KR20050114627A - 천연 원료로부터 파클리탁셀의 개선된 분리 및 정제 방법 - Google Patents

Abstract

파클리탁셀을 함유하는 탁산의 천연원료로부터 파클리탁셀을 추출 및 정제하기 위한 본 발명에 따른 개선된 방법은: a) 탈이온수 또는 순수로 탁산(taxanes)의 천연원료로부터 얻어지는, 파클리탁셀을 포함하는 원료물질을 세척하여 상기 원료물질의 가용성 불순물을 제거하는 단계; b) 상기 세척된 원료물질, 파클리탁셀을 포함하는 습윤 원료물질을 유기 용매로 추출하는 단계; c) 상기 습윤 원료물질과 염을 접촉시켜 침전에 의해 바이오매스를 얻고, 상기 바이오 매스를 분리 및 건조하는 단계; d) 아세톤 또는 아세톤-헥산 혼합물에 상기 바이오 매스를 용해하여 분리 및 건조된 바이오 매스로부터 송진 및 천연 색소를 제거한 다음 여기에 파클리탁셀-농축 오일상이 얻어질 때까지 최소 하나의 극성 용매를 첨가하는 단계; 및 e) 휘발성 용매에서 전 단계에서 얻어진 파클리탁셀-농축 오일상을 적어도 한번 크로마토그래피로 정제하여 정제 용액을 얻고 크로마토그래피에 의해 얻어진 정제 용액을 적어도 한번 결정화하는 단계를 포함한다. 본 발명에 따라서 침전에 의한 바이오매스로부터 얻어지는 불순물 파클리탁셀 및 유사물의 부피가 감소되며, 정제단계를 감소시키고 얻어지는 파클리탁셀의 양을 증가시키며 생산가를 보다 경제적인 수준으로 보다 감소되는 잇점이 있다.

Description

천연 원료로부터 파클리탁셀의 개선된 분리 및 정제 방법{Improved Process For Isolation and Purification of Paclitaxel From Natural Sources}

본 발명은 천연원료로부터 파클리탁셀을 분리 및 정제하는 개선된 방법에 관한 것이다.

본 출원인, CHAICHEM PHARMACEUTICALS INTERNATIONAL,의 미국 특허 제 6,452,024호 및 그 모든 해외 대응특허에서는 상기된 종류의 공정을 개시 및 청구하고 있으며, 이는 특히, 미국특허의 서론에 종래기술로 개시된 모든 종래 공정과 비교하여 매우 흥미로운 것이다. 보다 상세하게, 미국 특허에 개시된 공정은

- 상이한 종류의 주목류의 수피, 침엽 및/또는 가지를 추출한 후에 바이오매스를 쉽게 얻고;

- 이와 같이 정제된, 크로마토그래피에 의해 정제되어야 하는 바이오매스의 양을 증가시키고;

- 정제 단계를 감소시키고;

- 수득되는 파클리탁셀의 양을 증가시키고;

- 보다 경제적인 수준으로 제조 비용을 감소시키는 것이다.

미국 특허 제 6,452,024호에 개시된 공정은 기본적으로:

a) 탁산의 천연 원료로부터 파클리탁셀을 포함하는 원료 물질을 유기 용매로 추출하는 단계;

b) 상기 원료 물질과 염기성 매질 또는 산성 매질을 접촉시켜 침전에 의해 바이오매스를 얻고, 상기 바이오 매스를 분리 및 건조하는 단계;

c) 아세톤에 상기 바이오 매스를 용해하여 분리 및 건조된 바이오매스로부터 송진 및 천연 색소를 제거한 다음, 여기에 파클리탁셀-농축된 오일상이 얻어질 때까지 헥산 또는 헵탄과 같은 적어도 하나의 비-극성 용매를 첨가하는 단계;

d) 상기 단계에서 회수된 파클리탁셀-농축 오일상을 상기 단계 (b)가 염기성 매질에서 수행되는 경우에는 산성 매질 또는 단계 (b)가 산성 매질에서 수행되는 경우에는 염기성 매질과 접촉시켜 침전에 의해 침전물을 얻고, 상기 침전물을 분리하고 이를 건조하는 단계; 및

e) 휘발성 용매에 상기 분리된 침전물의 용액을 적어도 한번 크로마토그래피 정제하고 크로마토그래피에 의해 얻어진 정제 용액을 적어도 한번 결정화하는 단계

를 포함한다.

또한, 상기 미국특허에서, 단계 (e)는 바람직하게:

e1) 단계(d)에서 분리된 침전물을 휘발성 용매에 녹이고, 수득된 용액과 실리카 겔 혼합물을 준비한 후, 상기 혼합물을, 실리카겔을 담고 있는 크로마토그래피 칼럼 내에서 처리하고, 파크리탁셀-농축 분획을 회수하는 것으로 이루어진 제 1 크로마토그래피 정제 ;

e2) 전 단계에서 회수한 파크리탁셀-농축 분획을 증발 건조하여 잔여물을 얻고, 상기 잔여물을 휘발성 용매에 녹여 혼합물을 준비하고, 상기 혼합물을 앞선 부단계와 같은 조건 하에서의 크로마토그래피로 재정제하여 또 다른 파크리탁셀 농축 분획을 얻는 것으로 이루어진 제 2 크로마토그래피 정제 ;

e3) 앞선 부단계에서 얻어진 또 다른 파크리탁셀-농축 분획을 증발 건조하여 잔여물을 얻고, 아세톤 내에서 상기 잔여물의 혼합물을 준비하고, 비극성 용매로 상기 혼합물에 함유된 파크리탁셀을 결정화하는 것으로 이루어진 제 1 결정화

e4) 앞선 부단계에서 얻어진 파크리탁셀 결정을 아세톤에 용해시키고, 앞선 부단계와 같은 조건하에서 파크리탁셀을 재결정화하는 것으로 이루어진 제 2 결정화;

e5) 앞선 부단계에서 재결정화에 의해 얻어진 결정을 휘발성 용매에 용해시키고, 실리카겔과 상기 용액의 혼합물을 제조하고, 상기 혼합물을 실리카겔로 채워진 크로마토그래피 컬럼내에서 용리 용매로 처리하여 더 진한 파크리탁셀-농축 분획을 얻는 제 3 크로마토그래피 정제

e6) 앞선 부단계에서 얻은, 더 진한 파크리탁셀 농축 분획을 증발 건조하여 잔여물을 얻고, 알콜, 세톤(cetone) 또는 알콜-세톤 혼합물에 상기 잔여물을 용해시켜 또다른 혼합물을 얻고, 상기 또 다른 혼합물에 포함된 파크리탁셀을 물로 결정화하는 것으로 이루어진 제 3 결정화

를 포함한다.

상기된 바와 같이, 미국특허 제 6,452,024호에 개시된 공정은 기존의 공정보다 훨씬 간단하고, 효율적이며 비용면에서 효과적인 것이다. 그러나, 이 방법은 탁산의 천연 원료로부터 침엽 및 소지를 사용하여 추출을 수행하는 경우에 발생되는 과량의 용매-가용성 불순물의 제거에 요구되는 크로마토그래피에 의한 분리 및 결정화에 의한 정제의 다수의 단계가 여전히 요구되고 있다. 이에 따라 상이한 종류의 주목류에 특히 소량의 파클리탁셀로 인해 여전히 높은 제조비용이 결과된다. 또한, 정제될 수 있는 바이오 매스의 양은 소형 크기의 크로마토그래피 컬럼 및 정제 후에 얻어지는 낮은 수득율의 파클리탁셀로 인해 매우 한정된다.

본 발명의 목적은 상기된 문제를 해결하는 개선된 방법을 제공하는 것이다.

보다 상세하게, 본 발명의 목적은:

- 상이한 종의 주목류(Taxus)의 수피, 침엽 및/또는 가지를 추출한 후에 보다 많은 파클리탁셀 및 유사물을 함유하는 용액을 얻는 것;

- 침전에 의한 바이오매스로부터 얻어지는 불순물 파클리탁셀 및 유사물의 부피를 감소시키는 것;

- 크로마토그래피로 정제되어야 하는 바이오매스의 양을 더욱 증가시키는 것;

- 정제 단계를 추가로 감소시키는 것;

- 생산가를 보다 경제적인 수준으로 보다 감소시키는 것

을 포함하는 개선된 방법을 제공하는 것이다.

도 1a 및 1b는 본 발명에 따른 공정 및 가장 유사한 종래기술, 즉 미국특허 제 6,452,024호의 기본적인 단계를 비교한 흐름도이다.

