DE60001173T2

DE60001173T2 - Verfahren zum extrahieren und reinigung von paclitaxel aus natürlicher quelle

Info

Publication number: DE60001173T2
Application number: DE60001173T
Authority: DE
Inventors: Trung Bui-Khac; Nicolas Dupuis
Original assignee: Chaichem Pharmaceuticals International Inc
Current assignee: Chaichem Pharmaceuticals International Inc
Priority date: 1999-06-22
Filing date: 2000-05-25
Publication date: 2003-11-20
Anticipated expiration: 2020-05-26
Also published as: KR100706983B1; JP4563632B2; EP1194423B1; CN1356992A; KR20020031345A; JP2003502414A; EP1194423A2; CA2299149C; WO2000078741A3; ES2191628T3; CA2299149A1; ATE230736T1; DK1194423T3; CN1148364C; AU5377100A; DE60001173D1; HK1047285A1; WO2000078741A2

Description

ERFINDUNGSGEBIET

Die vorliegende Erfindung betrifft ein einfaches und schnelles Verfahren zum Extrahieren und Reinigen von Paclitaxel. Im Vergleich zu nach dem Stand der Technik bekannten Verfahren ist dieses Verfahren besonders wirtschaftlich, weil es 1 eine begrenzte Zahl von Schritten umfasst und geringere Verluste während der Reinigung aufweist.

