KR101591581B1 - 파클리탁셀의 개선된 정제방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 파클리탁셀의 정제방법 및 이를 통해 정제한 파클리탁셀을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 택서스속 바이오매스에서 파클리탁셀을 추출하는 방법에 있어서, 종래 추출방법보다 현저하게 증가한 추출효율 및 높은 순도의 파클리탁셀을 수득할 수 있는 파클리탁셀의 정제방법 및 이를 통해 정제한 파클리탁셀을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

파클리탁셀의 개선된 정제방법{Improved method for purifying paclitaxel}

본 발명은 파클리탁셀의 정제방법 및 이를 통해 정제한 파클리탁셀을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 택서스속 바이오매스에서 파클리탁셀을 추출하는 방법에 있어서, 종래 추출방법보다 현저하게 증가한 추출효율 및 높은 순도의 파클리탁셀을 수득할 수 있는 파클리탁셀의 정제방법 및 이를 통해 정제한 파클리탁셀을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

파클리탁셀은 주목 나무의 표피에서 발견된 항암물질로 난소암, 유방암, 카포시 종양(Kaposi's sarcoma), 비소세포성 폐암(non-small cell lung cancer, NSCLC) 치료에 대해 미국 FDA (U.S. Food and Drug Administration) 허가를 취득하여 현재 가장 많이 사용되고 있는 항암제로서, 현재 항암제 중 시장규모 1위, 주요 항암화학치료제 시장의 22% 정도를 점유하고 있다. 류마티스성 관절염, 알츠하이머 치료 등의 적용증이 계속 확대되고 있으며, 또한 여러 다른 치료 방법들과의 복합처방에 관한 임상실험이 진행 중에 있어 향후 파클리탁셀의 수요는 계속 늘어날 전망이다.

파클리탁셀의 주요 생산 방법에는 세 가지가 있다. 첫째, 주목나무에서 직접 추출하는 방법으로 원료의 계속적인 공급이 어렵고 추출 및 정제에도 많은 어려움이 있으며 환경보호수인 주목나무 보호에도 적합하지 않은 방식이다. 둘째, 주목나무의 잎에서 전구체(baccatin Ⅲ, 10-deacetylbaccatin Ⅲ, 10-deacetyl paclitaxel 등)를 얻어 사이드 체인(side chain)을 화학적으로 결합하는 반합성 방법이다. 이 방법 역시 전구체를 주목나무에서 직접 얻어야 하므로 직접 추출의 경우와 마찬가지인 문제점들을 가진다. 셋째, 주목나무에서 칼루스(callus)를 유도하고 종균배양 (seed culture)을 거쳐 주배양기(main bioreactor)에서 식물세포를 배양하여 얻는 방법이다. 이들 중 세 번째 방법은 기후, 환경 등의 외부 인자에 의한 영향을 받지 않고 생물반응기 내에서 안정적으로 생산할 수 있기 때문에 일정한 품질의 파클리탁셀을 대량 생산할 수 있다는 장점이 있다.

식물세포배양으로부터 항암물질 파클리탁셀의 분리 및 정제는 여러 단계의 추출 및 정제 공정을 거쳐 높은 순도 (>98%)의 제품을 생산하게 된다. 일반적으로 분리 및 정제 과정은 원료인 바이오매스로부터 파클리탁셀을 먼저 유기용매로 추출하고, 전 처리 공정을 거쳐 최종 정제를 통하여 제품을 생산하는 공정으로 이루어져 있는데, 이 과정에서 특히 전 처리 공정은 최종 정제 비용에 많은 영향을 미친다.

이에 대하여, 등록특허 10-0474228(공개일자: 2000년05월15일)에는 파클리탁셀과 세팔로만닌의 혼합물을 N-할로숙신이미드 존재하에서 지방족 알콜 또는 아민과 반응시켜 얻은 혼합물로부터 파클리탁셀을 분리하는 것을 특징으로 하는 파클리탁셀의 분리방법을 제안하고 있다.

상기 등록특허 및 종래 파클리탁셀 분리 및/또는 추출방법들은 파클리탁셀 정제를 위한 전 처리 공정으로 고가의 크로마토그래피를 이용하거나 전 처리 없이 추출을 거친 원료(crude) 파클리탁셀을 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC; high performance liquid chromatography)를 이용하여 최종 정제하는 방법이 통상적이였다.

그러나, 상기 통상의 파클리탁셀 분리 및/또는 정제방법은 낮은 순도의 파클리탁셀 추출물을 HPLC의 시료로 사용하여 많은 양의 유기용매 사용, 컬럼에 팩킹된 원료(resin)의 수명 단축, 처리량 감소 등 경제적 측면에서 많은 문제가 있으며 또한 스케일업(scale-up) 및 대량생산에 많은 어려움이 있었다.

또한, 통상적인 파클리탁셀 추출방법 중 하나인 유기용매를 이용한 파클리탁셀 추출방법은 추출한 파클리탁셀의 순도가 0.5% 이하이며, 간단한 전처리 공정 후에도 10% 정도의 순도로 매우 낮은 문제점이 있었다.

