KR20230129844A - 파클리탁셀의 분리 및 정제방법 - Google Patents

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공주대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 파클리탁셀의 분리 및 정제방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 음압 캐비테이션 추출, 물 및 헥산의 순차적 세척, 흡착제 처리 및 음압 캐비테이션 분별 침전 단계로 수행되는 파클리탁셀의 효율적인 분리 및 정제방법을 제공한다. 본 발명에 따른 파클리탁셀의 분리 및 정제방법을 통해 파클리탁셀의 순도, 수율 및 조업 시간과 같은 생산 공정 효율을 획기적으로 개선할 수 있다.

Description

파클리탁셀의 분리 및 정제방법 {Method for isolation and purification of paclitaxel}
본 발명은 파클리탁셀의 분리 및 정제 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 음압 캐비테이션 추출, 물 및 헥산의 순차적 세척, 흡착제 처리 및 음압 캐비테이션 분별 침전 단계로 수행되는 파클리탁셀의 효율적인 분리 및 정제 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 파클리탁셀의 분리 및 정제 방법을 통해 파클리탁셀의 순도, 수율 및 조업 시간과 같은 생산 공정 효율을 획기적으로 개선할 수 있다.
파클리탁셀(paclitaxel)은 태평양 주목 나무인 택서스　브레비폴리아(Taxus brevifolia)의 표피에서 분리된 테트라사이클릭 디테르페노이드(tetracyclic diterpenoid, C47H51NO14, M.W.: 853.9) 계열의 천연 화합물로, 도 1과 같은 화학 구조를 갖는다. 이 분자는 미세소관(microtubule)의 안정성 향상으로 해중합(depolymerization)을 저해하여 종양 세포에서 세포 사멸(apoptosis)을 유도한다. 독특한 약리 효과(pharmacological effect)를 가진 파클리탁셀은 유방암, 자궁내막암, 비소세포 폐암, 방광암, 자궁경부암 등에 항암 활성을 보이는 가장 널리 사용되는 화학항암제 중 하나이다. 파클리탁셀은 원래 택서스　브레비폴리아(T. brevifolia)에서 발견되었지만, 유럽 주목(T. baccata) 또는 중국 주목(T. chinensis)과 같은 다른 택서스(Taxus) 종에도 존재하는 것으로 보고되었다. 파클리탁셀은 1971년에 항암 활성이 처음 보고되었으며[L. -T. et al., "Investigating two distinct dummy templates molecularly imprinted polymers as paclitaxel adsorbent in synthesis system and releaser in biological samples," Microchemical Journal, 165, 106042(2021).], 미국 식품의약국(FDA)으로부터 1992년에 난소암 치료제로 승인되었고, 1994년과 1999년에는 진행성 유방암과 초기 유방암 치료제로 각각 승인되었다[F. Y. Alqahtani et al., "Chapter Three - Paclitaxel," Profiles of Drug Substances, Excipients and Related Methodology, 44, 205-238(2019)]. 파클리탁셀의 적응증 확대와 처방법의 개발로 그 수요는 계속 늘어날 전망이다[Y. -S. et al., "Characteristics and mechanism of microwave-assisted drying of amorphous paclitaxel for removal of residual solvent," Biotechnol. Bioprocess Eng., 24, 529-535(2019); M. Ghorbani et al., "Paclitaxel resistance resulted in a stem-like state in triple-negative breast cancer: A systems biology approach," Meta Gene, 26, 100800(2020); T. Sun, et al., "Administration with hyperoside sensitizes breast cancer cells to paclitaxel by blocking the TLR4 sigmaling," Mol. Cell. Probes, 53, 101602(2020)]. 글로벌 파클리탁셀 시장 규모(원료의약품 기준)는 2020년 1억 1,740만 달러에서 2026년까지 1억 9,360만 달러에 이를 것으로 예상되며, 2021-2026년 의 연평균 성장률(compound annual growth rate, CAGR)은 8.7%에 달할 것으로 예상된다.
1971년 고무적인 초기 항암 활성 발견에도 불구하고 널리 사용될 수 없었다. 주목(yew tree)의 나무껍질을 벗겨서 파클리탁셀을 얻는 직접 추출 방법은 주목 나무에 포함된 파클리탁셀 함량이 매우 낮아(농도; 0.001-0.05%) 암환자 1명 치료에 약 6그루의 주목 나무를 필요로 하여, 암 치료에 충분한 양을 공급하기에 높은 생태학적 비용이 들었기 때문이다. 또한, 직접 추출 방법은 환경 보호수인 주목나무 보호에 적합하지 않다. 다른 파클리탁셀의 생산 방법으로 주목의 잎에서 전구체(바카틴 Ⅲ, 10-디아세틸바카틴 Ⅲ, 10-디아세틸파클리탁셀 등)를 회수하여 곁사슬을 화학적으로 결합하는 반합성 방법이 있지만, 이 또한 원료의 지속적인 공급이 어려우며 추출/정제에도 많은 어려움이 있다. 직접 추출 방법과 반합성 방법의 지속 불가능한 공급 문제를 해결하기 위해 식물체로부터 유도된 캘러스(callus)를 이용한 식물 세포 배양 방법이 개발되었다. 식물 세포 배양은 외부 인자(기후, 환경)의 영향이 적어 안정적으로 생산이 가능하며, 생물반응기에서 일정한 품질의 파클리탁셀을 지속적으로 공급할 수 있다.
식물 세포 배양에 의하여 생산된 파클리탁셀은 대표적 이차대사산물(secondary metabolite)로 대부분 바이오매스(식물 세포)에 축적되어 있다. 바이오매스로부터 높은 순도의 파클리탁셀을 생산하기 위해서 여러 추출(extraction) 및 정제 단계를 거치게 된다. 일반적으로 원료인 바이오매스로부터 파클리탁셀을 먼저 유기 용매로 추출하고 전처리 정제(pre-purification)를 거쳐 최종 정제(final purification)를 통하여 제품을 생산하는 공정으로 이루어져 있다. 기존 문헌에 의하면, 2000년 이전에는 전처리 정제 공정으로 높은 비용을 요구하는 크로마토그래피를 이용하고 있거나 전처리 정제 없이 추출된 미가공 파클리탁셀(crude paclitaxel)을 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC)로 최종 정제하여 경제적 측면에서 바람직하지 않으며 또한 스케일 업 및 산업적 대량 생산에도 많은 어려움이 있었다[G. -J. Kim et al., "A simultaneous microwave-assisted extraction and adsorbent treatment process under acidic conditions for recovery and separation of paclitaxel from plant cell," Korean J. Chem. Eng., 32, 1023-1028(2015); H. -J. Kang et al., "Removal of residual toluene and methyl tertiary butyl ether from amorphous paclitaxel by simple rotary evaporation with alcohol pretreatment," Biotechnol. Bioprocess Eng., 25, 86-93(2020)]. 일반적으로 바이오매스로부터 유기용매를 통한 파클리탁셀 추출 시 순도는 0.5% 이하로 알려져 있으며, 간단한 전처리 정제 공정을 도입하여도 그 순도는 10% 이하 수준이다. 이러한 시료를 바로 HPLC에 의해 최종 정제할 경우 많은 양의 유기용매 사용, 충전제(resin) 수명 단축, 처리량 감소 등의 문제가 발생할 수 있어 매우 비경제적이며 대량 생산을 위한 공정으로는 적합하지 않다[H. -J. Kang et al., "Removal of residual toluene and methyl tertiary butyl ether from amorphous paclitaxel by simple rotary evaporation with alcohol pretreatment," Biotechnol. Bioprocess Eng., 25, 86-93(2020)]. 따라서, 전처리 정제 공정에서 시료의 순도를 최대한 높여 주어야 최종 정제, 특히 HPLC를 이용한 정제에서 비용을 줄일 수 있다.