STAND DER TECHNIK

Erste Untersuchungen zu Paclitaxel, auch TaxolTM oder PacitaxelineTM genannt, begannen in den 60er Jahren in den USA, als das National Cancer Institute ein Programm zur Auswahl von Pflanzenextrakten, die Aktivitäten gegen Krebstumore oder antineoplasische Aktivitäten aufweisen.
Von 1960 bis 1981 wurden mehr als 110.000 Zusammensetzungen aus 35.000 Pflanzenarten extrahiert, isoliert und getestet (Blume E. J. Natl. Cancer Inst. 1991; 83: 1054-1056).
Koniferen waren unter den ausgewählten und getesteten Pflanzen und der erste Extrakt aus Koniferenrinden (Taxus brevifolia Nutt) von der Westküste der Vereinigten Staaten (Oregon) wurde von Wani et al (Wani et al. J. Am. Chem. Soc., 1971; 93: 2325-2327) extrahiert. Der Rohextrakt dieser Rinden wies eine cytotoxische Aktivität gegen Leukämiszellen und eine hemmende Wirkung auf eine Reihe von Tumoren auf.
Einige Jahre später wurde die aktive Verbindung des Extrakts isoliert. Dieser aktiven Verbindung wurde der generische Name Paclitaxel gegeben und ihre Molekularstruktur wurde röntgenkristallographisch und durch 1H-NMR Spektrum bestimmt.
Seither wurden Untersuchungen zur Wirkung von Paclitaxel gegen Krebstumore in vitro und in vivo durchgeführt und die positiven Ergebnisse haben dazu geführt, dass diese aktive Zusammensetzung zu den vielversprechenden Medikamenten in der Behandlung von Eierstockkrebs und Brustkrebs (Rowinski et al. Pharmacol. Ther. 1991; 52: 35-84) gezählt wird. Übrigens ist die Verwendung von Paclitaxel zur Behandlung verschiedener Krebsarten seit 1992 von der Food and Drug Administration zugelassen.
Die erste Koniferenart, die zur Herstellung von Paclitaxel verwendet wurde, war Taxus brevifolia, aber auch andere Arten aus unterschiedlichen Regionen der Welt wurden getestet. Diese umfassen Taxus baccata, Taxus canadensis, Taxus wallichiana, Taxu ynnanensis, Taxus densiformis, Taxus hicksii, Taxus wardii, Taxus cuspidata, Taxus capitata, Taxus brownii (Miller et al. J. Org. Chem. 1981; 46: 1469; Mc Laughlin et al. J. Nat. Prod. 1981; 44: 321; Kingston et al. J. Nat. Prod. 1982; 45: 466; Senilh et al. J. Nat. Prod. 1984; 47: 131-137; Huang et al. J. Nat. Prod. 1986; 49: 665-669; Fett-Neto et al. Bio/Technology 1992; 10: 1572-1575).
Diese Arten enthalten alle Paclitaxel, aber in geringen Mengen - 0,0004 bis 0,008% - (Kingston, Pharmacol. Ther. 1991; 52: 1-34). Durch diese geringe Paclitaxelkonzentration wird das Extrahieren und Reinigen sehr kostspielig, da dies zeitintensiv ist und im Allgemeinen wiederholte Chromatographien erfordert.
Diese geringe Paclitaxelkonzentration in allen Koniferenarten führt zu einer großen Einwirkung auf die Umwelt. Um 1 kg Paclitaxel aus der Rinde der Taxus brevifolia zu extrahieren, müssen etwa 3.000 ausgewachsene Bäume gefällt werden, um 10.000 kg Rinde zu erhalten. Die so erhaltene Menge Paclitaxel (1 kg) ermöglicht die Behandlung von etwa 500 Patienten, es gibt aber Hunderttausende Krebspatienten. Aufgrund des langsamen Wachstums der Bäume wird eine Neupflanzung der Bäume die dringende Nachfrage nach Paclitaxel nie befriedigen (Vidensek et al. J. Nat. Prod. 1990; 53: 1609-0610; Kelsey et al. J. Nat. Prod. 1992; 55: 912-917; Wheeler et al. J. Nat. Prod. 1992; 55: 432-440).
Zahlreiche Verfahren zum Extrahieren und Reinigen von Paclitaxel wurden vorgeschlagen. Zum Beispiel haben Wani et al. (Wani et al. Am. Chem. Soc, 1971; 93: 2325-2327) ein Verfahren zum Extrahieren von Paclitaxel aus Koniferenrinden von der Westküste der Vereinigten Staaten (Taxus brevifolia) vorgeschlagen, das eine Behandlung der Rinden mit Alkohol und einige anschließende Reinigungsschritte durch Chromatographie umfasst.
Miller et al. (1981) haben Paclitaxel aus Taxus wallichiana anhand des folgenden Verfahrens extrahiert:
1) Extrahieren aus der Pflanze und Konzentrieren des Extraktes;
2) Fettentfernung durch Trennen von Wasser und Hexan;
3) Extrahieren mit Chloroform und Konzentrieren;
4) erstes Reinigen durch Chromatographie in einer ersten Silicasäule;
5) zweites Reinigen durch Chromatographie in einer zweiten Silicasäule;
6) erste Gegenstromverteilung;
7) zweite Gegenstromverteilung;
8) präparative HPLC-Chromatographie.
Senilh et al. (1984) haben Paclitaxel (oder TaxolTM A: 0,0165%), Cephalomannin (oder TaxolTM B: 0,0064%) und andere Verbindungen aus Rinden der Taxus baccata anhand des folgenden Verfahrens extrahiert:
1) Extrahieren mit Alkohol und Konzentrieren;
2) Trennen von Wasser und Dichlormethan;
3) Filterchromatographie;
4) Chromatographie in einer Silicasäule;
5) Aluminiumoxid-Chromatographie;
6) Chromatographie in einer Silicasäule mit mittlerem Druck;
7) HPLC-Chromatographie.
Für andere Analoge sind zwei bis drei weitere Säulenchromatographie-Behandlungen mit anschließender präparativer HPLC-Chromatographie notwendig.
Ein weiteres von Polysciences Inc. verwendetes Verfahren umfasst die folgenden Schritte:
1) getrocknete gemahlene Rinden werden mit Methanol oder Ethanol behandelt und der erhaltene Extrakt wird konzentriert, um den Alkohol zu entfernen,
2) das Konzentrat wird anschließend mit Dichlormethan behandelt und der so erhaltene lösliche Extrakt wird konzentriert, so dass ein Pulver entsteht,
3) das Pulver wird mit einer Mischung aus Aceton und Ligroin (1 : 1) aufgelöst und gefiltert, um nichtlösliche Bestandteile zu entfernen,
4) die organische Phase, die Paclitaxel enthält, wird konzentriert, in 30% Ligroin gelöst und in eine Florisil®-Säule gegeben,
5) die Paclitaxel-Fraktion aus der Säule wird durch zweifaches Kristallisieren gereinigt,
6) die so erhaltenen Paclitaxelkristalle werden in einer Silicasäule chromatographiert. Das Paclitaxel wird bei diesem Schritt von den anderen Taxanen (verwandte Analoge, Cephalomannin, etc.) getrennt,
7) das im vorangehenden Schritt erhaltene gereinigte Paclitaxel wird zweifach kristallisiert, und
8) ungetrennte Mischungen und Mutterlaugen werden durch die Silicasäule zurückgeführt, um zusätzliche Mengen Paclitaxel zu erhalten.
Natürlich gibt es andere Verfahren, Paclitaxel aus natürlichen Quellen zu reinigen, wie in den folgenden Quellen beschrieben:
Kingston et al., beschreiben neue aus Taxus brevifolia gewonnene Taxane (J. Nat. Prod. 1982; 45: 466-470); und Witherup et al., beschreiben ein Verfahren zur Trennung von Paclitaxel und verwandten Verbindungen aus Taxus brevifolia (J. Liq. Chrom. 1989; 12: 2117-2132).
Das US Patent Nr. 5,279,949, 1994 Nair erteilt, betrifft die Verwendung von Gewebe aus Zierkoniferen (Taxus x media Hicksii) zur Reinigung von Paclitaxel. In diesem Patent:
1) werden frische Nadeln mit 70% Alkohol extrahiert,
2) wird der Extrakt mit Holzkohle Kohle entfärbt und gefiltert,
3) wird der gefilterte Extrakt konzentriert, um möglichst viel des organischen Lösungsmittels zu entfernen,
4) wird das wässrige Konzentrat zentrifugiert, um die Feststoffe, die Paclitaxel zusammenhalten, herauszutrennen,
5) werden die Feststoffe dann einer ersten Normal-Phasen- Chromatographie unterzogen,
6) wird das erhaltene pure Paclitaxel einer zweiten Niederdruck-Silica-Chromatographie unterzogen; und
7) wird die letzte Reinigung in einer, Reverse-Phasen-Säule durchgeführt.
Das US Patent Nr. 5,654,448, erteilt an Pandey et al., betrifft ein Verfahren zum Extrahieren und Reinigen von Paclitaxel aus Rinden der Taxus brevifolia. In diesem Verfahren:
1) werden die Rinden drei Mal mit Methanol behandelt, wobei jede Extraktion über einen Zeitraum von 5 Tagen vorgenommen wird und der so erhaltene Extrakt dann konzentriert wird;
2) wird das Methanol-Konzentrat getrennt, um Methylenchlorid und Wasser zu erhalten, und der Methylenchlorid-Extrakt wird zur Trockne verdampft, wobei der feste Rückstand das Paclitaxel zu 1,8-2,2% w/w enthält;
3) wird der feste Rückstand in Aceton gelöst und mit einem Volumen Hexan gemischt, um polare Unreinheiten zu entfernen, und die Mischung wird auf 1/3 ihres Volumens verdampft;
4) wird der Aceton/Hexan-Rückstand tropfenweise zu Hexan gegeben (1,5 l-3,0 l Rückstand auf 10-15 l Hexan), um ein Präzipitat zu erhalten, dass unter Hochvakuum (1 mm bis 2 mm) bei einer Temperatur von 40ºC gefiltert und getrocknet wird, um etwa 0,5-0,6 kg eines festen Rückstandes zu erhalten;
5) wird der feste Rückstand aus dem vorhergehenden Schritt in 0,5 l Aceton-Methylenchlorid gelöst, um eine 1 : 9 v/v Mischung zu erhalten und einer Chromatographie in einer Silicasäule unterzogen; Cephalomannin wird mit Paclitaxel zusammen eluiert; die Fraktionen, die Paclitaxel und Cephalomannin enthalten werden vereinigt und zur Trockne rotationsverdampft, wobei der feste Rückstand ein Rohgemisch von Paclitaxel und Cephalomannin ist, das zwischen 36 und 40 Gramm Paclitaxel enthält (45-55%);
6) wird ein Rohgemisch (10 g) aus dem vorhergehenden Schritt chemisch verändert, um das Paclitaxel vom Cephalomannin durch Bromierung zu trennen, wobei der nach der Bromierungsreaktion erhaltene feste Rückstand ein Gewicht von 13,2 g hat;
7) wird der bromierte Rückstand in Aceton/Methylenchlorid (1 : 9 v/v) gelöst und chromatographisch durch eine Silicasäule getrennt, die Fraktionen, die Paclitaxel enthalten, werden vereinigt und zur Trockne verdampft; und
8) wird der feste Rückstand aus dem vorhergehenden Schritt in Aceton gelöst und mit dem gleichen Volumen n-Hexan oder anderer Hexane kristallisiert, und die Kristall werden mit kaltem Aceton/Hexan, 1/1 v/v Lösung, gewaschen, gefiltert und im Vakuum bei 40ºC getrocknet, wobei die so erhaltenen Kristalle 4,84 g wiegen und, wie eine Messung durch HPLC-Chromatographie ergab, > 97% w/w Paclitaxel enthalten.
Die US Patente Nr. 5,475,120 und Nr. 5,670,673, erteilt an Rao, beschreiben ein Verfahren zur Isolierung von Paclitaxel. In diesem Verfahren:
1) werden Rinden, Nadeln, Holz, Wurzeln oder ein Kombination davon mit Alkohol behandelt und der erhaltene Extrakt wird unter Druck (< 35-40ºC) konzentriert, um möglichst viel von dem Alkohol zu entfernen;
2) wird für das Konzentrat eine Verteilungschromatographie mit Chloroform (oder Dichlormethan, Dichlorethan oder Trichlorethan) durchgeführt, der Chloroform-Extrakt wird unter geringerem Druck konzentriert, so dass ein dicker Sirup entsteht, und der Sirup wird in Glasschalen gefüllt und in einem Vakuumofen (< 40ºC) getrocknet, so dass ein Pulver entsteht, wenn Rinden oder Holz verwendet werden, oder nadelförmige Kristalle, wenn Nadeln verwendet werden (100 kg Holz oder Rinden ergaben 1,5-2,5 kg Extrakt und 100 kg Nadeln ergaben 2,4-4,8 kg Extrakt);
3) werden feste Chloroform-Extrakte in Acetonitril (5 l) gelöst und Wasser (5 l) wurde hinzugefügt; die Mischung wurde dann mit Silicagel ins Gleichgewicht gebracht (2-3 1 Aufschlämmung); mehr Wasser (15 l) wird nach und nach unter Rühren der Mischung zugegeben; die klare Lösung wird abgesaugt und die dickflüssige Aufschlämuung des Silicagels, die nun mit der Probe imprägniert ist, wird auf den Kopf einer Säule aus Edelstahl aufgebracht; Fraktionen, die Paclitaxel und verschieden wichtige Paclitaxel- Analoge enthalten, werden in einen Abzug gestellt, wo ein langsames Verdampfen des Lösungsmittels stattfindet;
Kristalle bilden sich nach 1 bis 2 Tagen und der Prozess wird für weitere 8-10 Tage zugelassen; und
4) die so erhaltenen reinen Kristalle, die weniger als 5% Cephalomannin enthalten, werden zweifach mit einer Aceton-/Ligroin-Mischung und unter Verwendung von Holzkohle kristallisiert, wobei 41 g reines Paclitaxel erhalten werden, d. h. eine Ausbaute von 0,04%, wobei diese Ausbeute mit 100 kg Rinde erzielt wird; alternativ dazu werden die reinen Kristallen entfärbt, indem man die in Chloroform gelösten Kristalle durch eine kurze Silica- oder Florisil®-Säule führt. Ein weiteres alternatives Verfahren, das kontaminierende Cephalomannin zu entfernen, besteht in der Verwendung von Ozon. Das Waschen der Säule mit einer Mischung von 1-2% Methanol in Chloroform ergab eine Menge Paclitaxel, die durch Konzentrieren oder Kristallisieren gewonnen werden kann. Die Ausbeute ist fast identisch mit der vorherigen von 40 g. Eine Analyse der HPLC-Chromatographie zeigt, dass das so gewonnene Paclitaxel weniger als 0,3% Cephalomannin enthält.
Das US Patent Nr. 5,969,165, erteilt an Liu, beschreibt ein Verfahren zum Isolieren und Reinigen von Paclitaxel und anderen verwandten Verbindungen aus der Taxus canadensis. durch industrielle präparative Niederdruck-Chromatographie.
In diesem Verfahren werden Nadeln und Äste der Taxus canadensis (200 kg) mit 1000 l Methanol bei 60ºG während 5 Stunden extrahiert und dann filtriert. Die Rohstoffe werden mit 700 l Methanol bei 55-60ºC während 4 weiterer Stunden extrahiert und dann gefiltert. Das Filtrat wird mit 10 kg Aktivkohle (5% w/w) zusammengebracht und gemischt. Die Aktivkohle wird durch Filtrieren entfernt. Das Filtrat wird dann auf etwa 100 l konzentriert. Daraufhin werden 300 l Wasser und Dichlormethan (1 : 1) zugegeben. Die organische Schicht wird abgenomuen und die wässrige Lösung wird noch zwei weitere Male mit 200 l Dichlormethan extrahiert. Die Dichlormethanlösung wird vereinigt und verdampft, so dass eine Aufschlämmung entsteht, und dann mit 20 l Aceton verdünnt.
20 kg Celite® 545 werden mit der Acetonlösung überzogen und getrocknet und dann auf die Spitzen von drei industriellen Niederdruckchromatographiesäulen aufgebracht (150 · 15 cm). Jede Säule wird mit 15 kg eines Aluminiumoxid-Absorbens gefüllt. Die Säulen werden mit einem Lösungsmittelsystem aus einer Mischung von Hexan und Aceton eluiert, bei einem Druck zwischen 10 und 15 psi bei einer Durchflussrate von etwa 150 ml/min.
Fraktionen, die Taxane enthalten werden abgenommen und vereinigt und dann konzentriert, um alle anderen Lösungsmittel zu entfernen. Der erhaltene Stoff wird in Methanol gelöst und bei Umgebungstemperatur über Nacht stehen gelassen, um nadelartige Kristalle zu erhalten. Die Kristalle werden filtriert und aus Aceton rekristallisiert, so dass weiße, nadelartige Kristalle entstehen, die als 13-Acetyl-9-dihydrobaccatin III bezeichnet werden.
Das Filtrat wird zur Trockne kristallisiert. Der Rückstand wird in 3 l Aceton gelöst. Die Aceton-Lösung wird mit 1,5 kg eines Polystyrol-Divinylbenzols gemischt. Das Lösungsmittel wird durch Verdampfung entfernt und das erhaltenen Pulver wird oben in eine industrielle Niederdruckchromatographiesäule gegeben, die mit Polystyrol-Divinylbenzol beschickt ist, und wird mit 45% Aceton in Wasser bei eine Durchflussrate von 150 ml/min bei einem Betriebsdruck unter 30 psi.
Die Fraktionen, die Paclitaxel und Cephalomin enthalten, werden vereinigt und zur Entfernung des größten Teils des Acetons verdampft, dann wird mit deionisiertem Wasser verdünnt und dreimal mit 2,5 l Dichlormethan extrahiert. Die organische Schicht wird zur Trockne konzentriert und der Rückstand in 1 l Methanol gelöst.
Etwa 30% (v/v) Wasser werden zu der Methanollösung zugesetzt und die Mischung wird für einige Minuten auf 60ºC erwärmt und dann über Nacht bei Raumtemperatur gehalten. Das feste kristalline Rohprodukt aus der Methanollösung wird abgefiltert und in einem Vakuumofen bei 70-75ºC getrocknet. Der Feststoff besteht aus etwa 70% Paclitaxel und 25% Cephalomannin in einer Ausbeute von 31 g aus 200 kg Nadeln und Zweigen von Taxus canadensis.
Das rohe Paclitaxel wird in 200 ml Acetonitril gelöst und mit 250 ml deionisiertem Wasser verdünnt und auf eine Chromatographiesäule aufgebracht. Die Chromatographiesäule ist mit einem Polymerharz (Diaion®, makroporöses Polymethacrylatharz) beschickt. Die Säule wird mit einem Stufengradienten von 35, 40, 45 und 50% Acetonitril in Wasser eluiert.
Die erhaltenen Fraktionen, die Paclitaxel oder Cephalomanin enthalten, werden getrennt vereinigt und bei 5ºC gehalten bis zur Kristallisation. Dann werden die Paclitaxel- und Cephalomanin-Kristalle getrennt abgefiltert und beide bei 65ºC mit einem Gemisch von Methanol und Wasser rekristallisiert.
Paclitaxel wird als weiße nadelförmige Kristalle mit einer Reinheit > 99% und in einer Ausbeute von 18,5 g (0,009%) erhalten. Cephalomanin wird mit einer Reinheit > 98% in einer Ausbeute von 6,5 g (0,003%) erhalten.
Somit zeigt eine Übersicht über die bekannten Verfahren zur Reinigung von Paclitaxel wie sie dem Anmelder aus dem Stand der Technik bekannt waren, dass man, um hochreines Paclitaxel zu erhalten, zahlreiche Trennschritte mittels Chromatographie und Reinigung durch Kristallisation durchführen muss. Dies führt zu sehr hohen Produktionskosten insbesondere aufgrund des geringen Gehalts von Paclitaxel in den verschieden Taxusarten. Weiterhin ist die Menge an Biomasse, die gereinigt werden kann, sehr begrenzt, aufgrund der geringen Größen der Chromatographiesäulen und der geringen Ausbeute an Paclitaxel nach erfolgter Reinigung.

