H), 2,14 (s, 3H), 2,18–2,40 (m,
5H), 2,36 (s, 3H), 2,58 (m, 1H), 3,60 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 3,9 (d,
J = 6,6 Hz, 1H), 4,16 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 4,31 (d, J = 8,4 Hz,
1H), 4,79 (d, J = 1, 2,6 Hz, 1H), 4,92 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 5,53
(dd, J = 7,3, 10,2 Hz, 1H), 5,65 (d, J = 6,6 Hz, 1H9, 5,80 (dd,
J = 2,2, 9,2 Hz, 1H), 6,15 (dd, J = 8,8, 8,8 Hz, 1H), 6,22 (s, 1H),
7,10 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,35 (m, 1H), 7,41 (m, 4H), 7,48 (m, 5H),
7,60 (t, J = 7 Hz, 1H), 7,74 (d, J = 7,3 Hz, 2H), 8,09 (7,32 Hz,
2H); 13C NMR (125 MHZ, CD3OD) δ 10,07, 12,91;
13,39; 19,31; 20,73; 21,85; 22,03; 23,78; 25,43; 30,98; 32,94; 33,65;
35,21; 43,30; 47,24; 55,93; 56,36; 56,45; 70,85; 71,47; 73,50; 74,55;
75,24; 75,98; 77,55; 80,64; 83,84; 127,16; 127,17; 127,67; 128,26;
128,39; 128,41; 129,86; 129,98; 131,52; 133,13; 133,29; 134,31;
138,67; 140,71; 166,26; 169,07; 169,28; 170,64; 173,13; 202,30.
LRMS (Elektrospray) M/Z, beobachtet für C53H61NO15 (M + H): 952,8
und M/Z, beobachtet für
C53H61NO15Na (m + Na): 974,8.