이러한 문제를 해결하기 위해 2000년 이후에 먼저 유기 용매로 여러 번의 추출을 진행하고, 전처리 정제 [액-액 추출, 흡착제 처리, 헥산 침전, 분별 침전] 및 최종 정제 [ODS-HPLC, Silica-HPLC] 과정을 통하여 고순도(>98%)의 파클리탁셀을 얻는 방법이 개발되었다[H. -J. Kang et al., "Removal of residual chloroform from amorphous paclitaxel preated by alcohol," Korean J. Chem. Eng., 36, 1965-1970(2019); C. -G. Lee et al., "Increasing the efficiency of the separation and purification process for paclitaxel by pre-treatment with water", Process Biochem., 51, 1738-1743(2016); K. -W. Yoo aet al., "Kinetics and mechanism of ultrasound-assisted extraction of paclitaxel from Taxus chinensis," Biotechnol. Bioprocess Eng., 23, 532-540(2018)]. 바이오매스 유래 파클리탁셀 생산을 위한 전통적인 분리 및 정제 공정을 도 2a에 나타내었다. 유기 용매(메탄올)를 이용하여 바이오매스로부터 추출된 시료의 순도는 보통 0.5-0.7% 정도인데, 이를 후속 분리/정제 공정인 액-액 추출, 흡착제 처리, 헥산 침전, 분별 침전을 수행하면 시료의 순도는 각각 6-9%, 9-10%, 21-27%, 46-61% 정도로 향상되고, 분리 및 정제에는 18.2-76.2 시간 정도가 소요된다[[Kim, J. -H., "Comparison of conventional solvent extraction, microwave-assisted extraction, and ultrasound-assisted extraction methods for paclitaxel recovery from biomass," Korean Chem. Eng. Res., 58, 273-279(2020)]. 이러한 전처리 정제 공정을 통해 바이오매스 유래 불순물이 다량 제거되어 시료의 순도는 향상되고(순도>50%), 이로 인해 HPLC을 이용한 최종 정제에 적합한 시료를 얻게 된다. 하지만 여러 번의 추출 및 여러 단계로 구성된 전처리 정제 공정으로 인해 많은 조업 시간이 소요되고 다량의 유기용매 사용이 요구되어 효율적인 파클리탁셀의 대량생산이 어렵고 파클리탁셀의 생산원가 절감에도 한계가 있다[[Kim, J. -H., "Comparison of conventional solvent extraction, microwave-assisted extraction, and ultrasound-assisted extraction methods for paclitaxel recovery from biomass," Korean Chem. Eng. Res., 58, 273-279(2020)]. 따라서 생산 원가 절감을 위한 보다 효율적이고 경제적인 분리 및 정제 공정이 필요하다.
파클리탁셀 분리 및 정제의 첫 번째 단계인 추출 공정에서 경제적 관점에서 먼저 바이오매스로부터 파클리탁셀을 높은 수율로 회수하는 것이 매우 중요하다. 파클리탁셀 회수를 위해 일반적으로 용매 추출(solvent extraction) 방법이 널리 이용되고 있으며 유기 용매로 메탄올은 가장 적은 양으로 가장 높은 회수율을 얻어 추출에 가장 효과적이다[G. Chen et al., "Ultrasonic extraction, structural characterization, physicochemical properties and antioxidant activities of polysaccharides from bamboo shoots(Chimonobambusa quadrangularis) processing by-products," International Journal of Biological Macromolecules, 112, 656-666(2018)]. 또한, 주요 공정 변수(메탄올 농도, 바이오매스/메탄올 비, 조업 시간, 추출 횟수 등)를 최적화하여 바이오매스로부터 파클리탁셀 회수율을 증가시켰다[G. Chen et al., "Ultrasonic extraction, structural characterization, physicochemical properties and antioxidant activities of polysaccharides from bamboo shoots(Chimonobambusa quadrangularis) processing by-products," International Journal of Biological Macromolecules, 112, 656-666(2018)]. 하지만 전통적 용매 추출의 경우 여러 단계의 추출로 많은 유기 용매와 조업 시간이 요구되는 단점이 있다.
최근까지 바이오매스로부터 파클리탁셀을 효과적으로 회수할 수 있는 마이크로웨이브(microwave) 또는 초음파(ultrasound)를 이용한 추출 방식이 보고되고 있다[Kim, J. -H., "Comparison of conventional solvent extraction, microwave-assisted extraction, and ultrasound-assisted extraction methods for paclitaxel recovery from biomass," Korean Chem. Eng. Res., 58, 273-279(2020); Davoud, S. et al.,"Oil stability index and biological activities of Achillea biebersteinii and Achillea wilhelmsii extracts as influenced by various ultrasound intensities," Ind. Crop. Prod., 55, 163-172(2014); Chunying, L. et al., "Ionic-liquid-based ultrasound/microwave-assisted extraction of 2,4-dihydroxy-7-methoxy-1,4-benzoxazin-3-one and 6-methoxy,benzoxazolin-2-one from maize(Zea mays L.) seedlings," J. Sep. Sci., 38, 291-300(2015); Pstsaporn, P. et al., "Enhancement of microwave-assisted extraction of bioactive compounds from cabbage outer leaves via the application of ultrasonic pretreatment," Sep. Purif. Technol., 144, 37-45(2015); Ana, C, S. et al., "Effect of ultrasound on the technological properties and bioactivity of food: a review," Trends Food Sci. Technol., 21, 323-331(2010); Hyun, J. E. et al., "Microwave-assisted extraction of paclitaxel from plant cell cultures," Korean J. Biotechnol. Bioeng., 23, 281-284(2008)]. 특히 초음파를 이용한 추출(ultrasound-assisted extraction)에서는 초음파 캐비테이션 효과로 보다 효율적인 추출이 가능하였다. 하지만, 이들 방식의 경우 추출 횟수를 단축시켜 조업 시간을 절감하고 용매 사용량을 줄일 수 있으나 추가 장치 및 에너지 비용이 발생하고 공정이 복잡할 수 있다. 따라서, 공정 효율성뿐만 아니라 공정 편리성(convenient)과 실행 가능성(feasibility)이 담보되는 새로운 추출 기술인 그린(green) 음압 캐비테이션 추출 공정이 개발되었다[H. -S. Min et al., "Study of the extraction kinetics and calculation of effective diffusivity and mass transfer coefficient in negative pressure cavitation extraction of paclitaxel from Taxus chinensis," Biotechnol. Bioproc. Eng., Accepted(2021)]. 하지만 파클리탁셀의 분리 및 정제 공정에 적용된 사례는 전무한 실정이다.
추출 후 이루어지는 전처리 정제 공정은 최종 정제 비용에 많은 영향을 미친다. 기존 공정의 긴 조업 시간을 개선하기 위하여, 바이오매스 추출로부터 얻은 건조된 추출물에 물을 1:40(w/v) 비율로 첨가하고 10 분간 교반을 진행하는 물 세척 방법을 도입하여 파클리탁셀 전처리 정제(pre-purification) 효율을 개선하려는 연구가 시도되었다[Kim, J. -H., "Comparison of conventional solvent extraction, microwave-assisted extraction, and ultrasound-assisted extraction methods for paclitaxel recovery from biomass," Korean Chem. Eng. Res., 58, 273-279(2020)]. 바이오매스 유래 다량의 극성 불순물을 효과적으로 제거하여 긴 조업(전처리 정제) 시간을 어느 정도 단축시켰지만 파클리탁셀의 대량 생산 공정에 적용하기에는 여전히 부족한 실정이다. 또 다른 전처리 정제 공정 중 하나인 분별 침전(fractional precipitation)이란 파클리탁셀의 용해도 차이를 이용한 간단하고 효과적인 방법이다. 2000년 식물세포 유래 파클리탁셀의 분별 침전 방법이 최초로 보고되었으며, 이후 분별 침전 조건(용매, 온도, 시료 특성)의 최적화로 높은 순도의 파클리탁셀을 고수율로 얻을 수 있었다[J. H. Kim et al., "A novel prepurification for paclitaxel from plant cell cultures," Process Biochem., 37, 679-682(2002); S. I. Jeon et al., "Optimal temperature control in fractional precipitation for paclitaxel pre-purification," Process Biochem., 41, 276-280(2006)]. 하지만 분별 침전이 저온(0-4 ℃에서 장시간(~3 days) 조업이 이루어지기 때문에 경제성 측면에서 파클리탁셀 대량생산 공정에 적용하기에 한계가 있다.
이러한 문제점을 개선하기 위하여 유리구슬(glass beads) 또는 이온교환수지를 이용하여 침전기 내부 표면적(surface area per working volume, S/V)을 증가시켜 침전 효율을 향상하려는 연구가 시도되었다[Y. -L. Jeon et al., "Precipitation characteristics of paclitaxel in solvent systems with different ion exchange resins," Korean J. Chem. Eng., 30, 1954-1959(2013); K. -Y. Jeon et al., "Improvement of fractional precipitation process for pre-purification of paclitaxel," Process Biochem., 44 736-741(2009); H. A. Sim et al., "Evaluation of a high surface area acetone/pentane precipitation process for the purification of paclitaxel from plant cell cultures," Sep. Purif. Technol., 89, 112-116(2012)]. 이러한 연구들을 통해 아세톤-펜테인 용매 시스템에서는 침전 시간은 단축시키지 못하였고, 메탄올-물 용매 시스템에서는 긴 침전 시간을 어느 정도 단축시켰지만 파클리탁셀의 대량 생산 공정에 적용하기에는 여전히 부족한 실정이다. 2014년에는 침전 용액(메탄올-증류수 혼합물)의 극성 조절에 의해 침전 시간을 0.5 시간으로 단축시켰지만 과도한 증류수 첨가로 파클리탁셀 순도가 오히려 감소하는 문제가 있었다[C. -G. Lee et al., "Improved fractional precipitation method for purification of paclitaxel," Process Biochem., 49, 1370-1376(2014)]. 최근에는 초음파를 이용한 분별 침전으로 기존의 긴 침전 시간을 획기적으로 개선하였다[H. -W. Seo and J. -H. Kim, "Ultrasound-assisted fractional precipitation of paclitaxel from Taxus chinensis cell cultures," Process Biochem., 87, 238-243(2019); J. -H. Kim, "Optimization of liquid-liquid extraction conditions for paclitaxel separation from plant cell cultures," KSBBJ, 24, 212-215(2009)]. 즉, 침전 과정에 초음파를 도입함으로써 핵 생성 속도(nucleation rate)를 증가시켜 침전 시간을 단축할 수 있었다. 이러한 결과는 초음파 캐비테이션에 기인하는 것으로 캐비테이션 버블이 압축(compression)과 팽창(expansion) 과정에서 결국 불안정 해져서 붕괴되어 침전 용액의 마이크로젯, 강열한 국소 가열, 고압 충격파가 발생되기 때문으로 설명되고 있다. 하지만 초음파 캐비테이션 분별 침전의 경우 조업 시간을 줄일 수 있으나 추가 장치 및 에너지 비용이 발생하고 공정이 복잡할 수 있다.
