KR102090882B1 - 파클리탁셀 정제 시 초음파 처리에 의해 수행되는 분별침전방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 파클리탁셀 정제 시 초음파 처리에 의해 수행되는 분별침전방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 시료 내 파클리탁셀의 순도에 따라 분별침전 단계에서 초음파 처리 조건을 달리하여, 분별침전 시간을 획기적으로 단축시킨 분별침전방법, 및 상기 분별침전방법을 수행하여 시간을 현저하게 단축시킬 뿐만 아니라 기존의 파클리탁셀 정제방법과 유사한 수준의 수율 및 순도의 파클리탁셀을 수득할 수 있는 파클리탁셀 정제방법에 관한 것이다.

Description

파클리탁셀 정제 시 초음파 처리에 의해 수행되는 분별침전방법 {Fractional precipitation method performed by ultrasound treatment in purifying paclitaxel}

본 발명은 파클리탁셀 정제 시 초음파 처리에 의해 수행되는 분별침전방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 시료 내 파클리탁셀의 순도에 따라 분별침전 단계에서 초음파 처리 조건을 달리하여, 분별침전 시간을 획기적으로 단축시킨 분별침전방법, 및 상기 분별침전방법을 수행하여 시간을 현저하게 단축시킬뿐만 아니라 기존의 파클리탁셀 정제방법과 유사한 수준의 수율 및 순도의 파클리탁셀을 수득할 수 있는 파클리탁셀 정제방법에 관한 것이다.

파클리탁셀(paclitaxel)은 주목(yew tree)의 표피에서 발견된 디테르페노이드(diterpenoid)계 항암물질로 1971년 Wani 등에 의하여 파클리탁셀의 화학적 구조가 규명되었으며(Wani et al (1971)., J. Am. Chem. Soc, 93, 2325-2327), 1979년 Schiff 등에 의하여 항암 기작이 밝혀졌다(Schiff et al., Nature, 277, 655-667). 파클리탁셀은 난소암, 유방암, 카포시 종양(Kaposi’s sarcoma), 비소세포성 폐암(non-small cell lung cancer, NSCLC) 치료에 대해 미국 FDA (U.S. Food and Drug Administration) 허가를 취득하여 현재 가장 많이 사용되고 있는 항암제이며, 폐암, 류마티스성 관절염, 알츠하이머 치료 등의 적용증이 계속 확대되고 있고, 여러 다른 치료 방법들과의 복합처방에 관한 임상시험이 진행 중에 있어 향후 파클리탁셀의 수요는 계속 늘어날 전망이다. 이러한 파클리탁셀의 주요 생산방법으로는 주목나무에서 직접 추출(extraction)하는 방법, 주목나무의 잎에서 전구체(baccatin Ⅲ, 10-deacetylbaccatin Ⅲ, 10-deacetylpaclitaxel 등)를 얻어 곁사슬(side chain)을 화학적으로 결합하는 반합성(semi-synthesis) 방법, 주목나무에서 캘러스(callus)를 유도하고 종균배양(seed culture)을 거쳐 주배양기(main bioreactor)에서 식물세포배양(plant cell culture)을 하여 얻는 방법이 있다.

이들 중 직접추출법과 반합성법은 원료의 계속적인 공급이 어렵고 추출/정제에도 많은 어려움이 있으며 환경보호수인 주목나무의 보호에도 적합하지 않은 방식이다. 하지만 식물세포배양법은 기후, 환경 등의 외부 인자에 의한 영향을 받지 않고 생물반응기 내에서 안정적으로 생산이 가능하기 때문에 일정한 품질의 파클리탁셀을 대량 생산할 수 있다는 장점이 있다.

식물세포배양에 의한 파클리탁셀의 분리 및 정제는 여러 단계의 추출 및 정제 공정을 거쳐 높은 순도(>98%)의 제품을 생산하게 된다. 일반적으로 분리 및 정제 과정은 원료인 바이오매스 (파클리탁셀을 함유한 식물체 또는 식물세포)로부터 파클리탁셀을 먼저 유기용매로 추출하고, 전 처리 공정(pre-purification process)을 거쳐 최종정제(purification)를 통하여 제품을 생산하는 공정으로 이루어져 있다. 이 과정에서 특히 전 처리(pre-purification) 공정은 최종 정제 비용에 많은 영향을 미친다. 기존 문헌에 보고된 공정 중에는 정제를 위한 전 처리 공정으로 고가의 크로마토그래피를 이용하고 있거나 전 처리 없이 추출을 거친 미가공 파클리탁셀 (crude paclitaxel)을 HPLC (high performance liquid chromatography)에 의해서 바로 최종 정제하여 경제적 측면에서 많은 문제가 있었으며 또한 스케일 업(scale-up) 및 산업적 대량생산에 많은 어려움이 따랐다.

대체로 바이오매스로부터 유기용매를 이용하여 파클리탁셀을 추출하면 순도는 0.5% 정도이며, 간단한 전 처리 공정 후에도 10% 이하의 순도로 매우 낮다. 이러한 시료를 바로 HPLC에 의하여 최종 정제할 경우 많은 양의 유기용매 사용, 컬럼 팩킹 물질 (레진)의 수명 단축, 처리량 감소 등 상당히 비경제적이며 대량 생산을 위한 공정으로는 적합하지 않다. 따라서 전 처리 공정을 통하여 시료의 순도를 가능한 한 높여 주어야 최종 정제, 특히 HPLC를 이용한 정제에서의 비용을 줄일 수 있다.