파클리탁셀을 함유하는 탁산의 천연원료로부터 파클리탁셀을 추출 및 정제하기 위한 본 발명에 따른 개선된 방법은:

a) 탈이온수 또는 순수로 탁산(taxanes)의 천연원료로부터 얻어지는, 파클리탁셀을 포함하는 원료물질을 세척하여 상기 원료물질의 가용성 불순물을 제거하는 단계;

b) 상기 세척된 원료물질, 파클리탁셀을 포함하는 습윤 원료물질을 유기 용매로 추출하는 단계;

c) 상기 습윤 원료물질과 염을 접촉시켜 침전에 의해 바이오매스를 얻고, 상기 바이오 매스를 분리 및 건조하는 단계;

d) 아세톤 또는 아세톤-헥산 혼합물에 상기 바이오 매스를 용해하여 분리 및 건조된 바이오 매스로부터 송진 및 천연 색소를 제거한 다음 여기에 파클리탁셀-농축 오일상이 얻어질 때까지 최소 하나의 극성 용매를 첨가하는 단계;

e) 휘발성 용매에서 전 단계에서 얻어진 파클리탁셀-농축 오일상을 적어도 한번 크로마토그래피로 정제하여 정제 용액을 얻고 크로마토그래피에 의해 얻어진 정제 용액을 적어도 한번 결정화하는 단계

를 포함한다.

이와 같이 얻어진 결정화 생성물은 실제로 파클리탁셀 결정의 혼합물이며, 결정의 여과 및 건조 후에 기본적으로:

- 99% 이상의 순도를 갖는 결정 약 60%

- 98% 이상의(<99%) 순도를 갖는 결정 약 30%; 및

- 92% 이상의(<98%) 순도를 갖는 결정 약 10%

로 구성된다.

99% 미만의 순도를 갖는 결정은 99% 이상의 순도를 갖는 최종물을 보다 얻기 위해 분리한 다음, 함께 혼합하고 크로마토그래피에 의한 연속적인 정제에 적용할 수 있다.

이하 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명하고자 한다.

상기된 바와 같이, 본 발명에 따른 개선된 방법은 파클리탁셀을 함유하는 탁산의 천연 원료로부터 얻어지는 원료 물질로부터 파클리탁셀을 추출 및 정제하는데 사용하고자 하는 것이다.

본 발명에 따른 공정을 수행하는 출발물질로서 사용되는 탁산의 천연 원료는 주목류 종이다. 보다 상세하게, 이는 파클리탁셀 및 그 유도체를 함유하는 침엽수 종류 중 어떠한 하나로 구성된다. 파클리탁셀을 함유하는 침엽수 종은 Taxus brevifolia , Taxus baccata , Taxus canadensis , Taxus wallichiana , Taxus yunnanensis, Taxus densiformis , Taxus hicksii , Taxus wardii , Taxus cuspidata , Taxus capitata 또는 Taxus brownii로 이루어질 수 있다.

본 발명에 따른 방법은 파클리탁셀을 함유하는 탁산 천연 원료의 어떠한 부분도 사용가능하다는 잇점을 갖는다. 바람직하게, 선택된 침엽수의 수피가 사용된다. 선택적으로, 선택된 침엽수의 가지 및 침엽이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 각 공정 단계의 상세한 설명

단계 1 - 세척

본 발명에 따른 개선된 방법의 제 1단계는 탈이온수 또는 순수를 이용하여 탁산 천연 원료로부터 얻어지는 파클리탁셀 및 그 유사물을 함유하는 원료 물질을 세척하는 단계로 이루어진다. 수피, 가지, 침엽 등으로 구성될 수 있는 원료물질은 2 내지 24시간(바람직하게는 3시간) 동안 20 내지 100℃ 사이의 온도(바람직하게는 20~25℃)에서 교반하거나 또는 교반하지 않으면서 물로 완전히 덮는다(cover). 그 후에, 물을 배출한다. 이에 따라 원료물질로부터 수용성 불순물이 제거된다.

단계 2 - 추출

본 발명의 개선된 방법의 제 2단계는 상기 제 1단계에서 얻어진 세척된 원료물질로부터 파클리탁셀 및 그 유사물을 함유하는 습윤 원료물질을 유기용매로 추출하는 단계로 이루어진다.

이러한 추출 단계 도중에 사용되는 유기 용매는 바람직하게는, 알콜, 세톤 및 이들의 혼합물로 이루어지는 그룹으로부터 선택된다. 이러한 바람직한 용매의 예로는, 메탄올, 아세톤 및 메탄올 및 아세톤의 혼합물이 사용될 수 있다.

알콜 및 세톤의 혼합물이 사용되는 경우에, 알콜 및 세톤은 바람직하게 9:1 내지 1:9의 부피 비율로 존재한다. 보다 바람직하게, 상기 혼합물의 부피 비율은 약 1:1이다.

또한, 바람직하게, 이와 같이 얻어진 추출물을 여과하여 침전물을 여과 제거한 다음, 65 내지 70℃ 온도의 고온수가 공급된, 이중벽 탱크로 이동시킨다. 유기 용매를 탱크로부터 증류한다. 일반적으로 수집된 용매는 초기 부피의 약 70%이다. 그 다음, 파클리탁셀을 함유하는 나머지 용액을 다른 탱크로 배출시킨다. 나머지 용액은 그 안에 함유되어 있는 잔류 물로 인해 실제로 비-농축된 추출물이다.

단계 3 - 바이오 매스 분리

본 발명에 따른 개선된 방법의 제 3단계는 전 단계에서 얻어진 용액으로부터 바이오 매스를 분리하는 단계(isolating)로 이루어진다.

이러한 목적을 위하여, 상기 단계로부터 얻어진 비-농축된 추출물을 메탄올 및 물에 희석시킨 다음 솔트-아웃(salt-out)시켜 바이오 매스의 침전을 얻는다. 바람직하게, 소디움 클로라이드가 추출물을 솔트아웃(salting-out)시키는 염으로 사용된다. 그러나, 다른 염, 수용액에 용해되는 모든 염, 암모늄 클로라이드, 암모늄 술페이트, 소디움 또는 포타슘 아세테이트, 포타슘 클로라이드, 소디움 또는 포타슘 포스페이트 또는 소디움 또는 포타슘 시트레이트가 동일한 반응에 사용될 수 있다.

바람직하게는, 소디움 클로라이드(또는 어떠한 다른 선택된 염)은 격렬한 교반하에서 비-농축된 추출물에 빠르게 첨가된다. 구하고자 하는 바이오 매스는 용액의 리터 당 10 내지 200그램의 농도로 소디움 클로라이드를 빠르게 첨가하여 제조된다. 바람직하게, 소디움 클로라이드는 비-농축된 추출용액 리터 당 50 내지 100 그램, 보다 바람직하게는 50 내지 75그램의 농도로 첨가된다.

형성 및 침전된 바이오 매스를 여과 또는 원심분리에 의해 용액으로 부터 분리한다. 이와 같이 습윤, 분리된 바이오 매스를 바로 다음 단계에 적용하거나 또는 주위 공기 또는 진공하에서, 바람직하게는 통기 또는 동결건조에 의해 건조할 수 있다.

단계 4 - 송진 및 천연 색소의 제거

본 발명에 따른 개선된 방법의 제 4단계는 함유된 송진 및 천연색소를 제거하기 위하여 전단계에서 분리된 바이오 매스를 처리하는 단계로 이루어진다.

이 단계는 이전 단계에서 얻어진 바이오 매스의 종류, 즉, 건조 또는 습윤된 것인지에 따라 수행될 수 있다.

A - 상기 침전 단계에서 얻어진 바이오 매스를 건조시키는 경우, 바람직하게 침전화 전에 단계 2에서 얻어진 비-농축 추출물 부피의 약 1/25인, 아세톤 및 헥산의 혼합물(바람직하게, 1/1 부피 비율)을 첨가하여 다시 용액으로 만든다.

보다 바람직하게, 상기 건조된 바이오 매스는 아세톤 및 헥산의 혼합물을 먼저 첨가한 다음 1.5 추가 부피의 순수한 헥산을 첨가하여 다시 용액으로 만든다. 아세톤 대 헥산의 최종 비율은 헥산 4부피에 대하여 아세톤 1부피이다. 이러한 용해 후에, 얻어진 용액에 순수를 첨가하여 파클리탁셀-농축 오일상을 형성한다. 바람직하게 물은 첨가된 아세톤 100부피 당 2 내지 10부피, 보다 바람직하게는 5 내지 7부피의 비율로 첨가된다.

이와 같이 얻어진 혼합물을 그 다음 데칸팅(decanting) 플라스크로 이동시킨다. 플라스크의 바닥에 침전된 파클리탁셀 및 다른 탁산을 함유하는 오일상을 회수한다. 그 다음 오일상을 증발시키고 실리카겔 크로마토그래피로 정제할 준비를 한다.

B - 제 3단계에서 원심분리 후에 얻어진 바이오 매스가 습윤(즉, 건조에 적용하지 않은 경우)인 경우, 이러한 습윤 바이오 매스를 어떠한 물을 첨가하지 않은 아세톤 및 헥산 혼합물(바람직하게는 1:1의 부피 비율)에서 다시 용액으로 만들었다. 바람직하게, 아세톤의 부피는 침전화 전에 제 2단계에서 얻어진 비-농축 추출물의 약 1/20 부피와 동일하다.

