KR20020031345A

KR20020031345A - 천연 원료로부터의 파크리택셀의 추출 및 정제 방법

Info

Publication number: KR20020031345A
Application number: KR1020017016516A
Authority: KR
Inventors: 부이크핵트렁; 듀푸이스니콜라스
Original assignee: 챠이쳄 파마슈티컬즈 인터내셔널
Priority date: 1999-06-22
Filing date: 2000-05-25
Publication date: 2002-05-01
Also published as: EP1194423A2; JP4563632B2; ES2191628T3; CN1148364C; WO2000078741A2; ATE230736T1; KR100706983B1; JP2003502414A; DE60001173T2; EP1194423B1; CA2299149A1; WO2000078741A3; HK1047285A1; DK1194423T3; AU5377100A; CN1356992A; CA2299149C; DE60001173D1

Abstract

택산류의 천연 원료로부터 파크리택셀을 추출하고 정제하는 방법이 제공된다.

본 방법은 하기의 단계로 구성되어 있다 :

a) 상기 택산의 천연원료(natural sources)로부터 파크리택셀을 함유한 원료를 유기용매로 추출하는 단계;

b) 상기 원료를 염기 또는 산으로 처리하여 침전에 의해 생물량을 얻고, 상기 생물량을 단리시켜 건조하는 단계;

c) 상기 단리된 생물량을 퍼칼라라이징(percolorizing)하여 그 안에 함유된 수지 및 천연 색소를 제거하는 단계로서, 아세톤 내에 상기 생물량을 용해시키고 이어서 여기에 1 이상의 비극성 용매를 첨가하여 파크리택셀- 농축 오일상(Paclitaxel-enriched oily phase)을 얻는 단계;

d) 전 단계에서 수득된 파크리택셀-농축 오일상 내에 들어있는 생물량을 염기 또는 산으로 처리하여 침전에 의해 또 다른 생물량을 수득하고, 상기 또 다른 생물량을 단리하여 건조하는 단계

e) 전단계에서 수득된, 단리된 또 다른 생물량의 휘발성 용매 내에서 용액을 1회 이상 크로마토그래피로 정제하고, 크로마토그래피에 의해 얻어진 정제 용액을 1회 이상 결정화하는 단계

본 방법은 제한된 수의 단계로 이루어져 있으며, 여과 및 건조 후, 다음의 조성을 가지는 파크리택셀 결정의 혼합물을 얻는다: 99% 이상의 순도를 가지는 결정 약 53%, 98% 이상의 순도를 가지는 결정 약 22%, 및 92% 이상의 순도를 가지는 결정 약 23%.

Description

천연 원료로부터의 파크리택셀의 추출 및 정제 방법{Process For Extraction And Purification Of Paclitaxel From Natural Sources}

Taxol(상품명) 또는 Pacitaxeline(상품명)으로도 불리는 파크리택셀에 관한 최초의 연구는 1960년대 미국에서 시작되었는데, 당시 National Cancel Institute는 악성 종양에 대한 활성 및 항종양(anti-neoplastic) 활성을 가지는 식물 추출물을 골라내기 위한 계획을 시작하였다.

1960년부터 1981년에 걸쳐 3만 5천종의 식물로부터 11만 이상의 합성물이 추출되었고 단리 및 시험되었다(Blume E.J. Natl. Cancer Inst. 1991; 83; 1054∼1056).

주목(朱木 : yew)도 선택 및 시험된 식물 중 일부로서, Wani 등은 미국 서부 해안(오레곤: Oregon)에서 온 주목의 나무껍질(Taxus brevifolia Nutt)로부터 최초 추출물을 얻었다 (Wani 등, J. Am. Chem. Soc., 1971; 93; 2325∼2327).상기 나무껍질의 조추출물(crude extract)은 백혈병 세포에 대한 세포독성(cytotoxic) 활성 및 갖가지 종양에 대한 억제 작용을 나타내었다.

2∼3년 후, 상기 추출물로부터 활성 화합물이 단리되었는 바, 상기 활성 화합물은 파크리택셀로 명명되었고 그 분자구조가 X-선 결정학 및 1H-NMR 스펙트럼에 의해 측정되었다 (Wani 등, J. Am. Chem. Soc., 1971; 93; 2325∼2327)

그 후, 악성 종양에 대한 파크리택셀의 효과에 관해 시험관 내(in-vitro) 및 생체 내(in-vivo) 연구가 행해졌으며, 얻어진 긍정적 결과는 상기 활성 화합물을 난소암 및 유방암의 치료를 위해 가능성 있는 약의 하나로서 분류시키게 하였다. 한편, 각종 암 치료를 위한 파크리택셀의 사용이 1992년 이후 FDA에 의해 승인되어 왔다.

파크리택셀을 생산하기 위해 사용된 주목류의 최초 품종은Taxus brevifolia이나, 지구상의 각기 다른 지역에서 발견된 다른 품종 또한 시험되었는 바, 상기 품종들은Taxus baccata, Taxus canadensis, Taxus wallichiana, Taxus yunnanensis, Taxus densiformis, Taxus hicksii, Taxus wardii, Taxus cuspidata, Taxus capitata, Taxus brownii로 이루어져 있다 (Miiller 등, J. Org. Chem. 1981; 46; 1469; McLaughlin 등, J. Nat. Prod. 1981; 44; 321; Kingston 등, J. Nat. Prod. 1982; 45; 466; Senilh 등, J. Nat. Prod. 1984; 47; 131∼137; Huang 등, J. Nat. Prod. 1986; 49; 665∼669; Fett-Neto 등, Bio/Technology 1992; 10; 1572∼1575).

상기 모든 주목류는 파크리택셀을 함유하고 있으나, 그 양은 약0.0004∼0.008 ％ 정도의 극히 제한된 양이다 (Kingston, Pharmacol. Ther. 1991; 52; 1∼34). 이처럼 파크리택셀의 낮은 농도로 인해 그 추출 및 정제는 매우 고비용이 되었는데, 이는 상기 절차가 시간이 오래 걸리고 일반적으로 반복된 크로마토그래피를 요구하기 때문이다.

모든 주목류 내에서의 파크리택셀의 낮은 농도는 환경에도 크나큰 영향을 미친다. Taxus brevifolia 로부터 1 kg의 파크리택셀을 추출하기 위해서는 약 3000 그루의 성장된 나무를 베어 10,000kg 의 나무껍질을 얻어야 한다. 파크리택셀의 수득된 양(1kg)은 약 500 명의 환자를 치료하는 것을 허용하지만, 암으로 고통받고 있는 환자의 수는 그보다 무수히 높다. 주목류의 느린 성장때문에 나무의 재식목(replanting)도 인간의 필요를 위한 파크리택셀의 긴급한 수요를 만족시킬 수 없다 (Vidensek 등, J. Nat. Prod. 1990; 53; 1609∼1610; Kelsey 등, J. Nat. Prod. 1992; 55; 912∼917; Wheeler 등, J. Nat. Prod. 1992; 55; 432∼440).

파크리택셀의 추출 및 정제를 위해 수많은 방법이 제안되어 왔다.

예를 들어 Wani 등(Wani 등, J. Am. Chem. Soc., 1971; 93; 2325∼2327)은 미국 서부해안의 주목(Taxus brevifolia)의 껍질로부터 파크리택셀의 추출방법을 제안하였는데, 상기 방법은 나무껍질에 대한 알콜 처리 및 이어지는 여러 단계의 크로마토그래피 정제를 포함한다.

Miller 등(1981)은 하기의 방법에 의해 Taxus wallichiana Zucc로부터 파크리택셀을 추출하였다 :

1) 식물로부터 추출 및 상기 추출물의 농축 ;

2) 물과 헥산의 분별에 의한 지방분 제거 ;

3) 클로로포름을 이용한 추출 및 농축 ;

4) 제 1 실리카 칼럼 내에서의 크로마토그래피에 의한 첫 번째 정제;

5) 제 2 실리카 칼럼 내에서의 크로마토그래피에 의한 두 번째 정제;

6) 제 1 역류 분배 ;

7) 제 2 역류 분배 ;

8) 예비 HPLC 크로마토그래피;

Senilh 등(1984)은Taxus baccata나무껍질로부터 하기 방법에 의해 파크리택셀( 또는 상품명 Taxol A: 0.0165 %), 세파로마닌 (또는 상품명 Taxol B : 0.0064%) 및 기타 화합물들을 단리하였다 :

1) 알콜에 의한 추출 및 농축 ;

2) 물과 디클로로메탄의 분별 ;

3) 여과 크로마토그래피 ;

4) 실리카 칼럼내에서의 크로마토그래피 ;

5) 알루미나 크로마토그래피 ;

6) 중간 압력 실리카 칼럼내에서의 크로마토그래피 ;

7) HPLC 크로마토그래피

다른 유사물을 위해서는, 예비 HPLC 크로마토그래피 전에 2 또는 3회의 또다른 칼럼 크로마토그래피 처리가 필요하다.