ZIELE UND ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren bereitzustellen, welches erlaubt:
- das Erhalten einer Biomasse nach Extraktion der Rinden, Nadeln und/oder Zweige von Taxus unterschiedlicher Arten zu erleichtern;
- die Menge der zu erhaltenen und durch Chromatographie zu reinigenden Biomasse zu erhöhen;
- die Reinigungsschritte zu vermindern;
- die Menge des erhaltenen Paclitaxel zu erhöhen; und schließlich
- Produktionskosten auf ein wirtschaftlicheres Maß zu reduzieren.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, eine Mischung von Paclitaxelkristallen mit hoher Reinheit bereitzustellen.
Entsprechend der vorliegenden Erfindung wird das oben erstgenannte Ziel erreicht durch ein Verfahren zur Extraktion und Reinigung von Paclitaxel aus einer natürlichen Quelle von Taxanen, die extrahierbares Paclitaxel enthält, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
a) Extraktion eines Paclitaxel enthaltenden Rohmaterials aus der genannten natürlichen Quelle von Taxanen mit einem organischen Lösungsmittel;
b) Behandlung des genannten Rohmaterials mit einem basischen oder einem sauren Medium, um eine Biomasse durch Fällung und Isolierung der genannten Biomasse und ihre Trocknung zu erhalten;
c) Percolorierung der so isolierten Biomasse durch Entfernung des darin enthaltenen Harzes und der natürlichen Pigmente, Auflösung der genannten Biomasse in Aceton und abschließendem Zusatz von mindestens einem nichtpolaren Lösungsmittel, bis eine mit Paclitaxel angereicherte ölige Phase erhalten wird;
d) Behandlung der Biomasse in der mit Paclitaxel angereicherten öligen Phase, die in dem vorgenannten Schritt erhalten wurde, mit einem sauren Medium, wenn die Behandlung gemäß Schritt (b) mit einem basischen Medium durchgeführt wurde, oder mit einem basischen Medium, wenn die Behandlung gemäß Schritt (b) mit einem sauren Medium durchgeführt wurde, um eine andere Biomasse durch Fällung zu erhalten, die genannte andere Biomasse zu isolieren und sie zu trocknen;
e) mindestens einfache chromatographische Reinigung einer Lösung der isolierten anderen Biomasse, die im vorangehenden Schritt erhalten wurde, in einem flüchtigen Lösungsmittel und mindestens einfache Kristallisation der gereinigten Lösung, die durch Chromatographie erhalten wurde.
Entsprechend der Erfindung wird das zweite oben genannte Ziel erreicht durch eine Mischung von Paclitaxelkristallen, die nach dem oben beschriebenen Verfahren erhalten wurden und nach Filtration und Trocknung der Kristalle besteht aus:
- etwa 53% Kristallen mit einer Reinheit > 99%,
- etwa 22% Kristallen mit einer Reinheit > 98%, und
- etwa 23% Kristallen mit einer Reinheit > 92%.
Die vorliegende Erfindung, ihre Vorteile und der Weg zu ihrer Durchführung wird zum besseren Verständnis nachfolgend beschrieben, wobei die Beschreibung in keiner Weise beschränkend ist.

KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN

Die Fig. 1a, 1b und 1c stellen ein Fließschema dar, welches das Verfahren gemäß der Erfindung veranschaulicht.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung und in der nachfolgenden Beschreibung wird der Ausdruck "Percolorieren" in der Bedeutung verwendet "Harze und Pigmente aus einer Lösung entfernen durch Zusatz eines nichtpolaren Lösungsmittels, welches mischbar oder unmischbar mit der Lösung sein kann".
Wie oben ausgeführt, ist das Verfahren gemäß der Erfindung zur Extraktion und Reinigung von Paclitaxel aus einer natürlichen Quelle von Taxanen, die das zu extrahierende Paclitaxel enthalten, bestimmt.

Schritt 1 - Extraktion

Der erste Schritt des Verfahrens besteht aus der Extraktion eines Rohmaterials, welches Paclitaxel und seine Analoge enthält, aus einer natürlichen Quelle von Taxanen unter Verwendung eines organischen Lösungsmittelgemischs zur Extraktion.
Die natürliche Quelle der Taxane, die als Einsatzmaterial zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet wird, ist von der Taxusart. Sie besteht insbesondere aus einer der Koniferenarten, die Paclitaxel enthalten. Solche Paclitaxel enthaltenden Koniferenarten können sein Taxus brevifolia, Taxus baccata, Taxus canadensis, Taxus Wallichiana, Taxus yunnanensis, Taxus densiformis, Taxus hicksii, Taxus wardii, Taxus cuspidata, Taxus capitata oder Taxus brownii.
Das Verfahren gemäß der Erfindung besitzt den Vorteil, dass es mit einem beliebigen Teil der natürlichen Taxanquelle, die Paclitaxel enthält, durchgeführt werden kann. Vorzugsweise wird die Extraktion aus Rinden der ausgewählten Koniferen vorgenommen. Alternativ kann die Extraktion unter gleichzeitiger Verwendung von Zweigen und Nadeln der ausgewählten Koniferen durchgeführt werden.
Vorzugsweise wird der so erhaltene Extrakt zur Entfernung von Abscheidungen und Ablagerungen filtriert und in einen doppelwandigen Tank dekantiert, in den heißes Wasser (vorzugsweise bei einer Temperatur von 65-70ºC) eingegeben wird. Das Lösungsmittel wird aus diesem Tank destilliert bis eine sehr dicke Flüssigkeit erhalten wird. Der Extrakt wird dann aufgenommen und in Methanol gelöst.
In der Extraktionsstufe wird das eingesetzte organische Lösungsmittel vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus Alkoholen, halogenierten Kohlenwasserstoffen und Gemischen von halogenierten Alkoholen und Kohlenwasserstoffen. Als Beispiele für solche Lösungsmittel können angegeben werden Methanol, Dichlormethan, Trichlormethan und Gemische von Methanol mit Dichlormethan oder Trichlormethan.
Im Falle, dass ein Gemisch von halogeniertem Kohlenwasserstoff und Alkohol eingesetzt wird, stehen Alkohol und halogenierter Kohlenwasserstoff vorzugsweise in einem Volumenverhältnis zwischen 9 : 1 und 1 : 9. Weiter bevorzugt beträgt das Volumenverhältnis des Gemisches etwa 1 : 1.

