KR20220138228A - 물 및 헥산의 순차적 세척을 통한 파클리탁셀 추출물의 전처리 방법 및 이를 이용한 파클리탁셀의 정제방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 물 및 헥산의 순차적 세척을 통한 파클리탁셀 추출물의 전처리 방법 및 이를 이용한 파클리탁셀의 정제방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 파클리탁셀을 포함하는 바이오매스 (biomass)를 유기용매로 추출한 후 순차적으로 물 및 헥산 세척을 수행함으로써 파클리탁셀을 효과적으로 정제할 수 있는 전처리 방법을 제공한다.

Description

물 및 헥산의 순차적 세척을 통한 파클리탁셀 추출물의 전처리 방법 및 이를 이용한 파클리탁셀의 정제방법 {Pre-treatment method of paclitaxel extract through a tandem water and hexane washing and purification method of paclitaxel using the same}

본 발명은 물 및 헥산의 순차적 세척을 통한 파클리탁셀 추출물의 전처리 방법 및 이를 이용한 파클리탁셀의 정제방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 파클리탁셀을 포함하는 바이오매스 (biomass)를 유기용매로 추출한 후 순차적으로 물 및 헥산 세척을 수행함으로써 파클리탁셀을 효과적으로 정제할 수 있는 전처리 방법을 제공한다.

파클리탁셀 (paclitaxel)은 주목 (yew tree)의 표피에서 발견된 디테르페노이드 (diterpenoid)계 항암물질이며 1971년 Wani 등과 1979년 Schiff 등에 의해 화학적 구조 및 항암 기작이 규명되었으며, 난소암, 유방암, 카포시 종양 (Kaposi's sarcoma), 비소세포성 폐암 (non-small cell lung cancer, NSCLC)의 치료에 대해 미국 FDA (U.S. Food and Drug Administration) 허가를 취득하여 현재까지 가장 중요하게 사용되고 있는 항암제이다.

파클리탁셀의 주요 생산방법에는 주목나무에서 직접 추출하는 방법, 주목나무의 잎에서 전구체 (바카틴 Ⅲ, 10-디아세틸바카틴 Ⅲ, 10-디아세틸파클리탁셀 등)를 얻어 곁사슬 (side chain)을 화학적으로 결합하는 반 합성법, 주목나무에서 캘러스 (callus)를 유도하고 종균 배양을 거쳐 주 배양기에서 식물세포를 배양하여 얻는 방법이 있다.

식물세포배양에 의한 파클리탁셀의 분리/정제는 여러 단계의 추출 및 정제 공정을 거쳐 높은 순도 (>98%)의 제품을 생산하게 된다. 일반적으로, 분리 및 정제 과정은 원료인 바이오매스 (파클리탁셀을 함유한 식물세포)로부터 파클리탁셀을 먼저 유기 용매로 추출 (extraction)하고, 전처리 (pre-purification)를 거쳐 최종 정제 (final purification)를 통하여 제품을 생산하는 공정으로 이루어져 있다. 특히 전처리 (pre-purification) 공정은 최종 정제 비용에 많은 영향을 미친다 (김 등의 Process Biochemistry, 87: 238-243 (2019)).

종래 기술에 따르면, 전처리 공정으로 고가의 크로마토그래피 (chromatography)를 이용하고 있거나 전처리 없이 추출을 거친 미가공 파클리탁셀 (crude paclitaxel)을 HPLC (high performance liquid chromatography)에 의해 바로 최종 정제하여 경제적 측면에서 많은 문제가 있었으며, 또한 스케일 업 (scale-up) 및 산업적 대량 생산에도 많은 어려움이 있었다 (김 등의 Process Biochemistry, 59: 216-222 (2017)). 일반적으로 바이오매스로부터 유기용매를 이용하여 파클리탁셀을 추출하면 순도는 5% 이하이며, 간단한 전처리 공정 후에도 10% 이하로 순도가 매우 낮다. 이러한 시료를 바로 HPLC에 의해 최종 정제할 경우 많은 양의 유기용매 사용, 컬럼에 패킹된 원료 (수지)의 수명 단축, 처리량 (throughput) 감소 등 상당히 비경제적이며, 대량 생산을 위한 공정으로는 적합하지 않다 (김 등의 Process Biochemistry, 51: 1738-1743 (2016)). 따라서, 전처리 공정을 통하여 시료의 순도를 가능한 한 높여 주어야 최종 정제, 특히 HPLC을 이용한 정제에서의 비용을 줄일 수 있다. 그러므로, 간단하고 경제적으로 높은 순도의 파클리탁셀을 고수율로 얻을 수 있는 전처리 공정의 개발이 절실히 필요하다.