Polyscience Inc. 에 의한 또 다른 방법은 하기의 단계를 포함한다 :

1) 건조된 나무껍질(ground bark)을 메탄올 또는 에탄올로 처리한 후, 얻어진 추출물을 농축하여 알콜을 제거하고 ;

2) 이어서 농축물을 디클로로메탄으로 처리하고 얻어진 용매 추출물을 농축하여, 분말상을 얻고 ;

3) 분말을 아세톤과 리그로인(ligroin)의 1:1 혼합액에 녹여 여과시켜 불용성 물질을 제거하고 ;

4) 파크리택셀을 함유한 유기층을 농축한 후, 30%의 리그로인에 녹여 Florisil(상품명)의 칼럼에 투입하고 ;

5) 칼럼으로부터의 파크리택셀 분획을 이중 결정화에 의해 정제하고 ;

6) 얻어진 결정성 파크리택셀을 실리카 칼럼 상 크로마토그래피에 투입한다. 파크리택셀은 이 단계에서 다른 택산류 (관련 유사 화합물, 세파로마닌 등)와 분리된다 ;

7) 전단계에서 얻어진 정제된 파크리택셀을 2회 결정화하고 ;

8) 분리되지 않은 혼합물 및 모액을 실리카 칼럼을 통해 재순환시켜 여분의 양의 순수 파크리택셀을 수득한다.

물론, 하기의 참조에서 설명되는 바와 같이 천연원료로부터 파크리택셀을 정제하기 위한 다른 방법들도 있다 :

Taxus brevifolia으로부터 얻은 새로운 택산들을 개시한 Kingston 등(J. Nat. Prod. 1982; 45; 466∼470) ; 및,

Taxus brevifolia로부터 파크리택셀 및 관련 화합물을 분리하는 방법을 개시한 Witherup 등(J. Org. Chrom. 1989; 12; 2117∼2132).

1994년 Nair에게 부여된 미국 특허 5, 279, 949는 파크리택셀의 정제를 위해 장식용 주목(Taxus X media Hicksii)로부터의 조직을 사용하는 것을 개시하고 있다. 상기 특허에서는 :

1) 갓 따낸 침엽을 70%의 알콜로 추출하고 ;

2) 상기 추출물을 목탄으로 탈색하여 여과하고 ;

3) 여과된 추출물을 농축시켜 유기 용매 대부분을 제거하고 ;

4) 액체 농축물을 원심분리하여 파크리택셀을 함유하는 고체를 분리해내고;

5) 고체를 제 1 정상(normal phase) 실리카 크로마토그래피에 투입하고 ;

6) 얻어진 조(粗)파크리택셀 분획을 제 2 저압 실리카 크로마토그래피에 투입하고 ; 이어서

7) 역상 칼럼 내에서 최종 정제를 행한다.

Pandey 등에게 부여된 미국 특허 5, 654, 448는Taxus brevifolia의 나무껍질로부터 파크리택셀의 추출 및 정제의 한 방법을 개시하고 있다. 이 방법에서는 :

1) 나무껍질을 메탄올로 3회 처리함에 있어, 각각의 추출을 5일간에 걸쳐수행하고, 이어서 얻어진 추출물을 농축하고 ;

2) 상기 메탄올 농축액을 분별하여 메틸렌 클로라이드와 물을 얻고 메틸렌 클로라이드 추출물을 증발시켜 건조하면, 약 1.8∼2.2% w/w의 양에 달하는 파크리택셀을 함유한 고체 잔여물을 얻고 ;

3) 고체 잔여물을 아세톤에 녹여 1부피의 헥산과 혼합하여 극성 불순물을 제거하고, 혼합물을 1/3의 부피까지 증발시키고 ;

4) 아세톤/헥산의 잔여물을 헥산에 한 방울씩 첨가하여(1.5ℓ∼3.0ℓ 의 잔여물 당 10∼15ℓ의 헥산)침전물을 얻어, 이를 여과하고, 40℃ 온도의 고진공(1㎜ 내지 2㎜)하에서 건조하여 약 0.5∼0.6 kg의 고체 잔여물을 수득한다 ;

5) 전 단계에서 얻어진 고체 잔여물을 0.5ℓ의 아세톤메틸렌클로라이드에 녹여 1:9 v/v 혼합물을 형성하고, 실리카 칼럼 크로마토그래피에 투입시킨다; 세파로마닌이 파크리택셀과 함께 용출되어 나온다; 파크리텍셀과 세파로마닌을 함유한 분획을 합쳐서 회전 증발시켜 건조하면, 고체 잔여물은 파크리텍셀과 세파로마닌의 조(粗) 혼합물로서 상기 혼합물은 36 내지 40 g의 파크리택셀(45∼55%)을 함유한다.

6) 전 단계에서 얻어진 조혼합물(10g)을 브롬화에 의해 화학적으로 개질하여 세파로마닌으로부터 파크리택셀을 분리한다; 브롬화 반응 후에 얻어진 고체 잔여물은 13.2g의 무게를 가진다 ;

7) 브롬화된 잔여물은 아세톤/메틸렌클로라이드(1:9v/v)에 용해시켜 실리카 칼럼을 통해 크로마토그래피에 의해 분리하고, 파크리택셀을 함유한 분획을 함께모아 증발 건조한다 ; 그리고

8) 전 단계에서 수득된 고체 잔여물을 아세톤에 녹여 동일 부피의 n-헥산 또는 다른 헥산으로 결정화한 후, 결정을 찬 아세톤/헥산 1/1 v/v 용액에 세정한 후 여과하고 40℃의 진공하에 건조시키는 바, 수득된 고체 결정은 4.84 g이고 HPLC 크로마토그래피에 의해 측정하였을 때 97% w/w 이상의 파크리택셀을 함유한다.

Rao에게 부여된 미국특허 No. 5, 475, 120 및 5, 670, 673은 파크리택셀의 단리방법을 개시하고 있다. 상기 방법에서는 ;

1) 나무껍질, 침엽, 목질부, 뿌리 또는 이들의 조합을 알콜로 처리하고 얻어진 추출물을 압력하에 (＜ 35∼40℃) 농축하여 대부분의 알콜을 제거한다 ;

2) 농축물을 클로로포름(또는 디클로로메탄, 디클로로에탄 또는 트리클로로에탄)으로 분배하고, 클로로포름 추출물을 감압 하에 농축하여 진한 시럽을 형성한 후, 상기 시럽을 유리접시들에 부어 진공 오븐에서 건조하면, 나무껍질 또는 목질부가 사용된 경우에는 파우더를 형성하고, 침엽이 사용된 경우 바늘모양의 결정을 형성한다(100kg의 목질부 또는 나무껍질로부터 추출물 수득은 1.5∼2.5kg이고, 100kg의 침엽으로부터 생성추출물은 2.4∼4.8kg이다) ;

3) 클로로포름 고체 추출물(2∼2.5kg)을 아세토니트릴(5ℓ)에 용해시켜 물(5ℓ)을 첨가한다; 이어서 혼합물을 실리카겔(2∼3ℓ의 슬러리)로 평형화시킨다; 혼합물을 휘저으면서 점차로 더 많은 물(15ℓ)을 첨가한다; 맑은 용액을 시폰으로 제거하고(siphoned off), 이제 시료로 함침된 실리카겔의 걸쭉한 슬러리를 스테인레스 강 칼럼의 최상부으로 옮긴다; 파크리택셀 및 여러 중요한 파크리택셀 유사물을 함유한 분획을 hood에 따로 위치시키고 서서히 용매 증발을 수행한다; 1 내지 2일 후 결정이 형성되며, 과정은 8 내지 10일 동안 계속되게 한다; 이어서,

4) 5% 미만의 세파로마닌을 가진 수득된 조(粗)결정을 아세톤/리그로인 혼합물을 가지고 목탄을 사용하여 2회 결정화하면, 41g의 순수 파크리택셀, 즉 0.04%의 수율이 얻어지는데, 이는 100kg의 나무껍질을 사용한 수율이다; 대안으로서, 조결정을 실리카 또는 Florisil(상품명)의 쇼트 칼럼을 통해 클로로포름내에서의 용액을 통과시켜 탈색한다.

세파로마닌 오염물을 제거하기 위한 또다른 대안적 방법은 오존을 사용하는 것으로 이루어져 있다. 클로로포름 내의 1∼2 %의 메탄올 혼합물을 가지고 칼럼을 세척하면, 농축 및 결정화에 의해 회수될 수 있는 파크리택셀 벌크를 얻는다. 상기 수율은 거의 전과 같은 40g이다. HPLC 크로마토그래피 분석에 의하면 이렇게 얻어진 파크리택셀은 약 0.3% 미만의 세파로마닌을 함유한다.

Liu에게 부여된 미국 특허 no. 5, 969, 165는 공업적 예비 저압 크로마토그래피에 의해Taxus canadensis로부터 파크리택셀 및 다른 관련 화합물을 단리하고 정제하는 방법에 대해 개시하고 있다.

상기 방법에서는Taxus canadensis의 침엽 및 가지(200kg)는 1000L의 메탄올로 60℃에서 5시간 동안 추출된 후 여과된다. 원료를 700L의 메탄올로 55∼60℃에서 다시 4시간 동안 추출한 후 여과한다. 여과물을 합쳐서 10kg의 활성 탄소(5% w/w)와 혼합한다. 활성탄소를 여과에 의해 제거한다. 이어서 여과액을 대략 100L까지 농축시킨다. 이어서 물 및 디클로로메탄(1:1) 300L를 첨가한다. 유기층을 모으고, 수용액 층을 2회이상 200L의 디클로로메탄으로 추출한다. 디클로로메탄 용액은 합쳐서 증발시켜 슬러리를 형성시킨 후, 20 L의 아세톤으로 희석한다.