Schritt 2 - Erste Fällung

Der zweite Verfahrensschritt besteht in einer Behandlung des Rohmaterials entweder in einem basischen oder in einem sauren Medium, um die Ausfällung einer Biomasse zu erreichen.
Im Falle, dass die Fällung in einem basischen Medium durchgeführt wird, besteht dieses Medium vorzugsweise aus einer Lösung eines basischen Salzes wie Natriumacetat, Kaliumacetat oder Tris(hydroximetyl)aminomethan (auch als TRIS bezeichnet).
Nach einer bevorzugten Ausführungsform besteht das basische Medium aus einer Lösung von Natriumhydroxid und das Natriumhydroxid wird in einem Konzentrationsbereich zwischen 10 mmol und 80 mmol pro Liter Lösung und weiter bevorzugt zwischen 20 mmol und 50 mmol pro Liter Lösung eingesetzt.
Der pH-Wert des basischen Mediums liegt üblicherweise zwischen 8,5 und 11, vorzugsweise zwischen 9 und 10.
Wenn die Fällung in einem sauren Medium durchgeführt wird, besteht das saure Medium üblicherweise aus der Lösung einer Mineralsäure oder einer organischen Säurelösung. Die Säure kann aus der Gruppe ausgewählt werden, die besteht aus Chlorwasserstoffsäure, Essigsäure und Zitronensäure.
Die Säurekonzentration in der Lösung liegt vorzugsweise zwischen 10 mmol und 50 mmol pro Liter Lösung, und weiter bevorzugt zwischen 20 mmol und 30 mmol pro Liter Lösung.
Der pH-Wert des sauren Mediums liegt vorzugsweise zwischen 2 und 4.
In allen Fällen liegt das Volumen der basischen oder sauren Lösung, die zu dem Rohmaterial zugesetzt wird, um eine Ausfällung der Biomasse zu erreichen, zwischen dem 1- bis 20- fachen des Volumens des Rohmaterials, das in der ersten Stufe des Verfahrens extrahiert wurde.
Wenn eine basische Lösung verwendet wird, beträgt das Volumen der basischen Lösung, die zu dem Rohmaterial zugesetzt wird, vorzugsweise das 1- bis 15-fache des Volumens des Rohmaterials. Wenn eine saure Lösung eingesetzt wird, beträgt das Volumen der sauren Lösung, die zu dem Rohmaterial zugesetzt wird, vorzugsweise das 1- bis 10-fache des Volumens des Rohmaterials, das in dem ersten Verfahrensschritt erhalten wurde.
Unter diesen Bedingungen wird die gebildet® Ausfällung sehr fein und leicht und ihre Filtration ist sehr schwierig. Tatsächlich kann die Ausfällung nicht vollständig erhalten werden durch eine Zentrifugierung bei niedriger Geschwindigkeit (5000 Upm). Es ist eine Geschwindigkeit von 15000 oder sogar 20000 Upm erforderlich, um eine wirksame Trennung der Ausfällung aus der Lösung zu erreichen.
Zur Lösung dieses Problems und zur Erleichterung der Isolierung der Ausfällung aus der so erhaltenen Biomasse kann die Biomasse vor Isolierung und Trocknung gesalzen werden durch Zusatz von Natriumchlorid in einer Konzentration zwischen 25 und 200 g pro Liter der sauren oder basischen Lösung, die für die Fällung verwendet wurde. Vorzugsweise wird Natriumchlorid in einer Konzentration zwischen 50 und 100, weiter bevorzugt zwischen 50 und 75 g pro Liter für die Fällung verwendete saure oder basische Lösung zugegeben.
Das Salzen der Lösung mit Natriumchlorid ermöglicht es, eine Ausflockung zu erhalten. Die erhaltene Ausfällung ist dann schwerer, stärker agglomeriert und leichter zu filtrieren oder bei niedriger Geschwindigkeit zu zentrifugieren.
Natriumchlorid wird vorzugsweise rasch zu der Lösung unter starkem Rühren zugegeben.
Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die in diesem Schritt ausgefällte Biomasse aus der Lösung durch Filtration oder durch Zentrifugieren abgetrennt und dann bei Umgebungsbedingungen oder unter Vakuum getrocknet, vorzugsweise durch Ventilation oder Lyophilisierung.

Schritt 3 - Percolorierunp

Die dritte Stufe des Verfahrens der Erfindung besteht in der Percolorierung der in dem vorangegangenen Schritt isolierten Biomasse.
Genauer wird in dieser dritten Stufe die in dem vorangegangen Fällungsschritt erhaltene Biomasse zurück in Lösung gebracht durch Zugabe eines Volumens Aceton das gleich bis etwa das 2-fache dessen des in Schritt 1 extrahierten Rohmaterials beträgt, vor der Fällung.
Weiter bevorzugt wird die Biomasse zurück in Lösung gebracht durch zunächst den Zusatz von Aceton und dann von Wasser. Wasser wird vorzugsweise in einem Verhältnis 2-10 Volumenteilen, weiter bevorzugt 5-7 Volumenteilen, auf 100 Volumenteile des zugesetzten Acetons zugegeben.
Nach einer derartigen Auflösung wird mindestens ein nicht polares Lösungsmittel zu der erhaltenen Lösung zugegeben, um eine Paclitaxel angereicherte ölige Phase zu erhalten.
Das (Die) nicht polare(n) Lösungsmittel, die in diesem Percolorierungsschritt vorzugsweise verwendet wird (werden) wird ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus mit Aceton mischbaren Kohlenwasserstoffen wie Hexan oder Heptan. Wenn Hexan verwendet wird, beträgt das eingesetzte Volumen von Hexan das 3- bis 4-fache desjenigen der Acetonlösung.
Die erhaltene Mischung wird dann in ein Dekantiergefäß überführt und die ölige Phase, die Paclitaxel und die anderen Taxane enthält, die auf dem Hoden des Gefäßes abgeschieden werden, werden gewonnen. Die ölige Phase wird dann verdampft und durch Methanol ersetzt.
Der dritte Schritt erlaubt es, den größten Teil des Harzes und der natürlichen Pigmente der Koniferen, die als Einsatzmaterial verwendet werden, zu eliminieren.

Schritt 4 - Zweite Fällung

Der vierte Schritt des Verfahrens gemäß dar Erfindung besteht in der Behandlung der in der Paclitaxel angereicherten öligen Phase enthaltenen Masse, die in dem vorangehenden Schritt erhalten wird, mit einer Base oder einer Säure, um eine andere Biomasse durch Fällung zu erhalten, anschließend der Isolierung und Trocknung dieser anderen Biomasse.
Genauer wird in dieser vierten Stufe die in der vorangehenden Stufe erhaltene Paclitaxel angereicherte Phase zunächst zur Trockne eingedampft und dann mit Methanol zurück in Lösung gebracht.
Die so erhaltene Methanollösung wird dann mit einem basischen Medium gefällt, wenn der erste oben beschriebene Fällungsschritt 2 in einem sauren Medium durchgeführt wurde, oder in einem basischen Medium, wenn der erste Fällungsschritt in einem sauren Medium durchgeführt wurde. Zweck dieser Fällung ist es, eine Biomasse zu erhalten, die Paclitaxel in Form einer Ausfällung enthält.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die so durch Fällung erhaltene Biomasse weiter vor Isolierung und Trocknung gesalzen durch Zugabe von Natriumchlorid in einer Konzentration zwischen 30 und 200 g pro Liter der sauren oder basischen Lösung, die zur Fällung verwendet wurde. Vorzugsweise wird Natriumchlorid in einer Konzentration zwischen 50 und 100 g pro Liter der für die Fällung verwendeten sauren oder basischen Lösung zugesetzt.
Die in der Biomasse enthaltene Ausfällung wird dann abgefiltert und bei Umgebungsbedingungen oder unter Vakuum getrocknet oder lyophilisiert.
Die in diesem Schritt gebildete Ausfällung ist sehr fein und leicht, wodurch ihre Filtration sehr schwierig wird. Tatsächlich kann die Ausfällung nur teilweise gewonnen werden, wenn die Zentrifugierung bei einer niedrigen Geschwindigkeit (z. B. 5000 Upm) durchgeführt wird. Nur eine Geschwindigkeit von 15000 und 20000 Upm erlaubt die vollständige Abtrennung der Ausfällung aus der Lösung. Es ist wiederum vorteilhaft, Natriumchlorid zu der Lösung zuzusetzen, um eine Ausflockung zu erzielen, die das Präzipitat schwerer, agglomeriert und leichter zu filtrieren oder bei niedriger Geschwindigkeit zu zentrifugieren macht. Die zu dieser Behandlung verwendete Konzentration des Natriumchlorids beträgt vorzugsweise 25-100 g pro Liter Lösung, weiter bevorzugt zwischen 50 und 75 g pro Liter Lösung. Natriumchlorid wird der Lösung rasch unter starkem Rühren zugegeben.

Schritt 5 - Chromatographische Reinigung

Der fünfte und letzte Schritt des Verfahrens gemäß der Erfindung besteht in der mindestens einfachen chromatographischen Reinigung einer Lösung der isolierten anderen Biomasse, die in dem vorangehenden Schritt gewonnen wurde, in einem flüchtigen Lösungsmittel, und dem mindestens einfachen Kristallisieren der durch Chromatographie gereinigten Lösung.
Zu diesem Zweck wird die nach der Trocknung in Schritt vier erhaltene Ausfällung in einem flüchtigen Lösungsmittel gelöst und dann mindestens einem Schritt einer chromatographischen Reinigung und mindestens einem Schritt einer Kristallisation der durch die Chromatographie erhaltenen gereinigten Lösung unterworfen. Vorzugsweise wird jedoch das nach Trocknung in Schritt vier erhaltenen Präzipitat mehreren chromatographischen Reinigungen und mehreren Kristallisationen unterworfen, wobei die Anzahl der aufeinander folgenden Reinigungen und Kristallisationen vorzugsweise drei beträgt.
Diese drei aufeinander folgenden Reinigungen und Kristallisationen werden nun als Unterschritte A bis F beschrieben.

A - Erste chromatographische Reinigung

Im ersten chromatographischen Reinigungsschritt wird die in Schritt vier des Verfahrens erhaltene Biomasse in einem flüchtigen Lösungsmittel gelöst. Die erhaltene Lösung wird mit Silicagel gemischt und unter Ventilation getrocknet, anschließend wird das mit der Biomasse bedeckte Silicagel auf eine Chromatographiesäule aufgebracht, die den gleichen Geltyp enthält. In dieser Säule wird die Biomasse mit einem Elutionsgemisch gereinigt, welches 30-40% Aceton und 60-70% Hexan enthält. Vorzugsweise enthält das Elutionsgemisch etwa 40% Aceton und etwa 60% Hexan.
Das flüchtige Lösungsmittel, das für die Auflösung verwendet wird, ist vorzugsweise Aceton. Die Acetonlösung wird anschließend filtriert, um die unlöslichen Teilchen abzufiltrieren, und mit Silicagel gemischt. Das so erhaltene Gemisch wird dann unter Ventilation oder unter Vakuum getrocknet.
Das mit Paclitaxel und seinen Analogen imprägnierte Gel wird auf die Säule aufgebracht, die vorzugsweise eine Höhe von 142 cm und einen inneren Durchmesser von 7,6 cm aufweist und 2,2-2,3 kg Silicagel enthält. Das Gel der Säule wird gewaschen und mit dem Elutionsgemisch, das aus Aceton und Hexan (40-60% v/v) besteht, ins Gleichgewicht gebracht. Die Elution der Fraktionen wird mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch bei einer Durchflussrate von etwa 100 ml/min. unter einem Druck zwischen 0 und 30 psi durchgeführt.