따라서, 공정 효율성뿐만 아니라 공정 편리성(convenient)과 실행 가능성(feasibility)이 담보되는 새로운 캐비테이션 기반 분별 침전 기술인 음압 캐비테이션 분별 침전이 개발되었으나, 파클리탁셀의 분리 및 정제 공정에 적용된 사례는 전무한 실정이다.
이에 따라, 본 발명자들은 음압 캐비테이션 기술을 도입하여 기존 추출 공정에서 여러 번의 추출 단계(4회)를 단 1회로 단축하고자 하였으며, 바이오매스 유래 극성 불순물과 비극성 불순물을 제거하는 액-액 추출 및 헥산 침전을 간단한 물/헥산의 순차적 세척 방법으로 대체하고자 하였다. 또한, 많은 공정 시간이 요구되는 기존 분별 침전에 음압 캐비테이션 기술을 도입하여 조업시간을 획기적으로 단축하고자 하였다. 즉, 도 2b에서 보는 바와 같이 캐비테이션 추출 방법, 물/헥산 세척 방법 및 캐비테이션 분별 침전을 파클리탁셀 분리 및 정제 공정에 최초로 도입하여, 파클리탁셀 생산을 위한 친환경적이고 간편한 공정(추출 및 전처리 정제)을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다. 또한, 본 발명자들은 추출, 세척, 분별 침전의 조건을 최적화하여 파클리탁셀 분리/정제 공정 효율(순도, 수율) 향상뿐만 아니라 조업 시간도 획기적으로 단축시키고자 하였다.
본 발명은 상술한 과제를 해결하기 위해 안출된 것으로, 추출 단계의 단축, 효과적인 불순물 제거 및 분별 침전의 조업 시간 단축을 통해, 친환경적이고 공정의 편리성 및 실행가능성이 개선될 뿐만 아니라, 최종적으로 수득되는 파클리탁셀의 순도 및 수율이 향상된, 파클리탁셀의 분리 및 정제 방법을 제공하는데 목적이 있다.
상술한 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 다음의 a) 내지 f) 단계를 포함하는 파클리탁셀의 분리 및 정제 방법을 제공한다:
a) 파클리탁셀을 포함하는 택서스속(Taxus genus) 식물체 유래 바이오매스(biomass)를 수득하는 단계;
b) 상기 바이오매스를 유기용매와 혼합하고 음압 캐비테이션을 도입하여 파클리탁셀 미가공 추출물(crude extract)을 수득하는 단계;
c) 상기 파클리탁셀 미가공 추출물에 물을 첨가하여 교반 및 세척한 후 여과하여 여과물(cake)을 수득하는 단계;
d) 상기 여과물(cake)에 헥산을 첨가한 후 교반 및 세척하는 단계;
e) 흡착제를 처리하는 단계; 및
f) 음압 캐비테이션을 도입하여 분별 침전을 수행하는 단계.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 a) 단계의 바이오매스는 택서스속 식물체, 이의 세포, 이의 세포 조각(cell debris) 및 이의 세포 배양액으로 이루어진 군에서 선택한 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일 실시예에 따르면, 상기 b) 단계의 유기용매는 C1 내지 C4의 알코올 및 물로 이루어진 군에서 선택한 1종 이상이고, 상기 바이오매스와 상기 유기용매는 1:1 내지 1:6(w/v) 비율로 혼합될 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 b) 단계의 음압을 가하여 파클리탁셀을 추출하는 단계는 0 내지 30 ℃에서 20분 이하의 시간 동안 1회 수행될 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일 실시예에 따르면, 상기 b) 단계는 -50 mmHg 내지 -300 mmHg의 음압을 가하여 캐비테이션 버블을 발생시키는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 c) 단계는 미가공 추출물과 물의 비율이 1:5 내지 1:60(w/v)이 되도록 물을 첨가하여 0 ℃내지 30 ℃에서 5분 내지 60분 동안 수행될 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일 실시예에 따르면, 상기 d) 단계는 여과물과 헥산의 비율이 1:150 내지 1:170(w/v)이 되도록 헥산을 첨가하여 0 ℃내지 30 ℃에서 10분 내지 20분 동안 수행될 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 c) 단계와 d) 단계 사이에 여과물을 건조하는 단계를 포함하지 않을 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일 실시예에 따르면, 상기 e) 단계는 상기 d) 단계 이후에 수득되는 미가공 파클리탁셀 추출물 : 흡착제의 비율이 1:0.5 내지 1:2.5(w/w)가 되도록 처리하여 20 ℃ 내지 60 ℃에서 20분 내지 60분 동안 수행될 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 f) 단계는 상기 e) 단계 이후에 수득되는 미가공 파클리탁셀 추출물을 수용성 유기용매와 혼합하고 펜테인 또는 물을 첨가한 후 음압 캐비테이션을 도입하는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일 실시예에 따르면, 상기 수용성 유기용매는 C1 내지 C4의 알코올 및 아세톤으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종을 포함하고, 상기 펜테인은 수용성 유기용매와 펜테인의 비율이 1:3 내지 1:9(v/v)가 될 때까지 첨가하고, 상기 물은 수용성 유기용매와 물의 비율이 10:90 내지 80:20(v/v)가 될 때까지 첨가하는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 음압 캐비테이션 도입은 -50 mmHg 내지 -300 mmHg의 음압을 가하여 캐비테이션 버블을 발생시켜 0 ℃ 내지 30 ℃에서 1분 내지 20분 동안 수행될 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일 실시예에 따르면, 상기 f) 단계는:
f-1) 상기 e) 단계 이후에 수득되는 미가공 파클리탁셀 추출물을 수용성 유기용매와 혼합하고 펜테인을 첨가한 후 음압 캐비테이션을 도입하여 1차 분별 침전을 수행하고, 1차 분별 침전 후 수득되는 미가공 파클리탁셀 추출물을 수용성 유기용매와 혼합하고 물을 첨가한 후 음압 캐비테이션을 도입하여 2차 분별 침전을 수행하거나; 또는
f-2) 상기 e) 단계 이후에 수득되는 미가공 파클리탁셀 추출물을 수용성 유기용매와 혼합하고 물을 첨가한 후 음압 캐비테이션을 도입하여 1차 분별 침전을 수행하고, 1차 분별 침전 후 수득되는 미가공 파클리탁셀 추출물을 수용성 유기용매와 혼합하고 펜테인을 첨가한 후 음압 캐비테이션을 도입하여 2차 분별 침전을 수행하는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일 실시예에 따르면, 상기 f-1) 및 f-2) 단계에서 펜테인을 첨가하는 경우, 상기 수용성 유기용매는 C1 내지 C4의 알코올 및 아세톤으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종을 포함하고, 상기 펜테인은 수용성 유기용매와 펜테인의 비율이 1:3 내지 1:9(v/v)가 될 때까지 첨가하는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 f-1) 및 f-2) 단계에서 물을 첨가하는 경우, 상기 수용성 유기용매는 C1 내지 C4의 알코올 및 아세톤으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종을 포함하고, 상기 물은 수용성 유기용매와 물의 비가 10:90 내지 80:20(v/v)가 될 때까지 첨가하는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일 실시예에 따르면, 상기 f-1) 및 f-2) 단계에서 음압 캐비테이션 도입은 -50 mmHg 내지 -300 mmHg의 음압을 가하여 0 ℃ 내지 30 ℃에서 1분 내지 20분 동안 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 파클리탁셀의 분리 및 정제 방법은 음압 캐비테이션 추출, 물/헥산의 순차적 세척, 흡착제 처리 및 음압 캐비테이션 분별 침전 단계를 수행함으로써, 파클리탁셀의 분리 및 정제를 위한 기존의 공정에 비해 고순도의 파클리탁셀을 고수율로 짧은 조업 시간에 수득하는 것이 가능하다. 또한, 본 발명의 파클리탁셀의 분리 및 정제 방법은 다량의 유기용매를 사용하지 않더라도 파클리탁셀을 효과적으로 추출할 수 있고, 공정 과정에서 마이크로웨이브 또는 초음파 발생 장치와 같은 고가의 추가 장치를 필요로 하지 않으며, 기존 공정에 비해 전체적인 조업 시간이 현저하게 단축됨에 따라, 공정의 효율성, 편리성 및 실행가능성이 개선되어 파클리탁셀의 대량생산을 위한 공정으로 적용하기에 적합하다.