아세톤 용액을 20kg의 Celite(상표명) 545위에 코팅하여 건조시키고 이어서 세 개의 공업용 저압 크로마토그래피 칼럼(150times, 15cm)의 최상부에 올려놓는다. 각각의 칼럼은 15 kg의 알루미늄 산화물(aluminium oxide) 흡수제로 팩킹한다. 칼럼은 헥산과 아세톤의 혼합물로 이루어진 용매계로 10 내지 15 psi 의 압력하에서 약 150ml/min의 유출 속도로 용출시킨다.

택산들을 함유한 분획을 모아서 합하고, 이어서 농축시켜 다른 모든 용매를 제거한다. 결과물을 메탄올에 녹여 실온에서 하룻밤 방치하면 바늘 모양의 결정을 얻는다. 상기 결정을 여과시키고, 아세톤으로부터 재결정화하여 13-아세틸-9-디하이드로바카틴(dihydrobaccatin)Ⅲ으로 밝혀진 바늘모양의 결정을 얻는다.

여과액을 농축 건조한다. 잔여물은 3L의 아세톤에 용해시킨다. 아세톤 용액을 1.5kg 의 폴리스티렌-디비닐벤젠과 함께 혼합한다. 용매를 증발 제거하고 수득된 파우더를 폴리스티렌-디비닐벤젠으로 팩킹한 공업용 저압 크로마토그래피 칼럼의 최상에 위치시키고, 30psi 보다 낮은 작동 압력 하에서 150 ml/min의 유출속도로 수중의 아세톤 45%로 용출시킨다.

파크리택셀 및 세파로마닌을 함유한 분획을 모아서 대부분의 아세톤을 증발·건조시키고, 탈이온수로 희석하여 2.5 L의 디클로로메탄으로 3회 추출한다. 유기층은 농축·건조하고 잔여물은 1L의 메탄올에 녹인다.

대략 30%(v/v)의 물을 상기 메탄올 용액에 첨가하고 혼합물을 수분 동안 60℃까지 가온한 후, 실온에서 하룻밤 방치한다. 상기 메탄올 용액으로부터의 조(粗)결정성 고체를 여과·회수하고, 진공오븐 내에서 70∼75℃에서 건조한다. 고체는 대략 70%의 파크리택셀과 25%의 세파로마닌으로 이루어져 있으며, 수율은 Taxus canadensis의 침엽과 가지 200kg 당 31g이 된다.

조(粗)파크리택셀은 200ml의 아세토니트릴에 용해시켜 250ml의 탈이온수로 희석하고 크로마토그래피 칼럼에 건다. 크로마토그래피 칼럼은 고분자 수지( 상표명이 Diaion인, 거대 다공성(macroporous) 폴리메타크릴레이트 수지)로 팩킹되어 있다. 칼럼은 수중 아세토니트릴의 비율을 35, 40, 45 및 50% 로 하여 차례로 용출된다.

파크리택셀 또는 세파로마닌을 함유한 수득 분획들을 별도로 합하고, 결정화될 때까지 5℃에서 방치한다. 이어서 파크리택셀 및 세파로마닌 결정을 각각 여과하고 이 둘을 메탄올과 물의 혼합물로 65℃에서 재결정화한다.

파크리택셀은 18.5 g(0.009%) 의 수율로 순도 99% 이상인 흰색의 침상결정으로서 얻어진다. 세파로마닌은 6.5 g(0.003%) 의 수율로 순도 98% 이상으로 얻어진다.

따라서, 출원인에게 공지된 선행 기술분야에서 개시된 바와 같이, 파크리택섹의 정제를 위해 공지된 방법에 관해 전반적으로 살펴보면, 고순도의 파크리택셀을 얻기 위해서는 크로마토그래피에 의한 분리 및 결정화에 의한 정제의 수많은 단계를 수행하여야만 하는 것을 알 수 있다. 상기 문제점은, 특히 여러 다른 종류의Taxus 내의 파크리택셀의 낮은 농도로 인해 매우 고비용을 초래하게 된다. 나아가, 크로마토그래피 칼럼의 크기가 작고, 정제 후 수득된 파크리택셀의 수율이 낮아 정제 가능한 생물량(biomass)의 양은 매우 제한적이다.

본 발명은 천연원료로부터 파크리택셀(Paclitaxel)을 쉽고 빠르게 추출 및 정제하는 방법에 관한 것이다. 당해 기술분야에서 공지된 선행 방법과 비교하여, 본 방법은 제한된 공정 단계 수 및 정제 중 소실량의 감소로 인해 특히 경제적이다.

도 1a, 1b 및 1c 는 본 발명에 따른 방법을 도시한 흐름도이다.

본 발명의 첫 번째 목적은 하기를 허용하는 방법을 제공하는 것이다:

여러 종류의 Taxus의 나무껍질, 침엽 및/또는 가지의 추출 후 생물량의 획득을 보다 쉽게 하고 ;

수득되어 크로마토그래피에 의해 정제되어야 할 생물량의 양을 늘이고 ;

정제 단계를 줄이고 ;

수득된 파크리택셀의 양을 늘이고 ; 최종적으로

보다 경제적인 수준으로 생산가를 낮추는 것.

본 발명의 또 다른 목적은 고순도를 가지는 파크리택셀 결정의 혼합물을 제공하는 것이다.

본 발명에 따르면, 전술한 첫 번째 목적은 추출될 파크리택셀을 함유한 천연 원료로부터 파크리택셀을 추출 및 정제하는 방법으로서 하기의 단계를 포함하는 방법에 의해 달성된다 ;

a) 전술한 택산의 천연원료로부터 파크리택셀을 함유한 원료를 유기용매로 추출하는 단계;

c) 상기 단리된 생물량을 퍼칼라라이징하여 그 안에 함유된 수지 및 천연 색소를 제거하는 단계로서, 아세톤 내에 상기 생물량을 용해시키고 이어서 여기에 1 이상의 비극성 용매를 첨가하여 파크리택셀-농축 오일상(Paclitaxel-enriched oily phase)을 얻는 단계;

본 발명에 따르면, 상기 방법에 의해 얻어진, 결정의 여과 및 건조 후의 파크리택셀 결정 혼합물은 하기와 같이 구성되어 있어 전술한 두 번째 목적이 달성된다 ;

99% 이상의 순도를 가지는 결정 약 53%

98% 이상의 순도를 가지는 결정 약 22%, 및

92% 이상의 순도를 가지는 결정 약 23%.

하기의 제한적이지 않은 상세 서술을 읽으면, 본 발명, 그 장점 및 그 가능한 실행 방법이 더 잘 이해될 수 있다.

본 발명의 범위 내 및 하기의 설명 중에서, "퍼칼라라이즈(percolorize)"는 "용액과 혼화성이거나 비혼화성일 수 있는 비극성 용매를 첨가하여 용액으로부터 수지 및 색소를 제거하는 것"을 의미한다.

전술한 바와 같이 본 발명에 따른 방법은 추출될 파크리택셀을 함유한 택산 류의 천연 원료로부터 파크리택셀을 추출하고 정제하는 데에 사용하고자 하는 것이다.

1단계 - 추출

본 방법의 첫 번째 단계는 유기 용매 혼합물을 사용하여 택산류의 천연원료로부터 파크리택셀 및 그 유사물을 함유한 원료를 추출해내는 단계로 이루어져 있다.

본 발명에 따른 방법을 수행하기 위해 출발물질로 사용된 택산류의 천연원료는 Taxus 형이다. 보다 특별히, 상기는 파크리택셀을 함유한 모든 종류의 침엽수로 이루어져 있다. 파크리택셀을 함유한 이러한 침엽수 종은Taxus brevifolia, Taxus baccata, Taxus canadensis, Taxus wallichiana, Taxus yunnanensis, Taxus densiformis, Taxus hicksii, Taxus wardii, Taxus cuspidata, Taxus capitata또는Taxus brownii로 이루어질 수 있다.

본 발명에 따른 방법은 파크리택셀을 함유한 택산류의 천연원료 중 어느 부분도 사용 가능하다는 장점을 가지고 있다. 바람직하게는 선택된 침엽수(들)의 나무껍질로부터 추출을 행한다. 대안으로서, 선택된 침엽수들의 가지 및 침엽을 동시에 사용하여 추출을 행할 수 있다.

바람직하게는, 얻어진 추출물을 여과하여 침전물을 제거하고, 온수(바람직하게는 65∼70℃의 온도)가 공급되는 이중벽 탱크내에서 따뤄낸다. 상기 탱크로부터 용매를 증류 하여 매우 진한 액체를 얻는다. 이어서 상기 추출물을 회수하고 메탄올에 용해시킨다.

추출 단계에 있어, 바람직하게는 알콜, 할로겐화 탄화수소 및 할로겐화 알콜 및 탄화수소의 혼합물로 이루어진 군으로부터, 사용될 유기 용매를 선택한다. 이러한 용매의 예로써, 메탄올, 디클로로메탄, 트리클로로메탄 및 메탄올과 디클로로메탄 또는 트리클로로메탄의 혼합물을 언급할 수 있다.

할로겐화 탄화수소 및 알콜의 혼합물을 사용하는 경우, 알콜 및 할로겐화 탄화수소는 바람직하게는 9:1 내지 1:9 를 포함하는 부피비로 존재한다. 보다 바람직하게는 혼합물의 부피비는 약 1:1 이다.