B - Zweite chromatographische Reinigung

Im zweiten chromatographischen Reinigungsschritt werden die Paclitaxal-angereicherten Fraktionen, die in der vorangehenden Stufe erhalten wurden, vorzugsweise vereinigt und dann zur Trockne eingedampft bis ein Rückstand erhalten wird.
Eine Lösung des Rückstandes wird dann durch Lösung in einem flüchtigen Lösungsmittel hergestellt. Die so erhaltene Lösung wird anschließend durch Chromatographie unter den gleichen Bedingungen wie im vorangehenden Schritt gereinigt, um neue Paclitaxel angereicherte Fraktionen zu erhalten.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform wird der Rückstand in Aceton gelöst und dann mit Silicagel gemischt und getrocknet.
Das mit Paclitaxel und seinen Analogen imprägnierte Gel wird auf eine Säule aufgebracht (142 cm lang, 7,6 cm innerer Durchmesser), welche 2,2-2,3 kg Silicagel enthält. Das Gel der Säule wird gewaschen und mit einem Elutionsgemisch ins Gleichgewicht gebracht, welches aus Aceton und Hexan besteht (40-60 % v/v). Die Elution der Fraktionen wird mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch bei einer Durchflussrate von etwa 100 ml/min. unter einem Druck zwischen 0 und 30 psi durchgeführt.
Die Fraktionen, die Paclitaxel (im Allgemeinen zwischen 40 und 60% Paclitaxel) enthalten werden nochmals vereinigt.

C - Erste Kristallisation

In dieser Stufe werden die Paclitaxel enthaltenden Fraktionen, die durch Chromatographie im vorangehenden Reinigungsschritt erhalten wurden, zur Trockne eingedampft und wieder in eine Lösung in Aceton gebracht. Die Acetonmenge wird so eingestellt, dass eine Lösungsabsorption mit einem Wert von 1,0-1,5 O. D. (optische Dichte) für den Paclitaxel entsprechenden Peak gemäß der HPLC-Analyse erhalten wird. Dann wird das Paclitaxel kristallisiert durch Zugabe des 3- bis 4-fachen Volumens an Hexan zur Acetonlösung.
Es werden schnell Kristalle gebildet. Man lässt die Mischung über Nacht bei Umgebungstemperatur oder einer Temperatur zwischen 2 und 8ºC zur Vervollständigung der Kristallisation stehen.

D - Zweite Kristallisation

Bei diesem Schritt werden die durch Rekristallisation in der vorangehenden Stufe erhaltenen Kristalle durch Filtration abgetrennt und wieder in Aceton gelöst mit einem Volumen an Aceton, das so eingestellt ist, dass eine Absorption der Lösung zwischen 1,0 und 1,5 O. D. für den Paclitaxel entsprechenden Peak gemäß der HPLC-Analyse erzielt wird.
Das in der Lösung enthaltene Paclitaxel wird dann durch Zugabe des 3- bis 4-fachen Volumens Hexan pro Volumen der Lösung zu der Acetonlösung rekristallisiert.
Die in diesem Schritt erhaltenen Kristalle weisen gemäß der HPLC-Analyse eine Paclitaxelreinheit > 80% auf.

E - Dritte chromatographische Reinigung

In dieser Stufe werden die in der vorangehenden Stufe erhalten Kristalle filtriert und dann wieder in Lösung gebracht mit Methylenchlorid.
Die so erhaltene Lösung wird anschließend mit Silicagel gemischt und unter Ventilation getrocknet.
Das mit Paclitaxel bedeckte Silicagel wird auf eine Chromatographiesäule, die den gleichen Geltyp enthält, aufgebracht. Das Paclitaxel wird dann nochmals zum dritten Mal mit einem Elutionsgemisch aus einem organischen Lösungsmittel gereinigt. Vorzugsweise enthält das Elutionsgemisch zwischen 95 und 98% Methylenchlorid und zwischen 2 und 5% Isopropanol.
In dieser Stufe werden die Kristalle vorzugsweise mit Methylenchlorid gelöst, mit Silicagel gemischt und getrocknet. Das mit Paclitaxel imprägnierte Gel wird auf eine Chromatographiesäule aufgebracht (76 cm lang · 7,6 cm innerer Durchmesser), welche 1,5-1,6 kg. Silicagel enthält. Das Gel der Säule wird gewaschen und mit einem Lösungsmittel ins Gleichgewicht gebracht, welches aus Methylenchlorid und Isopropanol (98-2% v/v) besteht. Die Elution der Fraktionen wird mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch bei einer Durchflussrate von etwa 50 ml/min. unter einem Druck zwischen 0-30 psi durchgeführt.

F - Dritte Kristallisation

In dieser Stufe werden die Paclitaxel enthaltenden angereicherten Fraktionen, die in der vorangehenden Stufe durch Chromatographie erhalten wurden, vereinigt entsprechend ihrer Reinheit, vorzugsweise entsprechend Reinheiten von +98 bis +99% und 90 bis 98%. Anschließend werden sie zur Trockne eingedampft und wieder in Lösung gebracht in Alkohol, vorzugsweise Methanol, ein Keton oder eine Alkohol-Aceton-Mischung.
Das Volumen des zugesetzten Lösungsmittel, vorzugsweise Methanol, wird so eingestellt, dass eine Absorption zwischen 1,0 und 1,5 O. D. für den Paclitaxel entsprechenden Peak gemäß der HPLC-Analyse erzielt wird.
Das Paclitaxel wird dann zum dritten Male rekristallisiert durch Zugabe von 2 bis 10 Volumenteilen Wasser pro Volumen der Lösung zu der Methanollösung. Vorzugsweise werden 4 bis 7 Volumenteile Wasser pro Volumenteil der Methanollösung verwendet.
Hei der letzten Stufe der Reinigung und Rekristallisation, die oben beschrieben wurde, ist das verwendete Wasser vorzugsweise ein durch Deionisierung und/oder Destillation erhaltenes gereinigtes Wasser.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform werden 7 bis 10 Volumenteile reinen Wassers auf eine Temperatur von 2 bis 4ºC abgekühlt und zu einem Volumen der in Eis gekühlten Methanollösung gegeben. Daraufhin erscheinen unmittelbar Kristalle. Die Kristallisation wird über Nacht bei einer Temperatur zwischen 2 bis 4ºC fortgeführt.
Zugabe von Wasser in die Methanollösung kann bei Umgebungstemperatur erfolgen. Die Bildung der Kristalle wird dann langsamer sein, sie wird jedoch über Nacht bei 2 bis 4ºC vervollständigt. Die Kristalle werden abfiltriert und unter Ventilation oder unter Vakuum getrocknet, um ein feines und lockeres Pulver zu erhalten. Die Kristalle werden dann in Suspension in reinem Wasser aufgenommen und über 66 bis 72 Stunden bei einer Temperatur von etwa -60ºC lyophilisiert.
Die erhaltenen Taxan-Fraktionen können durch HPLC- Chromatographie (Waters-System) analysiert werden unter Verwendung eines Autosamplers (Waters 717 plus), eines Photodioden Array Detectors (Waters 996), eines Multisolvent Einspeisesystems (Waters® 600E) und einer C18 Nova-Pak®-Säule, 60 Å, 4 um (3,9 · 150 mm).
Analyse der Fraktion wird durch Injektion eines Volumens von 5 ul durchgeführt. Die Durchflussrate der mobilen Phase beträgt etwa 1 ml/min. unter Verwendung eines Lösungsmittelgradienten: Acetonitril-Wasser-Methanol (20 : 50 : 30 zu Beginn; 35 : 35 : 30 bei Ende).
Die Peaks der Verbindungen werden bei 228 nm detektiert, die Analysezeit einer Probe beträgt etwa 36 Minuten.
Vorzugsweise wird das flüchtige Lösungsmittel, das in der Stufe der chromatographischen Reinigung zur Lösung des Rückstandes verwendet wird, ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus Ketonen, C1-C3 niederen Alkoholen, Methylacetat, Methylenchlorid, und Mischungen dieser Lösungsmittel.
Zum Ende der Stufe F wird nach Kristallisation des Paclitaxels in Wasser und nach Filtern und Trocknen ein Gemisch von Paclitaxelkristallen erhalten. Dieses Gemisch von Paclitaxelkristallen besteht aus:
- 53% Kristallen mit einer Reinheit > 99
- 22% Kristallen mit einer Reinheit > 98% und
- 23% Kristallen mit einer Reinheit > 92%.
Die folgenden Beispiele dienen ausschließlich zur Veranschaulichung und stellen keinesfalls eine Beschränkung des Bereichs der vorliegenden Erfindung dar.

BEISPIEL 1

Extraktion

50 kg trockene Nadeln und Zweige von Taxus canadensis wurden mit deionisiertem Wasser gewaschen und unter Ventilation getrocknet. Die Rohmaterialien wurden gemahlen und in eine Baumwolltasche überführt. Diese Tasche wurde in einen Tank aus rostfreiem Stahl, der 150 l eines Lösungsmittelgemischs (Methylenchlorid-Methanol; 1 : 1 v/v) enthielt, eingehängt. Die Extraktion wurde während 16 Stunden bei Umgebungstemperatur durchgeführt. Der Extrakt wurde durch Filter in einen zweiten doppelwandigen Tank gepumpt. Das Lösungsmittel wurde mit Hilfe heißen Wassers von 70ºC, das innerhalb der Doppelwand des Tanks zirkulierte, abdestilliert bis eine sehr dicke Flüssigkeit erhalten wurde.