이에 본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 택서스속 바이오매스에서 파클리탁셀을 추출하는 방법에 있어서, 종래 추출방법보다 현저하게 증가한 추출효율 및 높은 순도의 파클리탁셀을 수득할 수 있는 파클리탁셀의 정제방법 및 이를 통해 정제한 파클리탁셀을 포함하는 약학적 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명은 파클리탁셀을 포함하는 택서스속(Taxus genus) 바이오매스를 유기용매 추출, 감압추출, 액체-액체 추출 및 헥산 침전 추출로 이루어진 군 중 1종 이상의 추출방법으로 추출물을 제조하는 단계; 상기 추출물 및 수용성 유기용매를 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계; 상기 혼합물에 물을 첨가하여 분별침전을 수행하는 단계; 및 분별침전 이후 교반하여 파클리탁셀을 수득하는 단계; 를 포함하고, 첨가한 물의 양은 수용성 유기용매와 물의 부피비가 50 : 50 ~ 20 : 80으로 혼합하는 파클리탁셀의 정제방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 수용성 유기용매는 C₁ ~ C₄의 알코올 및 메틸렌 클로라이드로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 교반은 10 ~ 35 ℃에서 5 분 ~ 2 시간 동안 100 ~ 300 rpm으로 수행할 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 교반 이후 0 ~ 35 ℃에서 10분 ~ 2시간 동안 보관하는 것을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 보관은 0 ~ 10 ℃에서 10 분 ~ 2 시간 동안 수행할 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 물의 첨가량은 수용성 유기용매와 물의 부피비가 47 : 53 ~ 35 : 65로 혼합할 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 파클리탁셀의 정제방법은 추출 수율이 40% 이상일 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 파클리탁셀의 정제방법은 추출물의 파클리탁셀 순도보다 1.5 ~ 4배 높은 순도의 파클리탁셀을 수득할 수 있다.

또한, 본 발명은 상술한 바와 같은 정제방법으로 정제한 파클리탁셀을 포함하는 항암제용 약학적 조성물을 제공한다.

나아가, 본 발명은 상술한 바와 같은 정제방법으로 정제한 파클리탁셀을 포함하는 류마티스 관절염 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

더불어, 본 발명은 상술한 바와 같은 정제방법으로 정제한 파클리탁셀을 포함하는 알츠하이머 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

종래 파클리탁셀 추출방법보다 현저하게 증가한 추출효율 및 높은 순도의 파클리탁셀을 수득할 수 있는 파클리탁셀의 정제방법 및 이를 통해 정제한 파클리탁셀을 포함하는 약학적 조성물을 제공하는 효과가 있다.

도 1은 실험예 1에서 측정한 실시예 2 내지 4의 파클리탁셀 순도이다.
도 2는 실험예 2에서 측정한 실시예 5 내지 10의 파클리탁셀 추출 수율이다.
도 3은 실험예 2에서 측정한 실시예 5 내지 10의 파클리탁셀 순도다.
도 4는 실험예 3에서 측정한 실시예 11 내지 12 및 비교예 1 내지 2의 파클리탁셀 추출 수율이다.
도 5는 실험예 4에서 측정한 실시예 2, 실시예 13 내지 16, 비교예 1 및 비교예 3 내지 4의 파클리탁셀 추출 수율이다.
도 6은 실험예 5에서 측정한 실시예 11 내지 12 및 실시예 17 내지 24의 파클리탁셀 순도이다.
도 7은 실험예 5에서 측정한 실시예 11 내지 12 및 실시예 17 내지 24의 파클리탁셀 추출 수율이다.
도 8은 실험예 6에서 측정한 실시예 4 및 비교예 5의 파클리탁셀 추출 수율이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

상술한 바와 같이, 종래 파클리탁셀 분리 및/또는 정제방법은 낮은 순도의 파클리탁셀 추출물을 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC; high performance liquid chromatography)의 시료로 사용하여 많은 양의 유기용매 사용, 컬럼에 팩킹된 원료(resin)의 수명 단축, 처리량 감소 등 경제적 측면에서 많은 문제가 있으며 또한 스케일업(scale-up) 및 대량생산에 많은 어려움이 있었다. 또한, 통상적인 파클리탁셀 추출방법 중 하나인 유기용매를 이용한 파클리탁셀 추출방법은 추출한 파클리탁셀의 순도가 0.5% 이하이며, 간단한 전처리 공정 후에도 10% 정도의 순도로 매우 낮은 문제점이 있었다.

이에 본 발명은 파클리탁셀을 포함하는 택서스속(Taxus genus) 바이오매스를 유기용매 추출, 감압추출, 액체-액체 추출 및 헥산 침전 추출로 이루어진 군 중 1종 이상의 추출방법으로 추출물을 제조하는 단계; 상기 추출물 및 수용성 유기용매를 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계; 상기 혼합물에 물을 첨가하여 분별침전을 수행하는 단계; 및 분별침전 이후 교반하여 파클리탁셀을 수득하는 단계; 를 포함하고, 상기 혼합물에 물을 수용성 유기용매와 물의 부피비가 50 : 50 ~ 20 : 80으로 혼합하는 파클리탁셀의 정제방법을 제공함으로써 상술한 문제의 해결을 모색하였다. 이를 통해 종래 파클리탁셀 추출방법보다 현저하게 증가한 추출효율 및 높은 순도의 파클리탁셀을 수득할 수 있는 파클리탁셀의 정제방법 및 이를 통해 정제한 파클리탁셀을 포함하는 약학적 조성물을 제공하는 효과가 있다.

본 발명은 파클리탁셀을 포함하는 택서스속(Taxus genus) 바이오매스를 유기용매 추출, 감압추출, 액체-액체 추출 및 헥산 침전 추출로 이루어진 군 중 1종 이상의 추출방법으로 추출물을 제조하는 단계; 상기 추출물 및 수용성 유기용매를 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계; 상기 혼합물에 물을 첨가하여 분별침전을 수행하는 단계; 및 분별침전 이후 교반하여 파클리탁셀을 수득하는 단계; 를 포함하는 파클리탁셀의 정제방법을 제공한다.