이러한 용해 후에, 최소 하나의 비-극성 용매를 상기 얻어진 용액에 첨가하여 동일한 방법으로 헥산으로부터 분리된 파클리탁셀-농축 오일상을 형성한다.

이러한 목적에 사용되는 비-극성 용매는 바람직하게, 펜탄, 헥산 또는 헵탄과 같은 아세톤과 혼화성인 탄화수소로 구성되는 그룹으로부터 선택된다. 헥산이 사용되는 경우, 사용되는 헥산의 부피는 일반적으로 상기 아세톤 용액 중 하나의 3 내지 4배이다.

습윤 바이오 매스가 과량의 물을 함유하는 경우에, 상기 얻어진 파클리탁셀-농축 오일상은 파클리탁셀 및 그 유사물을 회수 및 정제하기 위하여 실리카겔로 이를 코팅하고 이와 같이 코팅된 실리카겔을 크로마토그래피에 적용하기 전에 잔류의 물이 제거되도록 처리되어야 한다. 물의 제거로 크로마토그래피 컬럼에 이를 장입하기 전에 코팅된 실리카겔이 보다 빠르게 건조된다.

파클리탁셀-농축 오일상에 잔류하는 물은 물-비혼화성 용매로 추출하여 제거될 수 있다. 그 다음, 상기 혼합물을 따라내고 유기상을 물에서 분리한다. 사용되는 물-비혼화성 용매는 할로겐화된 탄화수소 또는 에테르로 구성되는 그룹으로부터 선택된다. 이러한 용매의 예로는, 클로로메틸렌, 트리클로로메탄 및 디에틸 에테르가 사용될 수 있다.

얻어지는 추출물을 진공하에서 회수, 농축하고, 이 때, 실리카겔로 크로마토그래피 정제할 준비를 한다.

단계 5 - 크로마토그래피 정제

본 발명에 따른 방법의 마지막 단계인 제 5단계는 이전 단계에서 얻어진 파클리탁셀-농축 오일상의 용액을 적어도 한번 크로마토그래피 정제하는 단계 및 크로마토그래피에 의해 얻어진 정제 용액을 적어도 한번 결정화하는 단계로 이루어진다.

이를 행하기 위해, 제 4단계에서 얻어진 농축된 파클리탁셀-농축 오일상을 적어도 1회의 크로마토그래피 정제에 적용하고 크로마토그래피에 의해 얻어진 정제 용액을 적어도 1회의 결정화에 적용한다. 그러나, 바람직하게, 상기 제 4단계에서 얻어진 파클리탁셀-농축 오일 상을 여러 번의 크로마토그래피 및 결정화에 적용하며, 크로마토그래피 정제의 횟수는 2회가 바람직하며, 결정화의 횟수는 3회가 바람직하다.

이러한 연속적인 정제 및 결정화를 다음 부-단계 A 내지 E로 설명하고자 한다.

A - 제 1크로마토그래피 정제

제 1크로마토그래피 정제 단계에서, 본 발명의 제 4단계에서 얻어진 파클리탁셀-농축 오일상을 실리카겔과 혼합하고 통기하에서 건조한다. 오일상으로 코팅된 실리카겔을 동일한 종류의 겔이 들어있는 크로마토그래피 컬럼에 장입한다. 이 컬럼에서, 상기 파클리탁셀을 30 내지 40%의 아세톤 및 60 내지 70%의 헥산을 포함하는 용리(elution) 혼합물로 정제한다. 바람직하게, 상기 용리 혼합물은 약 35%의 아세톤 및 약 65%의 헥산을 포함한다.

바람직하게 사용되는 컬럼은 높이가 142cm이며, 정제하고자 하는 파클리탁셀의 양에 따라 내부 직경이 7.6cm 또는 15.2cm이다. 4 내지 6g의 파클리탁셀을 함유하는 파클리탁셀-농축 오일상은 바람직하게 직경이 7.6cm인 컬럼에서 정제된다. 파클리탁셀 20 내지 24g을 함유하는 오일상의 경우에는 컬럼 직경이 15.2cm인 컬럼이 사용된다. 보다 소형인 컬럼(직경 7.6cm)은 실리카겔 2.2 내지 2.3kg을 포함하며, 보다 대형의 컬럼(직경 15.2cm)은 8 내지 9kg을 포함한다.

컬럼의 실리카겔을 세척하고 아세톤 및 헥산으로 구성되는 용리 혼합물로 균형을 잡는다(balance). 분획(fractrion)의 용리는 직경이 7.6cm인 컬럼에서 약 100ml/min의 유속으로, 직경이 15.2cm인 컬럼에서는 400ml/min의 유속으로 동일한 용매 혼합물로 수행된다. 두개 모두의 경우에, 부피는 바람직하게 0 내지 30psi로 변화되는 압력하에서 유지된다.

B - 제 1결정화

B.1 - 이 단계에서, 이전 단계에서 크로마토그래피에 의해 얻어지는 파클리탁셀 함유 분획을 증발 건조시키고 이를 다시 아세톤 용액으로 만든다. 아세톤의 양을 조절하여 HPLC 분석에 의해 파클리탁셀에 해당하는 최대 피크의 경우에 228nm에서 1.0 내지 1.5 O.D.의 흡광도가 얻어진다. 그 다음, 상기 파클리탁셀은 아세톤 용액에 3 내지 4 부피의 헥산을 첨가하여 결정화된다.

B.2 - 선택적으로, 이전 단계에서 크로마토그래피에 의해 얻어진 파클리탁셀을 함유하는 분획을 초기 부피의 1/5로 증발시키거나 또는 HPLC 분석에 의해 파클리탁셀에 해당되는 최대 피크의 경우에 1.0 내지 1.5의 O.D.가 얻어질 때까지 감소시킨다. 이에 따라, 파클리탁셀은 아세톤-헥산(35-65%)의 용매 혼합물에 잔류한다. 그 다음, 상기 파클리탁셀을 용액에 2 내지 3 부피의 헥산을 첨가하여 결정화한다.

결정은 빠르게 형성된다. 혼합물을 밤새 상온 또는 2 내지 8℃의 온도에 두어 결정화를 완료한다.

C - 제 2결정화

이 단계에서, 이전 단계에서 결정화에 의해 얻어진 결정은 여과 또는 원심분리에 의해 분리되고 아세톤의 부피가 조절된 용액으로 다시 만들고 HPLC 분석에 의해 파클리탁셀에 해당하는 피크의 경우에 1.0 내지 1.5 O.D.로 변화되는 용액의 흡광도를 얻는다.

그 다음, 이 용액에 함유된 파클리탁셀을 용액 부피 당 3 내지 4부피의 헥산을 아세톤 용액에 첨가하여 재결정한다.

이 단계에서 얻어진 결정은 HPLC 분석에 의해 85 내지 95%의 파클리탁셀 순도를 갖는다.

상기 두개의 결정화 단계로부터 여과하여 결정을 분리한 후, 9-디하이드로 13-아세틸바카틴 Ⅲ로 확인된 피크에 상응하는 제 1크로마토그래피로부터 얻어진 분획을 헥산 상과 혼합한다. 이 성분은 파클리탁셀 피크에 도달하기 전에 여러개의 분획으로 용리된다. 그 다음, 상기 혼합물을 증발 건조한다. 이와 같이 얻어진 잔류물은 메탄올의 첨가에 의해 엷은 황색 결정의 9-하이드로-13-아세틸바카틴 Ⅲ으로 전환된다. 상기 결정을 여과에 의해 분리한 다음, 다시 아세톤 용액으로 만들고 4 부피의 헥산을 빠르게 첨가하여 결정화시킨다. 여과에 의해 이 단계에서 얻어진 9-디하이드로-13-아세틸바카틴 Ⅲ의 결정은 상기 개시된 동일한 방법으로 결정화되며, HPLC 분석에 의해 98% 이상의 순도를 가질 수 있다.

D - 제 2크로마토그래피 정제

D.1 이 단계에서, 이전 단계에서 얻어진 파클리탁셀 결정을 여과하고 아세톤 용액으로 다시 만든다. 상기 파클리탁셀 용액을 여과하여 아세톤내에 용해되지 않은 입자를 제거한다. 이와 같이 얻어진 용액을 실리카겔과 혼합하고 통기 건조한다.

파클리탁셀로 코팅된 실리카겔을 동일한 종류의 겔이 들어있는 크로마토그래피 컬럼에 장입한다. 그 다음 파클리탁셀을 유기 용매계 용리 혼합물로 2회 재정제한다. 바람직하게, 상기 용리 혼합물은 30 내지 40%의 아세톤 및 70 내지 60%의 헥산을 포함한다.

