DE602004011034T2

DE602004011034T2 - Verbessertes verfahren zur isolierung und aufreinigung von paclitaxel aus naturprodukten

Info

Publication number: DE602004011034T2
Application number: DE602004011034T
Authority: DE
Inventors: Trung Montreal BUI-KHAC; Michel Montreal POTIER
Original assignee: Chaichem Pharmaceuticals International Inc
Current assignee: Chaichem Pharmaceuticals International Inc
Priority date: 2003-02-27
Filing date: 2004-01-27
Publication date: 2009-02-12
Anticipated expiration: 2024-01-28
Also published as: US6759539B1; CN1774431A; CA2516811A1; HK1087109A1; EP1608636A1; ATE382613T1; KR101114982B1; JP2006519184A; WO2004076435A1; CN1774431B; KR20050114627A; JP4563994B2; CA2516811C; EP1608636B1; DE602004011034D1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren für die Isolierung und Reinigung von Paclitaxel aus natürlichen Quellen.
KURZE BESCHREIBUNG DES STANDS DER TECHNIK
Die US-Patentschrift Nr. 6,452,024 und ihre ausländischen Gegenstücke, alle im Namen des hier genannten Anmelders CHAICHEM PHARMACEUTICALS INTERNATIONAL, offenbaren und beanspruchen ein Verfahren des vorstehend erwähnten Typs, welches besonders interessant im Vergleich zu all den früheren Verfahren ist, die als „Stand der Technik" im Oberbegriff dieser US-Patentschrift offenbart werden. Genauer gesagt ist das Verfahren, das in dieser US-Patentschrift offenbart wird, interessant, weil es erlaubt:

– das Erhalten einer Biomasse nach Extraktion der Rinden, Nadeln und/oder Äste von Taxus unterschiedlicher Spezies einfacher zu machen;
– die Menge an Biomasse, welche derart erhalten wird und mittels Chromatographie gereinigt werden soll, zu erhöhen;
– die Schritte der Reinigung zu verringern;
– die Menge an erhaltenem Paclitaxel zu erhöhen; und
– die Herstellungskosten auf ein ökonomischeres Niveau zu verringern.

Das Verfahren, das in dieser US-Patentschrift Nr. 6,452,024 offenbart wird, umfasst im Grunde die folgenden Schritte:

a) Extrahieren eines Rohmaterials, umfassend Paclitaxel aus einer natürlichen Quelle für Taxane, mit einem organischen Lösemittel;
b) In-Kontakt-Bringen des Rohmaterials mit einem basischen Medium oder einem sauren Medium, um durch Ausfällen, Isolieren und Trocknen der Biomasse eine Biomasse zu erhalten;
c) Entfernen von Harz und natürlichen Pigmenten aus der isolierten und getrockneten Biomasse durch Auflösen der Biomasse in Aceton und dann dazu Zugeben mindestens eines unpolaren Lösemittels, wie Hexan oder Heptan, bis eine an Paclitaxel angereicherte ölige Phase erhalten wird;
d) In-Kontakt-Bringen der an Paclitaxel angereicherten öligen Phase, die im vorhergehenden Schritt gewonnen wurde, mit einem sauren Medium, wenn Schritt (b) mit einem basischen Medium durchgeführt wurde, oder mit einem basischen Medium, wenn Schritt (b) mit einem sauren Medium durchgeführt wurde, um durch Ausfällen einen Niederschlag zu erhalten, Isolieren des Niederschlags und Trocknen desselben; und
e) mindestens einmal chromatographisches Reinigen einer Lösung des isolierten Niederschlags in einem flüchtigen Lösemittel und mindestens einmal Kristallisieren der gereinigten Lösung, die mittels Chromatographie erhalten wurde. In der vorstehenden US-Patentschrift wird auch offenbart, dass Schritt (e) vorzugsweise umfasst:
e₁) eine erste chromatographische Reinigung, umfassend Auflösen des Niederschlags, der in Schritt (d) isoliert wurde, in einem flüchtigen Lösemittel, Herstellen eines Gemischs der so erhaltenen Lösung mit Silicagel, Behandeln des Gemischs in einer chromatographischen Säule, die Silicagel enthält, und Gewinnen von an Paclitaxel angereicherten Fraktionen;
e₂) eine zweite chromatographische Reinigung, umfassend zur Trockene Eindampfen der an Paclitaxel angereicherten Fraktionen, die im vorhergehenden Schritt gewonnen wurden, bis ein Rückstand erhalten wird, und Herstellen eines Gemischs durch Lösen des Rückstands in einem flüchtigen Lösemittel, wobei das Gemisch erneut durch Chromatographie unter denselben Bedingungen wie im vorstehenden Teilschritt gereinigt wird, um weitere, an Paclitaxel angereicherte Fraktionen zu erhalten;
e₃) eine erste Kristallisation, umfassend zur Trockene Eindampfen der weiteren, an Paclitaxel angereicherten Fraktionen, die im vorhergehenden Teilschritt erhalten wurden, bis ein Rückstand erhalten wird, Herstellen eines Gemischs dieses Rückstands in Aceton und Kristallisieren des Paclitaxels, das in dem Gemisch enthalten ist, mit einem unpolaren Lösemittel;
e₄) eine zweite Kristallisation, umfassend Lösen der Paclitaxelkristalle, die im vorhergehenden Teilschritt erhalten wurden, in Aceton und Umkristallisieren des Paclitaxels unter denselben Bedingungen wie im vorstehenden Teilschritt;
e₅) eine dritte Chromatographiereinigung, umfassend Lösen der Kristalle, die durch Umkristallisation im vorhergehenden Teilschritt erhalten wurden, in einem flüchtigen Lösemittel, um eine Lösung zu erhalten, Herstellen eines Gemischs dieser Lösung mit Silicagel und Behandeln des Gemischs in einer chromatographischen Säule, die Silicagel enthält, um mit einem Elutionslösemittel weitere, an Paclitaxel angereicherte Fraktionen zu erhalten; und
e₆) eine dritte Kristallisation, umfassend zur Trockene Eindampfen der weiteren, an Paclitaxel angereicherten Fraktionen, die im vorhergehenden Teilschritt erhalten wurden, bis ein Rückstand erhalten wird, Lösen des Rückstands in einem Alkohol, Keton oder einem Alkohol-Keton-Gemisch, um ein weiteres Gemisch zu erhalten, und Kristallisieren des Paclitaxels, das in dem weiteren Gemisch enthalten ist, mit Wasser.

Wie vorstehend erwähnt, ist das Verfahren, das in der vorstehenden US-Patentschrift Nr. 6,452,024 offenbart wird, sehr interessant, da es viel einfacher, effizient und kostengünstig ist als die vorhandenen Verfahren. Jedoch verlangt dieses Verfahren immer noch zahlreiche Schritte der Trennung mittels Chromatographie und Reinigung mittels Kristallisation, die notwendig sind, um die großen Mengen an in Lösemittel löslichen Verunreinigungen zu entfernen, die erhalten werden, wenn die Extraktion unter Verwendung von Nadeln und Zweigen aus natürlichen Quellen für Taxane durchgeführt wird. Dies führt zu immer noch hohen Herstellungskosten auf Grund insbesondere der geringen Menge an Paclitaxel in den unterschiedlichen Spezies von Taxus. Darüber hinaus ist die Menge an Biomasse, welche gereinigt werden kann, sehr begrenzt wegen der geringen Größen der Chromatographiesäulen und wegen der geringen Ausbeute an Paclitaxel, die nach der Reinigung erhalten wird.
KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein verbessertes Verfahren bereitzustellen, welches die meisten der Probleme löst, die hier vorstehend wurden.
Insbesondere ist es die Aufgabe der Erfindung, ein verbessertes Verfahren bereitzustellen, welches erlaubt:

– eine Lösung zu erhalten, welche mehr Paclitaxel und Analoga nach Extraktion der Rinden, Nadeln und/oder Äste von Taxus unterschiedlicher Spezies enthält;
– die Verunreinigungen und das Volumen des Paclitaxel- und Analogextrakts zu verringern, welche aus der Biomasse durch Ausfällen erhalten werden;
– die Menge an Biomasse weiter zu erhöhen, welche mittels Chromatographie gereinigt werden muss;
– die Schritte der Reinigung weiter zu verringern;
– weiter die Menge an Paclitaxel zu erhöhen, die erhalten wird; und schließlich
– die Herstellungskosten weiter auf ein ökonomischeres Niveau zu verringern. Das verbesserte Verfahren gemäß der Erfindung zur Extraktion und Reinigung von Paclitaxel aus einer natürlichen Quelle für Taxane, die Paclitaxel enthält, umfasst die folgenden Grundschritte:
a) Waschen eines Rohmaterials, umfassend Paclitaxel, mit deionisiertem oder reinem Wasser, wobei das Rohmaterial aus der natürlichen Quelle für Taxane kommt, wobei dieses Waschen das Entfernen von löslichen Verunreinigungen aus dem Rohmaterial ermöglicht;
b) Extrahieren eines nassen Rohmaterials, umfassend Paclitaxel, aus dem gewaschenen Rohmaterial mit einem organischen Lösemittel;
c) In-Kontakt-Bringen des nassen Rohmaterials mit einem Salz, wodurch durch Ausfällen eine Biomasse erhalten wird, und Isolieren und Trocknen der Biomasse;
d) Entfernen von Harz und natürlichen Pigmenten aus der so isolierten und getrockneten Biomasse durch Auflösen der Biomasse in Aceton oder einem Aceton-Hexan-Gemisch und dann Zugeben mindestens eines polaren Lösemittels, bis eine an Paclitaxel angereicherte Ölphase erhalten wird;
e) mindestens einmal Reinigung mittels Chromatographie der an Paclitaxel angereicherten öligen Phase, die im vorhergehenden Schritt erhalten wurde, in einem flüchtigen Lösemittel, wodurch eine gereinigte Lösung erhalten wird, und mindestens einmal Kristallisation der gereinigten Lösung, die durch Chromatographie erhalten wurde.