먼저, 파클리탁셀을 포함하는 택서스속(Taxus genus) 바이오매스에서 추출물을 제조하는 단계를 설명한다.

상기 파클리탁셀을 포함하는 택서스속 바이오매스는 택서스속 식물체, 이의 세포 및 이의 세포 배양액으로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함할 수 있다.

또한, 상기 택서스속 식물체는 택서스 브레비폴리아(Taxus brevifolia), 택서스 카나덴시스(Taxus canadensis), 택서스 쿠스피다타(Taxus cuspidata), 택서스 바카타(Taxus baccata), 택서스 글로보사(Taxus globosa), 택서스 플로리다나(Taxus floridana), 택서스 월리치아나(Taxus wallichiana), 택서스 메디아(Taxus media) 또는 택서스 치넨시스(Taxus chinensis) 등이 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 택서스속 바이오매스에서 추출물을 제조하는 방법은 통상적으로 바이오매스에 포함되어 있는 성분을 추출하기 위해 수행하는 방법이라면 특별히 제한하지 않는다. 예를 들면, 유기용매 추출, 감압추출, 액체-액체 추출 및 헥산 침전 추출로 이루어진 군 중 1종 이상의 추출방법으로 추출할 수 있다.

구체적으로, 상기 유기용매 추출의 유기용매는 통상적으로 식물체에서 유효성분을 추출하기 위해 사용하는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 C₁ ~ C₄의 알콜 및 물로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함할 수 있다.

나아가, 상기 유기용매 추출의 조건은 통상적으로 식물체에서 유효성분을 추출하는 방법에서 사용할 수 있는 조건이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 20 ~ 45 ℃에서 30 분 ~ 2 시간 동안 수행할 수 있다.

만약, 20 ℃ 미만의 온도로 처리할 경우, 낮은 온도로 인해 파클리탁셀의 추출 효율이 감소하는 문제가 발생할 수 있으며, 45 ℃를 초과하는 온도로 처리할 경우, 높은 온도로 인해 파클리탁셀이 분해되는 문제가 발생할 수 있다.

만약, 30 분 미만으로 처리할 경우, 바이오매스 내의 파클리탁셀이 모두 추출되지 않아 파클리탁셀의 추출효율이 낮아지는 문제가 발생할 수 있으며, 2 시간을 초과하는 시간으로 처리할 경우, 과도한 조업 시간으로 경제적인 문제가 발생할 수 있다.

더불어, 상기 용매 추출은 1회 내지 수회 반복 수행할 수 있으며, 바람직하게는 2회 이상, 더욱 바람직하게는 3 회 내지 5회 반복 수행할 수 있다.

상기 액체-액체 추출은 통상적으로 비극성 유기용매와 극성 유기용매의 상분리를 이용하여 파클리탁셀에 함유되어 있는 극성 불순물을 제거하는 방법이라면 특별히 제한하지 않는다.

예를 들어, 상기 비극성 유기용매는 메틸렌 클로라이드, 에틸아세테이트 및 에테르로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함할 수 있다. 또한, 상기 극성 유기용매는 C₁ ~ C₄의 알콜 및 물로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함할 수 있다.

또한, 상기 액체-액체 추출은 1회 내지 수회 반복 수행할 수 있으며, 바람직하게는 2회 이상, 더욱 바람직하게는 3 회 내지 5회 반복 수행할 수 있다.

나아가, 만약, 극성 유기용매가 C₁ ~ C₄의 알콜인 경우, 비극성 유기용매로 메틸렌 클로라이드를 사용하는 것이 바람직하고, 메틸렌 클로라이드는 알콜 농축액의 20 ~ 30 %(v/v)로 바람직하게 사용될 수 있으며, 과도한 메틸렌 클로라이드의 사용은 후속 공정에 많은 부담을 초래하게 된다.

다음, 상기 추출물 및 수용성 유기용매를 혼합하여 혼합물을 제조한다.

상기 혼합은 통상적으로 고체와 액체의 혼합에 사용하는 방법이라면 특별히 제한하지 않는다. 예를 들면, 교반기를 이용하여 교반할 수 있다.

게다가, 상기 혼합은 수용성 유기용매에 추출물을 균일하게 분산할 수 있는 함량의 혼합이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 수용성 유기용매 100 중량부에 대하여 1 ~ 5 중량부의 추출물을 혼합할 수 있다.

만약, 수용성 유기용매 100 중량부에 대하여 1 중량부 미만의 추출물을 혼합할 경우, 추출 수율 감소 및 과도한 용매 사용으로 인한 경제적 문제가 발생할 수 있으며, 수용성 유기용매 100 중량부에 대하여 5 중량부를 초과하는 추출물을 혼합할 경우, 추출한 파클리탁셀의 순도가 저하되는 문제가 발생할 수 있다.

상기 수용성 유기용매는 통상적으로 식물체에서 유효성분을 추출하기 위해 사용하는 유기용매라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 C₁ ~ C₄의 알콜 및 메틸렌 클로라이드로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 메탄올을 포함할 수 있다.

다음으로, 상기 혼합물에 물을 첨가하여 분별침전을 수행한다.