보다 바람직하게, 상기 단계 C에서 얻어진 결정은 아세톤으로 용해되고 실리카겔과 혼합되고 건조된다. 파클리탁셀과 함침된 겔을 크로마토그래피 컬럼에 장입한다(바람직하게, 길이는 142cm, 내부 직경은 7.6cm 또는 15.2cm이며, 이는 정제하고자 하는 파클리탁셀의 양에 따라 결정됨.). 직경이 7.6cm인 컬럼은 실리카겔을 2.2 내지 2.3kg 포함할 수 있으며, 직경이 15.2cm인 컬럼은 실리카겔을 8kg 포함할 수 있다. 상기 컬럼내의 겔을 세척하고 아세톤 및 헥산으로 이루어지는 용매(바람직하게 부피 당 35:65%)로 평형화시킨다. 분획의 용리는 직경이 7.6cm인 컬럼에서 약 100ml/min의 유속으로, 직경이 15.2cm인 컬럼에서는 400ml/min의 유속으로 동일한 용매 혼합물로 수행된다. 두개 모두의 경우에, 바람직하게 0 내지 30psi로 변화되는 압력에서 조작된다.

D.2 선택적으로, 상기 단계 C에서 얻어진 파클리탁셀 결정을 여과한 다음 메틸렌 클로라이드 용액으로 다시 만든다. 상기 파클리탁셀 용액을 여과하여 클로라이드 메틸렌에 비용해된 입자를 제거한다.

이와 같이 얻어진 용액을 그 다음 실리카겔과 혼합하고 통기 하에서 건조한다.

파클리탁셀로 코팅된 실리카겔을 동일한 종류의 겔이 들어있는 크로마토그래피 컬럼에 장입한다. 그 다음 파클리탁셀을 유기-용매계 용리 혼합물로 2회 재정제한다. 바람직하게, 상기 용리 혼합물은 95 내지 98%의 클로로메틸렌 및 2 내지 5%의 이소프로판올을 포함한다.

보다 바람직하게, 상기 단계 C에서 얻어진 결정은 클로로메틸렌으로 용해되고, 실리카겔과 혼합되고 건조된다. 파클리탁셀과 함침된 겔을 크로마토그래피 컬럼에 장입한다(바람직하게, 길이는 142cm, 내부 직경은 7.6cm 또는 15.2cm이며, 이는 정제하고자 하는 파클리탁셀의 양에 따라 결정됨.). 직경이 7.6cm인 컬럼은 실리카겔을 2.2 내지 2.3kg 포함할 수 있으며, 직경이 15.2cm인 컬럼은 실리카겔을 8kg 포함할 수 있다. 상기 컬럼내의 겔을 세척하고 클로로메틸렌 및 이소프로판올로 이루어지는 용매(바람직하게 부피 당 97.5:2.5%)로 평형화시킨다. 분획의 용리는 직경이 7.6cm인 컬럼에서 약 100ml/min의 유속으로, 직경이 15.2cm인 컬럼에서는 400ml/min의 유속으로 동일한 용매 혼합물로 수행된다.

E - 제 3결정화

이 단계에서, 단계 D의 크로마토그래피에 의해 회수된 파클리탁셀을 함유하는 농축 분획을 그 순도에 따라, 바람직하게는 98 내지 99%의 순도 및 90 내지 98%의 순도에 따라 합하였다. 그 다음, 이들을 증발 건조시키고, 아세톤, 알콜(에탄올), 에틸 아세테이트 또는 디에틸 에테르 용액으로 다시 만든다.

첨가된 아세톤의 부피를 조절하여 HPLC 분석에 따라 파클리탁셀에 해당하는 피크의 경우에 1.0 내지 1.5 O.D.로 변화하는 흡광도를 얻는다. 상기된 다른 용매가 사용되는 경우에, 즉, 알콜(에탄올), 에틸 아세테이트 또는 디에틸 에테르가 사용되는 경우에, 상기 파클리탁셀 농도는 보다 중요하며, 일반적으로 아세톤 용액내의 파클리탁셀 보다 5배 이상 농축된 것이다.

그 다음 파클리탁셀을 3회 재결정화시키고, 이는 바람직하게는 다음과 수행된다:

1. 아세톤 부피 당 3 내지 4부피의 헥산을 아세톤 용액에 첨가.

2. 알콜 또는 에틸 아세테이트 부피 당 적어도 3부피의 헥산을 알콜 용액 또는 에틸 아세테이트 용액에 첨가.

3. 디에틸에테르 부피 당 최소 2부피의 헥산을 디에틸 에테르 용액에 첨가.

상기 개시된 마지막 정제 및 재결정 단계에서, 파클리탁셀 용액에 헥산의 첨가는 상온에서 수행될 수 있다. 이는 결정이 천천히 형성되도록 하나, 2~4℃ 또는 상온에서 밤새 결정화가 완료될 것이다. 결정을 여과하고 진공하에서 건조하여, 미세한 분리(detached) 분말을 얻는다. 그 다음 상기 결정을 알콜(메탄올 또는 에탄올)에 용해시키거나 또는 아세톤에 용해시킨 다음 물 현탁액으로 만들고 약 -60℃의 온도에서 66 내지 72시간동안 동결건조한다.

그 다음, 얻어진 탁산의 분획을 Autosampler(Water 717 plus), Photodiode Array Detecter(Waters 996), Multisolvent Delivery System(Waters 600^E) 및 C18 Nova-Pak 컬럼, 60Å, 4㎛ (3.9 X 150mm)을 사용하는 HPLC 크로마토그래피(Waters system)로 분석할 수 있다.

분획의 분석은 5㎕ 부피를 주입하여 수행될 수 있다. 컬럼은 아세토니트릴-물-메탄올(초기에 25:50:30 부피 및 말기에 35:35:30)의 용매 그래디언트를 사용하여 1ml/min의 유속으로 용리된다.

화합물의 피크는 228nm에서 검출되며, 샘플의 분석 시간은 약 36분이다. 파클리탁셀 피크의 머무름 시간은 약 18.9±0.2분이며, 9-디하이드로-13-아세틸바카틴 Ⅲ 피크는 6.5±0.2분이다.

바람직하게, 잔류물의 용해를 위한 크로마토그래피 정제 단계에서 사용되는 휘발성 용매는 세톤, C1-C3 경(light) 알콜, 에틸 아세테이트, 클로로메틸렌 또는 이러한 용매의 혼합물로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.

단계 E의 말기에, 헥산에서 파클리탁셀을 결정화하고 여과 및 건조한 후에, 파클리탁셀 결정의 혼합물이 얻어진다. 파클리탁셀 결정의 혼합물은:

- 99% 이상의 순도를 갖는 결정 약 60%

- 98% 이상 99%이하의 순도를 갖는 결정 약 30%; 및

- 92% 이상이나 98% 이하의 순도를 갖는 결정 약 10%

로 구성된다.

본 발명 및 본 출원인의 미국특허 제 6,452,024호의 기본적인 차이

상기된 바와 같이, 도 1a 및 1b는 본 발명과 미국특허 6,452,024호의 기분적인 단계를 비교한 흐름도이다.:

1. 흐름도에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 방법에서, 건조된 침엽 및 소지로 바람직하게 구성되는, 추출하고자 하는 파클리탁셀을 함유하는 원료 물질을 메탄올 또는 아세톤과 같은 유기 용매로 추출하기 전에 순수로 세척한다. 이러한 세척단계 후에 얻어지는 물은 폐기되는 일부 수용성 성분을 함유한다. 습윤 침엽 및 소지들은 그 다음 메탄올 또는 아세톤 또는 이들의 혼합물로 '덮혀지고(covered)', 예를 들어, 20℃에서 16시간동안 추출에 적용된다. 그 다음, 추출물을 카트리지 필터에 통과시키고 자켓내의 가열된 물의 순환에 의해 용매가 증발되는 이중벽 탱크내로 펌프시킨다. 상기된 바와 같이, 일부 잔류하는 물을 함유하는 추출물을 '비-농축된 추출물'이라 한다.

반대로, 미국특허 제 6,452,024호에서는, 건조된 침엽 및 소지의 추출을 메탄올 및 메틸렌 클로라이드의 용매 혼합물을 사용하여 바로 수행한다. 증류 후에 얻어지는 농축 추출물은 매우 점성이며, 이는 송진 및 천연 색소를 상당한 양 함유한다. 이러한 추출물을 '농축된 추출물'이라 한다.

2. 본 발명에 따른 방법에서, 소디움 클로라이드를 비-농축 추출물에 첨가하여 바로 침전되는 바이오 매스를 형성한다. 이러한 바이오 매스는 원심분리에 의해 분리된다.

미국 특허 6,452,024호에서, 바이오 매스는 염기성 또는 산성 매질내의 미리 희석된 메탄올에 농축된 추출물의 침전에 의해 얻어진다. 형성된 침전물은 매우 미세하고 엷은 색이며, 소디움 클로라이드의 첨가에 의해 분리되기 전에 솔트아웃된다.

3. 그 다음,본 발명에 따른 방법 뿐만 아니라, 미국 특허 제 6,452,024호에 따른 방법에서, 상기 바이오 매스는 아세톤에 용해되며, 헥산과 같은 비극성 용매의 주어진 양(바람직하게는 4부피)을 아세톤 용액에 첨가하여 파클리탁셀-농축 오일상을 형성한다.