이러한 전처리 공정 중 분별침전(fractional-precipitation)은 파클리탁셀의 용해도 차이를 이용하여 간단하고 효율적으로 높은 순도의 파클리탁셀을 고수율로 얻을 수 있는 방법이다. 기존에 보고된 문헌에서는 이러한 분별침전을 최적화하고 개선하기 위하여 다양한 연구들이 시도되었다. 2000년 분별침전 공정으로 높은 순도(>50%)의 파클리탁셀을 얻을 수 있는 방법이 최초로 보고되었으며(Kim et al (2000)., Biotechnology Letters, 22, 1753-1756), 2002년에는 분별침전을 위한 최적의 메탄올 함량에 대한 연구가 수행되었으며(Kim et al (2000)., Process Biochemistry, 37, 679-682), 2006년에는 분별침전 후 보관 온도에 대한 연구가 수행되어 고순도 및 고수율의 파클리탁셀을 얻을 수 있었다(Kim et al., Process Biochemistry, 41, 276-280).

하지만 분별침전의 가장 큰 단점은 침전에 많은 시간(~3 일)이 소요되며 저온(0-4℃)에서 침전이 이루어지기 때문에 경제성 측면에서 파클리탁셀 대량생산 공정에 적용하기에 한계가 있다 (Kim et al (2006)., Kor . J. Biotechnol . Bioeng , 21, 1-10; Kim et al (2000)., Biotechnology Letters, 22, 1753-1756; Kim et al (2002)., Process Biochemistry, 37, 679-682; Kim et al (2006)., Process Biochemistry, 41, 276-280).

따라서 이러한 문제점을 개선하기 위하여 2009~2013년 동안 유리 비드(glass beads) 또는 이온교환수지 등 표면적증가물질을 이용하여 반응기 내부 표면적(surface area per working volume. S/V)을 증가시켜 분별침전 효율을 향상시키려는 연구와 분별침전 시 조추출물(crude extract) 순도 및 순수 파클리탁셀 함량의 영향을 확인하여 침전효율을 향상시키려는 연구가 진행되었다. 이러한 연구들을 통하여 분별침전에 소요되는 긴 침전시간을 어느 정도 단축시켰지만 파클리탁셀의 대량생산을 위한 공정에 적용시키기에는 여전히 미흡한 점이 있고, 높은 수율과 높은 순도를 얻기에는 어려운 실정이다. 따라서 본 발명자들은 분별침전에 소요되는 긴 침전시간과 장시간 저온보관해야 하는 기존 문제들을 획기적으로 개선할 수 있는 방법을 제시하고자 하였다. 즉, 다양한 순도의 시료(crude paclitaxel)를 사용하여 분별침전한 후 초음파 처리를 수행하여 침전시간, 침전수율 및 순도를 파악하고, 궁극적으로 분별침전 시간을 획기적으로 개선할 수 있는 방법을 개발하고자 하였다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 파클리탁셀 정제시 초음파 처리를 통해 분별침전 시간을 획기적으로 개선할 수 있는 분별침전방법 및 이를 포함하는 파클리탁셀 정제방법을 제공하는데 목적이 있다.

상술한 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 파클리탁셀 정제 시 초음파 처리에 의해 수행되는 분별침방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 분별침전방법은 파클리탁셀을 포함하는 시료를 수용성 유기용매와 혼합하고 물을 첨가한 후 초음파를 처리하는 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 수용성 유기용매는 C1 내지 C4의 알코올 및 메틸렌 클로라이드로 이루어진 군으로부터 선택된 1종을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 물은 수용성 유기용매와 물의 부피비가 50:50 내지 20:80이 될 때까지 첨가할 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 초음파 처리는 3분 내지 25분 동안 이루어질 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 초음파 처리는 시료 내 파클리탁셀의 순도가 20% 미만인 경우 30 내지 50 kHz에서 150 내지 300 W의 초음파 파워로 이루어질 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 초음파 처리는 시료 내 파클리탁셀의 순도가 20 내지 70%인 경우 30 내지 50 kHz에서 50 내지 250 W의 초음파 파워로 이루어질 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 분별침전방법은 상온에서 이루어질 수 있다.

본 발명은 또한, a) 택서스속(Taxus genus) 식물체의 세포 배양액으로부터 바이오매스를 수득하는 단계; b) 유기용매 추출을 수행하는 단계; c) 액체-액체 추출을 수행하는 단계; d) 흡착제를 처리하는 단계; e) 헥산 침전 추출을 수행하는 단계; 및 f) 전술한 분별침전단계; 를 포함하는 파클리탁셀 정제방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 a) 단계의 바이오매스는 택서스속 식물체, 이의 세포, 이의 세포 조각(cell debris) 및 이의 세포 배양액으로 이루어진 군에서 선택한 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 분별침전방법 및 이를 포함하는 파클리탁셀 정제방법은 시료 내 파클리탁셀의 순도에 따라 분별침전 단계에서 초음파를 달리 처리하여, 분별침전 시간을 획기적으로 단축시키면서 기존의 파클리탁셀 정제방법과 유사한 수준의 수율 및 순도의 파클리탁셀을 수득할 수 있도록 한다. 또한, 분별침전을 위한 저온 보관도 필요치 않으므로, 파클리탁셀의 대량생산을 위한 공정에 적합하다.