도 1은 파클리탁셀의 화학 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 바이오매스로부터 파클리탁셀을 분리 및 정제 방법하는 방법을 나타낸 것으로, (A)는 기존의 전통적인 방법, (B)는 본 발명에 따른 신규 방법을 비교하여 나타낸 것이다.
도 3은 바이오매스로부터 파클리탁셀을 회수하기 위한 추출 방법의 개략도를 나타낸 것으로, (A)는 기존의 통상적인 추출 방법, (B)는 음압 캐비테이션 추출 방법을 보여준다.
도 4는 물 및 헥산 세척 방법의 수행 순서, 각 세척 방법의 단독 또는 순차적 수행 및 순차적 세척 방법 사이의 건조 수행 여부에 따라 서로 다르게 수행된 4가지 전처리 정제 방법을 나타낸 것으로, 방법 I(Method I)과 방법 II(Method II)는 각각 물 및 헥산 세척을 단독으로 수행하는 방법, 방법 III(Method III)과 방법 IV(Method IV)는 각각 물 세척 후 헥산 세척을 순차적으로 수행하되, 방법 IV는 세척 사이 건조를 수행하는 방법을 보여준다. 방법 V(Method V)와 방법 VI(Method VI)은 헥산 세척 후 물 세척을 순차적으로 진행하되, 방법 VI은 세척 사이에 건조를 수행하는 방법을 보여준다.
도 5는 물 및 헥산 세척 단계에서의 크로마토그램을 나타낸 것으로, (A)는 음압 캐비테이션 추출 후 수득된 미가공 추출물, (B)는 물 세척 후 수득된 여과물, (C)는 헥산 세척 후 수득된 미가공 파클리탁셀 추출물, (D)는 건조 없이 물 및 헥산 세척을 순차적으로 수행한 후 수득된 미가공 파클리탁셀 추출물, (E)는 건조 없이 헥산 및 물 세척을 순차적으로 수행한 후 수득된 미가공 파클리탁셀 추출물, (F)는 물 세척, 건조 및 헥산 세척을 수행한 후 수득된 미가공 파클리탁셀 추출물 및 (G)는 헥산 세척, 건조 및 물 세척을 수행한 후 수득된 미가공 파클리탁셀 추출물의 크로마토그램을 보여준다.
도 6은 바이오매스로부터 파클라탁셀의 전처리 정제를 위한 순차적 세척 방법을 나타낸 개략도이다.
도 7은 물 및 헥산 세척을 순차적으로 수행한 후 수득되는 여과물의 크로마토그램을 나타낸 것으로, (A)는 물 세척 후 수득된 여과물 및 (B)는 헥산 세척 후 수득되는 여과물의 크로마토그램을 보여준다.
도 8은 캐비테이션 추출, 순차적인 물 및 헥산 세척 및 음압 캐비테이션 분별 침전을 이용한 파클리탁셀의 분리 및 정제 방법의 전략을 나타낸 것으로, 방법 I(Method I)은 아세톤-펜테인 분별 침전을 이용한 방법, 방법 II(Method II)는 메탄올-물 분별 침전을 이용한 방법을 보여준다.
도 9는 파클리탁셀의 정제를 위한 분별 침전 방법의 개략도를 나타낸 것으로, (A)는 기존의 통상적인 아세톤-펜테인 분별 침전, (B)는 음압 캐비테이션 아세톤-펜테인 분별 침전, (C)는 기존의 통상적인 메탄올-물 분별 침전 및 (D)는 음압 캐비테이션 메탄올-물 분별 침전 방법을 보여준다.
도 10은 흡착제 처리 전(A)과 후(B)의 미가공 파클리탁셀 추출물에 대한 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 11은 음압 캐비테이션 추출, 순차적인 물 및 헥산 세척, 흡착제 처리 및 음압 캐비테이션 분별 침전을 이용한 파클리탁셀의 분리 및 정제 방법의 전략을 나타낸 것으로, 방법 I(Method I)은 아세톤-펜테인 음압 캐비테이션 분별 침전을 단독으로 이용한 방법, 방법 II(Method II)는 아세톤-펜테인 및 메탄올-물 음압 캐비테이션 분별 침전을 순차적으로 이용한 방법, 방법 III(Method III)은 메탄올-물 음압 캐비테이션 분별 침전을 단독으로 이용한 방법, 방법 IV(Method IV)는 물-메타올 및 아세톤-펜테인 음압 캐비테이션 분별 침전을 순차적으로 이용한 방법을 보여준다.
상술한 바와 같이, 파클리탁셀의 분리 및 정제 공정에서 있어서 고순도의 파클리탁셀을 높은 수율로 수득하면서 조업시간을 단축시키기 위한 다양한 시도가 있었으나, 저온에서의 장시간 조업, 과도한 증류수의 첨가로 인한 파클리탁셀 순도 감소, 추가 장치의 필요성, 에너지 비용 발생 및 공정의 복잡성 등의 문제로 인해 파클리탁셀의 대량생산을 위한 공정에 적용하기에는 한계가 있었다.
이에, 본 발명에서는 도 2b에서 보는 바와 같이 캐비테이션 추출 방법, 물/헥산의 순차적 세척 방법 및 캐비테이션 분별 침전을 파클리탁셀 분리 및 정제 공정에 최초로 도입하여, 친환경적이고 간편한 파클리탁셀의 분리 및 정제 방법을 개발하였고, 추가로 추출, 세척 및 분별 침전의 세부적인 조건을 최적화하여 공정 효율(순도, 수율)의 향상뿐만 아니라 조업 시간도 획기적으로 단축시킴으로써 상술한 문제의 해결방안을 모색하였다.
따라서, 본 발명은 다음의 a) 내지 f) 단계를 포함하는 파클리탁셀의 분리 및 정제 방법을 제공한다:
a) 파클리탁셀을 포함하는 택서스속(Taxus genus) 식물체 유래 바이오매스(biomass)를 수득하는 단계;
b) 상기 바이오매스를 유기용매와 혼합하고 음압 캐비테이션을 도입하여 파클리탁셀 미가공 추출물(crude extract)을 수득하는 단계;
c) 상기 파클리탁셀 미가공 추출물에 물을 첨가하여 교반 및 세척한 후 여과하여 여과물(cake)을 수득하는 단계;
d) 상기 여과물(cake)에 헥산을 첨가한 후 교반 및 세척하는 단계;
e) 흡착제를 처리하는 단계; 및
f) 음압 캐비테이션을 도입하여 분별 침전을 수행하는 단계.
본 발명의 파클리탁셀의 분리 및 정제 방법에 있어서, a) 단계는 파클리탁셀을 포함하는 택서스속(Taxus genus) 식물체 유래 바이오매스를 수득하는 단계로, 상기 바이오매스는 택서스속 식물체, 이의 세포, 이의 세포 조각(cell debris) 및 이의 세포 배양액으로 이루어진 군에서 선택한 1종 이상을 포함할 수 있다.
이때, 파클리탁셀을 추출하고자 하는 대상은 택서스속 식물체의 잎으로부터 얻은 캘러스(callus)를 이용한 식물세포배양으로부터 회수한 식물세포인 바이오매스(biomass)인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 택서스속 식물체는 택서스 브레비폴리아(Taxus brevifolia), 택서스 카나덴시스(Taxus canadensis), 택서스 쿠스피다타(Taxus cuspidata), 택서스 바카타(Taxus baccata), 택서스 글로보사(Taxus globosa), 택서스 플로리다나(Taxus floridana), 택서스 월리치아나(Taxus wallichiana), 택서스 메디아(Taxus media) 또는 택서스 치넨시스(Taxus chinensis) 등이 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 파클리탁셀 분리 및 정제 방법에 있어서, 상기 바이오매스를 수득하는 a) 단계는 통상적으로 식물세포 배양액으로부터 바이오매스를 수득하는 방법이라면 특별히 제한하지 않는다.