그러나, 본 발명에 따른 방법에서, 이와 같이 얻어진 파클리탁셀-농축 오일상은 저압에서 실리카겔이 채워진 크로마토그래피 컬럼에서 정제하기 위해 준비된다. 반대로, 미국 특허 제 6,452,024호에 개시된 방법의 경우에, 얻어진 파클리탁셀-농축 오일상은 산성 또는 염기성 매질내에서 제 2침전화에 적용되어야 한다. 상기 침전물은 소디움 클로라이드 첨가에 의해 솔트아웃된 후에 원심분리에 의해 분리된다. 얻어진 침전물을 건조한 다음 아세톤에 용해한다. 이는 저압에서 실리카겔이 채워진 크로마토그래피 컬럼에서 정제하기 위해 아세톤 용액이 준비되는 경우에만 해당된다.

4. 본 발명에 따른 공정의 제 1크로마토그래피 정제 단계에서, 상기 파클리탁셀-농축 오일상은 실리카겔과 혼합되며 통기 하에서 건조된다. 그 다음, 상기 바이오 매스로 덮혀진 실리카겔을 크로마토그래피 컬럼에 장입한다. 상기 파클리탁셀을 아세톤 및 헥산의 용리 혼합물로 정제한다. 크로마토그래피에 의해 얻어진 파클리탁셀을 함유하는 분획을 모은 다음, 결정화한다. 여과 또는 원심분리에 의해 얻어진 결정을 아세톤에 용해한 다음 2회 재결정한다. 상기 결정을 여과 또는 원심분리에 의해 분리하고 저압에서 실리카겔로 제 2 및 최종 크로마토그래피 컬럼에 의해 정제할 준비를 한다.

미국특허 제 6,452,024호에 개시된 방법의 제 1크로마토그래피 정제 단계에서, 상기 파클리탁셀-농축 오일상은 실리카겔과 혼합되고 통기 하에서 건조된다. 그 다음, 바이오 매스로 덮혀진 실리카겔을 크로마토그래피 컬럼에 장입한다. 상기 파클리탁셀을 아세톤 및 헥산의 용리 혼합물로 정제한다. 크로마토그래피에 의해 얻어진 파클리탁셀을 함유하는 분획을 함께 모은 다음 이전 단계에서 사용되는 조건으로 제 2크로마토그래피 컬럼으로 재정제된다. 상기 제 2크로마토그래피에 의해 얻어지는 파클리탁셀을 함유하는 분율을 함께 모으고 결정화한다. 여과 또는 원심분리에 의해 얻어진 결정을 아세톤에 용해한 다음 2회 재결정한다. 상기 결정을 여과 또는 원심분리에 의해 분리하고 저압에서 실리카겔로 제 3 및 최종 크로마토그래피 컬럼으로 재정제할 준비를 한다.

이에 따라, 미국특허 제 6,452,024호에 개시된 방법에서, 수행하고자 하는 크로마토그래피의 횟수는 보다 많다(2회가 아닌 3회).

두개 모두의 경우에, 본 발명에서 제 2 및 최종 크로마토그래피 컬럼의 파클리탁셀을 함유하는 분획 또는 미국특허 제 6,452,024호에서 제 3 및 최종 크로마토그래피 컬럼한 경우를 함께 모은 다음 결정화하여 최종 생성물을 제조한다.

이와 같이, 보다 나은 이해를 돕기 위해 개시된 바와 같이, 미국특허 제 6,452,024호와 비교되는 본 발명의 주요한 잇점은, 본 발명에 따른 방법은 침엽의 초기 추출물 중 하나에서부터 바이오매스의 획득물까지 보다 적은 제조단계 및 보다 적은 정제단계: 즉, 미국 특허 제 6,452,024호에 개시된 바와 같이 3회가 아닌 2회의 크로마토그래피가 수행된다는 것이다.

또한, 본 발명에 따른 방법은 동일한 양의 최종 생성물을 얻기 위하여 훨씬 적은 용매를 사용하며 훨씬 적은 원료물질을 필요로 한다. 따라서, 본 발명에 따른 개선된 방법을 이용하는 경우의 제조경비는 파클리탁셀 정제에 사용되는 일반 통상적인 방법 뿐만 아니라 미국특허 제 6,452,024호 보다 훨씬 감소된다.

이하, 다음 실시예를 통하여 본 발명을 설명하고자 하며, 이로써 본 발명을 제한하는 것은 아니다.

실시예 1

세척

Taxus canadensis의 건조 및 분쇄된 침엽 및 소지 100kg을 순면 백에 위치시켰다. 이 백을 증류수 400L가 첨가된 스테인레스 강 탱크에 넣었다. 상기 순면 백을 상온에서 3시간 동안 물에 완전히 침윤시키고 수용성 불순물을 함유하는 용액을 배출시켰다.

실시에 있어서, 이 세척단계는 1회 또는 2회 반복될 수 있고, 상기 습윤 침엽은 순면백에 의해 탱크에서 유지된다.

추출

메탄올 250L를 습윤 침엽 및 소지를 포함하는 탱크에 첨가하였다. 상온에서 16시간동안 추출을 수행하였다. 상기 추출물을 제 2이중벽 탱크내로 필터를 통하여 펌프하였다. 메탄올은 탱크의 이중벽에서 순환되는 80℃의 고온수의 보조로 증류되었다. 회수된 메탄올을 헹굼을 위해 침엽을 함유하는 탱크로 이동시키고 순수한 메탄올 부피를 400L로 하였다. 헹구어진 메탄올을 그 다음 펌프하고 메탄올 부피의 75%가 리큐퍼레이트될(recuperated) 때까지 증류하였다. 약 100 내지 120L의 잔류 용액을 이하, '비농축된 추출물'이라 하며, 이를 또 다른 탱크로 이동시키고 추출물의 온도가 상온으로 감소될 때까지 유지하였다.

솔트아웃에 의한 바이오매스의 침전

비농축된 추출물을 10L의 메탄올(비-농축된 추출물 부피에 대하여 약 10%의 메탄올)로 투명화시켰다. 상기 바이오매스는 교반하에서 소디움 클로라이드를 빠르게 첨가하여 침전에 의해 분리되었다. 소디움 클로라이드의 농도는 추출물 용액 리터 당 약 50g이었다. 침전이 바로 형성되고 혼합물을 교반하지 않고 밤새 유지하였다. 상청액을 배출시킨 다음 헤비(heavy) 침전물을 여과나 원심분리 하지 않고 쉽게 회수하였다.

필요에 따라서, 소디움 클로라이드의 첨가에 의해 얻어진 바이오매스는 30분동안 20℃에서 4,200rpm의 속도로 여과 또는 원심분리하여 빠르게 회수될 수 있다(J6 MC Beckman Centrifugal 기계, 4.2 JS 로토). 연속 흐름 원심분리기는 바람직하게 과량의 침전물 처리에 사용될 수 있는 것으로 여겨진다.

10-디아세틸바카틴 Ⅲ 및 바카틴 Ⅲ을 함유하는 상청액은 메틸렌 클로라이드 또는 디에틸에테르를 이용하여 추출되었다. 유기상은 증발에 의해 농축되며 탁산의 이러한 유사물 추출을 위해 처리될 수 있다.

송진 및 색소의 제거

1. 얻어진 침전물을 공기 건조하였다. 선택적으로, 이는 진공건조되거나 또는 동결건조(동결 건조기 - FTS 시스템)될 수 있다. 침전물의 중량은 약 1.3 내지 1.5kg이었다. 이 침전물을 아세톤-헥산 혼합물 (1:1) 6L에 용해시키고 30분동안 0~2℃에서 여과하여(선택적으로, 4,200rpm으로 원심분리) 함유된 불용성 입자를 제거하였다. 그 다음, 상기 아세톤-헥산 용액을 비이커로 이동시키고 몇분 동안 교반하면서 순수한 헥산(9L) 1.5부피 그 다음 연속적으로 헥산 1/2 부피와 혼합하고, 순수 5 내지 20%, 바람직하게는 5 내지 10%를 첨가하여 오일상을 형성하였다. 물의 양을 사용되는 아세톤 부피에 따라 계산하였다. 상기 혼합물을 분리 플라스크에 공급하고 약 30분동안 분배하였다. 상기 파클리탁셀-농축상을 플라스크의 바닥에서 회수하고 퍼컬러리제이션(percolorization) 전에 얻어진 용액의 초기 부피의 1/10로 증발시켜 농축하였다. 이 침전물을 크로마토그래피 정제 단계를 위해 실리카겔에 흡착시킬 준비를 하였다.