도 1은 파클리탁셀의 정제를 위한 분별침전 단계를 개략도로 나타낸 것이다.
도 2는 초음파 처리에 의한 분별침전 단계 수행 여부에 따른 파클리탁셀의 수율 변화를 나타낸 그래프이다.
도 3은 초음파 처리에 의한 분별침전 단계 수행 여부에 따른 파클리탁셀의 순도 변화를 나타낸 그래프이다.

상술한 바와 같이, 종래 기술에서는 파클리탁셀의 정제방법에서 분별침전에 소요되는 긴 침전시간을 어느 정도 단축시켰지만, 이를 파클리탁셀의 대량생산을 위한 공정에 적용시키기에는 여전히 미흡한 점이 있고, 높은 수율과 높은 순도를 얻기에는 어려운 문제점이 있다.

이에 본 발명자들은 시료 내 파클리탁셀의 순도에 따라 분별침전방법에서 초음파 처리 조건을 달리하여, 분별침전 시간을 획기적으로 단축시킨 분별침전방법, 및 상기 분별침전방법을 수행하여 시간을 현저하게 단축시킬 뿐만 아니라 기존의 파클리탁셀 정제방법과 유사한 수준의 수율 및 순도의 파클리탁셀을 수득할 수 있는 파클리탁셀 정제방법을 개발하였다. 본 발명에 따른 분별침전방법 및 이를 포함하는 파클리탁셀 정제방법은 시료 내 파클리탁셀의 순도에 따라 분별침전 단계에서 초음파를 달리 처리하여, 분별침전 시간을 획기적으로 단축시키면서 기존의 파클리탁셀 정제방법과 유사한 수준의 수율 및 순도의 파클리탁셀을 수득할 수 있도록 한다. 또한, 분별침전을 위한 저온 보관도 필요치 않으므로, 파클리탁셀의 대량생산을 위한 공정에 적합하다.

이하, 첨부한 도면을 참고로 하여 본 발명의 실시예에 대하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본원 명세서 전체에서, "A 및/또는 B"의 기재는, "A 또는 B, 또는, A 및 B"를 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다.

본 발명은 파클리탁셀 정제 시 초음파 처리에 의해 수행되는 분별침전방법을 제공한다.

통상적으로 바이오매스로부터의 파클리탁셀 추출 및 정제방법은 용매추출, 액체-액체 추출, 흡착제 처리, 헥산침전 및 분별침전의 단계로 구성된다 (Kim et al (2002)., Process Biochem 37:679-82; Kim et al (2004)., Process Biochem 39:1985-91; Kim et al (2006)., Korean J. Biotechnol. Bioeng;21(1):1-10).

바이오매스를 이용하여 용매추출, 액체-액체 추출, 흡착제 처리, 헥산 침전 및 분별침전을 거치면 시료의 순도는 각각 0.5-0.7%, 6-9%, 9-10%, 21-27%, 46-61% 정도로 향상된다. 이러한 전처리 공정을 통해 불순물은 다량 제거되었고, 미가공 파클리탁셀(crude paclitaxel)의 순도는 매우 증가하여 최종 HPLC 공정에 적합하게 되었다. 그러나, 분별침전은 침전에 많은 시간(~3 일)이 소요되고 저온(0-4℃)에서 침전이 이루어지기 때문에 경제성 측면에서 파클리탁셀 대량생산 공정에 적용하기에 한계가 있었다.

본 발명자들은, 파클리탁셀 정제에 있어서 분별침전방법에 초음파를 처리하는 경우 침전시간을 획기적으로 단축시킬 수 있다는 것을 확인하였다.

이에 따라, 본 발명의 분별침전방법은 파클리탁셀을 포함하는 미가공의 시료를 수용성 유기용매와 혼합하고 물을 첨가한 후 초음파를 처리하는 것으로 수행된다.

본 발명의 분별침전방법에 있어서, 시료를 수용성 유기용매에 용해하는 것은 수용성 유기용매에 시료를 균일하게 분산할 수 있는 함량으로 용해하는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 수용성 유기용매에 순수 파클리탁셀의 함량이 0.1% 내지 1%(w/v)가 되도록 용해시킬 수 있다.

상기 수용성 유기용매는 통상적으로 식물체에서 유효성분을 추출하기 위해 사용하는 유기용매라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 C1 내지 C4의 알콜 및 메틸렌 클로라이드로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 메탄올을 포함할 수 있다.

그 다음으로, 시료를 수용성 유기용매에 용해시킨 다음 수용성 유기용매와 물의 부피비가 50:50 내지 20:80이 될 때까지 물을 첨가하여 분별침전을 수행한다. 이때, 물은 증류수를 사용할 수 있고, 교반 하에 한 방울씩 떨어뜨려 첨가하는 것이 바람직하다.