본 발명의 파클리탁셀 분리 및 정제 방법에 있어서, b) 단계는 상기 a) 단계에서 수득된 바이오매스를 유기용매와 혼합하고 음압 캐비테이션을 도입하여 파클리탁셀을 추출하는 단계로, 상기 유기용매는 통상적으로 식물체에서 유효성분을 추출하기 위해 사용하는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 C1 내지 C4의 알코올, 메틸렌 클로라이드 및 물로 이루어진 군에서 선택한 1종 이상을 포함할 수 있다.
상기 유기용매의 구체적인 예로는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 메틸렌 클로라이드 및 물로 이루어진 군에서 선택한 1종 또는 2종 이상의 혼합물을 사용할 수 있으며, 바이오매스로부터 파클리탁셀을 가급적 많이 회수할 수 있는 유기용매로 바람직하게는 메탄올을 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 80 내지 100%의 농도의 메탄올을 사용할 수 있다.
또한, 상기 b) 단계의 바이오매스와 유기용매는 1:1 내지 1:6(w/v) 비율로 혼합될 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니며, 통상적으로 식물체에서 유효성분을 추출하기 위해 사용할 수 있는 비율이라면 특별히 제한하지 않는다. 본 발명의 일 구현예에서는 최적의 추출 효율을 위하여 바이오매스와 유기용매를 1:2(w/v) 비율로 일정하게 혼합하였다.
상기 최적화된 추출 용매의 종류, 농도 및 비율은 바이오매스를 추출 대상으로 하였을 때 파클리탁셀 회수율을 극대화할 수 있는 조건이므로, 추출 대상이 달라짐에 따라, 추출 대상에 따른 최적화된 추출 용매의 종류, 농도 및 비율을 확인하기 위한 수많은 반복 실험이 별도로 요구된다.
본 발명의 파클리탁셀 분리 및 정제 방법에 있어서, 상기 b) 단계는 -50 mmHg 내지 -300 mmHg의 음압을 가하여 캐비테이션 버블을 발생시키는 방식으로 수행될 수 있다.
본 발명에서, 용어 "음압(negative pressure)"은 대기압(760 mmHg)보다 낮은 압력을 말한다. 구체적으로, 상기 b) 단계는 대기압 760 mmHg보다 낮은 압력이 되도록 -50 mmHg 내지 -300 mmHg, 바람직하게는 -160 mmHg 내지 -260 mmHg의 범위의 압력을 가하는 것일 수 있다.
본 발명의 파클리탁셀 분리 및 정제 방법에 있어서, 상기 b) 단계는 진공도(degree of vacuum), 즉 대기압과의 차이가 증가할수록 파클리탁셀의 회수율이 증가하나, -300 mmHg를 초과하는 음압에서 추출을 수행하는 경우, 추출 용매의 과도한 증발과 이로 인한 파클리탁셀 회수율 감소로 추출 효율이 감소할 수 있고, -50 mmHg 미만의 음압에서 추출을 수행하는 경우, 대기압에서 추출을 수행하였을 때와 비교하여 파클리탁셀 회수율 증가 효과가 미미할 수 있다. 따라서, 파클리탁셀 추출 효율을 극대화하기 위해서는 상기 범위 내의 음압에서 파클리탁셀을 추출하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 용어 "음압 캐비테이션(negative pressure cavitation)"은 음압으로 야기되는 캐비테이션으로, 액체-고체 시스템(liquid-solid system)에 도입되어 추출 용매와 매트릭스 사이의 교류(turbulence), 충돌(collision) 및 물질 전달을 증가시킨다.
본 발명의 파클리탁셀 분리 및 정제 방법에 있어서, 음압 하에 파클리탁셀을 추출하는 b) 단계는 단 1회 수행하는 것만으로도 바이오매스로부터 파클리탁셀을 약 90 내지 100%까지 회수할 수 있다.
이때, 상기 b) 단계는 0 ℃ 내지 30 ℃에서 20분 이하의 시간 동안 수행할 수 있다. 바람직하게는 5 ℃ 내지 30 ℃, 보다 바람직하게는 10 ℃ 내지 30 ℃에서 5분 내지 20분, 보다 바람직하게는 10분 내지 20분 동안 수행할 수 있다.
본 발명의 파클리탁셀 추출방법은 특별히 고안된 음압 캐비테이션 장치 없이 시판되는 진공 조절기(vacuum controller) 및 진공 펌프(vacuum pump)만을 이용하여 추출 용매 내로 음압을 가하는 방식으로 수행될 수 있다.
일반적으로 추출 시간이 길어질수록 장시간 캐비테이션 버블을 발생시킬 수 있도록 질소와 같은 기타 가스를 추출 용매 내로 도입하는 것이 요구될 수 있으나, 본 발명의 파클리탁셀 추출 방법은 20분 이하의 짧은 시간 안에 조업이 완료되므로 추출 과정에서 추출 용기에 질소를 도입하는 것은 필요치 않다. 따라서, 본 발명의 음압 캐비테이션을 이용한 파클리탁셀 추출방법은 추출 횟수를 단축하기 위해 요구되는 장치를 최소화 및/또는 단순화함으로써, 마이크로웨이브 또는 초음파를 이용한 추출 공정의 한계였던 공정의 복잡성, 장치의 위험성 및 많은 에너지 소모에 의한 고비용 문제를 획기적으로 개선할 수 있다.
본 발명의 파클리탁셀 분리 및 정제 방법에 있어서, c) 단계는 물 세척을 수행하는 단계로, 구체적으로 상기 b) 단계에서 수득되는 미가공 파클리탁셀 추출물에 물을 첨가하여 교반 및 세척한 후 여과하여 여과물(cake)을 수득하는 방식으로 수행된다.
본 발명의 파클리탁셀 전처리 방법에 있어서, 상기 c) 단계에서 물은 미가공 추출물과 물의 비율이 1:5 내지 1:60(w/v)이 되도록 첨가할 수 있으며, 바람직하게는 1:25 내지 1:45(w/v), 보다 바람직하게는 1:35 내지 1:45(w/v)가 되도록 물을 첨가할 수 있고, 이후 교반 및 세척 후 여과하여 수득된 여과물(cake)은 헥산 세척 단계에 사용할 수 있다.
상기 c) 단계의 물 세척은 0 ℃ 내지 30 ℃에서 교반 하에 5 내지 60분 동안 수행하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 5 ℃ 내지 30 ℃에서 5 내지 30분 동안, 더욱 바람직하게는 10 ℃ 내지 30 ℃에서 5 내지 20분 동안 수행할 수 있다.
본 발명의 파클리탁셀 분리 및 정제 방법에 있어서, d) 단계는 헥산 세척을 수행하는 단계로, 구체적으로 상기 c) 단계에서 수득되는 여과물(cake)에 헥산을 첨가한 후 교반 및 세척하는 방식으로 수행된다.
본 발명의 파클리탁셀 분리 및 정제 방법에 있어서, 상기 d) 단계에서 헥산은 여과물(cake)과 헥산의 비율이 1:150 내지 1:170(w/v)이 되도록 첨가할 수 있으며, 보다 바람직하게는 1:155 내지 1:165(w/v)가 되도록 헥산을 첨가할 수 있고, 이후 교반 및 세척한 후 여과하여 수득된 여과물(cake)은 추가의 정제 공정에 사용할 수 있다.
상기 d) 단계의 헥산 세척은 0 ℃ 내지 30 ℃에서 교반 하에 10 내지 20분 동안 수행하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 5 ℃ 내지 30 ℃, 더욱 바람직하게는 10 ℃ 내지 30 ℃에서 10 내지 20분 동안 수행할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 도 4에 나타낸 바와 같이 물 또는 헥산 단독 세척과 물 및 헥산의 2단계 세척을 수행하여, 2단계의 순차적 세척 시 각 세척의 순서와 세척 사이 건조에 따른 영향을 조사하였다. 그 결과, 도 5(A) 내지 5(C)에 나타난 바와 같이 단독 세척의 경우 물 세척 전후의 파클리탁셀 순도는 약 6% 증가한 반면 헥산 세척 전후 파클리탁셀 순도는 약 0.3% 증가하여 순도 변화가 미미한 것으로 확인되었다. 또한, 도 5(A), 5(D) 및 5(E)에 나타난 바와 같이 2단계 세척 시 물 및 헥산의 순차적 세척에 따른 파클리탁셀 순도는 26.6%까지 증가한 반면, 헥산 및 물의 순차적 세척에 따른 파클리탁셀 순도는 13.8%까지 증가하였다. 따라서, 단독 세척보다는 2단계의 순차적 세척이 효과적이며, 특히 물 및 헥산 순서로 2단계 세척을 수행하는 것이 가장 효과적임을 알 수 있다.
본 발명의 파클리탁셀 분리 및 정제 방법에 있어서, 상기 c) 단계와 d) 단계 사이에는 여과물(cake)을 건조하는 단계를 포함하지 않는다.