2. 건조 단계없이 원심분리한 후에, 이와 같이 얻어진 침전물을 3L의 아세톤에 용해시키고, 30분동안 0~2℃에서 여과(또는 선택적으로, 4,200rpm에서 원심분리)하여 함유된 불용성 입자를 제거하였다. 그 다음, 아세톤 용액을 비이커로 이동시키고 몇분 동안 각각 교반하면서 4부피의 헥산(12L) 그 다음 1부피의 헥산을 연속적으로 첨가하여 혼합하였다. 오일상이 빠르게 형성되었다. 그 다음 상기 혼합물을 분리 플라스크에 공급하고 약 30분동안 분배시켰다. 파클리탁셀-농축 상을 플라스크의 바닥에서 회수하였다. 이 용액은 일부 잔류하는 물을 함유하며, 이에 따라 1 부피의 클로로메틸렌을 첨가하여 추출하였다.

물을 이 혼합물로부터 분배하고 파클리탁셀을 함유하는 저급 클로로메틸렌 상을 송진 및 색소의 제거 또는 증발 건조하기 전에 얻어진 아세톤 용액의 초기 부피의 1/5로 농축시켰다. 후자의 경우에, 상기 건조된 잔류물을 아세톤 0.5L에 용해시켰다.

실시예 2

저압에서 실리카겔 상의 크로마토그래피에 의한 제1정제

실시예 1에서 송진 및 색소를 제거한 후에 얻어지는 파클리탁셀 및 유사물을 함유하는 아세톤 용액을 실리카겔(230~400메쉬) 500g과 혼합하였다. 추출물과 함침된 겔을 통기하에서(또는 진공하에서) 공기 건조하였다. 건조 후에 전체 중량은 약 900~950g이며, 이 물질의 절반을 실리카겔(230~400메쉬) 2.2kg을 포함하는 컬럼(142x7.6cm내부 직경)에 장입하였다. 상기 겔을 세척하고 아세톤 및 헥산의 혼합물(35:65%, 부피 당 부피)로 균형을 잡았다. Dynamax® 용매 전달 시스템을 사용하여 동일한 용매로 용리를 수행하였다. 용리의 유속은 0 내지 30psi의 압력하에서 약 100ml/min이었다. 용매 혼합물의 부피는 약 40L이며, 각 분획을 1L의 배치에 수집하였다. HPLC 분석은 26번째 또는 27번째 내지 35번째 또는 36번째의 9 내지 10개의 분획이 있으며, 이는 파클리탁셀을 약 0.2mg/ml 내지 0.7mg/ml함유하며, 그 순도는 10 내지 58%로 변화함을 나타내었다. 보다 많은 파클리탁셀이 함유된 분획은 보다 높은 순도를 갖는다. 각 분획의 파클리탁셀의 양은 표준 파클리탁셀의 면적과 비교하여 그 피크면적으로부터 결정되었다.

이는 파클리탁셀을 함유하는 분획이 하나의 정제에서 다른 정제까지 서로에 대하여 오프셋(offset)될 수 있음을 나타낸다.

가장 많은 양의 오염물을 갖는 분획을 폐기하였다. 일반적으로, 0.3mg/ml미만의 파클리탁셀이 함유된 제 1분획을 제거하였다.

실시예 3

저압에서 실리카겔상의 크로마토그래피에 의한 제 1정제

실시예 1에서 송진 및 색소를 제거한 후에 얻어지는 파클리탁셀 및 유사물을 함유하는 아세톤 용액을 실리카겔(230~400메쉬) 500g과 혼합하였다. 추출물과 함침된 겔을 통기하에서(또는 진공하에서) 공기 건조하였다. 건조 후에 전체 중량은 약 920g이며, 이 물질의 절반을 실리카겔(230~400메쉬) 2.2kg을 포함하는 컬럼(142x7.6cm내부 직경)에 장입하였다. 상기 겔을 세척하고 아세톤 및 헥산의 혼합물(40:60%, 부피 당 부피)로 균형을 잡았다. Dynamax® 용매 전달 시스템을 사용하여 동일한 용매로 용리를 수행하였다. 용리의 유속은 0 내지 30psi사이의 압력하에서 약 100ml/min이었다. 용매 혼합물의 부피는 약 30L이며, 각 분획을 1L의 배치에 수집하였다. HPLC 분석은 16번째 또는 17번째 내지 23번째 또는 24번째의 7 내지 8개의 분획이 있으며, 이는 파클리탁셀을 약 0.1mg/ml 내지 0.7mg/ml함유하며, 그 순도는 8 내지 45%로 변화함을 나타내었다. 보다 많은 파클리탁셀이 함유된 분획은 보다 높은 순도를 갖는다. 각 분획의 파클리탁셀의 양은 표준 파클리탁셀의 면적과 비교하여 그 피크면적으로부터 결정되었다.

다시 한번, 이는 파클리탁셀을 함유하는 분획이 하나의 정제에서 다른 정제까지 서로에 대하여 오프셋(offset)될 수 있음을 나타낸다.

가장 많은 양의 오염물을 갖는 분획을 폐기하였다. 일반적으로, 0.3mg/ml미만의 파클리탁셀이 함유된 제 1분획을 제거하였다.

실시예 4

제 1결정화

실시예 2 및 실시예 3에서 제 1크로마토그래피 정제한 후에, 3.0mg/ml 이상의 파클리탁셀 농도를 갖는 분획을 합하고 증발 건조하였다. 잔류물을 아세톤에 용해시키고 아세톤의 부피를 조절하여 HPLC에 의해 1.0 내지 1.5 O.D.의 범위에서 최대 파클리탁셀의 피크를 얻었다. 그 다음, 헥산 4부피를 아세톤 용액에 첨가하고 그 이후 시간동안 결정화가 시작되었다. 상기 혼합물을 2~8℃ 또는 상온에서 밤새 유지하여 결정화를 완료하였다.

제 2결정화

그 다음, 얻어진 결정을 여과하고(또는 원심분리) 아세톤에 용해하였다. 아세톤의 부피를 조절하여 1.0 내지 1.5 범위의 최대 O.D.를 갖는 HPLC 피크에 의해 파클리탁셀 피크를 얻었다. 그 다음 헥산을 아세톤 용액에 대하여 4부피의 비율로 첨가하였다. 결정은 이후에 형성되었다. 혼합물을 2~8℃의 온도 또는 상온에서 밤새 유지하여 결정화를 완료하였다. 결정을 여과하거나 원심분리하고 공기 또는 진공하에서 건조하였다. HPLC 분석은 파클리탁셀 함량이 약 85% 이상임을 나타낸다.

9- 디하이드로 -13- 아세틸바카틴 Ⅲ의 직접 분리 및 제 1결정화

실시예 2의 크로마토그래피에 의한 제 1정제로부터 얻어지는 9-디하이드로-13-아세틸바카틴 Ⅲ(분획 20 내지 25번째)을 함유하는 분획 또는 실시예 3의 13번째 내지 15번째 분획을 9-디하이드로-13-아세틸바카틴 Ⅲ을 함유하는, 제 1 및 제 2 결정화 단계에서 얻어지는 헥산/아세톤 용액(모액)과 함께 합하고 증발 건조하였다. 메탄올을 첨가하여 결정이 형성되고 여과 또는 원심분리에 의해 리큐퍼레이트하였다(recuperate). 얻어진 결정을 아세톤에 용해하고 3부피의 헥산으로 결정화하였다. 생성물은 >95%의 순도를 갖는 9-디하이드로-13-아세틸바카틴 Ⅲ으로 확인되었다.

9- 디하이드로 -13- 아세틸바카틴 Ⅲ 의 제 2결정화

이와 같이 얻어진 9-디하이드로-13-아세틸바카틴 Ⅲ 결정을 아세톤에 용해한 다음 1부피의 헥산을 아세톤 용액에 첨가하였다. 상기 혼합물을 천천히 교반하고 2부피의 헥산을 추가로 첨가하였다. 상기 용액을 천천히 결정화하였다. 백색 결정을 여과 또는 원심분리로 회수하고 통기 또는 진공하에서 건조하였다. 이러한 결정의 HPLC 분석은 9-디하이드로-13-아세틸바카틴 Ⅲ 함량이 98% 이상임을 나타내었다.

실시예 5

저압에서 실리카겔 상의 크로마토그래피에 의한 제 2정제

실시예 4에서 제 2결정화 후에 얻어진 파클리탁셀 결정을 75 내지 100ml의 아세톤에 용해한 다음, 여과하여 불용성 입자를 제거하고 75 내지 100g의 실리카겔에 흡착시켰다. 파클리탁셀로 코팅된 겔을 통기 또는 진공하에서 공기 건조하였다. 상기 건조된 겔을 실리카겔(230~400메쉬) 2.2kg을 포함하는 컬럼(142x7.6cm 내부 직경)의 상부에 장입하였다. 상기 겔을 세척하고 아세톤 및 헥산의 혼합물(부피당 35:63부피)로 균형을 잡았다. 0 내지 30psi의 압력하에서 약 100ml/min의 유속으로 Dynamax® 용매 전달 시스템을 사용하여, 동일한 용매로 용리를 수행하였다. 용매 혼합물의 부피는 약 40L이며, 분획을 1L의 배치에서 수집하였다. HPLC 분석은 26 또는 27번째 내지 34 또는 35번째의, 9 내지 10개의 분획이 있으며, 이는 파클리탁셀 0.2 내지 0.6mg/ml를 함유하며, 그 순도는 85 내지 99%임을 나타내었다. 순도가 98% 이상인 파클리탁셀을 함유하는 분획을 제 3 및 최종 결정화를 위해 서로 합하였다.