상기 물의 첨가량은 수용성 유기용매와 물의 부피비가 50 : 50 ~ 20 : 80으로 혼합할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 수용성 유기용매와 물의 부피비가 47 : 53 ~ 35 : 65로 혼합할 수 있다.

실험예 6 및 도면 8에서 확인되는 바와 같이, 메탄올을 수용성 유기용매로 사용할 경우 아세톤을 사용한 경우보다 약 11% 높은 수율로 파클리탁셀을 추출할 수 있는 것을 알 수 있었다.

다음, 분별침전 이후 교반하여 파클리탁셀을 수득한다.

상기 교반은 통상적으로 식물체에서 성분 추출에 사용되는 조건이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 15 ~ 26 ℃에서 5분 ~ 2시간 동안 100 ~ 300 rpm으로 교반할 수 있다.

만약, 15 ℃ 미만에서 교반할 경우, 낮은 온도로 인해 파클리탁셀의 추출 효율이 감소하는 문제가 발생할 수 있으며, 26 ℃를 초과하는 온도에서 교반할 경우, 높은 온도로 인해 파클리탁셀의 추출 효율이 감소하는 문제가 발생할 수 있다.

만약, 5 분 미만으로 교반할 경우, 파클리탁셀의 침전이 잘 이루어지지 않아 파클리탁셀 추출 수율이 감소하는 문제가 발생할 수 있으며, 2 시간을 초과하는 시간으로 교반할 경우, 과도한 조업 시간으로 인해 조업효율이 저하되는 문제가 발생할 수 있다.

만약, 100 rpm 미만의 속도로 교반할 경우, 교반으로 인해 수득할 수 있는 이점인 파클리탁셀 침전 속도가 느려 파클리탁셀 추출 시간이 증가하는 문제가 발생할 수 있으며, 300 rpm을 초과하는 속도로 교반할 경우, 과도한 혼합으로 조업효율이 저하되는 문제가 발생할 수 있다.

더불어, 본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 교반 이후 0 ~ 35 ℃에서 10분 ~ 2시간 동안 보관하는 단계를 더 포함하여 파클리탁셀을 수득할 수 있으며, 바람직하게는 상기 교반 이후 0 ~ 10 ℃에서 10분 ~ 2시간 동안 보관하는 단계를 더 포함하여 파클리탁셀을 수득할 수 있다.

만약, 0 ℃ 미만의 온도에서 보관할 경우, 침전 효율 대비 과도한 에너지를 사용하는 문제가 발생할 수 있으며, 35 ℃를 초과하는 온도에서 보관할 경우, 파클리탁셀 추출 수율 저하되고 파클리탁셀이 분해되는 문제가 발생할 수 있다.

만약, 10 분 미만의 시간 동안 보관할 경우, 파클리탁셀의 침전이 용이하지 않아 추출 수율이 감소하는 문제가 발생할 수 있으며, 2 시간을 초과하는 시간 동안 보관할 경우, 과도한 조업시간에 따른 조업효율이 감소하는 문제가 발생할 수 있다.

상술한 바와 같은 파클리탁셀의 정제방법은 추출 수율이 40 % 이상이며, 이를 통해 추출한 추출물의 파클리탁셀 순도보다 1.5 ~ 4배 높은 순도의 파클리탁셀을 수득할 수 있다. 이는 종래 파클리탁셀의 정제방법으로 수득할 수 있는 파클리탁셀 순도인 10% 미만보다 현저하게 높은 것이다.

더불어, 본 발명은 상술한 바와 같은 파클리탁셀의 정제방법으로 정제한 파클리탁셀을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 상기 약학적 조성물은 통상적으로 파클리탁셀을 포함할 수 있는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 항암제, 류마티스 관절염 치료제 또는 알츠하이머 치료제일 수 있다.

상기 항암제는 악성종양의 치료를 위하여 사용되는 화학요법제의 총칭으로, 대부분의 항암제는 암세포의 각종 대사경로에 개입하여 주로 헥산의 합성을 억제하거나 항암활성을 나타내는 약제이다. 정상세포를 손상하지 않고 종양세포만을 저해하는 것은 어렵기 때문에 작용 메커니즘이 여러 가지로 다른 각양각색의 약제가 많은 기업에 의하여 연구되어 왔다. 의약품에 관련된 생물공학의 응용 중 가장 주력하고 있는 분야이다. 현재 판매되고 있는 항암제는 작용 메커니즘에 따라 면역을 부활화하는 것, 대사길항작용이 있는 것, 종양세포를 직접 살상하는 항생물질의 세 가지 종류로 대별된다.

본 발명에 따른 정제방법으로 정제한 파클리탁셀을 포함하는 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

상세하게는, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 파클리탁셀에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.

경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween)61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 파클리탁셀은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 0.01 내지 500 mg/㎏의 양, 바람직하게는 0.1 내지 100 mg/㎏의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 또한 파클리탁셀의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

준비예 1. 바이오매스 준비

바이오매스는 택서스종(Taxus chinensis)의 잎으로부터 얻은 세포주(cell line)를 배양하여 수득하였다.

구체적으로, 택서스종 잎으로부터 수득한 현탁액 세포는 24 ℃ 암조건(darkness condition)에서 150 rpm으로 교반하여 배양하였다. 상기 현탁액 세포는 수정된 겜보르그 비5(Gamborg's B5) 배지, 30 g/ℓ 수크로오스(sucrose), 10 ㎛ 나프탈렌 아세트산(naphthalene acetic acid), 0.2 ㎛ 6-벤질 아미노 퓨린(6-benzylamino purine), 1 g/ℓ 카제인 가수분해물(casein hydrolysate) 및 1 g/ℓ 2-(엔-모르폴리노)에탄술폰산(2-(N-morpholino)ethane sulfonic acid)을 포함하는 배지에서 배양하였다.