교반 속도는 100 내지 300rpm으로 이루어질 수 있다. 만약, 100rpm 미만의 속도로 교반할 경우, 교반으로 인해 수득할 수 있는 이점인 파클리탁셀 침전 속도가 느려 파클리탁셀 침전 시간이 증가하는 문제가 발생할 수 있으며, 300rpm을 초과하는 속도로 교반할 경우, 과도한 혼합으로 조업효율이 저하되는 문제가 발생할 수 있다.

상기 물의 첨가량은 수용성 유기용매와 물의 부피비가 50:50 내지 20:80으로 혼합할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 수용성 유기용매와 물의 부피비가 47:53 내지 35:65로 혼합할 수 있다.

물을 첨가하는 것이 완료되면, 초음파를 처리한다. 초음파 처리 조건은 시료 내 파클리탁셀의 순도에 따라 달라질 수 있다. 초음파 처리 조건에 대해서는 분별침전 전에 수행되는 단계에 따라 나누어 아래에 보다 상세히 설명하였다.

본 발명의 분별침전방법에 있어서, 초음파 처리시간은 3 내지 25 분 동안 이루어질 수 있고, 바람직하게는 5 내지 20분 동안 이루어질 수 있다. 초음파의 파워는 50 내지 300 W인 것이 바람직하다. 만약, 초음파 파워가 50 W 미만인 경우 침전효율이 감소하는 문제가 발생할 수 있고, 초음파 파워가 300 W를 초과하는 경우 파클리탁셀 분해 문제가 발생할 수 있다.

본 발명의 분별침전방법은 상온에서 이루어질 수 있다. 파클리탁셀 정제 시 종래의 분별침전방법은 0 내지 4 ℃의 저온에서 이루어져 경제성 측면에서 파클리탁셀 대량생산 공정에 적용하기에 한계가 있었다.

그러나, 본 발명의 파클리탁셀 정제 시 수행되는 분별침전방법은 파클리탁셀의 순도가 5 내지 70%인 시료를 상온에서 초음파 처리하여 수행되므로, 분별침전을 위한 저온 보관을 필요로 하지 않아 대량생산 공정에 적용하기에 적합하다.

또한, 본 발명은 전술한 분별침전방법을 포함하는 파클리탁셀 정제방법을 제공한다.

본 발명의 파클리탁셀 정제방법은 상기 분별침전방법을 수행하기 전에 a) 택서스속(Taxus genus) 식물체의 세포 배양액으로부터 바이오매스를 수득하는 단계; b) 유기용매 추출을 수행하는 단계; c) 액체-액체 추출을 수행하는 단계;를 수행할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 상기 a) 내지 c) 단계를 거쳐 수득된 순도 6.81%의 파클리탁셀 조추출물을 40 kHz에서 초음파 파워를 80, 180 및 250 W로 처리하여 침전에 소요되는 시간, 파클리탁셀 수율 및 순도를 확인하였다.

그 결과 도 2 및 3에 서 확인되는 바와 같이, 침전시간은 약 20분 정도 소요되었고, 초음파 파워에 따라 수율은 각각 60.9%, 66.4% 및 76.7%였으며, 순도는 각각 8.7%, 9.2% 및 11.0%였다. 반면, 초음파를 처리하지 않은 대조군의 경우 침전시간은 약 72시간 정도 소요되었고, 수율과 순도는 각각 78.1% 및 10.7%였다. 이를 통해, 분별침전 단계에서 저온 보관 없이 상온에서 초음파를 처리하는 경우 분별침전 시간은 획기적으로 단축되지만 수율과 순도는 초음파를 처리하지 않았을 때와 동등한 수준을 유지한다는 것을 확인하였다.

또한, 본 발명의 파클리탁셀 정제방법은 상기 분별침전 단계 전에 a) 택서스속(Taxus genus) 식물체의 세포 배양액으로부터 바이오매스를 수득하는 단계; b) 유기용매 추출을 수행하는 단계; c) 액체-액체 추출을 수행하는 단계; 및 d) 흡착제를 처리하는 단계;를 수행할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 상기 a) 내지 d) 단계를 거쳐 수득된 순도 19.5%의 파클리탁셀 조추출물을 40 kHz에서 초음파 파워를 80, 180 및 250 W로 처리하여 침전에 소요되는 시간, 파클리탁셀 수율 및 순도를 확인하였다.

그 결과 도 2 및 3에 서 확인되는 바와 같이, 침전시간은 약 10분 정도 소요되었고, 초음파 파워에 따라 수율은 각각 62.0%, 61.5% 및 70.8%였으며, 순도는 각각 22.5, 26.8 및 27.8%였다. 반면, 초음파를 처리하지 않은 대조군의 경우 침전시간은 약 14-72시간 정도 소요되었고, 수율과 순도는 각각 73.8% 및 26.8%였다. 이를 통해, 분별침전 단계에서 저온 보관 없이 상온에서 초음파를 처리하는 경우 분별침전 시간은 획기적으로 단축되지만 수율과 순도는 초음파를 처리하지 않았을 때와 동등한 수준을 유지한다는 것을 확인하였다.