종래 기술 (김 등의 Process Biochemistry, 87: 238-243 (2019); 김 등의 Process Biochemistry, 59: 216-222 (2017); 및 김 등의 Process Biochemistry, 39, 1985-1991 (2004))에 따르면, 파클리탁셀의 대량 생산을 위한 분리/정제 공정은 액체-액체 추출 (liquid-liquid extraction), 흡착제 처리 (adsorbent treatment), 헥산 침전 (hexane precipitation), 분별 침전 (fractional precipitation)으로 구성되어 있다. 유기용매 (메탄올)를 이용하여 바이오매스를 추출하여 얻은 추출물 (extract)의 순도는 보통 0.5-0.7% 정도인데, 이를 후속 분리/정제 공정인 액체-액체 추출, 흡착제 처리, 헥산 침전 및 분별 침전을 거치면 시료의 순도는 각각 6-9%, 9-10%, 21-27%, 46-61% 정도로 향상된다 (김 등의 Process Biochemistry, 51: 1738-1743 (2016)). 이러한 전처리 공정을 통해 다량의 불순물이 제거되고 미가공 파클리탁셀의 순도는 매우 증가하여, HPLC을 이용한 최종 정제에 적합하게 된다. 하지만 여러 단계로 구성된 복잡한 공정으로 인해 많은 조업시간이 소요되고, 다량의 유기용매 사용이 요구되어 효율적인 파클리탁셀의 대량 생산이 여전히 어렵고, 파클리탁셀의 생산 원가 절감에도 한계가 있다. 따라서, 본 발명에서는 간단하고 편리한 물 및 헥산의 순차적 세척 방법을 통해 파클리탁셀 정제를 위한 새로운 전처리 공정을 개발하고자 하였다.

본 발명은 상술한 과제를 해결하기 위해 안출된 것으로, 종래의 파클리탁셀 전처리 공정에 비해 전처리 효율이 획기적으로 개선된, 물 및 헥산의 순차적인 세척 방법을 이용한 파클리탁셀의 전처리 방법을 제공한다.

보다 구체적으로는, 물 및 헥산의 순차적 세척을 통해 전처리 방법의 최적화를 이루고, 이에 따라, 파클리탁셀의 순도와 수율 증가 및 조업시간의 단축과 같은 전처리 방법의 효율을 향상시킬 뿐만 아니라 전처리 방법의 단계를 획기적으로 단축시키고자 하는데 목적이 있다.

나아가, 본 발명의 다른 목적은 전술한 파클리탁셀의 전처리 방법을 이용한 파클리탁셀의 정제방법을 제공하는 것이다.

상술한 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 다음의 a) 내지 d) 단계를 포함하는 파클리탁셀의 전처리 방법을 제공한다: a) 파클리탁셀을 포함하는 택서스속 (Taxus genus) 식물체 유래 바이오매스 (biomass)를 수득하는 단계; b) 상기 바이오매스를 유기용매로 추출하여 파클리탁셀 미가공 추출물 (crude extract)을 수득하는 단계; c) 상기 파클리탁셀 미가공 추출물에 물을 첨가하여 교반 및 세척한 후 여과하여 여과물 (cake)을 수득하는 단계; 및 d) 상기 여과물에 헥산을 첨가한 후 교반 및 세척하는 단계.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 a) 단계의 바이오매스는 택서스속 식물체, 이의 세포, 이의 세포 조각(cell debris) 및 이의 세포 배양액으로 이루어진 군에서 선택한 1종 이상을 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 b) 단계의 유기용매는 C₁ 내지 C₄의 알코올 및 물로 이루어진 군에서 선택한 1종 이상을 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 b) 단계의 바이오매스와 유기용매는 1:1 내지 1:6 (w/v) 비율로 혼합될 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 c) 단계는 15℃ 내지 35℃에서 5 내지 20분 동안 수행할 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 c) 단계에서 미가공 추출물과 물의 비율이 1:5 내지 1:60 (w/v)이 되도록 물을 첨가할 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 d) 단계는 15℃ 내지 35℃에서 10 내지 20분 동안 수행할 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 d) 단계에서 여과물과 헥산의 비율이 1:150 내지 1:170 (w/v)이 되도록 헥산을 첨가할 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 c) 단계와 d) 단계 사이에 여과물을 건조하는 단계를 포함하지 않을 수 있다.

본 발명은 또한, 전술한 파클리탁셀의 전처리 방법을 포함하는 파클리탁셀의 정제방법을 제공한다.