세포 배양은 2주마다 새로운 배지로 갈아주었으며 생산과 배양을 연장시키기 위해 7일과 21일째 되는 날에 1 ~ 2%의 맥아당(maltose)를 첨가해주고 유도인자로서 배양 초기에 4 ㎛의 질산은(AgNO₃)를 첨가했다. 상기 배양된 세포는 배양액으로부터 디캔터(웨스트팔리아사의 CA150 Claritying decanter사용) 및 고속원심분리기(알파-라발사의 BTPX205GD-35CDEEP 사용)를 이용하여 식물세포와 세포조각을 회수하였다. 회수한 식물세포와 세포조각을 합하여 바이오매스(biomass)로 사용하였다.

실시예 1.

준비예 1에서 수득한 바이오매스와 메탄올의 비율을 1/1 (w/v)로 첨가하여 25 ℃에서 30 분 동안 메탄올 추출하고 여과하여 추출액을 제조하고, 이후 1차 메탄올 추출한 바이오매스에 메탄올을 1/1 (w/v)의 비율로 첨가하여 동일한 방법으로 4회 반복하여 추출액을 제조하였다.

상기 추출액을 회전증발기(rotary evaporator, CCA-1100, EYELA, Japan)를 이용하여 원액의 30%까지 감압농축하고 메틸렌 클로라이드를 농축액의 25% 부피비로 첨가하여 25 ℃에서 30 분 동안 교반 후 정체시켜 액체-액체 추출을 수행하였다. 극성 불순물이 포함된 상층의 메탄올 층을 제거한 후 하층의 메틸렌 클로라이드층을 회수하여 회전증발기(rotary evaporator, CCA-1100, EYELA, Japan)를 이용하여 감압상태에서 농축하여 액-액 추출물을 제조한 후 여과지(150 mm, Whatman)로 감압 여과 후 건조하여 조(crude) 추출물을 제조하였다.

이후, 식물세포 유래 타르 및 왁스 성분을 제거하기 위하여, 상기 조 추출물 10g에 메틸렌 클로라이드 50 ℓ를 첨가하고, 흡착제인 실로푸트(sylopute, 일본 Fuji Silysia Chemical Ltd.에서 구매)를 조 추출물 대비 100% (w/w) 비율로 첨가하여 40 ℃ 항온조(PS-1000, EYELA, Japan)에서 30분 동안 교반하여 반응시킨 후 여과하였다. 상기 여과로 얻은 여과액은 30℃, 감압상태에서 건조하여 건조된 시료를 얻고 이 건조된 시료를 헥산 침전 공정에 이용하였다.

헥산 침전 공정은 상기 건조된 시료를 메틸렌 클로라이드에 녹이고 헥산에 떨어뜨려 침전을 유도하여 비극성 불순물을 제거하였다(메틸렌 클로라이드/헥산 = 1/10, v/v). 헥산 침전 후 여과를 통하여 추출물을 얻고 35 ℃에서 24시간 동안 진공오븐(UP-2000, EYELA, Japan)으로 건조하였다.

이후 17.6 %, 21.3 %, 27.6 %, 32.6 % 또는 42.0 % 순도의 진공건조한 추출물을 파클리탁셀 시료로 사용하였다.

실시예 2. 파클리탁셀 정제

실시예 1에서 제조한 순도 21.3%의 진공 건조한 추출물과 메탄올을 0.5 : 99.5(w/v) 비율로 혼합하고 25 ℃에서 메탄올과 물의 비율이 50:50 부피비가 될 때까지 180 rpm으로 교반하며 물을 한 방울씩 첨가하여 파클리탁셀 침전용 혼합물을 제조하였다. 이후 파클리탁셀 침전용 혼합물을 25 ℃에서 10 분 동안 180 rpm으로 교반한 후 여과하고, 35 ℃에서 24 시간 동안 진공오븐으로 건조하여 파클리탁셀을 수득하였다.

실시예 3.

메탄올과 물의 비율이 40:60 부피비가 될 때까지 물을 첨가한 것을 제외하고는 실시예 2와 동일한 방법으로 파클리탁셀을 제조하였다.

실시예 4.

메탄올과 물의 비율이 30:70 부피비가 될 때까지 물을 첨가한 것을 제외하고는 실시예 2와 동일한 방법으로 파클리탁셀을 제조하였다.

실험예 1. 정제한 파클리탁셀 및 추출 효율 분석

실시예 2 내지 4에서 정제한 파클리탁셀의 순도 분석을 위해, HPLC system(SCL-10AVP, Shimadzu, Japan)과 Capcell Pak C₁₈ UG 120 (250 ㎜ × 4.6 ㎜, Shiseido, Japan) 컬럼(column)을 사용하였다. 또한, 이동상은 아세토니트릴/물(acetonitrile/water; 65/35 ~ 35/65, v/v, gradient mode)을 사용하였으며, 이동상의 유속은 1.0 ㎖/분, 시료 주입량은 20 ㎕로 주입하였다. 이후 227 ㎚에서 UV detector를 사용하여 파클리탁셀의 순도를 분석하였다. 파클리탁셀 표준물질은 Sigma-Aldrich 제품(순도: 95%)을 사용하였다. 측정한 파클리탁셀의 순도는 도 1에 나타냈다.