또한, 본 발명의 파클리탁셀 정제방법은 상기 분별침전 단계 전에 a) 택서스속(Taxus genus) 식물체의 세포 배양액으로부터 바이오매스를 수득하는 단계; b) 유기용매 추출을 수행하는 단계; c) 액체-액체 추출을 수행하는 단계; d) 흡착제를 처리하는 단계; 및 e) 헥산 침전 추출을 수행하는 단계;를 수행할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 상기 a) 내지 e) 단계를 거쳐 수득된 순도 60.0%의 파클리탁셀 조추출물을 40 kHz에서 초음파 파워를 80, 180 및 250 W로 처리하여 침전에 소요되는 시간, 파클리탁셀 수율 및 순도를 확인하였다.

그 결과 도 2 및 3에서 확인되는 바와 같이, 침전시간은 약 5분 정도 소요되었고, 초음파 파워에 따라 수율은 각각 80.8%, 84.7% 및 77.8%였으며, 순도는 각각 70.2%, 76.2% 및 69.1%였다. 반면, 초음파를 처리하지 않은 대조군의 경우 침전시간은 약 3-6시간 정도 소요되었고, 수율과 순도는 각각 74.3% 및 76.0%였다. 이를 통해, 분별침전 단계에서 저온 보관 없이 상온에서 초음파를 처리하는 경우 분별침전 시간은 획기적으로 단축되지만 수율과 순도는 초음파를 처리하지 않았을 때와 동등한 수준을 유지한다는 것을 확인하였다.

결과적으로, 상온에서 초음파를 처리하여 분별침전을 수행하는 경우, 초음파 파워에 관계없이 침전시간이 20분 이하로 획기적으로 단축된다는 것을 확인하였다. 보다 구체적으로, 수율 및 순도를 고려하였을 때, 파클리탁셀 조추출물의 순도가 20% 미만인 경우 30 내지 50 kHz에서 150 내지 300 W의 초음파 파워로 초음파를 처리하는 것이 유리하고, 보다 바람직하게는 30 내지 50 kHz에서 200 내지 270 W의 초음파 파워로 초음파를 처리하는 것이 유리하다. 파클리탁셀 조추출물의 순도가 20 내지 70%인 경우 30 내지 50 kHz에서 50 내지 250 W의 초음파 파워로 초음파를 처리하는 것이 유리하고, 보다 바람직하게는 30 내지 50 kHz에서 80 내지 200 W의 초음파 파워로 초음파를 처리하는 것이 유리하다.

만약 50 W 미만의 초음파 파워로 초음파가 처리되는 경우, 침전효율이 감소하는 문제가 발생할 수 있고, 300 W를 초과하는 초음파 파워로 초음파가 처리되는 경우, 파클리탁셀 분해 문제가 발생할 수 있다.

본 발명의 파클리탁셀 정제방법에 있어서, 상기 a) 단계의 택서스속(Taxus genus) 식물체의 세포 배양액으로부터 수득한 바이오매스는 택서스속 식물체, 이의 세포, 이의 세포 조각(cell debris) 및 이의 세포 배양액으로 이루어진 군 중에서 선택한 1종 이상을 포함할 수 있다.

또한, 상기 택서스속 식물체는 택서스 브레비폴리아(Taxus brevifolia), 택서스 카나덴시스(Taxus canadensis), 택서스 쿠스피다타(Taxus cuspidata), 택서스 바카타(Taxus baccata), 택서스 글로보사(Taxus globosa), 택서스 플로리다나(Taxus floridana), 택서스 월리치아나(Taxus wallichiana), 택서스 메디아(Taxus media) 또는 택서스 치넨시스(Taxus chinensis) 등이 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 바이오매스를 수득하는 단계는 통상적으로 식물세포배양액으로부터 바이오매스를 수득하는 방법이라면 특별히 제한하지 않는다.

본 발명의 파클리탁셀 정제방법에 있어서, 상기 b) 단계의 유기용매 추출은 통상적으로 식물체에서 유효성분을 추출하기 위해 사용하는 유기용매를 사용하는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 C1 내지 C4의 알코올을 포함할 수 있다.

상기 유기용매의 구체적인 예로는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 메틸렌 클로라이드에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물을 사용할 수 있으며, 바이오매스로부터 파클리탁셀을 가급적 많이 회수할 수 있는 유기용매로 바람직하게는 메탄올을 사용할 수 있다.

나아가, 상기 유기용매 추출의 조건은 통상적으로 식물체에서 유효성분을 추출하는 방법에서 사용할 수 있는 조건이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 20 내지 45℃에서 30분 내지 2시간 동안 수행할 수 있다.

만약, 20℃ 미만의 온도로 처리할 경우, 낮은 온도로 인해 파클리탁셀의 추출 효율이 감소하는 문제가 발생할 수 있으며, 45℃를 초과하는 온도로 처리할 경우, 높은 온도로 인해 파클리탁셀이 분해되는 문제가 발생할 수 있다.

만약, 30분 미만으로 처리할 경우, 바이오매스 내의 파클리탁셀이 모두 추출되지 않아 파클리탁셀의 추출효율이 낮아지는 문제가 발생할 수 있으며, 2시간을 초과하는 시간으로 처리할 경우, 과도한 조업 시간으로 경제적인 문제가 발생할 수 있다.