본 발명의 물 및 헥산의 순차적 세척을 이용한 파클리탁셀의 전처리 방법은 종래 파클리탁셀의 분리 및 정제를 위한 전처리 공정보다 단축되고 단순화된 파클리탁셀의 전처리 공정을 제공하며, 종래의 파클리탁셀 분리 및 정제방법인, 용매추출, 액체-액체 추출, 흡착제 처리 및 헥산 침전을 순차적으로 수행하여 수득되는 파클리탁셀 시료보다 높은 순도 및 수율로 파클리탁셀을 수득할 수 있으므로, 단시간에 높은 순도의 파클리탁셀을 고수율로 수득할 수 있는 현저한 효과가 있다. 또한, 본 발명의 파클리탁셀 전처리 방법은 모두 상온에서 수행 가능하므로, 저온 보관을 위한 에너지 소모에 따른 고비용 문제를 개선할 수 있다. 따라서, 본 발명의 파클리탁셀 전처리 방법은 파클리탁셀의 대량 생산에 적용하기에 매우 적합하며, 이를 통해 파클리탁셀의 원가 절감 효과를 유도할 수 있다.

도 1(A)는 메탄올을 이용한 바이오매스 추출로부터 수득된 미가공 추출물에 대한 HPLC 크로마토그램 결과를 나타낸 것이고, 도 1(B)는 물 세척 후 수득된 시료 (cake)에 대한 HPLC 크로마토그램 결과를 나타낸 것이며, 도 1(C)는 물 세척 후 여과액에 대한 HPLC 크로마토그램 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 헥산 세척 시 다양한 시료 (cake):헥산 비 (각각 1:80, 1:100, 1:120, 1:140, 1:160 및 1:180 (w/v)) 및 조업 시간에 따른 파클리탁셀의 순도를 나타낸 그래프이다.
도 3(A)는 헥산 세척 후 수득된 시료 (cake)에 대한 HPLC 크로마토그램 결과를 나타낸 것이며, 도 3(B)는 헥산 세척 후 여과액에 대한 HPLC 크로마토그램 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 물 세척 후 여과를 통해 얻은 시료 (cake)를 건조하지 않고 바로 헥산 세척하고 여과하여 수득된 여과물에 대한 HPLC 크로마토그램 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 바이오매스로부터 파클리탁셀의 사전 정제를 위한 순차적 세척 방법을 나타낸 개략도이다.

상술한 바와 같이, 종래의 파클리탁셀의 정제를 위한 전처리 공정은 고가의 크로마토그래피를 이용하거나, 추출된 미가공 추출물을 바로 HPLC 공정에 의하여 최종 정제할 경우 많은 양의 유기용매 사용, 컬럼에 패킹된 원료(resin)의 수명 단축, 처리량 감소 등으로 인해 매우 비경제적이며 대량 생산을 위한 공정으로는 적합하지 않았다. 또한, 종래의 여러 단계의 전처리 공정에 따른 많은 전처리 공정시간 소모와 공정의 복잡성으로 인해 효율적으로 파클리탁셀을 생산하는데 어려움이 존재하여 파클리탁셀의 원가절감을 어렵게 하는 원인이 되었다.

이에, 본 발명에서는 a) 파클리탁셀을 포함하는 택서스속 (Taxus genus) 식물체 유래 바이오매스 (biomass)를 수득하는 단계; b) 상기 바이오매스를 유기용매로 추출하여 파클리탁셀 미가공 추출물 (crude extract)을 수득하는 단계; c) 상기 파클리탁셀 미가공 추출물에 물을 첨가하여 교반 및 세척한 후 여과하여 여과물 (cake)을 수득하는 단계; 및 d) 상기 여과물 (cake)에 헥산을 첨가한 후 교반 및 세척하는 단계를 포함하는 파클리탁셀의 전처리 방법을 제공함으로써, 상술한 문제의 해결방안을 모색하였다. 이를 통해, 종래 파클리탁셀 전처리 공정보다 단축되고 단순화된 공정을 거쳐 높은 순도의 파클리탁셀을 단시간에 고수율로 수득할 수 있어 전처리 공정 효율 (파클리탁셀의 순도와 수율 증가 및 조업 시간 단축)을 현저하게 향상시킬 수 있으므로, 파클리탁셀의 대량생산에 매우 적합하다는 이점이 있다.

먼저, 파클리탁셀을 포함하는 택서스속(Taxus genus) 식물체 유래 바이오매스를 수득하는 단계인 a) 단계를 설명한다.

본 발명의 파클리탁셀 전처리 방법에 있어서, 상기 파클리탁셀을 포함하는 택서스속 식물체 유래 바이오매스는 택서스속 식물체, 이의 세포, 이의 세포 조각 (cell debris) 및 이의 세포 배양액으로 이루어진 군 중에서 선택한 1종 이상을 포함할 수 있다.