Das kristallisierte Produkt, das derart erhalten wird, ist tatsächlich ein Gemisch von Paclitaxelkristallen, welches nach Filtration und Trocknen der Kristalle im Grunde besteht aus:

– etwa 60% Kristallen mit einer Reinheit von höher als 99%;
– etwa 30% Kristallen mit einer Reinheit von höher als 98% (< 99%); und
– etwa 10% Kristallen mit einer Reinheit von höher als 92% (< 98%).

Die Kristalle mit Reinheiten von weniger als 99% können abgetrennt, miteinander gemischt und damit nachfolgende Reinigung mittels Chromatographie durchgeführt werden, um mehr an dem Endprodukt mit einer Reinheit von höher als 99% zu erhalten.
Die vorliegende Erfindung, ihre grundlegenden Unterschiede im Hinblick auf den nächst verwandten Stand der Technik, ihre Vorteile und die Art, wie sie in die Praxis umgesetzt werden kann, werden besser nach Lesen der folgenden, nicht begrenzenden Beschreibung verstanden, die unter Bezug auf die beiliegenden Zeichnungen und die angefügten Beispiele geschieht.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die 1a und 1b sind Flussdiagramme, in denen die Grundschritte des Verfahrens gemäß der Erfindung und desjenigen, das im nächst verwandten Stand der Technik, nämlich US-Patentschrift Nr. 6,452,024 , offenbart wird, verglichen werden.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Wie vorstehend erwähnt, soll das verbesserte Verfahren gemäß der Erfindung zur Extraktion und Reinigung von Paclitaxel aus einem Rohmaterial verwendet werden, das aus einer natürlichen Quelle für Taxane kommt, die das Paclitaxel, das extrahiert werden soll, enthält.
Die natürliche Quelle für Taxane, die als Ausgangsmaterial zum Durchführen des Verfahrens gemäß der Erfindung verwendet wird, ist vom Genus Taxus. Genauer gesagt besteht sie aus einem beliebigen der Spezies von Koniferen, die Paclitaxel und seine Derivate enthalten. Solche Spezies von Koniferen, die Paclitaxel enthalten, können sich aus Taxus brevifolia, Taxus baccata, Taxus canadensis, Taxus wallichiana, Taxus yunnanensis, Taxus densiformis, Taxus hicksii, Taxus wardii, Taxus cuspidata, Texas capitata oder Taxus brownii zusammensetzen.
Das Verfahren gemäß der Erfindung weist den Vorteil auf, dass es mit jedem Teil der natürlichen Quelle für Taxane, welche Paclitaxel enthält, verwendbar ist. Vorzugsweise werden Rinden der gewählten Konifere(n) genutzt. Alternativ können Äste und Nadeln der gewählten Koniferen genutzt werden.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG VON JEDEM SCHRITT DES VERFAHRENS GEMÄß DER ERFINDUNG
Schritt 1 – Waschen
Der erste Schritt des verbesserten Verfahrens gemäß der Erfindung besteht im Waschen eines Rohmaterials, das Paclitaxel und seine Analoga enthält, welches aus einer natürlichen Quelle für Taxane kommt, wobei ein deionisiertes oder reines Wasser verwendet wird, um dies auszuführen. Das Rohmaterial, das aus Rinden, Ästen, Nadeln und dergleichen bestehen kann, wird vollständig mit dem Wasser mit oder ohne Rühren bei einer Temperatur, die zwischen 20°C und 100°C (vorzugsweise bei einer Temperatur von 20 bis 25°C) eingeschlossen ist, für eine Dauer von 2 bis 24 Stunden (vorzugsweise 3 Stunden) bedeckt. Nach dieser Zeit wird das Wasser abgelassen. Dies erlaubt es, wasserlösliche Verunreinigungen aus dem Rohmaterial zu entfernen.
Schritt 2 – Extraktion
Der zweite Schritt des verbesserten Verfahrens besteht im Extrahieren eines nassen Rohmaterials, das Paclitaxel und seine Analoga enthält, aus dem gewaschenen Rohmaterial, das im ersten Schritt erhalten wurde, mit einem organischen Lösemittel.
Das organische Lösemittel, das während dieses Extraktionsschritts verwendet wird, wird vorzugsweise aus Alkoholen, Ketonen und Gemischen davon gewählt. Als Bespiele für solche bevorzugten Lösemittel kann auf Methanol, Aceton und Gemische von Methanol mit Aceton verwiesen werden.
Wenn man ein Gemisch eines Alkohols und eines Ketons verwendet, liegen der Alkohol und das Keton vorzugsweise im Volumenverhältnis vor, das zwischen 9:1 und 1:9 eingeschlossen ist. Stärker bevorzugt ist das Volumenverhältnis in denn Gemisch gleich etwa 1/1.
Auch vorzugsweise wird der Extrakt, der derart erhalten wird, filtriert, um Ablagerungen zu entfernen, und dann in einen doppelwandigen Tank überführt, in den heißes Wasser vorzugsweise bei einer Temperatur von 65 bis 70°C eingeleitet wird. Das organische Lösemittel wird aus diesem Tank destilliert. Üblicherweise macht das gesammelte Lösemittel etwa 70% des Ausgangsvolumens aus. Die verbleibende Lösung, die Paclitaxel enthält, wird dann in einen weiteren Tank abgelassen. Diese verbleibende Lösung ist wegen des restlichen Wassers, das darin enthalten ist, tatsächlich ein nicht konzentrierter Extrakt.
Schritt 3 – Isolierung von Biomasse
Der dritte Schritt des verbesserten Verfahrens gemäß der Erfindung besteht im Isolieren einer Biomasse aus der Lösung, die im vorigen Schritt erhalten wurde.
Zu diesem Zweck wird der nicht konzentrierte Extrakt, der aus dem vorigen Schritt erhalten wurde, in Methanol und Wasser verdünnt und dann ausgesalzen, wodurch Ausfüllen einer Biomasse erhalten wird. Natriumchlorid wird vorzugsweise als Salz zum Aussalzen des Extrakts verwendet. Jedoch können andere Salze für dieselbe Reaktion verwendet werde, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Natrium- oder Kaliumacetat, Kaliumchlorid, Natrium- oder Kaliumphosphat oder Natrium- oder Kaliumcitrat, wobei alle diese Salze in einer wässrigen Lösung löslich sind.
Natriumchlorid (oder jedes andere gewählte Salz) wird vorzugsweise rasch unter starkem Rühren zu dem nicht konzentrierten Extrakt gegeben. Die gewünschte Biomasse wird rasch durch Zugabe von Natriumchlorid in einer Konzentration, die zwischen 10 und 200 Gramm pro Liter Lösung eingeschlossen ist, erzeugt. Vorzugsweise wird Natriumchlorid in einer Konzentration zugegeben, die zwischen 50 und 100 und stärker bevorzugt zwischen 50 und 75 Gramm pro Liter der nicht konzentrierten Extraktlösung eingeschlossen ist.
Die Biomasse, die erzeugt wird und ausgefallen ist, wird durch Filtration oder durch Zentrifugation aus der Lösung abgetrennt. Mit der so abgetrennten Biomasse, welche nass ist, kann unmittelbar der nächste Schritt durchgeführt werden, oder sie kann an Umgebungsluft oder unter Vakuum vorzugsweise durch Ventilation oder Lyophilisation getrocknet werden.
Schritt 4 – Entfernen von Harz und natürlichen Pigmenten
Der vierte Schritt des verbesserten Verfahrens gemäß der Erfindung besteht im Behandeln der Biomasse, die im vorhergehenden Schritt isoliert wurde, um Harz und natürliche Pigmente, die darin enthalten sind, zu entfernen.
Die Art und Weise, wie dieser Schritt durchgeführt werden kann, hängt von der Art der Biomasse ab, die im vorigen Schritt erhalten wurde, nämlich ob sie getrocknet oder nass ist.

A- Wenn die Biomasse, die aus dem vorhergehenden Schritt des Ausfällen erhalten wurde, getrocknet ist, dann wird sie wieder in Lösung gebracht, indem dazu ein Volumen eines Gemischs aus Aceton und Hexan (vorzugsweise in einem Volumenverhältnis von 1/1) zugegeben wird, das vorzugsweise gleich etwa 1/25 des Volumens des nicht konzentrierten Extrakts, der in Schritt 2 erhalten wurde, vor dem Ausfällen ist.

Stärker bevorzugt wird die getrocknete Biomasse wieder in Lösung gebracht, indem zuerst das Gemisch aus Aceton und Hexan zugegeben wird und dann zusätzliche 1,5 Volumina reines Hexan zugegeben werden. Das Endverhältnis von Aceton zu Hexan ist 1 Volumen Aceton auf 4 Volumina Hexan. Nach einem derartigen Auflösen wird das reine Wasser zu der erhaltenen Lösung gegeben, wodurch eine an Paclitaxel angereicherte ölige Phase erzeugt wird. Wasser wird vorzugsweise in einem Verhältnis von 2 bis 10 Volumina und stärker bevorzugt 5 bis 7 Volumina pro 100 Volumina zugegebenes Aceton zugegeben.
Das Gemisch, das derart erhalten wird, wird dann in einen Dekantierkolben überführt. Eine ölige Phase, die Paclitaxel und weitere Taxane enthält, die sich am Boden des Kolbens abgesetzt hat, wird gewonnen. Diese ölige Phase wird dann eingedampft und ist bereit, um durch Chromatographie an Silicagel gereinigt zu werden.

B- Wenn die Biomasse, die unmittelbar nach Zentrifugation im dritten Schritt erhalten wurde, nass ist (mit ihr wurde nämlich kein Trocknen durchgeführt), dann wird eine solche nasse Biomasse in einem Aceton- und Hexan-Gemisch (vorzugsweise in einem Volumenverhältnis von 1/1) ohne Zugeben von Wasser wieder in Lösung gebracht. Das Volumen an Aceton ist vorzugsweise gleich etwa 1/20 des Volumens des nicht konzentrierten Extrakts, der im zweiten Schritt erhalten wurde, vor dem Ausfällen.