다시 한번, 파클리탁셀을 함유하는 분획을 일정제에서 다른 정제까지 서로에 대하여 오프셋할 수 있다.

실시예 6

저압에서 실리카겔 상의 크로마토그래피에 의한 제 2정제

실시예 4의 제 2결정화 후에 얻어진 파클리탁셀 결정을 메틸렌 클로라이드 75 내지 100ml에 용해한 다음, 여과하여 불용성 입자를 제거한 다음, 75 내지 100g의 실리카겔과 접촉되도록 넣었다. 파클리탁셀로 코팅된 겔을 통기 또는 진공하에서 공기 건조하였다. 건조된 겔을 실리카겔(230~400메쉬) 2.2kg을 포함하는 컬럼(142X7.2cm 내부직경)의 상부에 장입하였다. 상기 겔을 세척하고 클로로메틸렌 및 이소프로판올의 혼합물(부피 당 97.5:2.5 부피)로 균형을 잡았다. 0 내지 30psi의 압력하에서 약 100ml/min의 유속으로 Dynamax® 용매 전달 시스템을 사용하여, 동일한 용매로 용리를 수행하였다. 용매 혼합물의 부피는 약 50L이며, 분획을 1L의 배치에서 수집하였다. HPLC 분석은 28 내지 48번째의, 20개의 분획이 있으며, 이는 파클리탁셀 약 0.1 내지 0.3mg/ml를 함유하며, 그 순도는 98% 내지 >99%이었다. 순도가 98% 이상인 순도를 갖는 파클리탁셀을 함유하는 분획을 제 3 및 최종 결정화를 위해 서로 합하였다.

제 3결정화

실시예 5 또는 실시예 6의 제 2크로마토그래피 정제 후에, 98% 이상의 파클리탁셀 순도를 갖는 분획을 합하고 증발 건조하였다. 잔류물을 아세톤에 용해하고, 아세톤의 부피를 조절하여 HPLC에 의해 1.0 내지 1.5 O.D.범위에서 최대 파클리탁셀 피크를 얻었다. 헥산 4부피를 아세톤 용액에 첨가하여 이후 시간 동안 결정화가 개시되었다. 혼합물을 2-8℃ 또는 상온에서 밤새 유지하여 결정화를 완료하였다.

백색 결정을 여과 또는 원심분리에 의해 회수하고 통기 또는 진공하에서 건조하였다. HPLC 분석된 결정의 순도는 다음과 같다:

실시예 5에서 얻어지는 경우 99.20 내지 99.50%; 및

실시예 6에서 얻어지는 경우 99.50 내지 99.90%.

상기 개시된 바와 같이, 제 2크로마토그래피 정제 후에 파클리탁셀을 함유하는 분획으로부터 얻어지는 잔류물은 에탄올, 에틸 아세테이트 또는 디에틸에테르에 용해될 수 있다. 이러한 용매의 부피는 이전에 사용된 아세톤보다 5배 적은 것이며, 이는 파클리탁셀 농도가 5배 이상(약 10mg/ml)임을 의미한다.

실시에 있어서:

헥산 1 내지 2부피를 에테르 용액에 첨가하고;

선택적으로,

3 내지 4부피의 헥산을 에탄올 또는 에틸아세테이트 용액에 첨가하여 이후의 시간동안 결정화를 시작하였다.

상기 혼합물을 2-8℃ 또는 상온에서 밤새 유지하여 결정화를 완료하였다. 결정화를 위해 아세톤을 사용하며 이러한 결정의 순도는 매우 유사하였다.

98% 보다 낮은 순도를 갖는 결정을 유지하고 상기된 제 2정제와 같이 동일한 조건으로 크로마토그래피하여 모두 재정제하였다. 이러한 재정제로 99% 이상의 순도를 갖는 이러한 결정의 전체 양의 약 75%를 얻었다.

결정을 최소 부피의 에탄올 또는 메탄올 또는 아세톤에 용해한 다음 순수를 함유하는 바이알에 다시 넣었다. 용매의 부피는 순수의 부피에 대하여 약 10 내지 15%였다. 파클리탁셀을 72시간동안 동결건조하고 100밀리토르의 압력하에서 분당 0.02℃로 -60℃에서 +20℃로 온도를 승온시켰다.

Claims (22)

1. a) 탁산의 천연원료로부터 얻어지는, 파클리탁셀을 함유하는 원료물질을 탈이온수 또는 순수로 세척하여 상기 원료물질의 가용성 불순물을 제거하는 단계;

   b) 상기 세척된 원료물질에서 파클리탁셀을 포함하는 습윤 원료물질을 유기 용매로 추출하는 단계;

   c) 상기 습윤 원료 물질을 염과 접촉시켜 침전에 의해 바이오매스를 얻고 상기 바이오매스를 분리 및 건조하는 단계;

   d) 아세톤 또는 아세톤-헥산 혼합물에 상기 바이오매스를 용해하여 상기 분리 및 건조된 바이오매스에서 송진 및 천연 색소를 제거한 다음 여기에 파클리탁셀-농축 오일상이 얻어질 때까지 적어도 하나의 극성 용매를 첨가하는 단계; 및

   e) 전단계에서 얻어진 파클리탁셀-농축 오일상을 휘발성 용매에서 적어도 1회 크로마토그래피 정제하여 정제 용액을 얻고 크로마토그래피에 의해 얻어진 정제 용액을 적어도 1회 결정화하는 단계

   를 포함하는, 추출하고자 하는 파클리탁셀을 함유하는 탁산의 천연 원료로부터 파클리탁셀의 추출 및 정제방법.
2. 제 1항에 있어서, 상기 파클리탁셀을 함유하는 탁산의 천연 원료는 Taxus brevifolia, Taxus baccata , Taxus canadensis , Taxus wallichiana , Taxus yunnanensis, Taxus densiformis , Taxus hicksii , Taxus wardii , Taxus cuspidata , Taxus capitata 또는 Taxus brownii 로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 침엽수로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1 또는 제 2항에 있어서, 상기 단계 (a)에서, 상기 원료물질은 상기 침엽수의 수피, 가지 및 침엽 또는 이들의 혼합물로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 1항 내지 제 3항에 있어서, 상기 단계 (b)에서, 상기 유기 용매는 알콜 또는 케톤 및 알콜 및 케톤의 혼합물로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 4항에 있어서, 상기 단계 (b)에서, 상기 유기 용매는 메탄올, 아세톤 또는 부피 비율의 범위가 9:1 내지 1:9인 메탄올 및 아세톤의 혼합물인 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 1 내지 제 5항 중 어느 한항에 있어서, 상기 단계 (c)에서, 침전에 의해 바이오 매스를 얻기 위해 사용되는 염은 소디움 클로라이드, 암모늄 클로라이드, 암모늄 술페이트, 소디움 아세테이트, 포타슘 아세테이트 및 이들의 혼합물로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제 6항에 있어서, 상기 단계 (c)에서, 상기 염은 소디움 클로라이드이며; 상기 단계(b)에서 추출된 습윤 원료물질 리터 당 10 내지 100 그램의 농도로 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제 6항 또는 제 7항에 있어서, 상기 단계 (c)에서, 상기 침전된 바이오매스는 여과 또는 원심분리에 의해 분리된 다음 바로 공기 또는 동결건조에 적용되는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한항에 있어서, 상기 단계 (d)에서, 상기 단계 (c)에서 얻어지는 건조된 바이오매스를 아세톤 그 다음 물을 첨가하여 용해하고, 상기 물은 첨가되는 아세톤 100부피 당 2 내지 10부피의 비율로 첨가되며, 이 때, 상기 단계 (d)에서, 상기 적어도 하나의 비-극성 용매는 헥산 및 펜탄으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 방법.
10. 제 1 내지 제 9항 중 어느 한항에 있어서, 상기 단계 (e)는 다음의 부-단계:

    e.1) 단계 (d)에서 얻어진 파클리탁셀-농축 오일상과 실리카겔의 혼합물을 준비하고, 실리카겔을 포함하는 크로마토그래피 컬럼에서 상기 혼합물을 용리 용매로 처리하여 제 1파클리탁셀-농축 분획을 얻는 단계;

    e.2) 잔류물이 얻어질 때까지 상기 제 1파클리탁셀-농축 분획을 증발 건조하고, 상기 잔류물을 아세톤에 용해하여 혼합물을 제조하고 비극성 용매로 상기 혼합물에 함유된 파클리탁셀을 결정화하거나 또는 수용가능한 파클리탁셀의 농도가 얻어질 때까지 상기 제 1파클리탁셀-농축 분획을 증발시키고 상기 혼합물에 함유된 파클리탁셀을 비-극성 용매로 결정화하는 단계;

    e.3) 상기 부 단계 (e.2)에서 얻어진 파클리탁셀 결정을 아세톤에 용해하고 비극성 용매로 상기 파클리탁셀을 재결정하는 단계;

    e.4) 상기 부단계 (e.3)에서 얻어진 결정을 휘발성 용매에 용해하여 용액을 얻고, 상기 용액과 실리카겔의 혼합물을 제조하고 상기 혼합물을 실리카겔을 포함하는 크로마토그래피 컬럼에서 용리용매로 처리하여 용리용매와 함께 제 2파클리탁셀-농출 분획을 얻는 단계; 및

    e.5) 잔류물이 얻어질 때까지 상기 부단계 (e.4)에서 얻어진 상기 제 2파클리탁셀-농축 분획을 증발 건조하고, 세톤, 알콜, 에테르, 에틸 아세테이트 또는 이들의 혼합물에 잔류물을 용해하고 비극성 용매로 파클리탁셀을 결정화하는 단계