더불어, 상기 용매 추출은 1회 내지 수회 반복 수행할 수 있으며, 바람직하게는 2회 이상, 더욱 바람직하게는 3회 내지 5회 반복 수행할 수 있고, 이후 수득된 추출액은 감압상태 하에서 농축한 뒤 건조하여 액체-액체 추출단계에 사용할 수 있다.

본 발명의 파클리탁셀 정제방법에 있어서, 상기 c) 단계의 액체-액체 추출은 통상적으로 비극성 유기용매와 극성 유기용매의 상분리를 이용하여 파클리탁셀에 함유되어 있는 극성 불순물을 제거하는 방법이라면 특별히 제한하지 않는다.

예를 들어, 상기 비극성 유기용매는 메틸렌 클로라이드, 에틸아세테이트 및 에테르로 이루어진 군 중에서 선택한 1종 이상의 화합물을 포함할 수 있다. 또한, 상기 극성 유기용매는 C1 내지 C4의 알코올로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.

또한, 상기 액체-액체 추출은 1회 내지 수회 반복 수행할 수 있으며, 바람직하게는 2회 이상, 더욱 바람직하게는 3회 내지 5회 반복 수행할 수 있다.

나아가, 만약 극성 유기용매가 C1 내지 C4의 알코올인 경우, 비극성 유기용매로 메틸렌 클로라이드를 사용하는 것이 바람직하고, 메틸렌 클로라이드는 알코올 농축액의 20 내지 30 %(v/v)로 바람직하게 사용될 수 있으며, 과도한 메틸렌 클로라이드의 사용은 후속 공정에 많은 부담을 초래하게 된다.

본 발명의 파클리탁셀 정제방법에 있어서, 상기 d) 단계의 흡착제 처리는 타르 등의 불순물을 제거하기 위해 실리카계 흡착제를 사용하는 것이 바람직하며, 실리카계 흡착제를 사용하는 경우, 바이오매스 유래 왁스, 타르 등의 불순물을 효과적으로 제거할 수 있으며, 파클리탁셀의 순도 및 정제공정의 효율성을 높이는데 효과적이다.

또한, 상기 d) 단계의 흡착제는 상기 c) 단계에서 수득된 조추출물/흡착제의 비율이 1:0.5 내지 1:2.5 (w/w)가 되도록 처리할 수 있다.

상기 흡착제는 20 내지 60℃에서 30분 동안 처리할 수 있고, 이후 여과지로 여과하여 감압상태에서 건조할 수 있다.

본 발명의 파클리탁셀 정제방법에 있어서, 상기 e) 단계의 헥산 침전 추출은 d) 단계에서 수득한 조추출물에 헥산을 첨가함으로써 파클리탁셀보다 비극성인 물질을 제거할 수 있다.

더불어, 본 발명은 상술한 바와 같은 파클리탁셀의 정제방법으로 정제한 파클리탁셀을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 상기 약학적 조성물은 통상적으로 파클리탁셀을 포함할 수 있는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 항암제, 류마티스 관절염 치료제 또는 알츠하이머 치료제일 수 있다.

상기 항암제는 악성종양의 치료를 위하여 사용되는 화학요법제의 총칭으로, 대부분의 항암제는 암세포의 각종 대사경로에 개입하여 주로 헥산의 합성을 억제하거나 항암활성을 나타내는 약제이다. 정상세포를 손상하지 않고 종양세포만을 저해하는 것은 어렵기 때문에 작용 메커니즘이 여러 가지로 다른 각양각색의 약제가 많은 기업에 의하여 연구되어 왔다. 의약품에 관련된 생물공학의 응용 중 가장 주력하고 있는 분야이다. 현재 판매되고 있는 항암제는 작용 메커니즘에 따라 면역을 부활화하는 것, 대사길항작용이 있는 것, 종양세포를 직접 살상하는 항생물질의 세 가지 종류로 대별된다.

본 발명에 따른 정제방법으로 정제한 파클리탁셀을 포함하는 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

상세하게는, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 파클리탁셀에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.

경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween)61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등 이 사용될 수 있다.

이상에서 본 발명의 일 실시예에 대하여 설명하였으나, 본 발명의 사상은 본 명세서에 제시되는 실시 예에 제한되지 아니하며, 본 발명의 사상을 이해하는 당업자는 동일한 사상의 범위 내에서, 구성요소의 부가, 변경, 삭제, 추가 등에 의해서 다른 실시 예를 용이하게 제안할 수 있을 것이나, 이 또한 본 발명의 사상범위 내에 든다고 할 것이다.

바이오매스의 준비

식물재료와 배양조건

본 실시예에서 사용된 식물세포 배양액은 택서스 치넨시스(Taxus chinensis)의 잎으로부터 얻은 세포주(cell line)를 이용하여 배양하였다. 택서스 치넨시스로부터 기원된 현탁액 세포는 24℃ 암조건(darkness condition)에서 150 rpm 으로 교반하여 배양하였다. 현탁(suspension) 세포는 수정된 Gamborg’s B5 배지, 30 g/l 수크로오스, 10 mM 나프탈렌 아세트산, 0.2 mM 6-벤질아미노퓨린, 1 g/l 카제인 가수분해물, 1 g/l 2-(N-모르폴리노) 에탄설폰산에서 배양하였다. 세포 배양은 2주마다 새로운 배지(medium)로 갈아주었으며 생산과 배양을 연장시키기 위해 7 일과 21 일 째 되는 날에 1~2%(w/v)의 말토오스를 첨가해 주고 유도인자(elicitor)로서 배양초기에 4 mM의 AgNO₃를 첨가해 주었다. 식물세포배양 후 배양액으로부터 데칸터 (Westfalia, CA150 Claritying Decanter)와 고속원심분리기(α-Laval, BTPX205GD-35CDEEP)를 이용하여 식물세포와 세포조각(cell debris)을 회수하였다. 회수한 식물세포와 세포조각을 합하여 바이오매스(biomass)라 하였다.