Nach einem solchen Auflösen wird mindestens ein uripolares Lösemittel zu der erhaltenen Lösung gegeben, wodurch eine an Paclitaxel angereicherte ölige Phase erzeugt wird, welche auf dieselbe Art und Weise von Hexan abgetrennt wird.
Das (Die) unpolare(n) Lösemittel, das (die) zu diesem Zweck verwendet wird (werden), wird (werden) vorzugsweise aus Kohlenwasserstoffen gewählt, die mit Aceton mischbar sind, wie Pentan. Hexan oder Heptan. Wenn Hexan genutzt wird, ist das Volumen an Hexan, das verwendet wird, üblicherweise das 3- bis 4-Fache desjenigen der Acetonlösung.
Wenn die nasse Biomasse zu viel Wasser enthält, muss die erhaltene, an Paclitaxel angereicherte ölige Phase behandelt werden, um restliches Wasser zu entfernen, bevor sie auf Silicagel beschichtet wird und mit dem derart beschichteten Silicagel Chromatographie durchgeführt wird, um Paclitaxel und seine Analoga zu gewinnen und zu reinigen. Das Entfernen von Wasser erlaubt es, das beschichtete Silicagel rascher zu trocknen, bevor es in die Chromatographiesäule geladen wird.
Das restliche Wasser in der an Paclitaxel angereicherten öligen Phase kann durch Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösemittel entfernt werden. Das Gemisch wird dann abdekantiert und die organische Phase wird vom Wasser abgetrennt. Das mit Wasser nicht mischbare Lösemittel, das verwendet wird, wird vorzugsweise aus halogenierten Kohlenwasserstoffen oder Ether gewählt. Als Beispiele für solche Lösemittel kann auf Methylenchlorid, Trichlormethan und auf Diethylether verwiesen werden.
Der erhaltene Extrakt wird dann wiedergewonnen, unter Vakuum eingeengt und ist zu diesem Zeitpunkt bereit, um durch Chromatographie an Silicagel gereinigt zu werden.
Schritt 5 – Chromatographische Reinigung
Der fünfte und letzte Schritt des Verfahrens gemäß der Erfindung besteht im mindestens einmal chromatographisch Reinigen einer Lösung der an Paclitaxel angereicherten öligen Phase, die im vorhergehenden Schritt erhalten wurde, und mindestens einmal Kristallisieren der gereinigten Lösung, die durch Chromatographie erhalten wurde.
Um dies durchzuführen, wird mit der konzentrierten, an Paclitaxel angereicherten öligen Phase, die im vierten Schritt erhalten wurde, mindestens eine chromatographische Reinigung und mit der gereinigten Lösung, die durch Chromatographie erhalten wurde, mindestens eine Kristallisation durchgeführt. Vorzugsweise jedoch werden mit der konzentrierten, an Paclitaxel angereicherten öligen Phase, die im vierten Schritt erhalten wurde, mehrere chromatographische Reinigungen und mehrere Kristallisationen durchgeführt, wobei die Anzahl der chromatographischen Reinigungen vorzugsweise gleich zwei und die Anzahl der Kristallisationen vorzugsweise gleich drei ist.
Diese aufeinander folgenden Reinigungen und Kristallisationen werden nun als Teilschritte A bis E beschrieben.
A – Erste chromatographische Reinigung
Bei dem ersten chromatographischen Reinigungsschritt wird die an Paclitaxel angereicherte ölige Phase, die im vierten Schritt des Verfahrens erhalten wurde, mit Silicagel gemischt und unter Ventilation getrocknet. Das Silicagel, das mit der öligen Phase beschichtet ist, wird in eine chromatographische Säule geladen, die denselben Typ von Gel enthält. In dieser Säule wird das Paclitaxel mit einem Elutionsgemisch, umfassend 30 bis 40% Aceton und 60 bis 70% Hexan, gereinigt. Vorzugsweise umfasst das Elutionsgemisch etwa 35% Aceton und etwa 65% Hexan.
Die Säule, die verwendet wird, weist vorzugsweise eine Höhe von 142 cm und einen Innendurchmesser von 7,6 cm oder 15,2 cm in Abhängigkeit von der Menge an Paclitaxel, die gereinigt werden soll, auf. Eine an Paclitaxel angereicherte ölige Phase, die 4 bis 6 g Paclitaxel enthält, wird vorzugsweise in einer Säule mit einem Durchmesser von 7,6 cm gereinigt. Eine ölige Phase, die 20 bis 24 g Paclitaxel enthält, verwendet eine Säule mit einem Säulendurchmesser von 15,2 cm. Die kleinere Säule (7,6 cm Durchmesser) enthält 2,2 bis 2,3 kg Silicagel, während die größere Säule (15,2 cm Durchmesser) 8 bis 9 kg enthält.
Das Silicagel der Säule wird mit dem Elutionsgemisch, das aus Aceton und Hexan besteht, gewaschen und ins Gleichgewicht gebracht. Die Flution der Fraktion wird mit demselben Lösemittelgemisch vorzugsweise bei einer Fließgeschwindigkeit von etwa 100 ml/min bei der Säule mit 7,6 cm Durchmesser und einer Fließgeschwindigkeit von 400 ml/min bei der Säule mit 15,2 cm Durchmesser durchgeführt. In beiden Fällen wird das Volumen vorzugsweise unter einem Druck gehalten, der von 0 bis 30 psi variiert.
B – Erste Kristallisation

B.1 – In diesem Schritt werden die Fraktionen, die Paclitaxel enthalten, welche mittels Chromatographie im vorhergehenden Schritt erhalten wurden, zur Trockene eingedampft und in Aceton wieder in Lösung gebracht. Die Menge an Aceton wird eingestellt, dass eine Extinktion bei 228 nm von 1,0 bis 1,5 O. D. für das Maximum des Peaks, der Paclitaxel entspricht, mittels HPLC-Analyse erhalten wird. Dann wird das Paclitaxel kristallisiert, indem 3 bis 4 Volumina Hexan in die Acetonlösung gegeben werden.
B.2 – Alternativ werden die Fraktionen, die Paclitaxel enthalten, welche mittels Chromatographie im vorhergehenden Schritt erhalten wurden, durch Eindampfen auf 1/5 des anfänglichen Volumens oder bis zum Erhalten von 1,0 bis 1,5 O. D. mittels HPLC-Analyse für das Maximum des Peaks, der Paclitaxel entspricht, eingeengt. Das Paclitaxel verbleibt somit in dem Lösemittelgemisch aus Aceton-Hexan (35–65%). Dann wird das Paclitaxel kristallisiert, indem 2 bis 3 Volumina Hexan in die Lösung gegeben werden.

Es bilden sich rasch Kristalle. Das Gemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur oder bei einer Temperatur zwischen 2 und 8°C belassen, um die Kristallisation zu vervollständigen.
C – Zweite Kristallisation
In diesem Schritt werden die Kristalle, die mittels Kristallisation im vorhergehenden Schritt erhalten wurden, mittels Filtration oder Zentrifugation abgetrennt und in Aceton mit einem Volumen an Aceton wieder in Lösung gebracht, dass eingestellt ist, dass eine Extinktion der Lösung mittels HPLC-Analyse erhalten wird, die von 1,0 bis 1,5 O. D. für den Peak, der Paclitaxel entspricht, variiert.
Das Paclitaxel, das in dieser Lösung enthalten ist, wird dann umkristallisiert, indem zu der Acetonlösung 3 bis 4 Volumina an Hexan pro Volumen der Lösung gegeben werden.
Die Kristalle, die in diesem Schritt erhalten werden, weisen eine Paclitaxelreinheit auf, die mittels HPLC-Analyse zwischen 85 bis 95% eingeschlossen ist.
Nach Abtrennung der Kristalle aus den zwei vorigen Kristallisationsschritten mittels Filtration wird die Hexanphase mit den Fraktionen gemischt, die aus der ersten Chromatographie erhalten wurden, welche dem Peak entsprechen, der als 9-Dihydro-13-acetylbaccatin III identifiziert wird. Diese Komponente wird in mehreren Fraktionen eluiert, bevor der Paclitaxelpeak erreicht wird. Das Gemisch wird dann zur Trockene eingedampft. Der so erhaltene Rückstand wird durch Zugabe von Methanol in hellgelbe Kristalle von 9-Dihydro-13-acetylbaccatin III umgewandelt. Die Kristalle werden mittels Filtration abgetrennt, dann in Aceton wieder in Lösung gebracht und rasch durch Zugeben von 4 Volumina Hexan kristallisiert. Die Kristalle von 9-Dihydro-13-acetylbaccatin III, die in diesem Schritt mittels Filtration erhalten wurden, können mit demselben Verfahren, wie vorstehend offenbart, umkristallisiert werden und weisen mittels HPLC-Analyse eine höhere Reinheit als 98% auf.
D – Zweite chromatographische Reinigung

D.1 In diesem Schritt werden die Paclitaxelkristalle, die im vorhergehenden Schritt erhalten wurden, filtriert und dann in Aceton wieder in Lösung gebracht. Die Paclitaxellösung wird filtriert, um Teilchen zu entfernen, die im Aceton nicht gelöst werden. Die so erhaltene Lösung wird dann mit Silicagel gemischt und unter Ventilation getrocknet.