2단계 - 제 1 침전

본 방법의 두 번째 단계는 상기 원료를 염기성 매질 또는 산성 매질 내에서 처리하여 생물량의 침전을 수득하는 것이다.

침전을 염기성 매질에서 수행하는 경우, 상기 매질은 바람직하게는 소디움 아세테이트, 포타슘 아세테이트 또는 트리스(히드록시메틸)아미노메탄(또는 TRIS로 불림)과 같은 염기성 염의 용액으로 이루어진다.

바람직한 구현예에 따르면, 염기성 매질은 수산화나트륨 용액으로 이루어지고, 수산화나트륨은 용액 리터 당 10 밀리몰 내지 80밀리몰의 농도 범위 내에서사용되며, 보다 바람직하게는 용액 리터 당 20 밀리몰 내지 50밀리몰의 농도 범위 내에서 사용된다.

염기성 매질의 pH는 통상 8.5 내지 11로 구성되며, 바람직하게는 9 내지 10로 구성된다.

침전이 산성 매질에서 수행되는 경우, 산성 매질은 통상 무기산 용액 또는 유기산 용액으로 구성된다. 산은 염산, 아세트산 및 시트르산으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 용액 내의 산 농도는 바람직하게는 용액 리터 당 10 밀리몰 내지 50 밀리몰을 포함하며, 보다 바람직하게는 용액 리터 당 20 밀리몰 내지 30밀리몰을 포함한다.

산성 매질의 pH는 바람직하게는 2 내지 4를 포함한다.

모든 경우, 생물량의 침전을 수행하기 위해 원료에 첨가되는 산성 또는 염기성 용액의 부피는 첫번째 단계에서 추출된 원료의 부피의 1 내지 20배에 해당한다.

염기성 용액을 사용하는 경우, 원료에 첨가되는 염기성 용액의 부피는 바람직하게는 원료 부피의 1 내지 15배이다. 산성 용액을 사용하는 경우, 원료에 첨가되는 산성 용액의 부피는 바람직하게는 첫번째 단계에서 얻어진 원료 부피의 1 내지 10배이다.

상기 조건 하에서, 형성된 침전은 매우 미세하고 가벼워서 그 여과가 매우 어렵다. 사실상, 저속(5,000 rpm)에서의 원심분리에 의해서는 침전을 전부 회수할 수는 없다. 용액으로부터 침전을 효율적으로 분리하기 위해서는 15,000 또는 심지어 20,000 rpm의 속도가 필요하다.

상기 문제점을 해결하고 얻어진 생물량으로부터 침전의 분리를 용이하게 하기 위해, 단리 및 건조 전, 침전에 사용된 산성 또는 염기성 용액 리터당 25 내지 200그램을 포함하는 농도에서 염화나트륨을 첨가하여 상기 생물량을 가염할 수 있다. 바람직하게, 염화나트륨은 침전에 사용된 산성 또는 염기성 수용액 리터 당 50 내지 100 g, 보다 바람직하게는 50 내지 75 g을 포함하는 농도로 첨가된다.

염화나트륨을 가지고 용액을 가염하면, 응집물을 얻을 수 있다. 수득된 침전은 보다 무겁고 잘 뭉쳐져 여과 또는 저속에서의 원심분리가 쉬워진다.

염화나트륨은 용액을 심하게 휘저으면서 용액에 빠르게 첨가하는 것이 바람직하다.

본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에 따르면, 이 단계에서 침전된 생물량은 여과 또는 원심분리에 의해 용액으로부터 분리되고 이어서 공기 중 또는 진공 하에, 바람직하게는 통기 또는 동결 건조에 의해 건조된다.

3단계 - 퍼칼라리제이젼(Percolorization)

본 발명에 따른 방법의 세 번째 단계는 전단계에서 단리된 생물량을 퍼칼라라이징하는 것으로 이루어져 있다.

보다 상세하게, 이 3 단계에서는 전 단계의 침전으로부터 얻어진 생물량에, 침전 전 1단계에서 추출된 원료의 약 2 부피에 해당하는 아세톤 부피를 첨가함에 의해 상기 생물량을 다시 용액으로 만든다.

보다 바람직하게는, 우선 아세톤을 첨가하고 이어서 물을 첨가함에 의해 상기 생물량을 용액으로 만든다. 물은 약 첨가된 아세톤 100 부피 당, 바람직하게는 2 내지 10 부피, 보다 바람직하게는 5 내지 7 부피의 비율로 첨가한다.

이러한 용해 후, 1 이상의 비극성 용매를 상기 얻어진 용액에 첨가하여 파크리택셀-농축 오일상을 형성한다.

이러한 퍼칼라리제이션 단계에서 사용되는 비극성 용매(들)은 바람직하게는, 헥산 또는 헵탄 같은 아세톤과 상용성이 있는 탄화수소로 구성된 군으로부터 선택한다. 헥산을 사용할 경우, 사용된 헥산의 부피는 아세톤 용액 부피의 통상 3 내지 4배이다.

수득된 혼합물을 디칸팅(decanting) 플라스크로 옮기고 플라스크의 밑부분에 가라앉은 파크리택셀 및 다른 택산을 함유한 오일상을 회수한다. 오일상을 증발시키고 메탄올로 바꾼다.

이러한 3단계에서 출발물질로 사용된 침엽수의 수지 및 천연색소 대부분이 제거되게 된다.

4단계 - 두 번째 침전

본 발명에 따른 방법의 4단계는 전 단계에서 회수된 파크리택셀-농축 오일상에 포함된 생물량에 염기 또는 산을 처리하여 침전에 의해 또 다른 생물량을 수득하고, 이어서 상기 또다른 생물량을 단리하여 건조하는 것으로 이루어져 있다.

보다 상세하게, 본 4단계에서는, 전 단계에서 수득된, 파크리택셀-농축 상을 우선 증발 건조하고 이어서 메탄올로 다시 용액으로 만든다.

이렇게 하여 얻어진 메탄올 용액은 '단계 2'라 불리우는 첫 번째 침전 단계가 산성 매질 내에서 행해진 경우에는 염기성 매질 내에서, 또는 첫 번째 침전 단계가 산성 매질 내에서 행해진 경우 염기성 매질 내에서 침전시킨다. 상기 침전의 목적은 파크리택셀을 함유한 생물량을 침전물 형태로 얻는 것이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 침전에 의해 얻어진 생물량은 단리 및 건조 전에 다시 한번 가염되는 바, 상기 가염은 침전에 사용된 산성 또는 염기성 용액의 리터 당 30 내지 200그램이 포함된 농도로 염화나트륨을 첨가함에 의해 이루어진다. 바람직하게는, 염화나트륨은 침전에 사용된 산성 또는 염기성 용액의 리터 당 50 내지 100그램이 포함된 농도로첨가된다.

이어서, 생물량에 포함된 침전물을 여과하고 순환 공기 중 또는 진공 하에서 건조시키거나 동결 건조시킨다.

본 단계에서 형성된 침전물은 매우 미세하고 가벼워서 그 여과가 매우 어렵다. 사실상, 저속(예를 들어 5,000 rpm)에서 원심분리를 행할 경우, 상기 침전물은 단지 부분적으로만 회수할 수 있다. 15,000 또는 20,000 rpm의 속도만이 상기 용액으로부터 침전물의 완전한 분리를 가능케 한다. 따라서, 상기 용액에 염화나트륨을 가하여 응집물을 얻어 침전물을 보다 무겁고 잘 뭉치게 만들어 여과 또는 저속에서의 원심분리를 쉽게하는 것이 다시 한번 적절하다. 이러한 처리에 사용되는 염화나트륨의 농도는 바람직하게는 용액 리터당 25 내지 100 g 이며, 보다 바람직하게는 용액 리터 당 50 내지 75 g이다. 염화나트륨은 심하게 휘져으면서 용액 내로 재빨리 첨가한다.

5단계 - 크로마토그래피를 이용한 정제

본 발명에 따른 방법의 마지막 단계인 5단계는 전단계에서 수득된 상기 단리된 또 다른 생물량의 휘발성 용매 내에서의 용액을 1회 이상 크로마토그래피 정제하고, 크로마토그래피에 의해 얻어진 정제 용액을 1회 이상 결정화하는 것으로 구성되어 있다.

이를 위해, 단계 4에서의 건조 후 얻어진 침전물을 휘발성 용매에 용해시키고 이어서 1단계 이상의 크로마토그래피 정제에 투입하고, 크로마토그래피에 의해 얻어진 정제된 용액을 1회 이상 결정화한다. 그러나, 바람직하게는 단계 4에서 건조 후 얻어진 침전물을 수 차례의 크로마토그래피 정제 및, 수 회의 결정화에 투입하는데, 연속적 정제 및 결정화의 수는 3회가 바람직하다.

상기 3회의 연속적 정제 및 결정화는 이제 부단계(sub-step)A 내지F라 서술한다.

A단계 - 제 1 크로마토그래피 정제

제 1 크로마토그래피 정제 단계에서는, 본 방법의 단계 4에서 얻어진 생물량을 휘발성 용매에 용해시킨다. 얻어진 용액을 실리카 겔과 혼합하고 통기 하에서 건조시키고, 이어서 생물량으로 덮혀진 실리카 겔을, 같은 형태의 겔을 담고 있는 크로마토그래피 칼럼에 올려 놓는다. 상기 칼럼 내에서 30 내지 40%의 아세톤과 60 내지 70%의 헥산으로 이루어진 용출 혼합액으로 상기 생물량을 정제한다. 바람직하게는 용출 혼합액은 약 40%의 아세톤과 60%의 헥산을 포함한다.