본 발명의 구체적인 다른 일 실시예에서는 도 4에 나타낸 바와 같이 물 및 헥산 세척과 헥산 및 물 세척의 2단계 세척 수행 시 각 세척 단계 사이에 건조를 수행하여, 세척 사이 건조가 미치는 영향을 조사하였다. 그 결과, 도 5(F)에 나타난 바와 같이 물 및 헥산 순서로 세척을 수행한 경우 건조 유무에 따른 파클리탁셀 순도 변화는 미미하였으며, 건조를 수행함으로써 오히려 공정 비용이 높아지는 문제가 발생함을 확인하였다. 또한, 도 5(G)에 나타난 바와 같이 헥산 및 물 순서로 세척을 수행한 경우에는 건조를 수행하지 않은 파클리탁셀 순도가 건조를 수행한 파클리탁셀 순도보다 2배 가량 높아 세척 사이 건조가 오히려 세척 효율을 저하시킴을 확인하였다.
결과적으로, 세척 순서는 1단계 물 세척, 2단계 헥산 세척이 최적이었으며, 두 종류의 세척 사이 건조 단계는 세척 효율 향상에 도움이 되지 않았다. 따라서, 1단계 세척한 시료를 여과한 후 수득한 케이크를 건조 없이 바로 순차적으로 2단계 세척을 수행하는 것이 공정 시간을 단축하고 공정 비용을 절감할 수 있음을 확인하였다. 이에 따라, 본 발명에서 개발된 "최적화된 물 및 헥산의 순차적 세척 공정"의 개략도는 도 6에 나타내었다.
본 발명의 구체적인 다른 일 실시예에서는 물 및 헥산의 순차적 세척 공정에서 각 단계별 여과액을 HPLC로 분석하여 각 세척 단계에 따른 불순물 제가 효율을 조사하였다. 도 7(A) 및 7(B)에서 확인되는 바와 같이, 물 세척 후 여과액과 헥산 세척 후 여과액에서 각각 극성 불순물과 비극성 불산물이 다량 검출되었으나 파클리탁셀은 거의 존재하지 않았다. 이를 통해, 물 및 헥산 세척 후 여과를 통해 수득한 여과물(cake)로 대부분의 파클리탁셀을 회수할 수 있음을 확인하였다.
문헌[Kim, J. -H., "Comparison of conventional solvent extraction, microwave-assisted extraction, and ultrasound-assisted extraction methods for paclitaxel recovery from biomass," Korean Chem. Eng. Res., 58, 273-279(2020).]에 따르면, 바이오매스 유래 극성 불순물 제거를 위해 주로 액-액 추출(liquid-liquid extraction) 공정이 사용되는데, 액-액 추출을 통해 얻은 파클리탁셀 순도와 조업 시간은 각각 6.0-8.8%, ~1.5 시간이었다. 또한, 바이오매스 유래 비극성 불순물 제거를 위해 헥산 침전(hexane precipitation) 공정(파클리탁셀 순도: 21.0-27.1%)을 이용한 것에 비하면, 본 발명에서 정립된 물 및 헥산 세척 방법(파클리탁셀 순도: 26.6%)이 훨씬 간단하고 편리할 뿐만 아니라 공정 효율 또한 높았다. 따라서, 본 발명에서 정립된 물 및 헥산의 순차적 세척 방법(파클리탁셀 순도: 26.6%, 조업 시간: 0.5 시간)은 공정 효율, 편리성 및 실행가능성이 개선되어 파클리탁셀의 대량생산을 위한 공정으로 적용하기에 적합하다.
본 발명의 파클리탁셀 분리 및 정제 방법에 있어서, 상기 e) 단계는 불순물을 제거하기 위한 흡착제 처리 단계로, 실리카계 흡착제를 사용하는 것이 바람직하다. 실리카계 흡착제를 사용하는 경우, 바이오매스 유래 왁스, 타르 등의 불순물을 효과적으로 제거할 수 있으며, 파클리탁셀의 순도 및 정제 공정의 효율성을 높이는데 효과적이다.
또한, 상기 e) 단계의 흡착제는 상기 d) 단계에서 수득되는 미가공 파클리탁셀 추출물에 미가공 파클리탁셀 추출물:흡착제의 비율이 1:0.5 내지 1:2.5(w/w)가 되도록 처리할 수 있다. 상기 흡착제는 20 ℃ 내지 60 ℃에서 20분 내지 40분 동안 처리할 수 있고, 이후 여과지로 여과하여 감압상태에서 건조할 수 있다.
본 발명의 파클리탁셀의 분리 및 정제 방법에 있어서, f) 단계는 음압 캐비테이션 분별 침전을 수행하는 단계로, 예를 들어, 상기 e) 단계 이후에 수득되는 미가공 파클리탁셀 추출물을 수용성 유기용매와 혼합하고 펜테인 또는 물을 첨가한 후 음압 캐비테이션을 도입하는 방식으로 수행될 수 있다.
상기 f) 단계에서 수용성 유기용매는 통상적으로 식물체 유래 유효성분을 용해하기 위해 사용하는 수용성 유기용매라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 C1 내지 C4의 알코올 및 아세톤으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종을 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 메탄올 또는 아세톤을 포함할 수 있다. 이때, 상기 e) 단계에서 수득되는 미가공 파클리탁셀 시료는 수용성 용매에 균일하게 분산될 수 있는 함량으로 용해시킬 수 있다.
또한, 상기 f) 단계에서 펜테인을 첨가하는 경우, 상기 펜테인은 수용성 유기용매와 펜테인의 비율이 1:3 내지 1:9(v/v)가 될 때까지 첨가할 수 있고, 교반 하에 한 방울씩 떨어뜨려 분별 침전을 수행하는 것이 바람직하다. 교반 속도는 100 내지 400 rpm이 바람직하다.
상기 f) 단계에서 물을 첨가하는 경우, 상기 물은 수용성 유기용매와 물의 비율이 10:90 내지 80:20(v/v)가 될 때까지 첨가할 수 있고, 교반 하에 한 방울씩 떨어뜨려 분별 침전을 수행하는 것이 바람직하다. 교반 속도는 100 내지 400 rpm이 바람직하다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면, 상기 f) 단계에서 상기 수용성 유기용매가 아세톤이고 물을 첨가하는 경우, 상기 물은 아세톤과 물의 비율이 10:90 내지 40:60 (v/v)가 될 때까지 첨가할 수 있다.
본 발명의 구체적인 다른 일 실시예에 따르면, 상기 f) 단계에서 상기 수용성 유기용매가 메탄올이고 물을 첨가하는 경우, 상기 물은 메탄올과 물의 비율이 50:50 내지 80:20 (v/v)가 될 때까지 첨가할 수 있다.
펜테인 또는 물을 첨가하는 것이 완료되면, 음압을 가하여 캐비테이션 버블을 발생시킨다. 상기 f) 단계는 대기압 760 mmHg보다 낮은 압력이 되도록 -50 mmHg 내지 -300 mmHg, 바람직하게는 -80 mmHg 내지 -260 mmHg의 범위의 압력을 가하여 캐비테이션 버블을 발생시킴으로써 수행될 수 있다.
만일, -300 mmHg을 초과하는 음압에서 분별침전을 수행하는 경우, 침전 용액의 증발로 조업이 어려워지 는 문제점이 발생할 수 있고, -50 mmHg 미만의 음압에서 분별침전을 수행하는 경우, 대기압에서 분별침전을 수행하였을 때와 비교하여 파클리탁셀 회수율 증가 효과가 미미할 수 있다. 따라서, 파클리탁셀 정제 시 분별침전의 효율을 극대화하기 위해서는 상기 범위 내의 음압에서 분별침전을 수행하는 것이 바람직하다.
이때, 상기 음압 캐비테이션 도입은 0 ℃ 내지 30 ℃에서 1분 내지 10분, 바람직하게는 5분 내지 10분 동안 수행될 수 있다.
본 발명의 파클리탁셀의 분리 및 정제 방법에 있어서, 상기 f) 단계의 음압 캐비테이션 분별 침전은 상온에서 수행하는 것이 가능하므로, 분별 침전을 위한 저온 보관이 필요치 않아 대량생산 공정에 적용하기에 적합하다.