Das Silicagel, das mit Paclitaxel beschichtet ist, wird in eine chromatographische Säule geladen, die denselben Typ von Gel enthält. Paclitaxel wird dann erneut ein zweites Mal mit einem Elutionsgemisch auf Basis organischen Lösemittels gereinigt. Vorzugsweise umfasst das Elutionsgemisch 30 bis 40% Aceton und 70 bis 60% Hexan.
Stärker bevorzugt werden die Kristalle, die in Schritt C erhalten wurden, mit Aceton gelöst, mit Silicagel gemischt und getrocknet. Das Gel, das mit Paclitaxel durchtränkt ist, wird in eine chromatographische Säule geladen (vorzugsweise 142 cm lang mit einem Innendurchmesser von 7,6 cm oder 15,2 cm in Abhängigkeit von der Menge an Paclitaxel, die gereinigt werden soll). Die Säule mit 7,6 cm Durchmesser kann 2,2 bis 2,3 kg Silicagel enthalten, während die Säule mit 15,2 cm Durchmesser 8 kg Silicagel enthalten kann. Das Gel in der Säule wird mit einem Lösemittel, das aus Aceton und Hexan (vorzugsweise 35:65% pro Volumen) besteht, gewaschen und äquilibriert. Die Flution der Fraktionen wird mit demselben Gemisch von Lösemitteln vorzugsweise bei einer Fließgeschwindigkeit von etwa 100 ml/min in der Säule mit 7,6 cm Durchmesser oder 400 ml/min in der Säule mit 15,2 cm Durchmesser durchgeführt. Beide Säulen werden bei einem Druck betrieben, der von 0 bis 30 psi variiert.

D.2 Alternativ werden die Paclitaxelkristalle, die im vorhergehenden Schritt C erhalten wurden, filtriert und dann in Methylenchlorid wieder in Lösung gebracht. Die Paclitaxellösung wird filtriert, um Teilchen zu entfernen, die im Methylenchlorid nicht gelöst werden.

Die so erhaltene Lösung wird dann mit Silicagel gemischt und unter Ventilation getrocknet.
Das Silicagel, das mit Paclitaxel beschichtet ist, wird in eine chromatographische Säule geladen, die denselben Typ von Gel enthält. Paclitaxel wird dann erneut ein zweites Mal mit einem Elutionsgemisch auf Basis organischen Lösemittels gereinigt. Vorzugsweise umfasst das Elutionsgemisch 95 bis 98% Methylenchlorid und 2 bis 5% Isopropanol.
Stärker bevorzugt werden die Kristalle, die in Schritt C erhalten wurden, mit Methylenchlorid gelöst, mit Silicagel gemischt und getrocknet. Das Gel, das mit Paclitaxel durchtränkt ist, wird in eine chromatographische Säule geladen (vorzugsweise 142 cm lang mit einem Innendurchmesser von 7,6 cm oder 15,2 cm in Abhängigkeit von der Menge an Paclitaxel, die gereinigt werden soll). Die Säule mit 7,6 cm Durchmesser kann 2,2 bis 2,3 kg Silicagel enthalten, während die Säule mit 15,2 cm Durchmesser 8 kg Silicagel enthalten kann. Das Gel in der Säule wird mit einem Lösemittel, das aus Methylenchlorid und Isopropanol (vorzugsweise 97,5:2,5% pro Volumen) besteht, gewaschen und äquilibriert. Die Flution der Fraktionen wird mit demselben Gemisch von Lösemitteln vorzugsweise bei einer Fließgeschwindigkeit von etwa 100 ml/min bei der Säule mit 7,6 cm Durchmesser oder 400 ml/min bei der Säule mit 15,2 cm Durchmesser durchgeführt.
E – Dritte Kristallisation
In diesem Schritt werden die angereicherten Fraktionen, die Paclitaxel enthalten, welche mittels Chromatographie in Schritt D gewonnen wurden, gemäß ihrer Reinheit, vorzugsweise gemäß Reinheiten von 98 bis 99% und 90 bis 98% vereinigt. Dann werden sie zur Trockene eingedampft und in Aceton, Alkohol (Ethanol), Ethylacetat oder Diethylether wieder in Lösung gebracht.
Das Volumen an zugegebenem Aceton wird eingestellt, dass eine Extinktion erhalten wird, die von 1,0 bis 1,5 O. D. gemäß HPLC-Analyse für den Peak, der Paclitaxel entspricht, variiert. Wenn die anderen Lösemittel, die vorstehend erwähnt werden, nämlich Alkohol (Ethanol), Ethylacetat oder Diethylether, genutzt werden, ist die Paclitaxelkonzentration viel wichtiger, im Allgemeinen 5-fach stärker konzentriert als Paclitaxel in Acetonlösung.
Das Paclitaxel wird dann ein drittes Mal umkristallisiert, vorzugsweise wie folgt:

1. durch Zugeben von 3 bis 4 Volumina Hexan pro Volumen Aceton zu der Acetonlösung.
2. durch Zugeben von mindestens 3 Volumina Hexan pro Volumen Alkohol oder Ethylacetat zu der Alkohollösung oder Ethylacetatlösung.
3. durch Zugeben von mindestens 2 Volumina Hexan pro Volumen Diethylether zu der Diethyletherlösung.

In dem letzten Schritt der Reinigung und Umkristallisation, der hier vorstehend offenbart wird, kann die Zugabe von Hexan in die Paclitaxellösung bei Raumtemperatur durchgeführt werden. Dies verlangsamt die Bildung von Kristallen, aber die Kristallisation wird über Nacht bei 2 bis 4°C oder bei Raumtemperatur vervollständigt. Die Kristalle werden filtriert und unter Vakuum getrocknet, um ein feines, losgelöstes Pulver zu erhalten. Die Kristalle werden dann in Alkohol (Methanol oder Ethanol) oder in Aceton gelöst und wieder in Wasser in Suspension gebracht und während 66 bis 72 Stunden bei einer Temperatur von etwa –60°C lyophilisiert.
Die erhaltenen Fraktionen von Taxanen können dann mittels HPLC-Chromatographie (Waters-System) unter Verwendung eines Autosampler (Waters 717 plus), eines Photodiodenarray-Detektors (Waters 996), eines Mehrfachlösemittel-Abgabesystems (Waters 600^E) und einer Säule C18 Nova-Pak, 60 Å, 4 um (3,9 × 150 mm) analysiert werden.
Die Analyse der Fraktionen kann durchgeführt werden, indem ein Volumen von 5 μl eingespritzt wird. Die Säule wird bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min unter Verwendung eines Lösemittelgradienten von Acetonitril-Wasser-Methanol (25:50:30 nach Volumen zu Beginn und 35/35/30 am Ende) eluiert.
Die Peaks der Verbindungen werden bei 228 nm detektiert und die Dauer für die Analyse einer Probe beträgt etwa 36 Minuten. Die Retentionszeit für den Paclitaxelpeak beträgt etwa 18,9 ± 0,2 Minuten und 6,5 ± 0,2 Minuten für den Peak von 9-Dihydro-13-acetylbaccatin III.
Vorzugsweise wird das flüchtige Lösemittel, das im chromatographischen Reinigungsschritt zum Lösen des Rückstands verwendet wird, aus Ketonen, leichten C1- bis C3-Alkoholen, Ethylacetat, Methylenchlorid oder einem Gemisch dieser Lösemittel gewählt.
Am Ende dieses Schritts E wird nach der Kristallisation des Paclitaxels in Hexan und nach Filtrieren und Trocknen ein Gemisch von Paclitaxelkristallen erhalten. Dieses Gemisch von Paclitaxelkristallen besteht aus:

– 60% Kristallen mit einer Reinheit von höher als 99%,
– 30% Kristallen mit einer Reinheit von höher als 98%, aber niedriger als 99%,

– 10% Kristallen mit einer Reinheit von höher als 92%, aber niedriger als 98%.

Grundlegende Unterschiede zwischen der vorliegenden Erfindung und derjenigen, die in der US-Patentschrift Nr. 6,452,024 des Anmelders offenbart und beansprucht wird
Wie vorstehend erwähnt, sind die 1a und 1b Flussdiagramme, in denen die Grundschritte des Verfahrens, das in US-Patentschrift Nr. 6,452,024 , offenbart und beansprucht wird, mit denjenigen der vorliegenden Erfindung verglichen werden:

1. Wie in diesen Flussdiagrammen gezeigt wird, wird im Verfahren gemäß der Erfindung das Rohmaterial, welches das Paclitaxel enthält, das extrahiert werden soll, welches vorzugsweise aus getrockneten Nadeln und Zweigen besteht, vor der Extraktion durch organisches Lösemittel, wie Methanol oder Aceton, in gereinigtem Wasser gewaschen. Das Wasser, das nach einem solchen Waschen erhalten wird, enthält einige wasserlösliche Komponenten, die verworfen werden. Die nassen Nadeln und Zweige werden dann mit Methanol oder Aceton oder einem Gemisch von beidem „bedeckt" und damit wird eine Extraktion für eine Dauer von beispielsweise 16 Stunden bei 20°C durchgeführt. Der Extrakt wird dann durch einen Kartuschenfilter geleitet und in einen doppelwandigen Tank gepumpt, wo das Lösemittel durch Zirkulation von erhitztem Wasser in der Ummantelung destilliert wird. Wie vorstehend erwähnt, wird der Extrakt, der einiges restliches Wasser enthält, als „nicht konzentrierter Extrakt" bezeichnet.

Im Gegensatz dazu wird in US-Patentschrift Nr. 6,452,024 , die Extraktion der getrockneten Nadeln und Zweige direkt unter Verwendung eines Lösemittelgemischs von Methanol und Methylenchlorid durchgeführt. Der erhaltene konzentrierte Extrakt ist nach der Destillation sehr viskos und enthält eine bedeutende Menge an Harz und natürlichen Pigmenten. Dieser Extrakt kann als „konzentrierter Extrakt" bezeichnet werden.