용해에 사용된 휘발성 용매는 바람직하게는 아세톤이다. 아세톤 용액을 여과하여 불용성 입자를 제거하고, 실리카겔과 혼합한다. 이렇게 수득된 혼합물은 통기 하 또는 진공 하에서 건조된다.

파크리택셀 및 그 유사물로 함침된 겔은 칼럼위에 놓여지는데, 상기 칼럼은 바람직하게는 높이가 142㎝이고 내경(inside diameter)이 76㎝이며, 2.2∼2.3kg 의 실리카겔을 담고 있다. 칼럼의 겔은 아세톤 및 핵산(40∼60%, v/v)으로 이루어진 용출 혼합액으로 세척하고 균형잡는다(balance). 분획의 용출은 동일한 용매 혼합액을 가지고 0 내지 30 psi로 변하는 압력 하에서 약 100ml/min의 흐름 속도로 행한다.

B단계 - 제 2 크로마토그래피 정제

두 번째 크로마토그래피 정제 단계에서, 전 단계에서 회수한 파트리팩셀-농축 분획은 바람직하게는 혼합하고 증발·건조하여 잔여물을 수득한다. 이어서 휘발성 용매내에서의 용해화를 통해 잔여물의 용액을 준비한다. 이렇게 해서 얻어진 용액은 앞선 단계에서와 같은 조건하에서 크로마토그래피에 의해 재정제되어 새로운 파크리택셀 농축 분획을 생산한다.

바람직한 구현예에 따르면, 잔여물은 아세톤에 녹이고 이어서 실리카겔과 혼합한 다음 건조한다.

파크리택셀 및 그 유사물로 함침된 겔을 2.2∼2.3 kg의 실리카 겔을 담고 있는 칼럼(길이 142㎝ × 내경 7.6㎝)에 올려놓는다. 칼럼의 겔을 아세톤 및 헥산(40∼60%, v/v)으로 이루어진 용출 혼합액으로 세척하고 균형을 맞춘다. 분획의 용출은 동일한 용매 혼합액을 가지고 0 내지 30 psi로 변하는 압력 하에서 약 100ml/min의 흐름 속도로 행한다.

파크리택셀(통상, 40∼60%의 파크리택셀)을 함유한 분획이 다시 한번 모아진다.

C단계 - 첫 번째 결정화

본 단계에서는, 앞선 정제 단계에서 크로마토그래피에 의해 얻어진 파크리택셀을 함유한 분획을 증발·건조하고 아세톤 내에서 다시 용액으로 만든다. 아세톤의 양을 조절하여, 용액의 흡광도가 HPLC 분석에 따라 파크리택셀에 상응하는 피크인 1.0 내지 1.5 DO의 값을 가지게 한다. 이어서 아세톤 용액에 3 내지 4 부피의 헥산을 첨가하여 파크리택셀을 결정화한다.

결정이 급속히 형성된다. 혼합물을 상온 또는 2 내지 8℃의 온도에서 하룻밤 방치하여 결정화를 완결한다.

D단계 - 두 번째 결정화

본 단계에서는, 전 단계에서 재결정화에 의해 얻어진 결정을 여과에 의해 분리하고, 아세톤 내에 다시 용액으로 만드는데, 이 경우 아세톤의 부피를 조절하여 용액의 흡광도가 HPLC 분석에 따라 파크리택셀에 상응하는 피크인 1.0 내지 1.5 DO에서 변하는 값을 가지게 한다.

이어서 상기 용액 부피 당 3 내지 4 부피의 헥산을 아세톤 용액에 첨가하여상기 용액내에 함유된 파크리택셀을 재결정화한다.

HPLC분석에 의하면 본 단계에서 얻어진 결정은 80% 초과의 파크리택셀 순도를 가진다.

E단계 - 세 번째 크로마토그래피 정제

본 단계에서는, 이전 단계에서 얻어진 결정을 여과하고, 이어서 메틸렌 클로라이드로 다시 용액으로 만든다.

상기 얻어진 용액을 실리카겔로 혼합하고 통기 하에서 건조한다.

파크리택셀로 코팅된 실리카겔을 동일 형태의 겔을 담고있는 크로마토그래피 칼럼위에 올려 놓는다. 이어서, 유기용매가 기초된 용출 혼합액으로 파크리택셀을 세 번째로 재정제한다. 바람직하게는, 상기 용출 혼합액은 95 내지 98%의 메틸렌크로라이드 및 2 내지 5%의 이소프로판올로 이루어진다.

본 단계에 있어 바람직하게는, 결정을 메틸렌클로라이드에 용해시키고 실리카 겔과 혼합한 후 건조시킨다. 파크리택셀이 함침된 겔을, 1.5 ∼ 1.6 kg의 실리카 겔을 담고 있는 크로마토그래피 칼럼(길이 76㎝ × 내경 7.6 ㎝)위에 올려 놓는다. 칼럼의 겔을 메틸렌 클로라이드 및 이소프로판올(982% 부피당)로 이루어진 용매로 세척하고 균형잡는다. 분획의 용출은 동일한 용매 혼합액을 가지고 0 내지 30 psi 범위의 압력 하에서 약 50 ml/min의 흐름 속도로 행한다.

F단계 - 세 번째 결정화

본 단계에서는, 전 단계에서 크로마토그래피에 의해 회수된 파크리택셀을함유하는 농축 분획들을 그들의 순도에 따라, 바람직하게는 ＋98 내지 ＋99% 및 90 내지 98%의 순도에 따라 합친다. 이어서, 이들을 증발·건조하고 메탄올 내에서 다시 용액으로 만든다.

첨가된 메탄올 부피를 조정하여 HPLC 분석에 따라 파크리택셀에 상응하는 피크를 위해 1.0 내지 1.5 DO 로 변하는 흡광도를 얻는다.

이어서 메탄올 용액에, 용액 부피당 2 내지 10 부피의 물을 첨가하여 세 번째로 파크리텍셀을 재결정화한다. 바람직하게는 메탄올 용액 부피당 4 내지 7부피의 물을 사용한다.

전술된 정제 및 재결정화의 마지막 단계에서, 사용된 물은 바람직하게는 탈이온화 및/또는 증류에 의해 얻어진 순수(purified water)이다.

바람직한 구현예에 따르면, 2 내지 4℃의 온도로 냉각된 순수 7 내지 10 부피를, 얼음내에서 냉각시킨 1 부피의 메탄올 용액에 첨가한다. 그러면, 결정이 즉각 나타난다. 결정화는 2∼4℃의 온도에서 하룻밤 동안 계속된다.

메탄올 용액 내에의 물의 첨가는 상온에서 행해질 수 있다. 그러면, 결정의 형성이 느려질 수 있으나, 2∼4℃의 온도에서 하룻밤 동안 결정 형성이 완결될 것이다. 결정을 여과하고 통기 하 또는 진공 하에서 건조하여 미세하고 분리된 분말을 수득한다. 이어서 결정을 순수내의 현탁액(suspension)으로 만들고, 약 -60℃의 온도에서 66 내지 72 시간 동안 동결 건조한다.

수득된 택산류의 분획은 오토샘플러(autosampler : Waters 717 plus), Photodiode Array Detector(Waters 996), Multisolvent Delivery System(Waters600E) 및 C18 Nova-Pak column(60Å, 4㎛) (3.9×150㎜)를 사용한 HPLC 크로마토그래피에 의해 분석될 수 있다.

분획의 분석은 5㎕의 부피를 주입하여 수행한다. 이동상(mobile phase)의 유동속도는 약 1ml/min 이며, 다음의 용매 구배(solvent)를 사용한다 : 아세토니트릴물메탄올(시작시, 20:50:30 에서 종료시 35:35:30)

화합물의 피크는 228㎚에서 검측되며, 시료 1개의 분석 시간은 약 36분이다.

바람직하게는, 크로마토그래피 정제에서 잔여물의 용해를 위해 사용된 휘발성 용매는 세톤류(cetones), C1∼C3 경알콜류(light alcohol), 에틸 아세테이트, 메틸렌 클로라이드 및 이들 용매의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택한다.

F단계에서, 수중에서의 파크리택셀 결정화 후, 및 여과와 건조 후, 파크리택셀 결정의 혼합물을 수득한다. 파크리택셀 결정의 상기 혼합물은 하기와 같이 구성되어 있다 :

99% 이상의 순도를 가지는 결정 약 53%

98% 이상의 순도를 가지는 결정 약 22%, 및

92% 이상의 순도를 가지는 결정 약 23%.

다음의 실시예는 설명을 목적으로 하여 주어지는 것으로, 본 발명의 범위를한정하는 것으로 생각되어서는 아니된다.

(실시예 1)

추출

Taxus canadensis의 건조 침엽 및 가지 50 kg을 탈이온수로 세척하고 통기하에서 건조한다. 원료를 갈아서 면 주머니(cotton back)으로 옮긴다. 상기 주머니를 150L 의 용매혼합물(메틸렌 클로라이드―메탄올; 1:1, v/v)을 담고 있는 스테인레스 강 탱크에 집어 넣는다. 추출을 상온에서 16시간동안 수행한다. 추출물을 필터를 통해 펌프로 뽑아 내어 두 번째 이중벽 탱크로 넣는다. 탱크의 이중벽 내에서 순환하는 70℃의 열수의 도움으로 용매를 증류시켜 매우 진한 액체를 얻는다.