상기 f) 단계의 음압 캐비테이션 분별 침전 또한 특별히 고안된 음압 캐비테이션 장치 없이 시판되는 진공 조절기(vacuum controller) 및 진공 펌프(vacuum pump)만을 이용하여 용매 내로 음압을 가하는 방식으로 수행될 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 도 8에 나타낸 바와 같이 음압 캐비테이션 추출, 물 및 헥산의 순차적 세척 및 음압 캐비테이션 분별 침전의 세 공정만을 이용하여 분리 및 정제를 수행하였을 때의 공정 효율성을 조사하였다. 방법 I(Method I)은 음압 캐비테이션 추출, 물 및 헥산의 순차적 세척 및 음압 캐비테이션 아세톤-펜테인 분별 침전을 수행한 것으로, 최종 순도 및 총괄 수율은 각각 36.0% 및 61.0%이었다. 본 발명에서 흡착제 처리된 시료를 이용하여 수행한 어쿠스틱 캐비테이션 기반 아세톤-펜테인 분별 침전(초음파 캐비테이션 분별 침전 시 순도 및 수율: 58.8-60.8%, 94.3-95.4%, 음압 캐비테이션 분별 침전 시 순도 및 수율: 44-53% 및 73.2-99.9%)과 비교하였을 때, 흡착제를 처리하지 않은 방법 I의 최종 파클리탁셀 순도 및 수율이 매우 낮음을 확인하였다.
방법 II(Method II)는 음압 캐비테이션 추출, 물/헥산 순차적 세척, 음압 캐비테이션 메탄올-물 분별 침전을 수행한 것으로, 최종 순도 및 총괄 수율은 각각 31.1% 및 74.2%이었다. 본 발명에서 흡착제 처리된 시료를 이용하여 수행한 캐비테이션 기반 메탄올-물 분별 침전(초음파 캐비테이션 분별 침전 시 순도 및 수율: 29.7-33.8%, 80.6-84.6%, 음압 캐비테이션 분별 침전 시 순도 및 수율: 34-41, 88.2-98.6%)과 비교하였을 때, 마찬가지로 흡착제를 처리하지 않은 방법 II의 최종 파클리탁셀 순도 및 수율이 매우 낮음을 확인하였다.
흡착제를 처리하지 않은 경우, 모든 용매 시스템에서 공정 효율성이 낮아지는 것으로 확인되었으며, 이는 세척만으로 제거되지 않은 바이오매스 유래 타르 및 왁스 성분에 의해 분별 침전 효율이 떨어졌기 때문인 것으로 판단된다. 타르 및 왁스 성분은 파클리탁셀 분리 및 정제 공정에 많은 악영향을 미쳐 전처리 정제 공정에서 반드시 제거되어야 하며, 이들 성분은 흡착제 처리로 쉽게 제거할 수 있다. 따라서, 본 발명의 파클리탁셀 분리 및 정제 방법에서는 물 및 헥산 순차적 세척과 분별 침전 사이에 흡착제 처리 공정을 도입하였다.
본 발명의 구체적인 다른 일 실시예에서는 흡착제 처리에 따른 불순물 제거 효율을 조사하였다. 도 10(A)와 10(B)에서 확인되는 바와 같이 흡착제 처리에 따른 파클리탁셀의 순도 증가 효과는 미미하였으나, 극성 불순물과 비극성 불순물이 다량 제거되었고, 짙은 색, 타르 및 왁스 성분도 제거되었다.
본 발명의 파클리탁셀의 분리 및 정제 방법에 있어서, 상기 f) 단계의 음압 캐비테이션 분별 침전은 2회 연속으로 수행될 수도 있다.
구체적으로, 상기 f) 단계의 음압 캐비테이션 분별 침전을 2회 연속으로 수행하는 경우, f-1) 상기 e) 단계 이후에 수득되는 미가공 파클리탁셀 추출물을 수용성 유기용매와 혼합하고 펜테인을 첨가한 후 음압 캐비테이션을 도입하여 1차 분별 침전을 수행하고, 1차 분별 침전 후 수득되는 미가공 파클리탁셀 추출물을 수용성 유기용매와 혼합하고 물을 첨가한 후 음압 캐비테이션을 도입하여 2차 분별 침전을 수행하거나, 또는
f-2) 상기 e) 단계 이후에 수득되는 미가공 파클리탁셀 추출물을 수용성 유기용매와 혼합하고 물을 첨가한 후 음압 캐비테이션을 도입하여 1차 분별 침전을 수행하고, 1차 분별 침전 후 수득되는 미가공 파클리탁셀 추출물을 수용성 유기용매와 혼합하고 펜테인을 첨가한 후 음압 캐비테이션을 도입하여 2차 분별 침전을 수행할 수 있다.
상기 f-1) 및 f-2) 단계에서 펜테인을 첨가하여 음압 캐비테이션 분별 침전을 수행하는 경우에 대한 여러 가지 조건은 전술한 바와 동일하므로, 그 기재를 생략한다.
상기 f-1) 및 f-2) 단계에서 물을 첨가하여 음압 캐비테이션 분별 침전을 수행하는 경우, 상기 수용성 유기용매는 통상적으로 식물체 유래 유효성분을 용해하기 위해 사용하는 수용성 유기용매라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 C1 내지 C4의 알코올 및 아세톤으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종을 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 메탄올을 포함할 수 있다. 이때, 상기 e) 단계에서 수득되는 미가공 파클리탁셀 시료는 수용성 용매에 균일하게 분산될 수 있는 함량으로 용해시킬 수 있다.
또한, 상기 f-1) 및 f-2) 단계에서 물은 수용성 유기용매와 물의 비율이 10:90 내지 80:20(v/v)가 될 때까지 첨가할 수 있고, 교반 하에 한 방울씩 떨어뜨려 분별 침전을 수행하는 것이 바람직하다. 교반 속도는 100 내지 400 rpm이 바람직하다.
상기 f-1) 및 f-2) 단계에서 물을 첨가하는 경우, 상기 수용성 유기용매의 종류에 따라 수용성 유기용매와 물의 비율이 10:90 내지 80:20(v/v)의 범위 내에서 적절히 조절될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 조건은 전술한 바와 동일하므로, 그 기재를 생략한다.
물을 첨가하는 것이 완료되면, 음압을 가하여 캐비테이션 버블을 발생시킨다. 음압의 범위는 -50 mmHg 내지 -300 mmHg의 음압을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
이때, 상기 음압 캐비테이션 도입은 0 ℃내지 30 ℃에서 1분 내지 30분, 바람직하게는 5분 내지 20분 동안 수행될 수 있다.
본 발명의 파클리탁셀의 분리 및 정제 방법에 있어서, 상기 f-1) 및 f-2) 단계의 음압 캐비테이션 분별 침전 또한 상온에서 수행하는 것이 가능하므로, 분별 침전을 위한 저온 보관이 필요치 않아 대량생산 공정에 적용하기에 적합하다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 음압 캐비테이션 추출, 물 및 헥산의 순차적 세척, 흡착제 처리 및 음압 캐비테이션 분별 침전 공정에서 분별 침전 단계에 서로 다른 용매 시스템(아세톤-펜테인, 메탄올-물)으로 2단계 분별 침전을 수행하였을 때 파클리탁셀의 순도 및 수율 변화를 알아보기 위해 도 11에 나타낸 공정과 같이 4가지 방법으로 실험을 수행하였고, 문헌 [Kim, J. -H., "Comparison of conventional solvent extraction, microwave-assisted extraction, and ultrasound-assisted extraction methods for paclitaxel recovery from biomass," Korean Chem. Eng. Res., 58, 273-279(2020).; S. -H. Pyo et al., "A large-scale purification of paclitaxel from cell cultures of Taxus chinensis," Process Biochem., 39, 1985-1991(2004).]에 보고된 파클리탁셀의 분리 및 정제 공정에 따른 파클리탁셀의 순도, 수물 및 조업시간과 비교하였다. 그 결과, 표 2및 3에서 확인되는 바와 같이, 본 발명을 통해 개발된 음압 캐비테이션 기반 추출, 물 및 헥산 순차적 세척, 흡착제 처리, 아세톤-펜테인 및 메탄올-물을 이용한 연속 음압 캐비테이션 분별 침전 과정을 거친 공정(도 11의 방법 II)에서 최종 순도, 총괄 수율 및 조업 시간 모두 획기적으로 개선되었다.
따라서, 본 발명에 따른 파클리탁셀의 분리 및 정제 방법은 기존 파클리탁셀의 분리 및 정제 방법에 비해, 총 조업시간이 약 50% 수준으로 획기적으로 단축되지만, 파클리탁셀의 순도(54.8% 내지 67.7%)와 수율(92.1% 내지 98.6%)은 더욱 개선되어 공정의 효율성, 편리성 및 실행가능성을 개선시킬 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통해 보다 상세하게 설명한다. 단, 본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는바, 이하에서 기술하는 특정 실시예 및 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발 명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니다. 본 발명의 범위는 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
바이오매스 준비
택서스 치넨시스(Taxus chinensis)로부터 기원된 현탁액 세포(Suspension cells)는 24 ℃, 암조건(darkness condition)의 수정된 갬보그 B5 배지(Gamborg's B5 medium)에서 150 rpm으로 교반하여 배양하였다. 세포 배양은 2 주마다 새로운 배지(medium)로 갈아주었고, 배양 시간을 연장시키기 위해 7 일과 21 일째 되는 날에 1∼2%(w/v)의 말토오스를 첨가해 주고 유도인자(elicitor)로서 배양 초기에 4 mM의 AgNO3를 첨가해 주었다[B. Modarresi-Darreh et al., "Comparison of synthetic and natural Taxol extracted from Taxus plant(Taxus baccata) on growth of ovarian cancer cells under in vitro condition," Eurasia J. Biosci., 12, 413-418(2018); G. Chen et al., "Ultrasonic extraction, structural characterization, physicochemical properties and antioxidant activities of polysaccharides from bamboo shoots(Chimonobambusa quadrangularis) processing by-products," International Journal of Biological Macromolecules, 112, 656-666(2018).]. 식물세포배양 후 데칸터(decanter; Westfalia, CA150 Claritying Decanter)와 고속원심분리기(α-Laval, BTPX205GD- 35CDEEP)를 이용하여 배양액으로부터 식물세포(바이오매스)를 회수하였다.