2. Im Verfahren gemäß der Erfindung wird Natriumchlorid zu dem nicht konzentrierten Extrakt gegeben, wodurch eine Biomasse erzeugt wird, die unmittelbar ausgefällt wird. Diese Biomasse wird mittels Zentrifugation isoliert. In US-Patentschrift Nr. 6,452,024 wird die Biomasse durch Ausfällen des konzentrierten Extrakts, der zuvor in Methanol verdünnt wurde, in einem basischen oder sauren Medium erhalten. Der Niederschlag, der erzeugt wird, ist sehr fein und leicht und wird vor dem Isolieren durch Zugabe von Natriumchlorid ausgesalzen.
3. Dann wird sowohl in dem Verfahren gemäß der Erfindung als auch in demjenigen, das in US-Patentschrift Nr. 6,452,024 offenbart wird, die Biomasse in Aceton gelöst und eine gegebene Menge (vorzugsweise 4 Volumina) eines unpolaren Lösemittels, wie Hexan, wird zu der Acetonlösung gegeben, wodurch eine an Paclitaxel angereicherte ölige Phase erzeugt wird.

Jedoch ist im Verfahren gemäß der Erfindung die so erhaltene, an Paclitaxel angereicherte ölige Phase bereit, um in einer chromatographischen Säule mit Silicagel bei niedrigem Druck gereinigt zu werden. Im Gegensatz dazu muss im Verfahren, das in US-Patentschrift Nr. 6,452,024 offenbart wird, mit der erhaltenen, an Paclitaxel angereicherten öligen Phase ein zweites Ausfällen in saurem oder basischem Medium durchgeführt werden. Der Niederschlag wird mittels Zentrifugation isoliert, nachdem er durch Zugabe von Natriumchlorid ausgesalzen wurde. Der erhaltene Niederschlag wird getrocknet und dann in Aceton gelöst. Erst zu diesem Zeitpunkt ist die Acetonlösung bereit, um in einer chromatographischen Säule mit Silicagel bei niedrigem Druck gereinigt zu werden.

4. Bei dem ersten chromatographischen Reinigungsschritt des Verfahrens gemäß der Erfindung wird die an Paclitaxel angereicherte ölige Phase mit Silicagel gemischt und unter Ventilation getrocknet. Dann wird das Silicagel, das mit der Biomasse bedeckt ist, in eine chromatographische Säule geladen. Das Paclitaxel wird mit einem Elutionsgemisch aus Aceton und Hexan gereinigt. Die Fraktionen, die Paclitaxel enthalten, welche mittels Chromatographie erhalten wurden, werden zusammengefasst und dann kristallisiert. Die Kristalle, die mittels Filtration oder Zentrifugation erhalten wurden, werden in Aceton gelöst und dann ein zweites Mal umkristallisiert. Die Kristalle werden mittels Filtration oder Zentrifugation isoliert und sind bereit, um erneut durch eine zweite und letzte chromatographische Säule mit Silicagel bei niedrigem Druck gereinigt zu werden.

Bei dem ersten chromatographischen Reinigungsschritt des Verfahrens, das in US-Patentschrift Nr. 6,452,024 offenbart wird, wird die an Paclitaxel angereicherte ölige Phase mit Silicagel gemischt und unter Ventilation getrocknet. Dann wird das Silicagel, das mit der Biomasse bedeckt ist, in eine chromatographische Säule geladen. Das Paclitaxel wird mit einem Elutionsgemisch aus Aceton und Hexan gereinigt. Die Fraktionen, die Paclitaxel enthalten, welche mittels Chromatographie erhalten wurden, werden zusammengefasst und dann erneut durch eine zweite chromatographische Säule bei den Bedingungen, die für den vorhergehenden Schritt verwendet wurden, gereinigt. Die Fraktionen, die das Paclitaxel enthalten, die mittels der zweiten Chromatographie erhalten wurden, werden zusammengefasst und dann kristallisiert. Die Kristalle, die mittels Filtration oder Zentrifugation erhalten wurden, werden in Aceton gelöst und dann ein zweites Mal umkristallisiert. Die Kristalle werden mittels Filtration oder Zentrifugation isoliert und sind bereit, um erneut durch eine dritte und letzte chromatographische Säule mit Silicagel bei niedrigem Druck gereinigt zu werden.
Somit ist bei dem Verfahren, das in US-Patentschrift Nr. 6,452,024 offenbart wird, die Anzahl der Chromatographien, die durchgeführt werden sollen, höher (3 anstatt 2).

5. In beiden Fällen werden natürlich die Fraktionen, die Paclitaxel enthalten, aus der zweiten und letzten chromatographischen Säule in dieser Erfindung oder diejenigen aus der dritten und der letzten chromatographischen Säule in US-Patentschrift Nr. 6,452,024 zusammengefasst und dann kristallisiert, wodurch ein Endprodukt erzeugt wird.

Somit ist, wie nun besser verstanden werden kann, ein Hauptvorteil der vorliegenden Erfindung im Vergleich zu demjenigen von US-Patentschrift Nr. 6,452,024 , dass das Verfahren gemäß der Erfindung weniger Herstellungsschritte von dem einen des Startens der Extraktion der Nadeln bis zum Erhalten der Biomasse und weniger Reinigungsschritte: zwei Chromatographien anstatt drei, wie in US-Patentschrift Nr. 6,452,024 beschrieben, umfasst.
Das Verfahren gemäß der Erfindung verwendet auch viel weniger Lösemittel und benötigt viel weniger Rohmaterialien, um dieselbe Menge an Endprodukt zu erhalten. Deshalb sind die Herstellungskosten mit dem verbesserten Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung viel niedriger als nicht nur beim üblichen und herkömmlichen Verfahren, das zur Paclitaxelreinigung verwendet wird, sondern auch als bei demjenigen von US-Patentschrift Nr. 6,452,024 .
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele werden zu dem einzigen Zweck der Veranschaulichung angegeben und sollten nicht als Begrenzung für den Umfang der vorliegenden Erfindung angesehen werden.
Beispiel 1
Waschen
100 kg getrocknete und vermahlene Nadeln und Zweige von Taxus canadensis wurden in einen Baumwollsack gegeben. Dieser Sack wurde in einen Edelstahltank gegeben, in welchen 400 L destilliertes Wasser zugegeben wurden. Der Baumwollsack wurde für eine Dauer von 3 Stunden bei Raumtemperatur vollständig unter Wasser getaucht und die Lösung, die wasserlösliche Verunreinigungen enthielt, wurde abgelassen.
In der Praxis kann diese Waschvorgehensweise einmal oder zweimal wiederholt werden, wobei die nassen Nadeln durch den Baumwollsack im Tank gehalten werden.
Extraktion
250 L Methanol wurden in den Tank gegeben, der die nassen Nadeln und Zweige enthielt. Die Extraktion wurde während 16 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt. Der Extrakt wurde durch Filter in einen zweiten doppelwandigen Tank gepumpt. Das Methanol wurde mit der Hilfe von heißem Wasser bei 80°C, das in der Doppelwand des Tanks zirkulierte, destilliert. Das wieder gewonnene Methanol wurde in den Tank, der Nadeln enthielt, zum Spülen überführt und das Volumen an reinem Methanol wurde auf 400 L ergänzt. Das ausgespülte Methanol wurde dann gepumpt und destilliert, bis etwa 75% des Methanolvolumens wiedererlangt worden waren. Die restliche Lösung von etwa 100 bis 120 L, nachstehend als „nicht konzentrierter Extrakt" bezeichnet, wurde in einen weiteren Tank überführt und wurde gehalten, bis die Temperatur des Extrakts auf Raumtemperatur abgesunken war.
Ausfällen von Biomasse durch Aussalzen
Der nicht konzentrierte Extrakt wurde mit 10 L Methanol geklärt (etwa 10% Methanol im Vergleich zu dem Volumen des nicht konzentrierten Extraktvolumens). Die Biomasse wurde durch Ausfällen isoliert, indem rasch unter Rühren Natriumchlorid zugegeben wurde. Die Konzentration von Natriumchlorid betrug etwa 50 g pro Liter der Extraktlösung. Ein Niederschlag bildete sich unmittelbar und das Gemisch wurde ohne Rühren über Nacht gehalten. Die überstehende Lösung wurde dann abgelassen und der schwere Niederschlag wurde leicht ohne Filtration oder Zentrifugation gewonnen.
Nötigenfalls kann die Biomasse, die durch Zugeben von Natriumchlorid erhalten wurde, rasch durch Filtration oder Zentrifugation bei einer Geschwindigkeit von 4.200 Upm bei 20°C während 30 Minuten (Maschine J6 MC Beckman Centrifugal, Rotor 4.2 JS) gewonnen werden. Es versteht sich, dass eine Durchfluss-Zentrifugalmaschine vorzugsweise verwendet werden kann, um große Menge an Niederschlag zu verarbeiten.
Eine überstehende Lösung, die 10-Deacetylbaccatin III und Baccatin III enthielt, wurde mit Methylenchlorid oder Diethylether extrahiert. Die organische Phase wurde durch Eindampfen eingeengt und kann behandelt werden, um diese Analoga von Taxan zu extrahieren.
Entfernung von Harz und Pimenten