첫 번째 침전

추출 농축액을 회수하여 2 L 의 메탄올로 희석한다. 20 mM의 NaOH 용액에 추출액을 첨가하여 침전에 의해 생물량을 단리한다. 추출액을 NaOH 용액에 첨가함에 따라 매우 미세한 침전물이 형성된다. 염기성 용액에 대한 추출물의 비율은 약 1 : 15이다.

미세 침전은 여과하기가 매우 힘들다. 오직 고속(1500020000 rpm)의 원심분리만이 생물량의 회수를 가능하게 한다. 따라서, 50g/용액 L의 비율로 용액에 NaCl 을 첨가하여 침전물을 보다 잘 응집하게 한다. 이어서, 침전물을 여과하거나, 또는 30분 동안 20℃에서 단지 4200 rpm 의 속도로 원심분리한다(원심분리기: J6MC Beckman(상표명), 4.2 JS rotor). 연속 흐름 원심분리기를 사용하여 많은 양의 침전물을 진행할 수 있다고 생각된다.

이렇게 얻어진 침전물은 공기 또는 진공 건조되거나 동결 건조(동결 건조기 : FTS Systems)된다. 침전물의 양은 약 500 내지 550g 이었다. 상기 침전물은 2L의 아세톤에 용해되어, 여과되거나 또는 4200 rpm의 속도로 02℃에서, 30 분 동안 원심 분리되어 그 안에 있는 불용성 입자를 제거한다.

퍼칼라리제이션

이어서, 1L 의 아세톤 용액을 6L 플라스크로 공급하고, 헥산 1L의 연속적 첨가에 의해 상기 용액에 4L의 헥산을 혼합하는데, 각각의 첨가시, 플라스크를 손으로 심하게 흔든다. 혼합물을 약 10분간 방치한 후 플라스크 밑부분의 오일상을 회수한다.

실제, 아세톤 용액은 큰 Becher 또는 적절한 탱크를 사용하여 하나의 배치에서 처리될 수 있는데, 이 경우 상기 Becher 등으로부터 핵산상을 사이펀으로 빨라 올려내고 남아 있는 액체는 분별 플라스크로 옮겨져 오일 상의 회수를 완성할 수 있다.

상기 단계에 있어 심하게 착색된 헥산층은 버려진다.

두 번째 침전

오일상을 증발·건조한다. 잔여물을 2 L의 메탄올에 용해시킨다. 상기 메탄올 용액을 20mM의 HCl 용액에 첨가하여 완성된 침전에 의해 생물량이 두 번째로 단리된다. 추출물이 첨가될 때 매우 고운 침전물이 형성된다. 산성 용액에 대한 추출물의 부피비는 약 1:5이다. 다시금, 상기 미세 침전물은 여과가 매우 힘들어진다. 오직 고속(1500020000 rpm)의 원심분리만이 생물량의 회수를 가능하게 한다. 따라서, 다시 한번 상기 용액에 NaCl 을 첨가하여 (50g/용액 L) 침전물을 보다 잘 응집하게 한다. 이어서, 침전물을 여과하거나, 20℃에서 30분 동안 단지 4200rpm의 속도로 원심분리한다(원심분리기: J6MC Beckman(상표명), 4.2 JS rotor). 다시금, 많은 양의 침전을 진행하기 위해 연속 흐름 원심분리기를 사용할 수 있다.

저압에서 실리카겔 상의 크로마토그래피에 의한 첫 번째 정제

회수된 침전물을 공기 또는 진공 하에서 건조하거나 동결 건조한다. 침전물의 양은 약 240∼260 g이었다. 상기 침전물을 0.5L 의 아세톤에 용해시키고 4200 rpm으로 02℃에서 30분 동안 원심 분리하여 그 안에 포함된 불용성 입자를 제거한다. 이어서, 아세톤 용액을 200 ∼ 250g 의 실리카 겔(230 ∼400 mesh, 제약 등급, Sillicycle(상표명), Quebec, Canada)과 혼합한다. 추출물로 함침된 겔을 통기 하 또는 진공하에서 공기 건조한다. 건조된 겔을 2.2 kg의 실리카겔(230 ∼400 mesh)을 담고 있는 칼럼(142×내경 7.6㎝)에 올려 놓는다. 아세톤 및 헥산(40:60%, v/v)의 혼합물을 가지고 상기 겔을 세척하고 균형잡는다. Dynamax(상품명) solvent delivery system을 사용하여 동일 용매로 용출을 행한다. 용출의 흐름속도는 10∼30 psi 의 압력하에서 약 100 ml/min이 된다. 용매 혼합물의 부피는 약 30 L이고 각각의 분획을 1L의 용매 정제를 사용하여 배치내에 모은다. HPLC 분석에 따르면, 17번째 분획에서 25번째 분획까지, 파크리택셀을 함유한 분획들이 9개 있다.

상기 분획들의 파크리택셀 함량을 HPLC에 의해 정하면 각각 다음과 같다 : 11; 24; 32; 40; 38; 33; 29; 14 및 9%

하나의 정제에서 다른 정제까지 파크리택셀을 함유한 분획이 다른 것들에 관하여 상쇄되는 것은 가치가 없다.

저압에서 실리카겔 상의 크로마토그래피에 의한 두 번째 정제

파크리택셀을 함유한 분획을 함께 합하여 증발 건조한다. 잔여물을 100㎖의 아세톤에 재용해시키고 100g의 실리카겔과 접촉시킨다. 파크리택셀로 코팅된 겔을 통기하 또는 진공에서 공기 건조한다. 상기 건조된 겔을, 2.2 kg의 실리카겔(230 ∼400 mesh)을 담고 있는 칼럼(142×내경 7.6㎝)에 올려 놓는다. 아세톤 및 헥산(40:60%, v/v)의 혼합물을 가지고 상기 겔을 세척하고 균형잡는다. solvent delivery system을 사용하여 동일 용매로 용출을 행한다. 용출의 흐름속도는 10∼30 psi 의 압력하에서 약 100 ml/min이 된다. 용매 혼합물의 부피는 약 30 L이고 각각의 분획당 1L의 용매를 사용하는 배치 내에 모은다. HPLC 분석에 따르면, 22번째 분획에서 26번째 분획까지 파크리택셀을 함유한 분획들이 5개 있다.

상기 분획들에서 HPLC 에 의해 정해진 파크리택셀 함량은 각각 다음과 같다 : 40; 58; 66; 50 및 49%. 다시 한번, 한 정제 단계에서 다른 정제까지 파크리택셀을 함유한 분획이 다른 것들에 대하여 상쇄될 수 있다.

첫 번째 결정화

파크리택셀을 함유한 분획을 합하여 증발 건조한다. 잔여물을 800㎖의 아세톤에 재용해시킨다. 아세톤 부피의 조절은 파크리택셀 피크인 1.0 내지 1.5 DO의 흡광도를 얻기 위해 HPLC 분석상 필요하다. 3부피의 헥산(2.4L)을 상기 아세톤 용액에 첨가한다. 시간이 흐르면서 결정이 형성된다. 혼합물을 2∼8℃의 온도에서 하룻밤동안 방치하여 결정화를 완결시킨다.

두 번째 결정화

수득된 결정을 여과하고 400㎖의 아세톤 내에 재용해시킨다. 3부피의 헥산(1.2L)을 아세톤 용액에 첨가한다. 시간이 흐르면서 결정이 형성된다. 혼합물을 2∼8℃의 온도에서 하룻밤동안 방치하여 결정화를 완결시킨다. 결정을 공기 또는 진공 하에 건조한다.

생성된 결정의 건조 무게는 약 10 g ± 0.2g 이었다. HPLC 분석에 따르면 파크리택셀 함량은 약 80% 이상이었다.

저압에서 실리카겔 상의 크로마토그래피에 의한 세 번째 정제

75 ㎖의 메틸렌 클로라이드에 결정을 다시 한번 녹여서 75 g 의 실리카겔과 접촉시킨다. 파크리택셀로 코팅된 겔은 통기 하에서 또는 진공하에서 공기 건조된다. 상기 건조된 겔을, 1.5 kg의 실리카겔(230 ∼400 mesh)이 담겨진 칼럼(76×내경 7.6㎝)에 올려 놓는다. 메틸렌클로라이드 및 이소프로판올 (98:2%, v/v)의 혼합물을 가지고 상기 겔을 세척하고 균형잡는다. Dynamax(상표명) solvent delivery system을 사용하여 동일 용매로 용출을 행한다. 용출의 흐름속도는 10∼30 psi 의 압력하에서 약 50 ml/min이 된다. 용매 혼합물의 부피는 약 30 L이고 각각의 분획 당 1L의 용매를 사용하여 분획들을 모은다. HPLC 분석에 따르면, 11번째 분획에서 22번째 분획까지 파크리택셀을 함유한 분획들이 12개 있다. 상기 분획들에 있어 HPLC 에 의해 정해진 파크리택셀 함량은 각각 다음과 같았다 : 80; 97; 99. 50; 99. 70; 99. 70; 99.30; 98.60; 97.30; 94; 92; 89 및 85% .

다시금, 한 정제 단계에서 다른 정제까지 파크리택셀을 함유한 분획이 다른 것들에 대하여 상쇄될 수 있다.