분별침전을 위한 시료 준비

상기 실시예 1에서 식물세포 배양액으로부터 회수한 바이오매스와 메탄올의 비율을 1/1 (w/v)로 하여 상온(room temperature)에서 30 분 동안 추출하여 여과하고, 바이오매스에 새로운 메탄올을 첨가하여 동일한 방법으로 4 회 반복하여 추출하였다. 이 추출액을 회전증발기(rotary evaporator, CCA-1100, EYELA, Japan)에서 감압상태 하에 농축(원액의 30%)하고 메틸렌 클로라이드를 첨가(농축액의 25%)하여 실온에서 30분 동안 교반 후 정체시켜 상 분리를 유도하였다.

극성 불순물이 포함된 상층의 메탄올 층을 제거한 후, 하층인 메틸렌 클로라이드 층은 회수하여 회전증발기를 이용하여 감압상태에서 농축/건조하였다. 액체-액체 추출을 통해 얻은 건조된 조추출물 (crude extract, 순도: 6.81%)를 시료로 사용하였고 남은 조추출물을 메틸렌 클로라이드에 20% (v/w) 비율로 녹이고 상용흡착제인 실로퓨트 (Fuji Silysia Chemical Ltd., Japan)를 건조된 조추출물 대비 100% (w/w) 비율로 첨가하여 40℃ 항온조(PS-1000, EYELA, Japan)에서 30분 동안 교반하며 반응시킨 후 여과하였다. 이 여과액을 30℃, 감압 하에 건조하여 헥산 침전 공정에 이용하였다.

건조된 시료를 메틸렌 클로라이드에 녹여 헥산(hexane)에 떨어뜨려(methylene chloride/hexane = 1/10, v/v) 침전을 유도하여 비극성 불순물(non-polar impurity)을 제거하였다. 헥산 침전 후, 여과를 통하여 얻어진 침전물을 35℃에서 24 시간 진공 건조하여 분별침전 공정에 이용하였다. 헥산 침전 공정을 통하여 얻은 다양한 순도의 미가공 파클리탁셀 (crude paclitaxel, 순도: 19.5, 60.0%)을 분별침전을 위한 시료로 사용하였다.

초음파 처리에 의한 분별침전

도 1에 나타난 바와 같이 메탄올 용액에서의 파클리탁셀의 용해도 차이를 이용하여 분별침전을 수행하였다.

구체적으로, 상기 실시예 2에서 수득된 미가공 파클리탁셀의 시료(순도: 6.81, 19.5, 60%)를 메탄올에서 순수 파클리탁셀 함량이 0.5%(w/v)가 되도록 시료를 메탄올에 용해하고 상온에서 메탄올/물 비율 (v/v)이 38.5:61.5이 될 때까지 증류수를 교반(180 rpm) 하에 한 방울씩 떨어뜨렸다. 증류수 첨가가 끝난 뒤, 용액을 초음파로 처리하였다. 초음파 파워에 따른 영향을 조사하기 위하여 40kHz ultrasound cleaner(UC-10, Jeiotech, Korea)에서 초음파 파워(80, 180, 250W) 변화에 따른 침전시간, 파클리탁셀 수율 및 순도를 확인하였다. 침전 후 침전물을 여과하여 40℃에서 24 시간 동안 진공오븐(UP-2000, EYELA, Japan)에서 건조하였다. 건조된 침전물의 순도와 수율은 HPLC로 분석하였다.

HPLC에 의한 파클리탁셀 분석

파클리탁셀 함량 분석을 위해 HPLC (high performance liquid chromatography) 시스템 (Waters, USA)과 Capell Pak C₁₈ (250 × 4.6 mm, Shiseido, Japan) 컬럼을 사용하였다. 이동상은 아세토니트릴과 증류수 혼합 용액(65/35 내지 35/65, v/v, 구배 모드)을 유동 속도(flow rate) 1.0 ㎖/분으로 흘려주었다. 시료 주입량은 20 ㎕이며 227 nm에서 UV에 의해 검출하였다. HPLC 분석은 표준정량곡선을 이용하였으며 표준시료는 Sigma-Aldrich 제품(순도: 95%)을 사용하였다.

도 2에 나타난 바와 같이, 초음파 처리를 하지 않은 대조군의 경우, 시료 순도가 6.81, 19.5 및 60.0%일 때 침전시간은 각각 72시간, 14-72시간 및 3-6시간 정도 소요되었고, 수율은 78.1%, 73.8%, 74.3%를 나타내었다. 반면 초음파 처리의 경우, 초음파 파워 80, 180 및 250 W에서 시료 순도가 6.81%일 때 20분 정도 소요로 각각 수율 60.9%, 66.4% 및 76.7%, 시료 순도가 19.5%일 때 침전시간 10분 정도 소요로 각각 수율 62.0%, 61.5% 및 70.8%, 시료 순도가 60.0%일 때 침전시간 5분 정도 소요로 각각 수율 80.8%, 84.7% 및 77.8%이었다.