1. Der erhaltene Niederschlag wurde an Luft getrocknet. Alternativ hätte er vakuumgetrocknet oder lyophilisiert werden können (Gefriertrockner – FTS-System). Das Gewicht des Niederschlags betrug etwa 1,3 kg bis 1,5 kg. Dieser Niederschlag wurde in 6 L eines Aceton-Hexan-Gemischs (1:1) gelöst und bei 0 bis 2°C während 30 Minuten filtriert (oder alternativ bei 4.200 Upm zentrifugiert), um die unlöslichen Teilchen, die darin enthalten sind, zu entfernen. Dann wurde die Aceton-Hexan-Lösung in ein Becherglas überführt und mit 1,5 Volumina reinem Hexan (9 L) durch aufeinander folgende Zugabe von jeweils 1/2 Volumen von Hexan unter Rühren für wenige Minuten gemischt, die ölige Phase wurde durch Zugabe von zwischen 5% und 20% reinem Wasser, vorzugsweise 5% bis 10% erzeugt. Die Menge an Wasser wurde gemäß dem Volumen des verwendeten Acetons berechnet. Das Gemisch wurde dann in einen Scheidekolben überführt und etwa 30 Minuten lang sich trennen gelassen. Die an Paclitaxel angereicherte Phase wurde am Boden des Kolbens gewonnen und durch Eindampfen auf 1/10 des anfänglichen Volumens der Lösung, die vor dem Perkolieren erhalten wurde, eingeengt. Dieses Präparat war bereit, um an Silicagel für einen Chromatographiereinigungsschritt adsorbiert zu werden.
2. Nach Zentrifugation ohne Trocknen wurde der so erhaltene Niederschlag in 3 L Aceton gelöst und bei 0 bis 2°C während 30 Minuten filtriert (oder alternativ bei 4.200 Upm zentrifugiert), um die unlöslichen Teilchen, die darin enthalten sind, zu entfernen. Dann wurde die Acetonlösung in ein Becherglas überführt und mit 4 Volumina Hexan (12 L) durch aufeinander folgende Zugabe jeweils eines Volumens von Hexan unter Rühren für wenige Minuten gemischt. Die ölige Phase bildete sich rasch. Das Gemisch wurde dann in einen Scheidekolben überführt und etwa 30 Minuten lang sich trennen gelassen. Die an Paclitaxel angereicherte Phase wurde am Boden des Kolbens gewonnen. Diese Lösung enthielt einiges restliches Wasser und wurde somit durch Zugeben von 1 Volumen Methylenchlorid extrahiert.

Das Wasser wurde aus diesem Gemisch abgetrennt und die untere Methylenchloridphase, die das Paclitaxel enthielt, wurde auf 1/5 des anfänglichen Volumens der Acetonlösung, die vor dem Entfernen des Harzes und der Pigmente erhalten wurde, eingeengt oder zur Trockene eingedampft. Im letzteren Fall wurde der getrocknete Rückstand in 0,5 L Aceton gelöst.
Beispiel 2
Erste Reinigung mittels Chromatographie an Silicagel bei niedrigem Druck
Die erhaltene Acetonlösung, die Paclitaxel und Analoga enthält, wurde nach Entfernen des Harzes und der Pigmente in Beispiel 1 mit 500 g Silicagel (230 bis 400 mesh) gemischt. Das Gel, das mit dem Extrakt durchtränkt war, wurde an Luft unter Ventilation (oder unter Vakuum) getrocknet. Das Gesamtgewicht nach Trocknen betrug etwa 900 bis 950 g und die Hälfte dieses Materials wurde in eine Säule (142 × 7,6 cm Innendurchmesser) geladen, die 2,2 kg Silicagel (230 bis 400 mesh) enthielt. Das Gel wurde mit einem Gemisch von Aceton und Hexan (35:65%, Volumen pro Volumen) gewaschen und ins Gleichgewicht gebracht. Die Flution wurde mit demselben Lösemittel durchgeführt, wobei ein Dynamax^® Lösemittelabgabesystem verwendet wurde. Die Fließgeschwindigkeit der Flution betrug etwa 100 ml/min unter einem Druck zwischen 0 bis 30 psi. Das Volumen des Lösemittelgemischs betrug etwa 40 L und jede Fraktion wurde in Chargen von 1 L gesammelt. Die HPLC-Analyse zeigte an, dass es 9 bis 10 Fraktionen gab, von der 26. oder 27. bis zur 35. oder 36., welche etwa 0,2 mg/ml bis 0,7 mg/ml Paclitaxel enthielten, und ihre Reinheit variierte von 10 bis 58%. Die Fraktionen, die mehr Paclitaxel enthielten, weisen eine höhere Reinheit auf. Die Menge an Paclitaxel für jede Fraktion wurde aus ihrer Peakfläche durch Vergleich mit der Fläche eines Paclitaxelstandards bestimmt.
Es ist erwähnenswert, dass sich die Fraktionen, die Paclitaxel enthalten, im Hinblick auf die weiteren von einer Reinigung zur anderen voneinander abheben können.
Die Fraktionen mit den höchsten Mengen an Verunreinigungen werden verworfen. Im Allgemeinen wurden die ersten Fraktionen, die weniger als 0,3 mg/ml Paclitaxel enthielten, beseitigt.
Beispiel 3
Erste Reinigung mittels Chromatographie an Silicagel bei niedrigem Druck Die erhaltene Acetonlösung, die Paclitaxel und Analoga enthält, wurde nach Entfernen von Harz und Pigmenten in Beispiel 1 mit 500 g Silicagel (230 bis 400 mesh) gemischt. Das Gel, das mit dem Extrakt durchtränkt war, wurde an Luft unter Ventilation (oder unter Vakuum) getrocknet. Das Gesamtgewicht nach Trocknen betrug etwa 920 g und die Hälfte dieses Materials wurde in eine Säule (142 × 7,6 cm Innendurchmesser) geladen, die 2,2 kg Silicagel (230 bis 400 mesh) enthielt. Das Gel wurde mit einem Gemisch von Aceton und Hexan (40:60%, Volumen pro Volumen) gewaschen und ins Gleichgewicht gebracht. Die Flution wurde mit demselben Lösemittel durchgeführt, wobei ein Dynamax^® Lösemittelabgabesystem verwendet wurde. Die Fließgeschwindigkeit der Flution betrug etwa 100 ml/min unter einem Druck zwischen 0 bis 30 psi. Das Volumen des Lösemittelgemischs betrug etwa 30 L und jede Fraktion wurde in Chargen von 1 L gesammelt. Die HPLC-Analyse zeigte an, dass es 7 bis 8 Fraktionen gab, von der 16. oder 17. bis zur 23. oder 24., welche etwa 0,1 mg/ml bis 0,7 mg/ml Paclitaxel enthielten, und ihre Reinheit variierte von 8 bis 45%. Die Fraktionen, die mehr Paclitaxel enthielten, weisen eine höhere Reinheit auf. Die Menge an Paclitaxel für jede Fraktion wurde aus ihrer Peakfläche durch Vergleich mit der Fläche eines Paclitaxelstandards bestimmt.
Noch einmal ist es erwähnenswert, dass sich die Fraktionen, die Paclitaxel enthalten, im Hinblick auf die weiteren von einer Reinigung zur anderen voneinander abheben können.
Die Fraktionen mit den höchsten Mengen an Verunreinigungen werden verworfen. Im Allgemeinen wurden die ersten Fraktionen, die weniger als 0,3 mg/ml Paclitaxel enthielten, beseitigt.
Beispiel 4
Erste Kristallisation
Nach der ersten Chromatographiereinigung in den Beispielen 2 und 3 wurden die Fraktionen mit einer Konzentration an Paclitaxel von höher als 0,3 mg/ml vereinigt und zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde in Aceton gelöst und das Volumen an Aceton wurde eingestellt, um einen maximalen Peak von Paclitaxel im Bereich von 1,0 bis 1,5 O. D. mittels HPLC zu erhalten. 4 Volumina Hexan wurden dann zu der Acetonlösung gegeben, um die Kristallisation während der folgenden Stunde zu starten. Das Gemisch wurde über Nacht bei 2 bis 8°C oder bei Raumtemperatur gehalten, um die Kristallisation zu vervollständigen.
Zweite Kristallisation
Dann wurden die erhaltenen Kristalle filtriert (oder zentrifugiert) und in Aceton gelöst. Das Volumen an Aceton wurde eingestellt, um einen Paclitaxelpeak mittels HPLC mit einer maximalen O. D. im Bereich von 1,0 bis 1,5 zu erhalten. Hexan wurde dann in einem Verhältnis von 4 Volumina bezüglich der Acetonlösung zugegeben. In der folgenden Stunde bildeten sich Kristalle. Das Gemisch wurde über Nacht bei einer Temperatur, die zwischen 2 bis 8°C eingeschlossen war, oder bei Raumtemperatur gehalten, um die Kristallisation zu vervollständigen. Die Kristalle wurden filtriert oder zentrifugiert und unter Luft oder Vakuum getrocknet. HPLC-Analyse zeigte an, dass der Paclitaxelgehalt etwa 85% oder höher war.
Direkte Isolierung und erste Kristallisation von 9-Dihydro-13-acetylbaccatin 111 Die Fraktionen, die 9-Dihydro-13-acetylbaccatin III (20. bis 25. Fraktion) enthielten, welche aus der ersten Reinigung mittels Chromatographie in Beispiel 2 erhalten wurden, oder die 13. bis 15. Fraktion in Beispiel 3 wurden zusammen mit den Nexan/Aceton-Lösungen (Mutterlaugen), die aus den ersten und zweiten Kristallisationsschritten erhalten wurden, welche 9-Dihydro-13-acetylbaccatin III enthielten, vereinigt und zur Trockene eingedampft. Die Kristalle wurden durch Zugabe von Methanol erzeugt und mittels Filtration oder Zentrifugation wiedererlangt. Die erhaltenen Kristalle wurden in Aceton gelöst und durch 3 Volumina Hexan kristallisiert. Das Produkt wurde als 9-Dihydro-13-acetylbaccatin III mit einer Reinheit > 95% identifiziert.
Zweite Kristallisation von 9-Dihydro-13-acetylbaccatin III
Die so erhaltenen Kristalle von 9-Dihydro-13-acetylbaccatin III wurden in Aceton gelöst und dann wurde 1 Volumen Hexan zu der Acetonlösung gegeben. Das Gemisch wurde langsam gerührt und zusätzliche 2 Volumina Hexan wurden zugegeben. Die Lösung konnte langsam kristallisieren. Die weißen Kristalle wurden durch Filtration oder Zentrifugation gewonnen und unter Ventilation oder Vakuum getrocknet. HPLC-Analyse dieser Kristalle zeigte an, dass der Gehalt an 9-Dihydro-13-acetylbaccatin III gleich oder besser als 98% war.
Beispiel 5
Zweite Reinigung mittels Chromatographie an Silicagel bei niedrigem Druck Die Paclitaxelkristalle, die nach der zweiten Kristallisation in Beispiel 4 erhalten wurden, wurden in 75 bis 100 ml Aceton gelöst, dann filtriert, um unlösliche Teilchen zu entfernen, und auf 75 bis 100 g Silicagel adsorbiert. Das Gel, das mit Paclitaxel beschichtet war, wurde an Luft unter Ventilation oder unter Vakuum getrocknet. Das getrocknete Gel wurde oben in eine Säule (142 × 7,6 cm Innendurchmesser) geladen, die 2,2 kg Silicagel (230 bis 400 mesh) enthielt. Das Gel wurde mit einem Gemisch von Aceton und Hexan (35:65 Volumen pro Volumen) gewaschen und ins Gleichgewicht gebracht. Die Flution wurde mit demselben Lösemittel durchgeführt, wobei ein Dynamax^® Lösemittelabgabesystem bei einer Fließgeschwindigkeit von etwa 100 ml/min unter einem Druck zwischen 0 bis 30 psi verwendet wurde. Das Volumen des Lösemittelgemischs betrug etwa 40 L und Fraktionen wurden in Chargen von 1 L gesammelt. Die HPLC-Analyse zeigte an, dass es 9 bis 10 Fraktionen gab, von der 26. oder 27. bis zur 34. oder 35., welche etwa 0,2 mg/ml bis 0,6 mg/ml Paclitaxel enthielten, und ihre Reinheit variierte von 85 bis 99%. Die Fraktionen, welche Paclitaxel mit einer Reinheit von höher als 98% enthielten, wurden zusammen für eine dritte und letzte Kristallisation vereinigt.
Noch einmal können sich die Fraktionen, die Paclitaxel enthalten, im Hinblick auf die weiteren von einer Reinigung zur anderen voneinander abheben.
Beispiel 6
Zweite Reinigung mittels Chromatographie an Silicagel bei niedrigem Druck Die Paclitaxelkristalle, die nach der zweiten Kristallisation im Beispiel 4 erhalten wurden, wurden in 75 bis 100 ml Methylenchlorid gelöst, darin filtriert, um die unlöslichen Teilchen zu entfernen und dann in Kontakt mit 75 g bis 100 g Silicagel gebracht. Das Gel, das mit Paclitaxel beschichtet war, wurde an Luft unter Ventilation oder unter Vakuum getrocknet. Das getrocknete Gel wurde oben in eine Säule (142 × 7,6 cm Innendurchmesser) geladen, die 2,2 kg Silicagel (230 bis 400 mesh) enthielt. Das Gel wurde mit einem Gemisch von Methylenchlorid und Isopropanol (97,5:2,5 Volumen pro Volumen) gewaschen und ins Gleichgewicht gebracht. Die Flution wurde mit demselben Lösemittel durchgeführt, wobei ein Dynamax^® Lösemittelabgabesystem bei einer Fließgeschwindigkeit von etwa 100 ml/min unter einem Druck zwischen 0 bis 30 psi verwendet wurde. Das Volumen des Lösemittelgemischs betrug etwa 50 L und Fraktionen wurden in Chargen von 1 L gesammelt. Die HPLC-Analyse zeigte an, dass es 20 Fraktionen gab, von der 28. bis zur 48., welche etwa 0,1 mg/ml bis 0,3 mg/ml Paclitaxel enthielten, und ihre Reinheit variierte von 98 bis > 99%. Die Fraktionen, welche Paclitaxel mit einer Reinheit von höher als 98% enthielten, wurden zusammen für eine dritte und letzte Kristallisation vereinigt.
Dritte Kristallisation
Nach der zweiten Chromatographiereinigung von Beispiel 5 oder Beispiel 6 wurden die Fraktionen mit einer Reinheit von Paclitaxel von höher als 98% vereinigt und zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde in Aceton gelöst und das Volumen an Aceton wurde eingestellt, um einen maximalen Peak von Paclitaxel im Bereich von 1,0 bis 1,5 O. D. mittels HPLC zu erhalten. 4 Volumina Hexan wurden dann zu der Acetonlösung gegeben, um die Kristallisation während der folgenden Stunde zu starten. Das Gemisch wurde über Nacht bei 2 bis 8°C oder bei Raumtemperatur gehalten, um die Kristallisation zu vervollständigen.
Die weißen Kristalle wurden durch Filtration oder Zentrifugation gewonnen und unter Ventilation oder Vakuum getrocknet. Die Reinheiten der Kristalle, die mittels HPLC analysiert wurden, waren wie folgt:

– 99,20 bis 99,50%, wenn sie durch Beispiel 5 erhalten wurden; und
– 99,50 bis 99,90%, wenn sie in Beispiel 6 erhalten wurden.

Wie hier vorstehend offenbart, können die Rückstände, die aus den Fraktionen, welche Paclitaxel nach der zweiten chromatographischen Reinigung enthalten, erhalten wurden, in Ethanol, Ethylacetat oder Diethylether gelöst werden. Das Volumen an diesen Lösemitteln ist 5-fach geringer als Aceton, das zuvor verwendet wurde, es bedeutet, dass die Paclitaxelkonzentration 5-fach höher ist (etwa 10 mg/ml).
In der Praxis:

– 1 bis 2 Volumina Hexan wurden dann zu der Etherlösung gegeben; und alternativ
– 3 bis 4 Volumina Hexan wurden dann zu der Ethanol- oder Ethylacetatlösung gegeben, um die Kristallisation während der folgenden Stunde zu starten.

Das Gemisch wurde über Nacht bei 2 bis 8°C oder bei Raumtemperatur gehalten, um die Kristallisation zu vervollständigen. Die Reinheiten dieser Kristalle waren sehr ähnlich, während Aceton zur Kristallisation verwendet wurde.
Die Kristalle, welche eine Reinheit von weniger als 98% aufwiesen, wurden behalten und erneut zusammen mittels Chromatographie unter denselben Bedingungen, wie vorstehend bei der zweiten Reinigung beschrieben, gereinigt. Diese erneute Reinigung erlaubt es, immer noch rund 75% der gesamten Menge dieser Kristalle mit einer Reinheit von größer als 99% zu erhalten.
Die Kristalle wurden in einem minimalen Volumen an Ethanol oder Methanol oder Aceton gelöst und dann wieder in die Ampulle, die das reine Wasser enthielt, gegeben. Das Volumen des Lösemittels betrug etwa 10 bis 15% in Bezug auf das Volumen von reinem Wasser. Das Paclitaxel wurde während 72 Stunden lyophilisiert und die Temperatur wurde von –60°C bis auf +20°C mit 0,02°C pro Minute und unter einem Druck bei 100 Millitorr angehoben.