Erste Fällung

Das Extraktkonzentrat wurde gewonnen und mit 2 l Methanol verdünnt. Die Biomasse wurde durch Fällung isoliert durch Zugabe des Extrakts zu einer NaOH-Lösung von 20 mmol. Ein sehr feines Präzipitat wurde gebildet, sowie der Extrakt zu der Na-OH-Lösung zugesetzt wurde. Das Volumenverhältnis des Extrakts zur basischen Lösung betrug etwa 1 : 15.
Die feine Ausfällung war sehr schwierig zu filtrieren. Lediglich eine Zentrifugierung bei sehr hoher Geschwindigkeit (15000-20000 Upm) konnte eine Gewinnung der Biomasse ermöglichen. Daher wurde der Lösung NaCl in einer Menge von 50 g/l Lösung zugesetzt, um eine stärkere Agglomerierung des Präzipitats zu erzielen. Das Präzipitat wurde dann abgefiltert oder bei einer Geschwindigkeit von lediglich 4.200 Upm bei 20ºC während 30 Minuten zentrifugiert (J6MC Beckman® Zentrifuge, 4,2 JS Rotor). Selbstverständlich kann eine Zentrifuge mit kontinuierlichem Fluss verwendet werden, um große Mengen der Ausfällung zu erzeugen.
Das so erhaltene Präzipitat wurde luft- oder vakuumgetrocknet oder lyophilisiert (Gefriertrockner - FTS Systems). Das Gewicht des Präzipitats betrug etwa 500-550 g. Die Ausfällung wurde in 2 l Aceton gelöst und filtriert oder bei 4 200 Upm bei 0-2ºC während 30 Minuten zentrifugiert, um darin enthaltene unlösliche Teilchen abzutrennen.

Percolorierung

Anschließend wurde 1 l der Acetonlösung in ein 6 l- Gefäß eingesetzt, die Lösung wurde mit 4 l Hexan gemischt durch sukzessive Zugabe von 1 l Hexan und jeweils kräftiges manuelles Schütteln. Man ließ die Mischung für etwa 10 Minuten stehen, anschließend wurde die ölige Phase am Boden des Gefäßes gewonnen.
In der Praxis kann die Acetonlösung in einem Batch behandelt werden unter Verwendung eines großen Becher-Gefäßes oder eines entsprechenden Tanks, aus dem die Hexanphase abgesaugt werden kann und die verbleibende Flüssigkeit in ein Trenngefäß überführt werden kann, um die ölige Phase vollständig zu gewinnen.
Während dieser Stufe wurde die stark gefärbte Hexanphase verworfen.

Zweite Fällung

Die ölige Phase wurde dann zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in 2 l Methanol gelöst. Die Biomasse wurde zum zweiten Mal durch Fällung isoliert, die durch Zugabe der Methanollösung zu einer Lösung von 20 mmol 1101 bewirkt wurde. Eine sehr feine Ausfällung wurde gebildet sobald der Extrakt zugegeben wurde. Das Volumenverhältnis des Extrakts zur Säurelösung betrug etwa 1 : 5. Nochmals war es sehr schwierig, dieses feine Präzipitat zu filtrieren. Lediglich eine Zentrifugierung bei hoher Geschwindigkeit (15000-20000 Upm) konnte eine Gewinnung der Biomasse ermöglichen. Daher wurde wieder NaCL zu der Lösung zugegeben (50 g/l Lösung), um das Präzipitat stärker zu agglomerieren. Das Präzipitat wurde dann filtriert oder bei einer Geschwindigkeit von lediglich 4200 Upm bei 20ºC während 30 Minuten zentrifugiert (J6MC Beckman® Zentrifuge, 4,2 JS Rotor). Wiederum kann eine Zentrifuge mit kontinuierlichem Zufluss verwendet werden, um große Mengen an Präzipitat zu erzeugen.

Erste Reinigung durch Chromatographie an Silicagel bei niedrigem Druck

Die gewonnene Ausfällung wurde mit Luft oder unter Vakuum getrocknet oder lyophilisiert. Das Gewicht des Präzipitats betrug etwa 240-260 g. Dieses Präzipitat wurde in 0,5 l Aceton gelöst und bei 4 200 Upm zentrifugiert bei 0-2ºC während 30 Minuten, um die unlöslichen darin enthaltenen Partikel zu entfernen. Die Acetonlösung wurde dann mit 200-250 g Silicagel gemischt (230-400 mesh, pharmazeutische Qualität, Silicycle® Quebec Kanada). Das mit dem Extrakt imprägnierte Gel wurde luftgetrocknet unter Ventilation oder unter Vakuum. Das getrocknete Gel wurde auf eine Säule aufgebracht (142 · 7,6 cm innerer Durchmesser), die 2,2 kg Silicagel (230-400 mesh) enthielt. Das Gel wurde gewaschen und mit einem Aceton-/Hexan- Gemisch (40 : 60 v/v) ins Gleichgewicht gebracht. Die Elution wurde mit dem gleichen Lösungsmittel durchgeführt unter Verwendung eines Dynamax®-Lösungsmitteleinspeisesystems. Die Durchflussrate der Elution war 100 ml/min unter einem Druck zwischen 10 und 30 psi. Das Volumen des Lösungsmittelgemischs betrug etwa 30 l und jede Fraktion wurde in Batches unter Verwendung von 1 l Reinigungslösungsmittel gesammelt. Die HPLC- Analyse zeigte, dass von der 17. bis 25, erhaltenen Fraktion 9 Fraktionen Paclitaxel enthielten.
Der Paclitaxelgehalt in diesen Fraktionen gemäß Bestimmung durch HPLC betrug 11; 24; 32; 40; 38; 33; 29; 14 und 9%.
Es soll festgehalten werden, dass die Paclitaxelhaltigen Fraktionen sich im Hinblick auf die anderen von einer Reinigung zur nächsten absetzen können.

Zweite Reinigung durch Chromatographie an Silicagel bei niedrigem Druck

Die Paclitaxel enthaltenden Fraktionen wurden miteinander vereinigt und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde wieder in 100 ml Aceton gelöst und mit 100 g Silicagel in Kontakt gebracht. Das mit Paclitaxel bedeckte Gel wurde luftgetrocknet unter Ventilation oder unter Vakuum. Das getrocknete Gel wurde auf eine Säule aufgebracht (142 · 7,6 cm Innendurchmesser), die 2,2 kg Silicagel (230-400 mesh) enthielt. Das Gel wurde gewaschen und mit einem Gemisch von Aceton und Hexan ins Gleichgewicht gebracht (40 : 60% v/v). Die Elution wurde mit dem gleichen Lösungsmittel unter Verwendung eines Lösungsmitteleinspeisesystems durchgeführt. Die Durchflussrate der Elution betrug etwa 100 ml pro Minute unter einem Druck zwischen 10-30 psi. Das Volumen des Lösungsmittelgemischs betrug etwa 30 l und die Fraktionen wurden in Batches von etwa 1 l Lösungsmittel pro Fraktion gesammelt. Die HPLC-Analyse zeigte, dass es 5 Fraktionen gab, die Paclitaxel enthielten, von der 22. bis zur 26. Fraktion. Der Paclitaxelgehalt nach Bestimmung durch HPLC in diesen Fraktionen betrug: 40; 58; 66; 50 und 49%. Wiederum können die Paclitaxel-haltigen Fraktionen sich im Hinblick auf die anderen von einer Reinigung zur nächsten absetzen.

Erste Kristallisation

Die Fraktionen, die Paclitaxel enthielten, wurden vereinigt und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in 800 ml Aceton wieder aufgelöst. Die Einstellung des Acetonvolumens auf die HPLC-Analyse war erforderlich in der Weise, dass eine Absorption von 1,0-1,5 O. D. für die Paclitaxel Peaks erhalten wurde. Drei Volumenteile Hexan (2,4 l) wurden zur Acetonlösung zugegeben. Während der folgenden Stunde bildeten sich Kristalle. Das Gemisch wurde bei einer Temperatur zwischen 2-8ºC über Nacht gehalten, um die Kristallisation zu vervollständigen.

Zweite Kristallisation

Die erhaltenen Kristalle wurden filtriert und wieder in 400 ml Aceton aufgelöst. Drei Volumenteile Hexan (1,2 l) wurden zur Acetonlösung zugegeben. Es bildeten sich in der folgenden Stunde Kristalle. Das Gemisch wurde bei einer Temperatur zwischen 2-8ºC über Nacht stehen gelassen, um die Kristallisation zu vervollständigen. Die Kristalle wurden mit Luft oder unter Vakuum getrocknet.
Das Trockengewicht der erhaltenen Kristalle betrug etwa 10 g ± 0,2 g. Die HPLC-Analyse zeigte, dass der Paclitaxelgehalt etwa 80% und mehr betrug.

Dritte Reinigung durch Chromatographie an Silicagel bei niedrigem Druck

Die Kristalle wurden wiederum in 75 ml Methylenchlorid gelöst und mit 75 g Silicagel in Kontakt gebracht. Das mit Paclitaxel bedeckte Gel wurde luftgetrocknet unter Ventilation oder unter Vakuum. Das getrocknete Gel wurde auf eine Säule aufgebracht (76 · 7,6 cm innerer Durchmesser), die 1,5 kg Silicagel (230-400 mesh) enthielt. Das Gel wurde gewaschen und mit einem Gemisch von Methylenchlorid und Isopropanol ins Gleichgewicht gebracht (98 : 2% v/v). Die Elution wurde mit dem gleichen Lösungsmittel durchgeführt unter Verwendung eines Dynamax® Lösungsmitteleinspeisesystems. Die Durchflussrate der Elution betrug etwa 50 ml/min unter einem Druck zwischen 10-30 psi. Das Volumen des Lösungsmittelgemischs betrug etwa 30 l und die Fraktionen wurden gesammelt mit 1 l Lösungsmittel pro Fraktion. Die HPLC-Analyse zeigte, dass es 12 Fraktionen gab, die Paclitaxel enthielten, von der 11. bis zur 22. Fraktion. Der Paclitaxelgehalt bestimmt durch HPLC, in diesen Fraktionen betrug: 80; 97; 99,50; 99,70; 99,70; 99,30; 98,60; 97,30; 94; 92; 89 und 85%. Wiederum können die Paclitaxel-haltigen Fraktionen im Hinblick auf die anderen von einem Reinigungsschritt zu dem nächsten abgesetzt werden.