또한, 상기 택서스속 식물체는 택서스 브레비폴리아(Taxus brevifolia), 택서스 카나덴시스(Taxus canadensis), 택서스 쿠스피다타(Taxus cuspidata), 택서스 바카타(Taxus baccata), 택서스 글로보사(Taxus globosa), 택서스 플로리다나(Taxus floridana), 택서스 월리치아나(Taxus wallichiana), 택서스 메디아(Taxus media) 또는 택서스 치넨시스(Taxus chinensis) 등이 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 바이오매스를 수득하는 단계는 통상적으로 식물세포배양액으로부터 바이오매스를 수득하는 방법이라면 특별히 제한하지 않는다.

다음으로, 상기 바이오매스를 유기용매로 추출하여 파클리탁셀 미가공 추출물 (crude extract)을 수득하는 단계인 b) 단계를 설명한다.

본 발명의 파클리탁셀 전처리 방법에 있어서, 상기 b) 단계의 유기용매는 통상적으로 식물체에서 유효성분을 추출하기 위해 사용하는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 C₁ 내지 C₄의 알코올 및 물로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함할 수 있다.

상기 유기용매의 구체적인 예로는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 메틸렌 클로라이드에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물을 사용할 수 있으며, 바이오매스로부터 파클리탁셀을 가급적 많이 회수할 수 있는 유기용매로 바람직하게는 메탄올을 사용할 수 있다.

나아가, 상기 유기용매 추출의 조건은 통상적으로 식물체에서 유효성분을 추출하는 방법에서 사용할 수 있는 조건이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 20℃ 내지 45℃에서 30분 내지 2시간 동안 수행할 수 있다.

만약, 20℃미만의 온도로 처리할 경우, 낮은 온도로 인해 파클리탁셀의 추출 효율이 감소하는 문제가 발생할 수 있으며, 45℃를 초과하는 온도로 처리할 경우, 높은 온도로 인해 파클리탁셀이 분해되는 문제가 발생할 수 있다.

만약, 30분 미만으로 처리할 경우, 바이오매스 내의 파클리탁셀이 모두 추출되지 않아 파클리탁셀의 추출효율이 낮아지는 문제가 발생할 수 있으며, 2시간을 초과하는 시간으로 처리할 경우, 과도한 조업 시간으로 경제적인 문제가 발생할 수 있다.

본 발명의 파클리탁셀 전처리 방법에 있어서, 상기 단계의 바이오매스와 유기용매는 1:1 내지 1:6 (w/v) 비율로 혼합될 수 있으나, 이로 한정되는 것은 아니며, 통상적으로 식물체에서 유효성분을 추출하기 위해 사용할 수 있는 비율이라면 특별히 제한하지 않는다. 본 발명의 일실시예에서는 최적의 추출 효율을 위하여 바이오매스와 유기용매를 1:1 (w/v) 비율로 일정하게 혼합하였다.

더불어, 상기 용매 추출은 1회 내지 수회 반복 수행할 수 있으며, 바람직하게는 2회 이상, 더욱 바람직하게는 3회 내지 5회 반복 수행할 수 있고, 이후 수득된 추출액은 감압상태 하에서 농축한 뒤 건조하여 물 세척 단계에 사용할 수 있다.

다음으로, 파클리탁셀 미가공 추출물에 물을 첨가하여 교반 및 세척한 후 여과하여 여과물 (cake)을 수득하는 단계인 c) 단계를 설명한다.

본 발명의 파클리탁셀 전처리 방법에 있어서, 상기 c) 단계는 15℃ 내지 35℃에서 5 내지 60분 동안 수행하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 20℃ 내지 30℃에서 5 내지 30분 동안, 더욱 바람직하게는 20℃ 내지 30℃에서 5 내지 20분 동안 수행할 수 있다.

만약, 15℃ 미만의 온도에서 실시할 경우, 낮은 온도로 인한 경제성 문제가 발생할 수 있으며, 35℃를 초과하는 온도로 처리할 경우, 높은 온도로 인해 파클리탁셀이 분해되는 문제가 발생할 수 있다.

또한, 5분 미만으로 실시할 경우, 파클리탁셀이 충분히 세척되지 않는 문제가 발생할 수 있으며, 60분을 초과하여 실시할 경우, 과도한 조업 시간으로 조업 효율이 떨어지는 문제가 발생할 수 있다.

본 발명의 파클리탁셀 전처리 방법에 있어서, 상기 c) 단계에서 물은 미가공 추출물과 물의 비율이 1:5 내지 1:60 (w/v)이 되도록 첨가할 수 있으며, 바람직하게는 1:25 내지 1:45 (w/v), 보다 바람직하게는 1:35 내지 1:45 (w/v)가 되도록 물을 첨가할 수 있고, 이후 교반 및 세척 후 여과하여 수득된 여과물 (cake)은 헥산 세척 단계에 사용할 수 있다.