Claims

Verfahren zur Extraktion und Reinigung von Paclitaxel aus einer natürlichen Quelle für Taxane, die Paclitaxel, das extrahiert werden soll, enthalten, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: a) Waschen eines Rohmaterials, umfassend Paclitaxel, mit deionisiertem oder reinem Wasser, wobei das Rohmaterial aus der natürlichen Quelle für Taxane kommt, wobei dieses Waschen das Entfernen von löslichen Verunreinigungen aus dem Rohmaterial ermöglicht; b) Extrahieren eines nassen Rohmaterials, umfassend Paclitaxel aus dem gewaschenen Rohmaterial, mit einem organischen Lösemittel; c) In-Kontakt-Bringen des nassen Rohmaterials mit einem Salz, wodurch durch Ausfällen eine Biomasse erhalten wird, und Isolieren und Trocknen der Biomasse; d) Entfernen von Harz und natürlichen Pigmenten aus der so isolierten und getrockneten Biomasse durch Auflösen der Biomasse in Aceton oder einem Aceton-Hexan-Gemisch und dann Zugeben mindestens eines polaren Lösemittels, bis eine an Paclitaxel angereicherte Ölphase erhalten wird; e) mindestens einmal chromatographische Reinigung der an Paclitaxel angereicherten öligen Phase, die im vorhergehenden Schritt erhalten wurde, in einem flüchtigen Lösemittel, wodurch eine gereinigte Lösung erhalten wird, und mindestens einmal Kristallisation der gereinigten Lösung, die durch Chromatographie erhalten wurde.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die natürliche Quelle für Taxane, die Paclitaxel enthalten, aus Koniferen besteht, ausgewählt aus Taxus brevifolia, Taxus baccata, Taxus canadensis, Taxus wal(l)ichiana, Taxus yunnanensis, Taxus densiformis, Taxus hicksii, Taxus wardii, Taxus cuspidate, Taxus capitata und Taxus brownii.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei: in Schritt (a) das Rohmaterial aus Rinden, Ästen und Nadeln der Koniferen oder Gemischen davon ausgewählt wird.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, wobei: in Schritt (b) das organische Lösemittel aus Alkoholen oder Ketonen und Gemischen aus Alkohol und Keton ausgewählt wird.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei: in Schritt (b) das organische Lösemittel Methanol, Aceton oder ein Gemisch aus Methanol und Aceton, das in einem Volumenverhältnis im Bereich von 9:1 bis 1:9 vorliegt, ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei: in Schritt (c) das Salz, das verwendet wird, um die Biomasse durch Ausfällen zu erhalten, aus Natriumchlorid, Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Natriumacetat, Kaliumacetat und Gemischen davon ausgewählt wird.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei: in Schritt (c) das Salz Natriumchlorid ist; die Verwendung in einer Konzentration zwischen 10 bis 100 g pro Liter des nassen Rohmaterials, das in Schritt (b) extrahiert wurde.
Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, wobei: in Schritt (c) die ausgefällte Biomasse durch Filtration oder Zentrifugation isoliert wird und dann durch Luft oder durch Lyophilisation behandelt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei: in Schritt (d) die getrocknete Biomasse, die in Schritt (c) erhalten wurde, durch Zugeben von Aceton und dann Wasser aufgelöst wird, wobei das Wasser in einem Verhältnis von 2 bis 10 Volumina pro 100 Volumina an zugegebenem Aceton zugegeben wird, und wobei in dem Schritt (d) das mindestens ein unpolare Lösemittel aus Hexan und Pentan ausgewählt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei Schritt e) die folgenden Teilschritte umfasst: e.1) Herstellen eines Gemischs aus der an Paclitaxel angereicherten Ölphase, die in Schritt (d) erhalten wurde, mit Silicagel, Behandeln des Gemischs mit einem Elutionslösemittel in einer Chromatographiesäule, umfassend Silicagel, wodurch erste, an Paclitaxel angereicherte Fraktionen erhalten werden; e.2) Eindampfen der ersten, an Paclitaxel angereicherten Fraktionen zur Trockene, bis ein Rückstand erhalten wird, Herstellen eines Gemischs durch Lösen des Rückstands in Aceton und Kristallisieren des Paclitaxels, das im Gemisch enthalten ist, mit einem unpolaren Lösemittel, oder Eindampfen der ersten, an Paclitaxel angereicherten Fraktionen, bis eine akzeptable Konzentration an Paclitaxel erhalten wird, und Kristallisieren des Paclitaxels, das im Gemisch enthalten ist, mit einem unpolaren Lösemittel; e.3) Lösen der Pachtaxelkristalle, die in Teilschritt (e.2) erhalten wurden, in Aceton und Umkristallisieren des Paclitaxels mit einem unpolaren Lösemittel; e.4) Lösen der Kristalle, die in Teilschritt (e.3) erhalten wurden, in einem flüchtigen Lösemittel, wodurch eine Lösung erhalten wird, Herstellen eines Gemischs der Lösung mit Silicagel und Behandeln des Gemischs mit einem Elutionslösemittel in einer Chromatographiesäule, umfassend Silicagel, wodurch zweite, an Paclitaxel angereicherte Fraktionen mit einem Elutionslösemittel erhalten werden; und e.5) Eindampfen der zweiten, an Paclitaxel angereicherten Fraktionen, die in Teilschritt (e.4) erhalten wurden, zur Trockene, bis ein Rückstand erhalten wird, Lösen des Rückstands in Aceton, einem Alkohol, einem Ether, einem Ethylacetat oder einem Gemisch davon und Kristallisieren des Paclitaxels mit einem unpolaren Lösemittel.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei: – in Schritt (e.1) die an Paclitaxel angereicherte Ölphase, die in Schritt (d) erhalten wurde, mit Silicagel gemischt und an Luft getrocknet wird; das Silicagel wiedergewonnen und in eine Chromatographiesäule geladen wird, die auch Silicagel enthält; und das Paclitaxel dann mit einem Elutionsgemisch gereinigt wird, das 30% bis 40% Aceton und 60% bis 70% Hexan enthält; und – in Schritt (e.3) die Kristalle, die in Schritt (e.2) erhalten wurden, durch Filtration oder Zentrifugation isoliert werden und in Aceton gelöst werden, wodurch sich eine Lösung bildet, wobei das Volumen an Aceton so eingestellt wird, dass eine Extinktion der Lösung mit einem Wert von 1,0 bis 1,5 O. D. (optische Dichte) für den Peak, der der HPLC-Analyse entspricht, erhalten wird, und das Paclitaxel dann umkristallisiert wird, indem 3 bis 4 Volumina Hexan zu der Lösung gegeben werden.
Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, wobei: in Schritt (e.2) die angereicherten Fraktionen, die Paclitaxel enthalten, welche durch Chromatographie in Schritt (e.1) erhalten wurden, zusammen gruppiert werden, zur Trockene eingedampft werden und in Aceton gelöst werden, wodurch sich eine Lösung bildet, wobei die Menge an Aceton so eingestellt wird, dass eine Extinktion der Lösung mit einem Wert von 1,0 bis 1,5 O. D. (optische Dichte) für den Peak, der der HPLC-Analyse entspricht, erhalten wird; und das Paclitaxel dann umkristallisiert wird, indem 3 bis 4 Volumina Hexan zu der Lösung gegeben werden.
Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, wobei: in Schritt (e.2) die angereicherten Fraktionen, die Paclitaxel enthalten, welche durch Chromatographie in Schritt (e.1) erhalten wurden, zusammen gruppiert werden und bis zum Erhalten einer Extinktion der angereicherten Fraktionen mit einem Wert von 1,0 bis 1,5 O. D. (optische Dichte) für den Peak, der der HPLC-Analyse entspricht, eingedampft werden; und das Paclitaxel dann durch Zugeben von 1,5 bis 2 Volumina Hexan zu der angereicherten Lösung kristallisiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 13, wobei: in Schritt (e.4) die Kristalle, die in Schritt (e.3) erhalten wurden, filtriert oder zentrifugiert werden und in Aceton gelöst werden, wodurch sich eine Lösung bildet; die Lösung dann mit Silicagel gemischt und unter Belüftung getrocknet wird; das Silicagel, das mit Paclitaxel bedeckt ist, in eine Chromatographiesäule geladen wird, die auch Silicagel enthält; und das Paclitaxel dann erneut mit einem auf organischem Lösemittel basierenden Elutionsgemisch, umfassend 30% bis 40% Aceton und 60% bis 70% Hexan, gereinigt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 13, wobei: in Schritt (e.4) die Kristalle, die in Schritt (e.3) erhalten wurden, filtriert oder zentrifugiert werden und in Aceton gelöst werden, wodurch sich eine Lösung bildet; die Lösung dann mit Silicagel gemischt und unter Belüftung getrocknet wird; das Silicagel, das mit Paclitaxel bedeckt ist, in eine Chromatographiesäule geladen wird, die auch Silicagel enthält; und das Paclitaxel dann erneut mit einem auf organischem Lösemittel basierenden Elutionsgemisch, umfassend 95% bis 98% Methylenchlorid und 2% bis 5% Isopropanol, gereinigt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 15, wobei: in Schritt (e.5) die angereicherten Fraktionen, die Paclitaxel enthalten, welche durch Chromatographie in Schritt (e.4) erhalten wurden, gemäß ihrer Reinheit vereinigt werden, zur Trockene eingedampft werden und dann in Aceton gelöst werden, wodurch sich eine Lösung bildet, wobei die Menge an Aceton so eingestellt wird, dass eine Extinktion der Lösung mit einem Wert von 1,0 bis 1,5 O. D. (optische Dichte) für den Peak, der der HPLC-Analyse entspricht, erhalten wird; und das Paclitaxel dann kristallisiert wird, indem 3 bis 4 Volumina Hexan zu der Lösung gegeben werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 15, wobei: in Schritt (e.6) die angereicherten Fraktionen, die Paclitaxel enthalten, welche durch Chromatographie in Schritt (e.4) erhalten wurden, zusammen gruppiert werden und bis zum Erhalten einer Extinktion der angereicherten Fraktionen mit einem Wert von 1,0 bis 1,5 O. D. (optische Dichte) für den Peak, der der HPLC-Analyse entspricht, eingedampft werden; und das Paclitaxel dann durch Zugeben von 1,5 bis 2 Volumina Hexan zu der angereicherten Lösung kristallisiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 15, wobei: in Schritt (e.5) die angereicherten Fraktionen, die Paclitaxel enthalten, welche durch Chromatographie in Schritt (e.4) erhalten wurden, gemäß ihrer Reinheit vereinigt werden, zur Trockene eingedampft werden und dann in Ethanol gelöst werden, wodurch sich eine Lösung bildet, wobei die Menge an Ethanol so eingestellt wird, dass eine Paclitaxelkonzentration von etwa 5 bis 10 mg/ml der Lösung gemäß der HPLC-Analyse erhalten wird; und das Paclitaxel dann kristallisiert wird, indem 3 bis 4 Volumina Hexan zu der Lösung gegeben werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 15, wobei: in Schritt (e.5) die angereicherten Fraktionen, die Paclitaxel enthalten, welche durch Chromatographie in Schritt (e.4) erhalten wurden, gemäß ihrer Reinheit vereinigt werden, zur Trockene eingedampft werden und dann in Ethylacetat gelöst werden, wodurch sich eine Lösung bildet, wobei die Menge an Ethylacetat so eingestellt wird, dass eine Paclitaxelkonzentration von etwa 5 bis 10 mg/ml der Lösung gemäß der HPLC-Analyse erhalten wird; und das Paclitaxel dann kristallisiert wird, indem 3 bis 4 Volumina Hexan zu der Lösung gegeben werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 15, wobei: in Schritt (e.5) die angereicherten Fraktionen, die Paclitaxel enthalten, welche durch Chromatographie in Schritt (e.4) erhalten wurden, gemäß ihrer Reinheit vereinigt werden, zur Trockene eingedampft werden und dann in Diethylether gelöst werden, wodurch sich eine Lösung bildet, wobei die Menge an Diethylether so eingestellt wird, dass eine Paclitaxelkonzentration von etwa 5 bis 10 mg/ml der Lösung gemäß der HPLC-Analyse erhalten wird; und das Paclitaxel dann kristallisiert wird, indem 1 bis 2 Volumina Hexan zu der Lösung gegeben werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 20, wobei: in Schritt (e.3) das flüchtige Lösemittel aus Aceton, leichten C1- bis C3-Alkoholen, Ethylacetat, Diethylether, Methylenchlorid und Gemischen davon ausgewählt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 21, umfassend die zusätzlichen Schritte: – mit Methanol Extrahieren von Kristallen von 9-Dihydro-13-acetylbaccatin II aus den eluierten Fraktionen vor der Isolierung von Paclitaxel in Schritt (e.1) und aus den Gemischen, die nach der Kristallisation in den Schritten (e.2) und (e.3) erhalten wurden; und Umkristallisieren der so extrahierten Kristalle mit einem Gemisch von Aceton-Hexan.