Dritte Kristallisation

Die Paclitaxel enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt entsprechend ihren Reinheitsgraden und zur Trockne eingedampft. Die 12. bis 16. Fraktionen wurden in 100 ml Methanol gelöst (HPLC Grad), die 17. bis 18. Fraktionen wurden in 45 ml Methanol (HPLC Grad) gelöst und die 19. bis 25. Fraktionen in 75 ml Methanol (HPLC Grad).
1) 700 ml Wasser (HPLC Grad), die zuvor auf 2 bis 8ºC gekühlt wurden, wurden zu der Methanollösung (12. bis 16. Fraktion), die in Eis gekühlt war, zugegeben. Es erschienen unmittelbar weiße Kristalle.
2) 300 ml Wasser (HPLC Grad), die zuvor auf 2 bis 8ºC gekühlt worden waren, wurden zu der Methanollösung (17. und 18. Fraktion), die in Eis gekühlt war, zugegeben. Es bildeten sich unmittelbar weiße Kristalle.
3) 500 ml Wasser (HPLC Wasser), die zuvor auf 2-8ºC gekühlt worden waren, wurden zu der Methanollösung (19. bis 22. Fraktion), die in Eis gekühlt war, zugegeben. Es erschienen unmittelbar weiße Kristalle.
Die Kristalle wurden getrennt filtriert und mit Luft oder unter Vakuum getrocknet. Das Trockengewicht und die Reinheit der Kristalle entsprechend der HPLC-Analyse waren wie folgt:
12. bis 16. Fraktion: 3,40 g - Reinheit 99,30%
17. bis 18. Fraktion: 1,40 g - Reinheinheit %
19. bis 22. Fraktion: 1,60 g - Reinheinheit %
Kristalle mit einer Reinheit unter 98% wurden separiert und nochmals gemeinsam durch Chromatographie unter den gleichen Bedingungen wie in der dritten Reinigungsstufe entsprechend der vorangegangenen Beschreibung gereinigt. Diese nochmalige Reinigung ermöglichte es, etwa 75% der Gesamtmenge an Kristallen mit einer Reinheit größer als 99 % zu erhalten.

BEISPIEL 2

Das in Beispiel 2 beschrieben® Verfahren war ähnlich zu demjenigen, welches in Beispiel 1 beschrieben wurde, mit der Ausnahme, dass die erste und zweite Fällungsstufe wie folgt durchgeführt wurde.

Erste Fällung

Das Extraktkonzentrat wurde gewonnen und mit 2 l Methanol verdünnt. Die Biomasse wurde durch Fällung durch Zugabe des Extrakts zu einer Lösung von 20 mmol HCl isoliert. Ein sehr feines Präzipitat wurde nach Zugabe des Extrakts gebildet. Das Volumenverhältnis des Extrakts hinsichtlich der sauren Lösung betrug etwa 1 : 10. Das feine Präzipitat war sehr schwer zu filtrieren. Lediglich eine Zentrifugierung bei hoher Geschwindigkeit (15000-20000 Upm) erlaubte die Gewinnung der Biomasse. Daher wurde NaCl zu der Lösung in einer Menge von 50 g/l Lösung zugesetzt, um eine stärkere Agglomerierung des Präzipitats zu erhalten. Die Ausfällung wurde bei 4.200 Upm bei 20ºC während 30 Minuten zentrifugiert (J6MC Beckman® Zentrifuge, 4,2 JS Rotor).
Das gewonnene Präzipitat wurde mit Luft oder unter Vakuum getrocknet oder lyophilisiert. Das Gewicht des Präzipitats betrug etwa 500-520 g. Dieses Präzipitat wurde in 2 l Aceton gelöst und filtriert oder bei 4200 Upm bei 0-2ºC während 30 Minuten zentrifugiert, um die darin enthaltenen unlöslichen Teilchen zu entfernen.

Zweite Fällung

Die ölige Phase wurde dann zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in 2 l Methanol gelöst. Die Biomasse wurde ein zweites Mal durch Fällung durch Zusatz der Methanollösung zu einer Lösung von 20 mmol NaOH isoliert. Es wurde bei der Zugabe des Extrakts ein sehr feines Präzipitat gebildet. Das Volumenverhältnis des Extrakts zur basischen Lösung betrug etwa 1 : 5. Dieses feine Präzipitat war sehr schwer zu filtrieren. Lediglich eine Zentrifugierung bei hoher Geschwindigkeit (15000-20000 Upm) ermöglichte die Gewinnung der Biomasse. Daher wurde NaCl in einer Menge von 20 g/l der Lösung zugesetzt, um eine höhere Agglomeration des Präzipitats zu erzielen. Das Präzipitat wurde dann filtriert und bei 4200 Upm bei 20ºC während 30 Minuten zentrifugiert (J6MC Beckman® Zentrifuge, 4,2 JS Rotor).
Die in Beispiel 2 erhaltenen Ausbeute und Reinheitsgrade waren identisch mit denjenigen aus Beispiel 1.
Die vorangegangenen Beispiele zeigen, dass das Verfahren gemäß der Erfindung eine wesentliche Herabsetzung der Produktionskosten von Paclitaxel ermöglicht, verglichen mit den verschiedenen Verfahren, die aus dem Stand der Technik bekannt sind. Diese Kostenreduktion geht zurück auf eine Erhöhung der Paclitaxelausbeute mit einer akzeptablen therapeutischen Reinheit und bemerkenswerte Einsparungen in Form nicht-wiedergewinnbarer Produkte (Lösungsmittel, Gel ...) und Produktionszeit. Zusätzlich zu diesen Vorteilen stellt die vorliegende Erfindung ein sehr einfaches, schnelles und leichtes Verfahren bereit, dass in industriellem Maßstab eingesetzt werden kann, ohne dass es durch die niedrige Menge an Paclitaxel, die in den behandelten Biomassen enthalten ist, limitiert ist.

Claims

1. Verfahren zum Extrahieren und Reinigen von Paclitaxel aus einer natürlichen Quelle von Taxanen, die das zu extrahierende Paclitaxel enthält, umfassend die folgenden Schritte:

a) Extrahieren eines Paclitaxel enthaltenden Rohmaterials aus der natürlichen Taxan-Quelle mit einem organischen Lösemittel;

b) Behandeln des Rohmaterials in einem basischen oder einem sauren Medium, um durch Ausfällung eine Biomasse zu erhalten, Isolieren der Biomasse und Trocknen derselben;

c) Perkolorisieren der so isolierten Biomasse durch Entfernen von darin enthaltenem Harz und natürlicher Pigmente, Lösen der Biomasse in Aceton und dann Hinzugeben wenigstens eines unpolaren Lösemittels, bis eine mit Paclitaxel-angereicherte ölige Phase erhalten wird;

d) Behandeln der Biomasse, die in der mit Paclitaxel angereicherten, im vorhergehenden Schritt erhaltenen öligen Phase enthalten ist, mit einem sauren Medium, falls die Behandlung in Schritt b) mit einem basischen Medium erfolgte, oder mit einem basischen Medium, falls die Behandlung in Schritt (b) mit einem sauren Medium erfolgte, um durch Ausfällen eine andere Biomasse zu erhalten, Isolieren dieser anderen Biomasse und Trocknen derselben;

e) wenigstens einmaliges chromatographisches Reinigen einer Lösung der isolierten, im vorhergehenden Schritt gewonnenen anderen Biomasse in einem flüchtigen Lösemittel, und wenigstens einmaliges Kristallisieren der durch Chromatographie erhaltenen gereinigten Lösung.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die natürliche, Paclitaxel enthaltende Taxan-Quelle aus Koniferen besteht, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Taxus brevifolia, Taxus baccata, Taxus canadensis, Taxus wallichiana, Taxus yunnanensis, Taxus densiformis, Taxus hicksii, Taxus wardii, Taxus cuspidata, Taxus capitata, Taxus brownii.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (a) alle Teile der Koniferen verarbeitet werden.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (a) die Rinden der Koniferen verarbeitet werden.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (a) Zweige und Nadeln der Koniferen gleichzeitig verarbeitet werden.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (a) das organische Lösemittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alkoholen, halogenierten Kohlenwasserstoffen und Mischungen aus Alkoholen und halogenierten Kohlenwasserstoff an.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (a) das Lösemittel eine Mischung aus Methanol und Dichlormethan oder eine Mischung aus Methanol und Trichlormethan ist.

8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Alkohol und der halogenierte Kohlenwasserstoff in einem Volumenverhältnis im Bereich von 9 : 1 bis 1 : 9 vorliegen.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Volumenverhältnis von Alkohol zu halogeniertem Kohlenwasserstoff etwa 1 : 1 beträgt.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (b) die Biomasse in einem basischen Medium ausgefällt wird, das aus einer Lösung eines basischen Salzes besteht, welches aus der Gruppe bestehend aus Natriumacetat, Kaliumacetat, Natriumhydroxid und Tris(hydroxymethyl)aminomethan ausgewählt ist.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass:

- das basische Salz Natriumhydroxid ist;

- das Natriumhydroxid in einer Konzentraton zwischen 10 mM und 80 mM pro Liter der Lösung eingesetzt wird; und

- der pH-Wert der Lösung zwischen 8, 5 und 11 liegt.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 und 11, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert der Lösung zwischen 9 und 10 liegt.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (b) die Biomasse in einem sauren Medium ausgefällt wird, welches aus einer Lösung eines Minerals oder einer organischen Säure besteht.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Säure aus der Gruppe bestehend aus Salzsäure, Essigsäure und Zitronensäure ausgewählt ist.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Säurekonzentration der Lösung zwischen 10 mM und 50 mM pro Liter der Lösung liegt.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Säurekonzentration zwischen 20 mM und 30 mM pro Liter der Lösung liegt.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert der Lösung zwischen 2 und 4 liegt.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (b), das Ausfällen der Biomasse mit einer Lösung der Base oder der Säure bei einem Volumenverhältnis der Lösung zu dem in Schritt (a) extrahierten Rohmaterial zwischen 1 und 10 geschieht.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die ausgefällte Biomasse vor dem Isolieren und Trocknen gesalzen wird, und zwar durch Hinzugeben von Natriumchlorid in einer Konzentration zwischen 25 und 200 g pro Liter der für die Ausfällung verwendeten Lösung.