    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제 10항에 있어서,

    상기 단계 (e.1)에서, 상기 단계 (d)에서 얻어진 파클리탁셀-농축 오일상을 실리카겔과 혼합하고 공기 건조하고; 상기 실리카겔을 회수하고, 또한 실리카겔을 포함하는 크로마토그래피에 장입하고; 그 다음, 상기 파클리탁셀을 아세톤 30 내지 40% 및 헥산 60 내지 70%를 함유하는 용리 혼합물로 정제하고;

    상기 단계 (e.3)에서, 상기 단계 (e.2)에서 얻어지는 결정을 여과나 원심분리로 분리하고, 아세톤에 용해하여 용액을 형성하고, 아세톤의 부피를 조절하여 HPLC 분석에 해당하는 피크의 경우에 1.0 내지 1.5 O.D.(광학밀도)의 값을 갖는 상기 용액의 흡광도를 얻은 다음, 상기 파클리탁셀은 상기 용액에 3 내지 4 부피의 헥산을 첨가하여 재결정하는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제 10항 또는 제 11항에 있어서, 상기 단계 (e.2)에서, 상기 단계 (e.1)에서 크로마토그래피에 의해 얻어진 파클리탁셀을 함유하는 농축 분획을 함께 모으고, 증발 건조하고 아세톤에 용해하여 용액을 형성하고, 아세톤의 양을 조절하여, HPLC 분석에 해당하는 피크의 경우에 1.0 내지 1.5 O.D.(광학밀도)의 값을 갖는 상기 용액의 흡광도를 얻고; 그 다음 상기 파클리탁셀은 상기 용액에 3 내지 4부피의 헥산을 첨가하여 결정화시킴을 특징으로 하는 방법.
13. 제 10항 또는 제 11항에 있어서,

    상기 단계 (e.2)에서: 상기 단계 (e.1)에서 크로마토그래피에 의해 얻어진 파클리탁셀을 함유하는 농축 분획을 함께 모으고 HPLC 분석에 해당하는 피크의 경우에 1.0 내지 1.5 O.D.(광학밀도)의 값을 갖는 상기 농축 분획의 흡광도를 얻을 때까지 증발시키고; 그 다음, 상기 파클리탁셀은 상기 농축 용액에 헥산 1.5 내지 2부피를 첨가하여 결정화시킴을 특징으로 하는 방법.
14. 제 10항 내지 13항 중 어느 한항에 있어서,

    상기 단계 (e.4)에서, 상기 단계 (e.3)에서 얻어진 결정을 여과 또는 원심분리하고, 아세톤에 용해하여 용액을 형성하고; 그 다음, 상기 용액을 실리카겔과 혼합하고, 통기하에서 건조하고; 상기 파클리탁셀로 덮혀진 실리카겔을 또한 실리카겔을 포함하는 크로마토그래피 컬럼에 장입하고; 그 다음, 상기 파클리탁셀을 아세톤 30 내지 40% 및 헥산 60 내지 70%를 포함하는 유기-용매계 용리 혼합물로 재정제하는 것을 특징으로 하는 방법.
15. 제 10항 내지 13항 중 어느 한항에 있어서,

    상기 단계 (e.4)에서, 상기 단계 (e.3)에서 얻어진 결정을 여과 또는 원심분리하고, 아세톤에 용해하여 용액을 형성하고; 그 다음, 상기 용액을 실리카겔과 혼합하고, 통기하에서 건조하고; 상기 파클리탁셀로 덮혀진 실리카겔을 또한 실리카겔을 포함하는 크로마토그래피 컬럼에 장입하고; 그 다음, 상기 파클리탁셀을 메틸렌클로라이드 95 내지 98% 및 이소프로탄올 2 내지 5%를 포함하는 유기-용매계 용리 혼합물로 재정제하는 것을 특징으로 하는 방법.
16. 제 10항 내지 15항 중 어느 한항에 있어서,

    상기 단계 (e.5)에서: 상기 단계 (e.4)에서 크로마토그래피에 의해 얻어진 파클리탁셀 함유 농축 분획을 그 순도에 따라 합하고, 증발 건조한 다음 아세톤에 용해하여 용액을 형성하고, 아세톤의 양을 조절하여 HPLC 분석에 해당하는 피크의 경우에 1.0 내지 1.5 O.D.(광학밀도)의 값을 갖는 상기 용액의 흡광도를 얻고; 그 다음, 상기 파클리탁셀은 상기 용액에 헥산 3 내지 4부피를 첨가하여 결정화시킴을 특징으로 하는 방법.
17. 제 10항 내지 15항 중 어느 한항에 있어서,

    상기 단계 (e.5)에서: 상기 단계 (e.4)에서 크로마토그래피에 의해 얻어진 파클리탁셀 함유 농축 분획을 함께 모으고 HPLC 분석에 해당하는 피크의 경우에 1.0 내지 1.5 O.D.(광학밀도)의 값을 갖는 상기 농축 분획의 흡광도를 얻을 때까지 증발시키고; 그 다음, 상기 파클리탁셀은 상기 농축 용액에 헥산 1.5 내지 2부피를 첨가하여 결정화시킴을 특징으로 하는 방법.
18. 제 10항 내지 제 15항 중 어느 한항에 있어서,

    상기 단계 (e.5)에서: 상기 단계 (e.4)에서 크로마토그래피에 의해 얻어진 파클리탁셀 함유 농축 분획을 그 순도에 따라 합하고, 증발 건조한 다음 에탄올에 용해하여 용액을 형성하고, 에탄올의 양을 조절하여 HPLC 분석에 따른 용액의 약 5 내지 10ml/mg를 파클리탁셀의 농도로 얻고; 그 다음, 상기 파클리탁셀을 상기 용액에 헥산 3 내지 4부피를 첨가하여 결정화함을 특징으로 하는 방법.
19. 제 10항 내지 제 15항 중 어느 한항에 있어서,

    상기 단계 (e.5)에서: 상기 단계 (e.4)에서 크로마토그래피에 의해 얻어진 파클리탁셀을 함유하는 농축 분획을 그 순도에 따라 합하고, 증발 건조한 다음 에틸아세테이트에 용해하여 용액을 형성하고, 에틸아세테이트의 양을 조절하여 HPLC 분석에 따른 용액의 약 5 내지 10ml/mg를 파클리탁셀의 농도로 얻고; 그 다음, 상기 파클리탁셀은 상기 용액에 헥산 3 내지 4부피를 첨가하여 결정화시킴을 특징으로 하는 방법.
20. 제 10항 내지 제 15항 중 어느 한항에 있어서,

    상기 단계 (e.5)에서: 상기 단계 (e.4)에서 크로마토그래피에 의해 얻어진 파클리탁셀을 함유하는 농축 분획을 그 순도에 따라 합하고, 증발 건조한 다음 디에틸에테르에 용해하여 용액을 형성하고, 디에틸에테르의 양을 조절하여 HPLC 분석에 따른 용액의 약 5 내지 10ml/mg를 파클리탁셀의 농도로 얻고; 그 다음, 상기 파클리탁셀은 상기 용액에 헥산 1 내지 2부피를 첨가하여 결정화시킴을 특징으로 하는 방법.
21. 제 10항 내지 제 20항 중 어느 한항에 있어서,

    상기 단계 (e.3)에서, 상기 휘발성 용매는 아세톤, C1-C3 경 알콜, 에틸 아세테이트, 디에틸 에테르, 메틸렌 클로라이드 및 이들의 혼합물로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
22. 제 10항 내지 제 21항 중 어느 한항에 있어서,

    단계 (e.1)에서 파클리탁셀의 분리 전에 용리된 분획 및 단계 (e.2) 및 (e.3)에서 결정화후 얻어지는 혼합물로부터 9-디하이드로-13-아세틸바카틴 Ⅲ의 결정을 메탄올로 추출하는 단계; 및

    이와 같이 추출된 결정을 아세톤-헥산 혼합물로 재결정하는 단계

    를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.