세 번째 결정화

파크리택셀을 함유한 분획을 각각의 순도에 따라 합하여 증발 건조한다. 12 번째에서 16번째까지의 분획을 100 ml의 메탄올(HPLC 급)에 용해시키고, 17 번째에서 18번째의 분획을 45ml의 메탄올(HPLC 급)에 용해시키고, 19 번째에서 22번째의 분획을 75ml의 메탄올(HPLC 급)에 용해시켰다.

1) 미리 2∼8℃로 냉각시킨 700 ml의 물(HPLC 급)을 얼음 속에 냉각시킨 메탄올 용액(12 번째에서 16번째까지의 분획)에 첨가했다. 흰색의 결정이 즉시 나타났다.

2) 미리 2∼8℃로 냉각시킨 300 ml의 물(HPLC 급)을 얼음 속에 냉각시킨 메탄올 용액(17 번째에서 18번째까지의 분획)에 첨가했다. 흰색의 결정이 즉시 나타났다.

3) 미리 2∼8℃로 냉각시킨 500 ml의 물(HPLC 급)을 얼음 속에 냉각시킨 메탄올 용액(19 번째에서 22번째까지의 분획)에 첨가했다. 흰색의 결정이 즉시 나타났다.

결정은 각각 여과되어 공기 또는 진공하에 건조되었다. 결정의 건조 질량 및 HPLC에 의해 분석된 순도는 다음과 같다;

12 번째에서 16번째까지의 분획 : 3.40g - 순도 : 99.30%

17 번째에서 18번째까지의 분획 : 1.40g - 순도 : 98.85%

19 번째에서 22번째까지의 분획 : 1.60g - 순도 : 92.70%

98% 미만의 순도를 갖는 결정을 따로 떼어 전술한 세 번째 정제단계에서와 같은 조건 하에서 크로마토그래피에 의해 함께 재정제하였다. 상기 재결정화에 의해 99%를 초과하는 순도를 가진 결정을 총중량의 약 75%로 얻을 수 있었다.

(실시예 2)

실시예 2에서 개시된 방법은 첫 번째, 두 번째의 침전단계가 하기와 같이 수행되는 것을 제외하고는 실시예 1에서 개시된 것과 유사하다.

첫 번째 침전

추출 농축액을 회수하여 2 L 의 메탄올로 희석했다. 20 mM의 HCl 용액에 추출액을 첨가하여 침전에 의해 생물량을 단리했다. 추출액을 첨가함에 따라 매우미세한 침전물이 형성되었다. 산성 용액에 대한 추출액의 부피 비율은 약 1 : 10이었다.

미세 침전은 여과하기가 매우 힘들다. 오직 고속(1500020000 rpm)의 원심분리만이 생물량의 회수를 가능하게 한다. 따라서, 50g/용액 L의 비율로 용액에 NaCl 을 첨가하여 침전물을 보다 잘 응집하게 한다. 이어서, 침전물을 여과하거나, 30 분동안 20℃에서 4200 rpm 의 속도로 원심 분리했다(원심분리기: J6MC Beckman(상표명), 4.2 JS rotor).

이렇게 얻어진 침전물은 공기 또는 진공 건조되거나 동결건조된다. 침전물의 양은 약 500 ∼ 520g 이었다. 상기 침전물을 2L 의 아세톤에 용해시키고, 여과 또는 4200 rpm의 속도로 02℃에서, 30 분 동안 원심분리하여 그 안에 있는 불용성 입자를 제거한다.

두 번째 침전

오일상을 증발·건조한다. 잔여물을 2 L의 메탄올에 용해시킨다. 메탄올 용액을 20mM의 NaOH 용액에 첨가하여 침전에 의해 생물량이 두 번째로 단리된다. 추출물이 첨가될 때 매우 고운 침전물이 형성된다. 염기성 용액에 대한 추출물의 부피비는 약 1:5 였다. 이러한 미세 침전물은 여과가 매우 힘들다. 오직 고속(1500020000 rpm)의 원심분리만이 생물량의 회수를 가능하게 한다. 따라서, 상기 용액에 50g/용액 L의 비율로 NaCl 을 첨가하여 침전물을 보다 잘 응집하게 한다. 이어서, 침전물을 여과하거나, 20℃에서 30분 동안 단지 4200rpm의 속도로 원심분리하였다(원심분리기: J6MC Beckman(상표명), 4.2 JS rotor).

상기 실시예 2에서 수득된 파크리택셀의 수율 및 순도는 실시예 1에서 얻은 것과 같았다.

상기 실시예가 보여주듯이, 본 발명에 따른 방법은 당해 기술분야에서 공지된 여타의 방법과 비교하여 파크리택셀의 생산 가격을 상당히 감소시킨다. 상기 가격 감소는 치료제에 적합한 순도의 파크리택셀 수율의 증가 및, 회수불가능한 산물(용매, 겔 등) 및 생산 시간의 현저한 절감에 기인한 것이다. 상기 장점에 덧붙여, 본 발명은 매우 간단하고, 빠르며 쉬운 공정으로 처리된 생물량에 함유된 파크리택셀의 적은 양에 의해 한정됨이 없이 공업적 수준에서 사용가능하다.

Claims

추출될 파크리택셀을 함유한 택산류의 천연 원료로부터 파크리택셀을 추출 및 정제하는 방법으로, 하기의 단계를 포함하는 방법;

a) 전술한 택산의 천연 원료로부터 파크리택셀을 함유한 원료를 유기용매로 추출하는 단계;

b) 상기 원료를 염기 또는 산으로 처리하여 침전에 의해 생물량을 얻고, 상기 생물량을 단리시켜 건조하는 단계;

c) 상기 단리된 생물량을 퍼칼라라이징(percolorizing)하여 그 안에 들어있는 수지 및 천연 색소를 제거하는 단계로서, 아세톤 내에 상기 생물량을 용해시키고 이어서 여기에 1 이상의 비극성 용매를 첨가하여 파크리택셀-농축 오일상(Paclitaxel-enriched oily phase)을 얻는 단계;

d) 전 단계에서 수득된 파크리택셀 농축 오일상 내에 포함된 생물량을 염기 또는 산으로 처리하여 침전에 의해 또 다른 생물량을 수득하고, 상기 또 다른 생물량을 단리하여 건조하는 단계;

e) 전 단계에서 수득된, 단리된 또 다른 생물량의 휘발성 용매내의 용액을 1회 이상 크로마토그래피로 정제하고, 상기 크로마토그래피에 의해 얻어진 정제 용액을 1회 이상 결정화하는 단계.
제 1 항에 있어, 파크리택셀을 함유하는 택산류의 천연원료는Taxusbrevifolia, Taxus baccata, Taxus canadensis, Taxus wallichiana, Taxus yunnanensis, Taxus densiformis, Taxus hicksii, Taxus wardii, Taxus cuspidata, Taxus capitata, Taxus brownii로 이루어진 군으로부터 선택된 침엽수로 이루어 진 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어, 상기 단계 (a)에서, 침엽수의 모든 부분이 처리되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어, 상기 단계 (a)에서 침엽수의 나무껍질이 처리되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어, 상기 단계 (a)에서 침엽수의 가지 및 침엽(needle)이 동시에 처리되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어, 상기 단계 (a)에서 유기 용매가 알콜류, 할로겐화 탄화수소류, 및 알콜류와 할로겐화 탄화수소류의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
제 6 항에 있어, 상기 단계 (a)에서, 용매가 메탄올 및 디클로로메탄의 혼합물이거나, 메탄올 및 트리클로로메탄의 혼합물인 것을 특징으로 하는 방법.
제 6 항 또는 제 7 항에 있어, 알콜 및 할로겐화 탄화수소가 9:1 내지 1:9 의 범위의 부피비로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 8 항에 있어, 할로겐화 탄화수소에 대한 알콜의 부피비가 약 1:1 인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어, 단계 (b)에서, 생물량이 소디움아세테이트, 포타슘아세테이트, 수산화나트륨 및 트리스(히드록시메틸)아미노메탄으로 이루어진 군으로부터 선택된 염기성 염의 용액으로 구성된 염기 매질에서 침전되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 10 항에 있어, 염기성 염이 수산화나트륨이고, 수산화나트륨이 용액 리터 당 10mM 내지 80mM을 포함하는 농도에서 사용되며, 용액의 pH가 8.5 내지 11인 것을 특징으로 하는 방법.
제 10 항 또는 제 11 항에 있어, 상기 용액의 pH가 9 내지 10 인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (b)단계에서, 생물량이 무기산 또는 유기산의 용액으로 이루어진 산성 매질에서 침전된 것을 특징으로 하는 방법.
제 13 항에 있어서, 산이 염산, 아세트산 및 시트르산으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
제 13 항 또는 제 14 항에 있어서, 상기 용액의 산 농도가 용액 리터당 10mM 내지 50mM인 것을 특징으로 하는 방법.
제 15 항에 있어서, 산 농도가 용액 리터당 20mM 내지 30mM인 것을 특징으로 하는 방법.
제 13 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 용액의 pH가 2 내지 4인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계(b)에 있어, 단계(a)에서 추출된 원료에 대한 용액의 부피비가 1 내지 10 인 상기 염기 또는 산의 용액으로 생물량의 침전이 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 침전된 생물량의 단리 및건조 전, 침전에 사용된 용액 리터 당 25 내지 200 g 농도로 염화나트륨을 첨가하여 침전된 생물량을 가염하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 19 항에 있어서, 침전에 사용된 용액의 리터 당 50 내지 100 g 의 농도로 염화나트륨을 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 침전된 생물량이 여과 또는 원심 분리에 의해 분리되고 통기 또는 동결 건조에 의해 건조되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)에서 사용된 상기 1 이상의 비극성 용매가 헥산 또는 헵탄으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)에 있어, 단계 (b)에서 얻어진 건조된 생물량을 단계(a)에서 추출된 원료의 2부피에 해당하는 아세톤 부피를 첨가함에 의해 용액으로 되돌리는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)에서 얻어진 건조된 생물량을 아세톤의 첨가에 이은 물의 첨가에 의해 용액으로 되돌리는 것을 특징으로 하는 방법.
제 24 항에 있어서, 첨가된 아세톤 100 부피당 2 내지 10 부피의 비율로 물을 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)에서는 ;