20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass Natriumchlorid in einer Konzentration zwischen 50 und 100 g pro Liter der für die Ausfällung verwendeten Lösung hinzugegeben wird.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die ausgefällte Biomasse durch Filtration oder durch Zentrifugieren getrennt und dann durch Ventilation oder durch Lyophilisation getrocknet wird.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass das wenigstens eine unpolare Lösemittel, das in Schritt (c) verwendet wird, aus der Gruppe bestehend aus Hexan oder Heptan ausgewählt ist.

23. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (c) die in Schritt (b) erhaltene, getrocknete Biomasse erneut gelöst wird, und zwar durch Zugabe eines Volumens von Aceton, das 2 Volumina des in Schritt (a) extrahierten Rohmaterials entspricht.

24. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass die in Schritt (b) erhaltene, getrocknete Biomasse erneut gelöst wird, und zwar durch Zugabe von Aceton und anschließende Zugabe von Wasser.

25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass Wasser in einem Verhältnis von 2 bis 10 Volumina pro 100 Volumina des hinzugefügten Acetons hinzugegeben wird.

26. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (d):

- die in Schritt (c) erhaltene, mit Paclitaxel angereicherte Phase zur Trockne verdampft und erneut, in Methanol, gelöst wird; und

- die Methanol-Lösung dann in einem basischen Medium ausgefällt wird, falls die erste, in Schritt (b) beschriebene Ausfällung in einem sauren Medium durchgeführt wurde, oder in einem sauren Medium, falls die erste, in Schritt (b) beschriebene Ausfällung in einem basischen Medium durchgeführt wurde;

- so dass eine Paclitaxel enthaltende Biomasse erhalten wird, wobei Paclitaxel in Form eines Präzipitats vorliegt.

27. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass die in Schritt (d) erhaltene Biomasse weiterhin vor dem Isolieren und Trocknen gesalzen wird, und zwar durch Hinzugeben von Natriumchlorid in einer Konzentration zwischen 30 und 200 g pro Liter der für die Ausfällung verwendeten Lösung.

28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass Natriumchlorid in einer Konzentration zwischen 50 und 100 g pro Liter der für die Ausfällung verwendeten Lösung hinzugegeben wird.

29. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt (e) die folgenden Unterschritte umfasst:

e&sub1;) eine erste chromatographische Reinigung, umfassend:

Lösen des in Schritt (d) isolierten Präzipitats in einem flüchtigen Lösemittel, Herstellen einer Mischung der so erhaltenen Lösung mit Silicagel, Behandeln der Mischung in einer Silicagel enthaltenden Chromatographiesäule und Gewinnung von mit Paclitaxel angereicherten Fraktionen;

e&sub2;) eine zweite chromatographische Reinigung, umfassend:

Verdampfen der in dem vorhergehenden Schritt gewonnenen, mit Paclitaxel angereicherten Fraktionen bis zur Trockne, bis ein Rückstand erhalten wird, und Herstellen einer Mischung durch Solubilisieren des Rückstandes in einem flüchtigen Lösemittel, wobei die Mischung erneut gereinigt wird, und zwar durch Chromatographie unter den gleichen Bedingungen wie in dem vorhergehenden Unterschritt, um andere, mit Paclitaxel angereicherte Fraktionen zu erhalten;

e&sub3;) eine erste Kristallisation, umfassend: Verdampfen der anderen, in dem vorhergehenden Unterschritt gewonnenen, mit Paclitaxel angereicherten Fraktionen bis zur Trockne, bis ein Rückstand erhalten wird, Herstellen einer Mischung dieses Rückstands in Aceton und Kristallisieren des in der Mischung enthaltenen Paclitaxel mit einem unpolaren Lösemittel;

e&sub4;) eine zweite Kristallisation, umfassend: Solubilisieren von im vorhergehenden Unterschritt erhaltenen Paclitaxel-Kristallen in Aceton und Rekristallisieren des Paclitaxel unter den gleichen Bedingungen wie in dem vorhergehenden Unterschritt;

e&sub5;) eine dritte chromatographische Reinigung, umfassend:

Solubilisieren der durch Rekristallisation in dem vorhergehenden Unterschritt erhaltenen Kristalle in einem flüchtigen Lösemittel, um eine Lösung zu erhalten, Herstellen einer Mischung der Lösung mit Silicagel und Behandeln der Mischung in einer Silicagel enthaltenden Chromatographie- Säule, um, mit einem Elutionslösemittel, weitere mit Paclitaxel angereicherte Fraktionen zu erhalten; und

e&sub6;) eine dritte Kristallisation, umfassend: Verdampfen der in dem vorhergehenden Unterschritt erhaltenen, weiteren, mit Paclitaxel angereicherten Fraktionen zur Trockne, bis ein Rückstand erhalten wird, Solubilisieren des Rückstandes in einem Alkohol, in Aceton oder einer Alkohol- Aceton-Mischung, um eine andere Mischung zu erhalten, und Kristallisieren des in der anderen Mischung enthaltenen Paclitaxels mit Wasser.

30. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (e&sub1;):

- die in Schritt (d) erhaltene Biomasse erneut, in einem flüchtigen Lösemittel, gelöst wird;

- die erhaltene Lösung mit Silicagel gemischt und unter Ventilation getrocknet wird;

- das aus der Biomasse rückgewonnene Silicagel auf eine Silicagel enthaltende Chromatographiesäule gegeben wird; und

- die Biomasse dann mit einer Elutionsmischung, die 30 % bis 40% Aceton und 60% bis 70% Hexan enthält, gereinigt wird.

31. Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass die Elutionsmischung etwa 40% Aceton und etwa 60% Hexan enthält.

32. Verfahren nach einem der Ansprüche 29 bis 31, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (e&sub2;):

- die Paclitaxel enthaltenden, angereicherten Fraktionen, welche durch Chromatographie in Schritt (e&sub1;) erhalten wurden, neu gruppiert, zur Trockne verdampft und erneut, in einem flüchtigen Lösemittel, gelöst werden;

- das Paclitaxel dann mit einer Mischung organischer Lösemittel, die 30% bis 40% Aceton und 60% bis 70 % Hexan umfasst, erneut gereinigt wird.

33. Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass die Mischung organischer Lösemittel etwa 40% Aceton und 60% Hexan enthält.

34. Verfahren nach einem der Ansprüche 29 bis 31, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (e&sub3;):

- die in Schritt (e&sub2;) durch Chromatographie erhaltenen, Paclitaxel enthaltenden Fraktionen neu gruppiert und zur Trockne verdampft und erneut, in Aceton, gelöst werden, wobei die Menge des Acetons so eingestellt wird, dass ein Absorptionsvermögen der Lösung mit einem Wert von 1,0 bis 1,5 O. D. erhalten wird für den Paclitaxel entsprechenden Gipfel gemäß der HPLC- Analyse; und

- das Paclitaxel dann durch Zugabe von 3 bis 4 Volumina Hexan zu der Acetonlösung kristallisiert wird.

35. Verfahren nach einem der Ansprüche 29 bis 34, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (e&sub4;):

- die in Schritt (e&sub3;) erhaltenen Kristalle durch Filtration getrennt und erneut, in Aceton, gelöst werden, wobei das Volumen des Acetons so eingestellt wird, dass ein Absorptionsvermögen der Lösung erhalten wird, das zwischen 1.0 bis 1.5 O. D. für den Paclitaxel entsprechenden Gipfel gemäß der HPLC-Analyse variiert.

- das Paclitaxel dann durch Zugabe von 3 bis 4 Volumina Hexan zu der Aceton-Lösung rekristallisiert wird.

36. Verfahren nach einem der Ansprüche 29 bis 35, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (e&sub5;):

- die in Schritt (e&sub4;) erhaltenen Kristalle gefiltert und erneut, in Methylenchlorid, gelöst werden;

- die so erhaltene Lösung dann mit Silicagel gemischt und unter Ventilation getrocknet wird;

- das mit Silicagel bedeckte Paclitaxel auf eine Silicagel enthaltende Chromatographiesäule gegeben wird; und

- das Paclitaxel dann zum dritten Mal, mit einer auf organischem Lösemittel basierenden Elutionsmischung, gereinigt wird.

37. Verfahren nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, dass die Elutionsmischung 95% bis 98% Methylenchlorid und 2% bis 5% Isopropanol umfasst.

38. Verfahren nach einem der Ansprüche 29 bis 37, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (e&sub6;):

- die durch Chromatographie in Schritt (e) erhaltenen, Paclitaxel enthaltenden, angereicherten Fraktionen entsprechend ihrer Reinheit neu gruppiert, zur Trockne verdampft und dann erneut, in Methanol, zur Lösung gebracht werden, wobei das Volumen des zugegebenen Methanols so bemessen wird, dass ein Absorptionsvermögen erzielt wird, welches zwischen 1,0 bis 1,5 O. D. für den Paclitaxel entsprechenden Gipfel gemäß der HPLC-Analyse variiert; und

- das Paclitaxel dann zum dritten Mal, durch Zugabe von 2 bis 10 Volumina Wasser zu der Methanol-Lösung, rekristallisiert wird.

39. Verfahren nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, dass das Paclitaxel zum dritten Mal, durch Zugabe von 4 bis 7 Volumina Wasser zu der Methanol-Lösung, rekristallisiert wird.

40. Verfahren nach einem der Ansprüche 29 bis 39, dadurch gekennzeichnet, dass das in den Schritten (e&sub1;), (e&sub2;) und (e&sub3;) verwendete flüchtige Lösemittel aus der Gruppe bestehend aus Aceton, leichten C1-C3-Alkoholen, Ethylacetat, Methylenchlorid und Mischungen dieser Lösemittel ausgewählt ist.

41. Verfahren nach einem der Ansprüche 29 bis 40, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (e&sub6;), nach der Kristallisation des Paclitaxels in Wasser, eine Mischung von Paclitaxel- Kristallen durch Filtern erhalten und dann getrocknet wird.

42. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 41, dadurch gekennzeichnet, dass das im gesamten Verfahren verwendete Wasser durch Entionisieren und/oder Destillieren gereinigt wird.