또한, 파클리탁셀의 추출 효율은 하기 수학식 1에 의거하여 계산하였다. 측정한 파클리탁셀 추출 효율은 도 1에 나타냈다.

도 1에서 확인되는 바와 같이, 물의 비율이 증가할수록(methanol/water ratio가 감소할수록) 파클리탁셀 추출 수율이 증가함을 알 수 있었다. 또한, 파클리탁셀 추출 수율은 메탄올과 물의 비율(v/v)이 50:50, 40:60, 30:70일 때 각각 42%, 84.3%, 92%를 나타내었다. 특히, 메탄올과 물의 비율이 50:50인 실시예 2보다 메탄올과 물의 비율이 40:60인 실시예 3의 추출 수율이 매우 큰 폭으로 상승한 것을 확인하였다.

이는 분별침전 이후 저온(0 ~ 4 ℃) 보관 없이도 메탄올과 물의 혼합비를 변화시키는 것만으로도 파클리탁셀을 높은 수율로 수득할 수 있었다. 특히, 실시예 4는 약 92%의 파클리탁셀 추출 수율을 수득할 수 있었다.

나아가, 파클리탁셀의 순도는 메탄올과 물의 비율(v/v)이 50:50, 40:60, 30:70일 때 각각 60.2%, 63.6%, 57.7%를 확인할 수 있었다.

이로 인해, 본 발명의 파클리탁셀의 정제방법은 메탄올과 물의 비율과 관계없이 25 ℃에서 분별침전을 수행하고 추가 저온(0 ~ 4℃) 보관 없이 바로 파클리탁셀 침전물이 형성되어 회수할 수 있었다.

실시예 5.

실시예 1에서 제조한 순도 17.6%, 32.6% 또는 42.0%의 진공 건조한 추출물 각각을 사용한 것을 제외하고는 실시예 2와 동일한 방법으로 파클리탁셀 각각을 정제하였다.

실시예 6 ~ 10.

하기 표 1에 기재되어 있는 바와 같은 추출 조건을 사용한 것을 제외하고는 실시예 5와 동일한 방법으로 파클리탁셀 각각을 정제하였다.

구분	메탄올과 물의 혼합 부피비(v/v)
실시예 6	45:55
실시예 7	40:60
실시예 8	35:65
실시예 9	30:70
실시예 10	20:80

실험예 2.

실시예 5 내지 10에서 수득한 파클리탁셀 각각을 실험예 1과 동일한 방법으로 HPLC 분석 및 추출 수율을 분석하였으며, 파클리탁셀 추출 수율은 도면 2에, 파클리탁셀 순도 분석 결과는 도면 3에 나타냈다.

도 3에서 확인되는 바와 같이, 수득한 파클리탁셀 순도는 메탄올에 대하여 혼합하는 물의 양이 많아질수록 다소 감소하는 경향을 보였다. 또한 동일한 메탄올/물 혼합 부피비에서 분별침전 이전의 파클리탁셀의 순도가 높을수록 수득한 파클리탁셀의 순도는 증가함을 알 수 있었다.

도 2에서 확인되는 바와 같이, 분별침전 이전의 파클리탁셀의 순도에 관계없이 메탄올에 대한 물의 비율이 증가할수록 파클리탁셀의 추출 수율이 증가하는 경향을 보였다. 또한 동일한 메탄올/물 혼합 부피비에서 분별침전 이전의 파클리탁셀의 순도가 높을수록 파클리탁셀의 추출 수율이 증가함을 알 수 있었다.

이로 인해, 메탄올/물(v/v)의 혼합 비율만 조절하여도 다양한 시료(crude extract 순도: 17.6 ~ 42.0%)에서 분별침전 후 추가 저온(0 ~ 4℃) 보관 없이도 바로 높은 순도의 파클리탁셀을 고수율로 회수할 수 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 11.

실시예 1에서 제조한 순도 27.6%의 진공 건조한 추출물을 사용한 것을 제외하고는 실시예 2와 동일한 방법으로 파클리탁셀을 정제하였다.

실시예 12.

파클리탁셀 침전용 혼합물의 교반 이후 25 ℃에서 30 분 동안 보관한 후 여과한 것을 제외하고는 실시예 11과 동일한 방법으로 파클리탁셀을 정제하였다.

비교예 1 ~ 2.

하기 표 2에 기재되어 있는 바와 같은 추출 조건을 사용한 것을 제외하고는 실시예 12와 동일한 방법으로 파클리탁셀을 정제하였다.

구분	교반 조건	보관 조건.
비교예 1	교반 수행안함.	25 ℃에서 10분 보관.
비교예 2	교반 수행안함.	25 ℃에서 40분 보관.

실험예 3.

실시예 11 내지 12 및 비교예 1 내지 2에서 수득한 파클리탁셀을 실험예 1과 동일한 방법으로 HPLC 분석 및 추출 수율을 분석하였으며, 파클리탁셀 추출 수율은 도면 4에 나타냈다.

도 4에서 확인되는 바와 같이, 진공 건조한 추출물과 메탄올에 물을 모두 첨가한 후 10분 동안 교반한 경우인 실시예 11 내지 12의 파클리탁셀 추출 수율은 각각 50.0%와 77.8%이었다. 반면 진공 건조한 추출물과 메탄올에 물을 모두 첨가한 후 교반없이 여과한 경우인 비교예 1 내지 2의 파클리탁셀 추출 수율은 각각 11.6%와 36.6%이었다.