본 발명의 구체적인 일실시예에서는 메탄올을 이용한 바이오매스 추출로부터 수득한 시료 (순도: 4.5%)에 시료:물 비가 1:10 내지 1:60 (w/v)이 되도록 물 (distilled water)을 첨가한 후, 교반 하에 10분간 물 세척을 수행하였고, 이후 수득된 시료에 대해 HPLC를 수행하여 파클리탁셀의 순도를 확인하였다. 그 결과, 시료:물 비가 1:40 (w/v)일 때 가장 높은 순도 및 수율의 파클리탁셀을 수득할 수 있었고, 이때의 순도는 도 1(B)에 나타난 바와 같이, ~12.2%였고, 수율은 ~99.9%로 확인되었다. 또한, 물 세척 후 여과액을 회수하여 HPLC를 수행한 결과, 도 1(C)에 나타난 바와 같이 극성 불순물이 다량 검출된 반면, 파클리탁셀은 거의 존재하지 않아, 물 세척이 시료에 포함되어 있는 극성 불순물만을 효과적으로 제거한다는 것을 확인하였다.

마지막으로, 물 세척 후 수득된 여과물 (cake)에 헥산을 첨가한 후 순차적으로 교반 및 세척하는 단계인 d) 단계를 설명한다.

본 발명의 파클리탁셀 전처리 방법에 있어서, 상기 d) 단계는 15℃ 내지 35℃에서 10 내지 20분 동안 수행하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 20℃ 내지 35℃에서 10 내지 20분 동안, 더욱 바람직하게는 20℃ 내지 30℃에서 10 내지 20분 동안 수행할 수 있다.

만약, 15℃ 미만의 온도에서 실시할 경우, 낮은 온도로 인한 경제성 문제가 발생할 수 있으며, 35℃를 초과하는 온도로 처리할 경우, 높은 온도로 인해 파클리탁셀이 분해되는 문제가 발생할 수 있다.

또한, 10분 미만으로 실시할 경우, 파클리탁셀이 충분히 침전되지 않는 문제가 발생할 수 있으며, 20분을 초과하여 실시할 경우, 조업 시간 증가에 따른 파클리탁셀의 순도 및 수율이 상승 효과가 거의 나타나지 않아 조업 효율이 떨어지는 문제가 발생할 수 있다.

본 발명의 파클리탁셀 전처리 방법에 있어서, 상기 d) 단계에서 헥산은 여과물 (cake)과 헥산의 비율이 1:150 내지 1:170 (w/v)이 되도록 첨가할 수 있으며, 보다 바람직하게는 1:155 내지 1:165 (w/v)가 되도록 헥산을 첨가할 수 있고, 이후 교반 및 세척한 후 여과하여 수득된 여과물 (cake)은 추가의 정제 공정에 사용할 수 있다.

본 발명의 구체적인 일실시예에서는 물 세척 후 건조된 시료에 시료:헥산 비가 1:80 내지 1:180 (w/v)이 되도록 헥산을 첨가한 후, 교반 하에 각각 10 내지 40분간 헥산 세척을 수행하였고, 이후 수득된 시료에 대해 HPLC를 수행하여 파클리탁셀의 순도를 확인하였다. 그 결과, 도 2에서 확인되는 바와 같이, 시료:헥산 비가 1:160 (w/v) 이상, 조업 시간이 20분 이상인 경우 순도 증가가 거의 나타나지 않았다. 따라서, 헥산 세척 조건으로 시료:헥산 비는 1:160 (w/v), 처리 시간은 20분이 최적임을 확인하였다. 상기 최적의 헥산 처리 조건에서 헥산 세척 후 여과를 통해 수득한 시료에 대해 HPLC를 수행한 결과, 도 3(A)에 나타난 바와 같이 파클리탁셀 순도는 ~30.2%로 확인되었고 수율은 ~99.9%를 나타내었다.

또한, 상기 최적의 조건으로 헥산 세척 후 여과액을 회수하여 HPLC를 수행한 결과, 도 3(B)에 나타난 바와 같이 비극성 불순물이 다량 검출된 반면, 파클리탁셀은 거의 존재하지 않아, 헥산 세척이 시료에 포함되어 있는 비극성 불순물만을 효과적으로 제거한다는 것을 확인하였다.

본 발명의 파클리탁셀 전처리 방법에 있어서, 상기 c) 단계와 d) 단계 사이에는 여과물 (침전물, cake)을 건조하는 단계를 포함하지 않는다.

본 발명의 구체적인 일실시예에서는 물 및 헥산의 순차적 세척 공정 가능성을 조사하기 위하여, 물 세척 후 여과를 통해 얻은 여과물 (cake)을 건조하지 않고 바로 헥산 세척에 사용하였고, 이후 수득된 시료에 대해 HPLC를 수행하여 파클리탁셀의 순도를 확인하였다. 이때, 물 세척 및 헥산 세척의 조건은 각각 상기에서 확인된 최적의 조건을 적용하였다. 그 결과, 시료 내 파클리탁셀의 순도는 ~30% 정도로 물 세척한 시료를 건조한 후 헥산 세척을 순차적으로 수행한 결과로부터 얻은 파클리탁셀 순도 (30.2%)와 거의 유사하였다.