단계(c)에서 얻어진 파크리택셀 농축상을 증발 건조하여 메탄올 내에서 용액으로 되돌리고;

단계(b)에서 기술된 첫 번째 침전이 산성 매질에서 수행된 경우는, 염기성 매질 내에서 상기 메탄올 용액을 침전시키고, 혹은 단계(b)에서 기술된 최초 침전이 염기성 매질 내에서 수행된 경우 산성 매질 내에서 상기 메탄올 용액을 침전시키며;

파크리택셀을 함유한 생물량을 얻는데, 상기 파크리텍셀이 침전물 형태인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)에서 얻어진 생물량에, 단리 및 건조 전, 침전에 사용된 용액 리터당 30 내지 200g의 농도로 염화나트륨을 첨가하여 상기 생물량을 추가로 가염하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 27 항에 있어서, 염화나트륨을 침전에 사용된 용액의 리터 당 50 내지100g의 농도로 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계(e)가 하기의 부-단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:

e1) 단계(d)에서 단리된 침전물을 휘발성 용매에 녹이고, 수득된 용액과 실리카 겔 혼합물을 준비한 후, 상기 혼합물을, 실리카겔을 담고 있는 크로마토그래피 칼럼 내에서 처리하고, 파크리택셀-농축 분획을 회수하는 것으로 이루어진 제 1 크로마토그래피 정제 ;

e2) 전 단계에서 회수한 파크리택셀-농축 분획을 증발 건조하여 잔여물을 얻고, 상기 잔여물을 휘발성 용매 내에서 녹여 혼합물을 준비하고, 상기 혼합물을 앞선 부단계와 같은 조건 하에서의 크로마토그래피로 재정제하여 또 다른 파크리텍셀 농축 분획을 얻는 것으로 이루어진 제 2 크로마토그래피 정제 ;

e3) 앞선 부단계에서 얻어진 또 다른 파크리택셀-농축 분획을 증발 건조하여 잔여물을 얻고, 아세톤 내에서 상기 잔여물의 혼합물을 준비하고, 비극성 용매로 상기 혼합물에 함유된 파크리택셀을 결정화하는 것으로 이루어진 제 1 결정화

e4) 앞선 부단계에서 얻어진 파크리택셀 결정을 아세톤 내에서 용해시키고, 앞선 부단계와 같은 조건하에서 파크리택셀을 재결정화하는 것으로 이루어진 제 2 결정화;

e5) 앞선 부단계에서 재결정화에 의해 얻어진 결정을 휘발성 용매에 용해시키고, 실리카겔과 상기 용액의 혼합물을 제조하고, 상기 혼합물을 실리카겔로 채워진 크로마토그래피 칼럼내에서 용출 용매로 처리하여 더 진한 파크리택셀-농축 분획을 얻는 제 3 크로마토그래피 정제

e6) 앞선 부단계에서 얻은, 더 진한 파크리택셀 농축 분획을 증발 건조하여 잔여물을 얻고, 알콜, 세톤(cetone) 또는 알콜-세톤 혼합물 내에서 상기 잔여물을 용해시켜 또다른 혼합물을 얻고, 상기 또 다른 혼합물에 포함된 파크리택셀을 물로 결정화하는 것으로 이루어진 제 3 결정화.
제 29 항에 있어서, 단계(e1)에서는;

단계 (d)에서 얻어진 생물량을 휘발성 용매 내에서 용액으로 되돌리고,

얻어진 용액을 실리카겔과 혼합하여, 통기 하에서 건조하고;

생물량에서 얻어진 실리카 겔을, 실리카겔이 담겨 있는 크로마토그래피 칼럼에 올려놓고; 그리고,

30% 내지 40%의 아세톤 및 60% 내지 70%의 헥산을 함유하는 용출 혼합액으로 상기 생물량을 정제하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 30 항에 있어서, 용출 혼합액이 약 40%의 아세톤 및 약 60%의 헥산으로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
제 29 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계(e2)에서는;

단계(e1)에서 크로마토그래피에 의해 얻어진, 파크리택셀을 포함하는 농축 분획을 재편성(regroup)하여 증발 건조시키고 휘발성 용매 내에서 용액으로 되돌리고;

얻어진 용액을 실리카겔로 혼합하고 통기 하에서 건조하며;

생물량으로부터 수득한 실리카겔을, 실리카겔이 담겨진 크로마토그래피 칼럼에 올려놓고;

이어서, 30% 내지 40%의 아세톤 및 60% 내지 70%의 헥산으로 이루어진 유기 용매 혼합물에 의해 파크리택셀을 재정제함을 특징으로 하는 방법.
제 32 항에 있어서, 유기 용매 혼합물이 약 40%의 아세톤 및 60%의 헥산을 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 29 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (e3)는:

단계(e2)에서 크로마토그래피에 의해 얻어진 파크리택셀을 함유하는 분획을 재편성하여 증발 건조하고, 아세톤 내에서 용액으로 되돌리는 것으로, 이 때, 아세톤의 양을 조절하여 상기 용액의 흡광도가, HPLC 분석에 따라 파크리택셀에 상응하는 피크인 1.0 내지 1.5 D.O의 값을 갖게 하고; 그리고,

이어서, 아세톤 용액에 3 내지 4 부피의 헥산을 첨가하여 파크리택셀을 결정화함을 특징으로 하는 방법.
제 29 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 있어서, (e4)에서는 :

단계(e3)에서 얻어진 결정을 여과에 의해 분리하고 아세톤 내에서 용액으로 되돌리는 것으로, 이 때 아세톤의 부피를 조절하여, 상기 용액이 HPLC 분석에 따라 파크리택셀에 상응하는 피크인 1.0 내지 1.5D.O.에서 변화하는 흡광도를 갖도록 하고;

이어서, 아세톤 용액에 3 내지 4 부피의 헥산을 첨가하여 파크리택셀을 재결정화함을 특징으로 하는 방법.
제 29 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계(e5)에서는;

단계 (e4)에서 얻어진 결정을 여과하여 메틸렌 클로라이드에서 용액으로 되돌리고;

이어서 상기 얻어진 용액을 실리카겔과 혼합하여 통기 하에서 건조하고;

파크리택셀로 덮힌 실리카겔을, 실리카겔이 담겨있는 크로마토그래피 칼럼 위에 올려놓고; 그리고

이어서, 유기 용매에 기초한 용출 혼합액을 가지고 파크리택셀을 세번째로 재정제함을 특징으로 하는 방법.
제 36 항에 있어서, 용출 혼합액이 95% 내지 98%의 메틸렌 클로라이드와 2% 내지 5%의 이소프로판올로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
제 29 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계(e6)에서는:

단계(e5)에서 크로마토그래피에 의해 수득된 파크리택셀을 함유하는 농축 분획을 그들의 순도에 따라 재편성하고, 증발 건조하며 이어서 메탄올 내에서 용액으로 되돌리는 것으로, 이 때 첨가되는 메탄올의 부피를 조절하여 상기 용액이 HPLC 분석에 따라 파크리택셀에 상응하는 피크인 1.0 내지 1.5 D.O에서 변화하는 흡광도를 갖도록 하고;

이어서, 메탄올 용액에 2 내지 10 부피의 물을 첨가하여 파크리택셀을 세 번째로 재결정화함을 특징으로 하는 방법.
제 38 항에 있어서, 파크리택셀이 메탄올 용액 내에서 4 내지 7 부피의 물을 첨가함에 의해 세 번째로 재결정화되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 29 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (e1), (e2) 및 (e3)에서 사용된 휘발성 용매가 아세톤, C1∼C3의 경알콜(light alcohol), 에틸 아세테이트, 메틸렌 클로라이드 및 상기 용매들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 29 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계(e6)에 있어 수중에서의 파크리택셀의 결정화 후, 파크리택셀 결정의 혼합물을 여과에 의해 수득하고 이어서 건조하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 41 항 중 어느 한 항에 있어서, 모든 단계에서 사용된 물이 탈이온화 및/또는 증류에 의해 정제되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 42 항 중 어느 한 항에 정의된 방법에 의해 얻어진 파크리택셀 결정의 혼합물.
제 29 항 내지 제 41 항 중 어느 한 항에 정의된 방법에 의해 수득된 파크리택셀 결정의 혼합물로서, 결정의 여과 및 건조 후 상기 혼합물이 하기의 조성을 갖는 것을 특징으로 하는 혼합물:

99% 이상의 순도를 가지는 결정 약 53%,

98% 이상의 순도를 가지는 결정 약 22%, 및

92% 이상의 순도를 가지는 결정 약 23%.