이를 통해, 진공 건조한 추출물과 메탄올 혼합물에 물을 첨가한 후 10 분 동안 교반하는 것이 파클리탁셀 추출 수율 향상에 매우 중요한 요소임을 확인할 수 있었다. 또한, 실시예 11과 실시예 12의 파클리탁셀 추출 수율 비교시, 교반 후 정치(보관)을 수행하고 여과하는 것이 파클리탁셀 정제에 보다 유리한 것을 확인할 수 있었다.

실시예 13.

파클리탁셀 침전용 혼합물의 교반 이후 4 ℃에서 30 분 동안 보관하여 여과한 것을 제외하고는 실시예 2와 동일한 방법으로 파클리탁셀을 정제하였다.

실시예 14 ~ 16 및 비교예 3 ~ 4.

하기 표 3에 기재되어 있는 바와 같은 추출 조건을 사용한 것을 제외하고는 실시예 13과 동일한 방법으로 파클리탁셀을 정제하였다.

구분	교반 조건	보관 조건.
실시예 14	25℃에서 10분 동안 180 rpm으로 교반.	4℃에서 1시간 보관.
실시예 15	25℃에서 40분 동안 180 rpm으로 교반.	보관 수행안함.
실시예 16	25℃에서 70분 동안 180 rpm으로 교반.	보관 수행안함.
비교예 3	교반 수행안함.	25℃에서 10분, 4℃에서 30분 보관.
비교예 4	교반 수행안함.	25℃에서 10분, 4℃에서 1시간 보관.

실험예 4.

실시예 2, 실시예 13 내지 16, 비교예 1 및 비교예 3 내지 4에서 수득한 파클리탁셀을 실험예 1과 동일한 방법으로 HPLC 분석 및 추출 수율을 분석하였으며, 파클리탁셀 추출 수율은 도면 5에 나타냈다.

도 5에서 확인되는 바와 같이, 물 첨가 이후 10 분 동안 교반한 실시예 2의 파클리탁셀 추출 수율은 42%이었으며, 물 첨가 이후 10분 동안 교반한 후 저온(4℃) 보관한 실시예 13 내지 14의 파클리탁셀 추출 수율은 각각 82.5% 또는 84.7%이었고, 25 ℃에서 40분 또는 70분 동안 교반한 실시예 15 내지 16의 파클리탁셀 추출 수율은 각각 71.3% 또는 81%이었으며, 10 분의 교반없이 바로 저온(4℃) 보관한 비교예 3 내지 4의 파클리탁셀 추출 수율은 각각 33.6% 또는 48.92%이었다.

또한, 10분 동안 교반한 실시예 2 및 실시예 13 내지 16가 교반없이 저온(4℃) 보관한 비교예 3 내지 4에 비해 훨씬 높은 파클리탁셀 추출 수율을 얻을 수 있었다.

특히, 혼합물에 물을 첨가한 후 25 ℃에서 40분 동안 교반한 실시예 15는 10 분 동안 교반 후 저온(4℃)에서 1 시간 보관한 실시예 14(84.7%)에 준하는 높은 파클리탁셀 추출 수율(81%)을 얻을 수 있었다.

상기 결과를 통하여, 저온에 장시간 보관하였던 기존의 방법에 비해 교반만으로도 높은 파클리탁셀 추출 수율(~81%)을 저온보관 없이 바로 얻을 수 있으며, 분별침전시 진공 건조한 추출물과 메탄올 혼합물에 물을 첨가하고 적정 시간 교반을 수행하는 것이 파클리탁셀 추출 수율 향상에 매우 중요함을 알 수 있었다.

실시예 17 ~ 24.

하기 표 4에 기재되어 있는 바와 같은 추출 조건을 사용한 것을 제외하고는 실시예 11과 동일한 방법으로 파클리탁셀을 정제하였다.

구분	교반 조건	보관 조건.
실시예 17	25℃에서 10분 동안 180rpm으로 교반.	25℃에서 1시간 보관.
실시예 18	25℃에서 10분 동안 180rpm으로 교반.	25℃에서 2시간 보관.
실시예 19	25℃에서 10분 동안 180rpm으로 교반.	4℃에서 30분 보관.
실시예 20	25℃에서 10분 동안 180rpm으로 교반.	4℃에서 1시간 보관.
실시예 21	25℃에서 10분 동안 180rpm으로 교반.	4℃에서 2시간 보관.
실시예 22	25℃에서 40분 동안 180rpm으로 교반.	보관 수행안함.
실시예 23	25℃에서 70분 동안 180rpm으로 교반.	보관 수행안함.
실시예 24	25℃에서 130분 동안 180rpm으로 교반.	보관 수행안함.

실험예 5.

실시예 11 내지 12 및 실시예 17 내지 24에서 수득한 파클리탁셀을 실험예 1과 동일한 방법으로 HPLC 분석 및 추출 수율을 분석하였으며, 파클리탁셀 순도 분석 결과는 도면 6에, 파클리탁셀 추출 수율은 도면 7에 나타냈다.

도 6에서 확인되는 바와 같이, 교반 이후 25 ℃에서 보관한 실시예 11 내지 12 및 실시예 17 내지 18의 파클리탁셀 순도는 각각 64%, 67%, 64.7%, 64.3%였으며, 교반 이후 저온(4℃) 보관한 실시예 19 내지 21의 파클리탁셀 순도는 각각 63.7%, 62.1%, 65.2%였다. 또한, 10분 이상 교반한 실시예 11 및 실시예 22 내지 24의 파클리탁셀 순도는 각각 64%, 66%, 62.4%, 66.8%를 나타나 추출한 파클리탁셀의 순도는 큰 차이가 없었다.