이러한 결과들을 통해, 본 발명의 파클리탁셀 전처리 방법은 용매추출, 액체-액체 추출, 흡착제 처리 및 헥산 침전을 순차적으로 수행하여 수득되는 파클리탁셀 시료보다 높은 순도 및 수율로 파클리탁셀을 수득할 수 있으므로, 보다 단순화된 공정으로 단시간에 높은 순도의 파클리탁셀을 고수율로 수득할 수 있음을 확인하였다. 또한, 본 발명의 파클리탁셀 전처리 방법은 모두 상온에서 수행 가능하므로, 저온 보관을 위한 에너지 소모에 따른 고비용 문제를 개선할 수 있다.

나아가, 본 발명은 전술한 파클리탁셀의 전처리 방법을 포함하는 파클리탁셀 정제방법을 제공한다.

본 발명의 파클리탁셀 정제방법은 종래의 용매추출, 액체-액체 추출, 흡착제 처리 및 헥산 침전 단계 대신, 바이오매스를 유기용매로 추출한 후 물 및 헥산의 순차적 세척으로 단순화된 공정으로 수행되므로, 공정의 복잡성을 간소화하여 파클리탁셀의 대량 생산에 매우 유용하게 활용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통해 보다 상세하게 설명한다. 단, 본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는바, 이하에서 기술하는 특정 실시예 및 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발 명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니다. 본 발명의 범위는 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

바이오매스 준비

본 실시예에 사용된 식물세포배양액은 택서스 치넨시스 (Taxus chinensis)의 잎으로부터 얻은 세포주(cell line)를 이용하여 배양하였다. 택서스 치넨시스 (Taxus chinensis)로부터 기원된 현탁액 세포는 24℃ 암조건(darkness condition)에서 150 rpm으로 교반하여 배양하였다. 현탁 (suspension) 세포는 수정된 갬보그 B5 배지 (Gamborg's B5 medium), 30 g/L 수크로스, 10 mM 나프탈렌 아세트산 (naphthalene acetic acid), 0.2 μM 6-벤질아미노퓨린 (6-benzylaminopurine), 1 g/L 카제인 가수분해물 (casein hydrolysate), 1 g/L 2-(N-모르폴리노) 에탄술폰산 (2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid)에서 배양하였다. 세포 배양은 2 주마다 새로운 배지(medium)로 갈아주었고, 배양 시간을 연장시키기 위해 7 일과 21 일째 되는 날에 1∼2% (w/v)의 말토스 (maltose)를 첨가해 주고, 유도인자 (elicitor)로서 배양 초기에 4 mM의 AgNO₃를 첨가해 주었다[7,19]. 식물세포배양 후 배양액으로부터 데칸터 (decanter; Westfalia, CA150 Claritying Decanter)와 고속원심분리기(α-Laval, BTPX205GD-35CDEEP)를 이용하여 식물세포와 세포조각(cell debris)을 회수하였다. 회수한 식물세포와 세포조각을 합하여 바이오매스라 하였다.

물 세척 공정에 의한 파클리탁셀 시료의 전처리 및 파클리탁셀 함량 분석

2-1. 물 세척 공정을 위한 시료 준비

실시예 1의 식물세포배양액으로부터 회수한 바이오매스를 메탄올에 용해 (바이오매스/메탄올 비율=1:1, w/v)하여 상온에서 30분 동안 추출하여 여과하고, 바이오매스에 새로운 메탄올을 첨가하여 동일한 방법으로 4회 반복하여 추출하였다. 추출액을 회전 증발기 (rotary evaporator, CCA-1100, EYELA, Japan)에서 감압상태 하에 농축한 후, 진공 오븐 (UP-2000; EYELA)을 이용하여 40 ℃에서 24 시간 동안 완전 건조하였다. 건조된 시료의 순도는 4.5%이었으며, 이를 물 세척 공정에 이용하였다.

2-2. 물 세척 공정

실시예 2-1에서 메탄올을 이용한 바이오매스 추출로부터 수득한 시료 (순도: 4.5%)에 물 (distilled water)을 첨가한 후, 교반 (~300 rpm)하여 물 세척을 수행하였다. 물 세척은 상온에서 실시하였으며 시료/물 비는 1:10-1:60 (w/v)로 설정했고 처리 시간은 10 분이었다. 물 전 처리 후 얻어진 침전물을 여과 (Whatman Grade 5, 2.5 mm, 입자 정체 (particle retention), 150 mm 직경)한 후 얻은 여과물 (cake)을 헥산 세척에 이용하였다. 시료의 순도를 HPLC 분석한 결과 11.2%이었다.