또한, 도 3에 나타난 바와 같이 초음파 처리를 하지 않은 대조군의 경우, 시료 순도가 6.81, 19.5 및 60.0%일 때 침전시간은 각각 72시간, 14-72시간 및 3-6시간 정도 소요되었고, 순도는 각각 10.7, 26.4 및 76.0%를 나타내었다. 반면 초음파 처리의 경우, 초음파 파워 80, 180 및 250 W에서 시료 순도가 6.81%일 때 침전시간 20분 정도 소요로 각각 순도 8.7, 9.2 및 11.0%, 시료 순도가 19.5%일 때 침전시간 10분 정도 소요로 각각 순도 22.5, 26.8 및 27.8%, 시료 순도가 60.0%일 때 침전시간 5분 정도 소요로 각각 순도 70.2, 76.2 및 69.1%를 나타내었다.

결과적으로, 상온에서 분별침전 시 초음파 처리로 시료의 순도가 6.81, 19.5, 60.0%일 때 침전시간은 초음파 파워에 상관없이 각각 20, 10 및 5분 안에 침전이 완료되는 것을 확인하였다.

종래의 파클리탁셀 정제를 위한 분별침전은 0 내지 4℃의 저온 보관 조건 하에 침전에 최대 3일(72시간) 정도가 소요되었고(Kim et al (2004)., Process Biochemistry, 39, 1985-1991; Kim et al (2000)., Biotechnology Letters, 22, 1753-1756; Kim et al (2002)., Process Biochemistry, 37, 679-682; Kim et al (2006)., Process Biochemistry, 41, 276-280), 반응액 부피당 표면적(surface area per volume of reaction solution, S/V)이 증가된 개선된 분별침전(표면적증가물질: 유리 비드, Amberlite 200, 또는 Amberlite IRA 400 등)의 경우에도 0~4℃의 저온 보관 조건 하에 침전에 소요되는 시간이 여전히 ~12시간 정도 소요된 것을 감안하면(Kim et al (2009)., Process Biochemistry, 44, 736-741; Kim et al (2012)., Separation and Purification Technology, 99, 14-19; Kim et al (2010)., Process Biochemistry, 45, 1368-1374; Kim et al (2012)., Process Biochem, 47, 2388-2397), 본 발명의 초음파 처리에 의한 분별침전 단계를 포함하는 파클리탁셀 정제방법은 종래의 분별침전 단계를 포함하는 파클리탁셀 정제방법과 비슷한 수준의 수율 및 순도를 얻기 위해 소요되는 침전시간을 획기적으로 단축시킬 수 있을 뿐만 아니라 분별침전을 위한 저온 보관도 필요하지 않음을 확인하였다.

Claims (10)

1. 파클리탁셀 정제 시 초음파 처리에 의해 수행되는 분별침전방법.
2. 제1항에 있어서, 파클리탁셀을 포함하는 시료를 수용성 유기용매와 혼합하고 물을 첨가한 후 초음파를 처리하는 것을 특징으로 하는 분별침전방법.
3. 제2항에 있어서, 상기 수용성 유기용매는 C1 내지 C4의 알코올 및 메틸렌 클로라이드로 이루어진 군으로부터 선택된 1종을 포함하는 것을 특징으로 하는 분별침전방법.
4. 제2항에 있어서, 상기 물은 수용성 유기용매와 물의 부피비가 50:50 내지 20:80이 될 때까지 첨가하는 것을 특징으로 하는 분별침전방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 초음파 처리는 3분 내지 25분 동안 이루어지는 것을 특징으로 하는 분별침전방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 초음파 처리는 시료 내 파클리탁셀의 순도가 20% 미만인 경우 30 내지 50 kHz에서 150 내지 300 W의 초음파 파워로 이루어지는 것을 특징으로 하는 분별침전방법.
7. 제1항에 있어서, 상기 초음파 처리는 시료 내 파클리탁셀의 순도가 20 내지 70%인 경우 30 내지 50 kHz에서 50 내지 250 W의 초음파 파워로 이루어지는 것을 특징으로 하는 분별침전방법.
8. 제1항에 있어서, 상기 방법은 상온에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 분별침전방법.
9. a) 택서스속(Taxus genus) 식물체의 세포 배양액으로부터 바이오매스를 수득하는 단계;
   b) 유기용매 추출을 수행하는 단계;
   c) 액체-액체 추출을 수행하는 단계;
   d) 흡착제를 처리하는 단계;
   e) 헥산 침전 추출을 수행하는 단계; 및
   f) 제1항의 분별침전단계; 를 포함하는 파클리탁셀 정제방법.
10. 제9항에 있어서, 상기 a) 단계의 바이오매스는 택서스속 식물체, 이의 세포, 이의 세포 조각(cell debris) 및 이의 세포 배양액으로 이루어진 군에서 선택한 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 파클리탁셀 정제방법.

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