도 7에서 확인되는 바와 같이, 교반 이후 보관 0 ~ 30 분 사이에서 파클리탁셀 추출 수율이 급격하게 증가하였으며 그 이후 파클리탁셀 추출 수율 증가는 미비하였다.

구체적으로, 침전 시간(0 분, 30 분, 1 시간, 2 시간)에 따른 파클리탁셀의 추출 수율은 교반 이후 25 ℃에서 보관한 실시예 11 내지 12 및 실시예 17 내지 18은 각각 50.6%, 77.8%, 78.2%, 82.1%였으며, 교반 이후 저온(4℃) 보관한 실시예 19 내지 21은 84.3%, 88.4%, 89.6%였다. 또한, 10분 이상 교반한 실시예 22 내지 24의 파클리탁셀 추출 수율은 각각 83.2%, 86.9%, 87.1%를 나타내었다.

특히, 진공 건조한 추출물과 메탄올 혼합물에 물을 첨가한 후 분별침전 시간(30분 ~ 2 시간)에서 25 ℃ 보관에 비해 저온(4℃)보관 또는 25 ℃에서 40분 이상 교반한 경우가 더 높은 수율을 얻을 수 있는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과를 통해, 기존 분별침전에서 물을 모두 첨가 후 즉시 저온(0 ~ 4℃)에 보관하였던 기존 방법에 비하여, 건조 추출물과 유기용매 혼합물에 물을 첨가 후 상온에서 교반하는 본원 발명의 파클리탁셀의 정제방법은 높은 순도의 파클리탁셀을 고수율로 분별침전할 수 있어 매우 경제적인 방법인 것을 확인할 수 있었다.

비교예 5.

메탄올 대신 아세톤을 사용한 것을 제외하고는 실시예 4와 동일한 방법으로 파클리탁셀을 정제하였다.

실험예 6.

실시예 4 및 비교예 5에서 수득한 파클리탁셀을 실험예 1과 동일한 방법으로 HPLC 분석 및 추출 수율을 분석하였으며, 파클리탁셀 추출 수율은 도면 8에 나타냈다.

도 8에서 확인되는 바와 같이, 교반 이후 수득한 파클리탁셀 추출 수율은 아세톤을 사용한 비교예 5에서 81%였고, 메탄올을 사용한 실시예 4에서는 92%인 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 아세톤보다 메탄올을 사용하는 것이 파클리탁셀 추출 수율을 높이는데 더욱 효과적임을 알 수 있었다.

실시예, 비교예 및 실험예를 통해 확인할 수 있는 바와 같이, 분별침전 시 건조 추출물과 유기용매 혼합물에 물을 첨가한 후 교반해 주는 것이 파클리탁셀 추출 수율을 높이는데 매우 효과적임을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 기존 분별침전에서 건조 추출물과 유기용매 혼합물에 물 첨가 후 바로 저온(0~4℃)에서 장시간(~3 days) 보관하였던 방법에 비하여, 물 첨가 후 25℃에서 교반하는 것만으로도 높은 순도의 파클리탁셀을 고수율로 짧은 시간에 회수 가능한 것을 확인할 수 있었다. 이로 인해, 본 발명의 파클리탁셀의 정제방법이 기존 분별침전법에 비해 파클리탁셀 정제에 매우 적합하며, 보다 경제적인 방법임을 알 수 있었다.

Claims (11)

1. 파클리탁셀을 포함하는 택서스속(Taxus genus) 바이오매스를 유기용매 추출, 감압추출, 액체-액체 추출 및 헥산 침전 추출로 이루어진 군 중 1종 이상의 추출방법으로 추출물을 제조하는 단계;
   상기 추출물 및 수용성 유기용매를 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계;
   상기 혼합물에 물을 첨가하여 분별침전을 수행하는 단계; 및
   분별침전 이후 10 ~ 35 ℃에서 5 분 ~ 2 시간 동안 100 ~ 300 rpm으로 교반하여 파클리탁셀을 수득하는 단계; 를 포함하고,
   상기 물의 첨가량은 수용성 유기용매와 물의 부피비가 50 : 50 ~ 20 : 80으로 혼합하는 파클리탁셀의 정제방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 수용성 유기용매는 C₁ ~ C₄의 알코올 및 메틸렌 클로라이드로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 파클리탁셀의 정제방법.
3. 삭제
4. 제1항에 있어서, 상기 교반 이후 0 ~ 35 ℃에서 10분 ~ 2 시간 동안 보관하는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 파클리탁셀의 정제방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 보관은 0 ~ 10 ℃에서 10분 ~ 2 시간 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 파클리탁셀의 정제방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 파클리탁셀의 정제방법은 추출물의 파클리탁셀 순도보다 1.5 ~ 4배 높은 순도의 파클리탁셀을 수득하는 것을 특징으로 하는 파클리탁셀의 정제방법.
7. 제1항에 있어서, 상기 파클리탁셀의 정제방법은 파클리탁셀 추출 수율이 40% 이상인 것을 특징으로 하는 파클리탁셀의 정제방법.
8. 제1항에 있어서, 상기 물의 첨가량은 수용성 유기용매와 물의 부피비가 47 : 53 ~ 35 : 65로 혼합하는 것을 특징으로 하는 파클리탁셀의 정제방법.
9. 삭제
10. 삭제
11. 삭제

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