2-3. 파클리탁셀 함량 분석

실시예 2-1 및 2-2에서 수득된 각 시료에서 파클리탁셀의 함량 분석을 위해 HPLC (high performance liquid chromatography) 시스템 (SCL-10AVP, Shimadzu, Japan)과 캅셀팩 C₁₈ (Capcell Pak C₁₈; 250×4.6 mm, Shiseido, Japan) 컬럼을 사용하였다 (김 등의 Process Biochemistry, 99, 316-323; 및 김 등의 Process Biochemistry, 87: 238-243). 이동상은 아세토니트릴-증류수 혼합용액 (35/65~65/35, v/v, 구배용매조성법)이며 유속은 1.0 mL/분이었다. 시료 주입량은 20 μL이며 227 nm에서 UV로 검출하였다. 표준 파클리탁셀 시료 (순도: 95%)는 시그마-알드리치 (Sigma-Aldrich)로부터 구입하여 사용하였다.

실시예 2-1의 메탄올을 이용한 바이오매스 추출로부터 얻은 시료를 건조하여 HPLC를 수행한 결과, 도 1(A)에 나타난 바와 같이 파클리탁셀 순도는 4.5%로 확인되었다.

실시예 2-2에서 시료:물 비를 1:10 내지 1:60 (w/v)로 하여 10분간 물 세척한 후 여과를 통해 수득된 케이크 (cake)를 건조하여 HPLC 수행한 결과, 도 1(B)에서 확인되는 바와 같이 시료:물 비가 1:40 (w/v)인 경우 가장 높은 파클리탁셀 순도(~12.2%)와 수율(~99.9%)을 나타내었다.

또한, 물 세척 후 여과액을 회수하여 HPLC 분석을 통해 얻은 크로마토그램을 확인한 결과, 도 1(C)에 나타난 바와 같이 극성 불순물이 다량 검출되었으며, 이를 통해 물 세척이 시료에 포함되어 있는 극성 불순물의 제거에 매우 효과적임을 알 수 있었다. 더 나아가 여과액에는 파클리탁셀이 거의 존재하지 않았으며, 이를 통해 세척 후 여과를 통해 얻은 시료 (cake)로 대부분의 파클리탁셀 회수가 가능함을 알 수 있었다.

헥산 세척 공정에 의한 파클리탁셀 시료의 전처리 및 파클리탁셀 함량 분석

3-1. 헥산 세척 공정

실시예 2-2에서 물 세척을 통해 얻은 시료 (순도: 11.2%)에 헥산을 첨가한 후, 교반(~300 rpm)하여 헥산 세척을 수행하였다. 헥산 세척은 상온에서 실시하였으며, 최적의 헥산 첨가량을 조사하기 위하여 시료:헥산 비를 1:80, 1:100, 1:120, 1:140, 1:160 및 1:180 (w/v)로 각각 변화시켰다. 또한, 최적의 처리 시간을 조사하기 위해 처리시간을 10, 20, 30 및 40분으로 각각 변화시켰다. 헥산 세척 후 여과 (Whatman Grade 5, 2.5 mm, 입자 정체, 150 mm 직경)를 통해 시료 (cake)를 수득하였으며, 이를 건조하여 HPLC 분석을 통해 파클리탁셀의 순도와 수율을 계산하였다.

3-2. 파클리탁셀 함량 분석

실시예 2-3과 동일한 방법으로 HPLC를 수행하여 파클리탁셀의 함량을 분석하였다.

도 2에서 확인되는 바와 같이, 시료:헥산 비가 1:160 (w/v) 이상인 경우 순도 증가가 거의 나타나지 않았고, 처리 시간은 20분 이후에 순도 증가가 거의 나타나지 않았다. 따라서, 헥산 세척 조건으로 시료:헥산 비는 1:160 (w/v), 처리 시간은 20분이 최적임을 확인하였다. 상기 최적의 헥산 처리 조건에서 헥산 세척 후 여과를 통해 수득한 시료(cake)에 대해 HPLC를 수행한 결과, 도 3(A)에 나타난 바와 같이 파클리탁셀 순도는 ~30.2%로 확인되었고, 수율은 ~99.9%로 확인되었다.

또한, 상기 최적의 조건으로 헥산 세척 후 여과액을 회수하여 HPLC 분석을 통해 얻은 크로마토그램을 확인한 결과, 도 3(B)에 나타난 바와 같이, 여과액에서 비극성 불순물이 다량 검출되었으며, 이를 통해 헥산 세척이 시료에 포함되어 있는 비극성 불순물의 제거에 매우 효과적임을 알 수 있었다. 더 나아가 여과액에 파클리탁셀은 거의 존재하지 않았으며, 이를 통해 세척 후 여과를 통해 얻은 시료 (cake)로 대부분의 파클리탁셀 회수가 가능함을 알 수 있었다.

물 및 헥산의 순차적 세척 공정에 의한 파클리탁셀 시료의 전처리 및 파클리탁셀 함량 분석

4-1. 물 및 헥산의 순차적 세척 공정

물 및 헥산의 순차적 세척 공정 가능성을 조사하기 위하여, 물 세척 후 여과를 통해 얻은 시료 (cake)를 건조하지 않고 바로 헥산 세척에 사용하였다. 이는 물 세척 후 건조 과정이 생략되어 조업시간을 단축할 수 있는 장점이 있다.

구체적으로, 실시예 2-1의 메탄올을 이용한 바이오매스 추출로부터 얻은 시료 (순도: 4.5%)에 물 세척 공정의 최적의 조건인 물:시료 비를 1:40 (w/v)로 하여 10분 동안 물 세척을 수행하고, 물 세척 후 여과 (Whatman Grade 5, 2.5 mm, 입자 정체, 150 mm 직경)를 통해 얻어진 시료 (cake)를 이용하여 순차적으로 헥산 세척을 수행하였다. 마찬가지로, 헥산 세척 공정의 최적의 조건인 시료:헥산 비를 1:160 (w/v)로 하여 20분 동안 헥산 세척을 수행한 후 여과 (Whatman Grade 5, 2.5 mm, 입자 정체, 150 mm 직경)를 통해 얻은 시료 (cake)를 건조하였다.

4-2. 파클리탁셀 함량 분석

실시예 2-3과 동일한 방법으로 HPLC를 수행하여 파클리탁셀의 함량을 분석하였다.

그 결과, 도 4에서 확인되는 바와 같이 파클리탁셀의 순도는 ~30% 정도로 물 세척한 시료를 건조한 후 헥산 세척을 순차적으로 수행한 결과로부터 얻은 파클리탁셀 순도(30.2%)와 거의 유사하였다. 결과적으로 물 세척한 시료를 여과한 후 수득한 시료 (cake)를 건조 없이 바로 순차적으로 헥산 세척을 수행함으로써 공정 시간을 단축할 수 있었다.

본 발명에서 고안된 "물 및 헥산의 순차적 세척 공정”의 개략도를 도 5에 나타내었다.

Claims (10)

1. 다음의 a) 내지 d) 단계를 포함하는 파클리탁셀의 전처리 방법:
   a) 파클리탁셀을 포함하는 택서스속 (Taxus genus) 식물체 유래 바이오매스 (biomass)를 수득하는 단계;
   b) 상기 바이오매스를 유기용매로 추출하여 파클리탁셀 미가공 추출물 (crude extract)을 수득하는 단계;
   c) 상기 파클리탁셀 미가공 추출물에 물을 첨가하여 교반 및 세척한 후 여과하여 여과물 (cake)을 수득하는 단계; 및
   d) 상기 여과물(cake)에 헥산을 첨가한 후 교반 및 세척하는 단계.
2. 제1항에 있어서, 상기 a) 단계의 바이오매스는 택서스속 식물체, 이의 세포, 이의 세포 조각 (cell debris) 및 이의 세포 배양액으로 이루어진 군에서 선택한 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 파클리탁셀의 전처리 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 b) 단계의 유기용매는 C₁ 내지 C₄의 알코올 및 물로 이루어진 군에서 선택한 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 파클리탁셀의 전처리 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 b) 단계의 바이오매스와 유기용매는 1:1 내지 1:6 (w/v) 비율로 혼합되는 것을 특징으로 하는 파클리탁셀의 전처리 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 c) 단계는 15℃ 내지 35℃에서 5분 내지 60분 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 파클리탁셀의 전처리 방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 c) 단계에서 미가공 추출물과 물의 비율이 1:5 내지 1:60 (w/v)이 되도록 물을 첨가하는 것을 특징으로 하는 파클리탁셀의 전처리 방법.
7. 제1항에 있어서, 상기 d) 단계는 15℃ 내지 35℃에서 10분 내지 20분 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 파클리탁셀의 전처리 방법.
8. 제1항에 있어서, 상기 d) 단계에서 여과물과 헥산의 비율이 1:150 내지 1:170 (w/v)이 되도록 헥산을 첨가하는 것을 특징으로 하는 파클리탁셀의 전처리 방법.
9. 제1항에 있어서, 상기 c) 단계와 d) 단계 사이에 여과물을 건조하는 단계를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 파클리탁셀의 전처리 방법.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 파클리탁셀의 전처리 방법을 포함하는 파클리탁셀의 정제방법.

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