음압 캐비테이션 추출(negative pressure cavitation extraction)
추출 조건으로 바이오매스/메탄올 비는 1:2(w/v), 추출 온도는 25 ℃, 추출 횟수는 1회, 교반 속도는 500 rpm으로 하였으며, 진공조절기(vacuum controller unit; EYELA NVC-3000, Japan)와 다이아프램 진공 펌프(diaphragm vacuum pump; EYELA NVP-1000, Japan)를 이용하여 추출기 내 음압을 유지하였다. 높은 추출 온도에서의 과도한 에너지 소모를 고려하여 상온(25 ℃에서 음압 -260 mmHg를 유지하며 10분간 추출을 수행하였다. 추출 후 감압 여과(여과지: 185 mm, ADVANTEC)로 파클리탁셀 추출 여액을 회수하고 농축기(CCA-1100, EYELA, Japan)를 이용하여 농축한 후 진공 건조(40 ℃, overnight, -760 mmHg)하였다. HPLC 분석을 통해 건조된 미가공 파클리탁셀(crude paclitaxel)의 함량을 측정하였다. 전통적 추출 방법과 음압 캐비테이션 추출 방법은 도 3에 비교하여 나타내었다. 또한, 파클리탁셀 수율은 식 1과 같이 계산하였다.
[식 1]
파클리탁셀 함량은 HPLC 시스템(SCL-10AVP, Shimadzu, Japan)과 캅셀팩 C18(Capcell Pak C18; 250 Х 4.6 mm, Shiseido, Japan) 칼럼을 사용하여 분석하였다. 이동상은 증류수와 아세토니트릴 혼합 용액(65/35~35/65, v/v, 구배 모드)이며, 유속은 1.0 mL/분이었다. 시료 주입량은 20 μL이며 227 nm에서 UV에 의해 검출하였다. 정품 파클리탁셀(순도: 97%)은 Sigma-Aldrich에서 구입하여 표준으로 사용되었다.
분별 침전을 위한 전처리 정제 공정의 개발
3-1. 물 및 헥산 세척 방법의 단독 또는 순차적 수행에 따른 파클리탁셀 순도 변화 확인
실시예 2에서는 편리하고 간단한 메탄올을 이용한 어쿠스틱 캐비테이션 추출을 통해 상온(25 ℃에서 바이오매스를 빠른 시간에 추출할 수 있었다. 이를 통해 건조된 시료(순도: 4.4%)를 이용하여 바이오매스 유래 다량의 극성 불순물 및 비극성 불순물을 효과적으로 쉽고 빠르게 제거하기 위하여 세척을 진행하였다.
물, 헥산 단독 세척 또는 물 및 헥산의 세척을 수행할 때 세척 순서와 세척 사이 건조 유무가 공정 효율에 미치는 영향을 조사하기 위해, 물 또는 헥산 단독 세척과 물과 헥산 2단계 세척을 진행하였으며, 2단계 세척 시 각 세척의 순서와 세척 사이 건조에 따른 영향을 조사하였다. 이를 위해 도 4와 같이 6가지 방법으로 실험을 수행하였다. 구체적으로, 방법 I(Method I)과 방법 II(Method II)는 각각 물과 헥산을 단독으로 세척을 수행하였다. 방법 III(Method III)과 방법 IV(Method IV)는 물 세척 후 헥산 세척을 순차적으로 수행하였으나, 방법 4(Method IV)는 세척 사이 건조를 수행하였다. 방법 V(Method V)와 방법 VI(Method VI)은 헥산 세척 후 물 세척을 순차적으로 진행하였으나, 방법 VI에는 세척 사이에 건조를 수행하였다.
물 세척 공정은 미가공 추출물/물 비율(crude extract/water ratio)이 1:40(w/v)이 되도록 첨가하고 상온에서 교반(~300 rpm)하에 10 분 동안 세척하였다[Kim, J. -H., "Comparison of conventional solvent extraction, microwave-assisted extraction, and ultrasound-assisted extraction methods for paclitaxel recovery from biomass," Korean Chem. Eng. Res., 58, 273-279(2020); M. -G. Lee, "A Tandem Water and Hexane Washing Method for Purification of Paclitaxel from Biomass," B.S. Thesis, Kongju National University, Cheonan, Korea(2021)]. 물 세척 후 얻어진 침전물을 여과지(Whatman Grade 5, 2.5 mm, particle retention, 150 mm diameter)를 이용하여 여과하였다. 헥산 세척 공정은 미가공 추출물/헥산 비율(crude extract/hexane ratio)이 1:160(w/v)이 되도록 첨가하고 상온에서 교반(~300 rpm)하에 20 분 동안 세척하였다[M. -G. Lee, "A Tandem Water and Hexane Washing Method for Purification of Paclitaxel from Biomass," B.S. Thesis, Kongju National University, Cheonan, Korea(2021)]. 헥산 세척 후 얻어진 침전물을 여과지(Whatman Grade 5, 2.5 mm, particle retention, 150 mm diameter)를 이용하여 여과하였다. 세척 후 수득한 시료(cake)를 40 ℃에서 12시간 동안 진공 건조(-760 mmHg)를 수행하였다. 각 시료에 대한 HPLC 분석은 실시예 2에 기재된 바와 같이 수행되었다.
물 단독 세척(도 4의 방법 I)의 경우, 세척 전후에서 시료의 HPLC 크로마토그램을 도 5(A)와 도 5(B)에 각각 나타내었다. 물 세척 전의 시료(바이오매스 추출로부터 수득한 시료)의 파클리탁셀 순도는 4.4%이었으며 물 세척 후 시료(도 5(B))의 파클리탁셀 순도는 10.2%로 증가하였다. 헥산 단독 세척(도 4의 방법 II)의 경우, 세척 전 후에서 시료의 HPLC 크로마토그램을 도 5(A)와 도 5(C)에 각각 나타내었다. 헥산 세척 전의 시료(바이오매스 추출로부터 수득한 시료)의 파클리탁셀 순도는 4.4%이었으며, 헥산 세척 후 시료(도 5(C))의 파클리탁셀 순도는 4.7%로 순도 변화는 미미하였다.
3-2. 물 및 헥산 세척 방법 순서에 따른 파클리탁셀 순도 변화 확인
2단계 세척 시 세척 순서의 영향을 조사하였다. 물 세척한 후 여과를 통해 수득한 시료(케이크)를 건조하지 않고 순차적으로 헥산 세척을 수행한 후 여과한 케이크를 건조하여 실시예 2와 동일한 방법으로 HPLC 분석을 통해 파클리탁셀의 순도를 측정하였다(도 4의 방법 III). 시료의 HPLC 크로마토그램을 도 5(D)에 나타내었다. 파클리탁셀의 순도는 26.6%이었다. 반면, 헥산 세척한 후 여과를 통해 수득한 시료(cake)를 건조하지 않고 순차적으로 물 세척을 수행한 후 여과한 케이크를 건조하여 HPLC 분석을 통해 파클리탁셀의 순도를 측정하였다(도 4의 방법 V). 시료의 HPLC 크로마토그램을 도 5(E)에 나타내었다. 파클리탁셀의 순도는 13.8%이었다. 세척 순서에 따라 파클리탁셀 순도는 약 2배 차이가 났으며 최적의 2단계 세척 순서는 물 세척, 헥산 세척 순이었다.
3-3. 세척 사이 건조 수행 유무에 따른 파클리탁셀 순도 변화 확인
2단계 세척 시 세척 사이 건조가 미치는 영향을 조사하였다. 물 세척한 후 여과를 통해 수득한 시료(cake)를 건조하고 순차적으로 헥산 세척을 수행한 후 여과한 케이크를 건조하여 실시예 2와 동일한 방법으로 HPLC 분석을 통해 파클리탁셀의 순도를 측정하였다(도 4의 방법 IV). 시료의 HPLC 크로마토그램을 도 5(F)에 나타내었다. 파클리탁셀 순도는 25.1%로 건조가 없는 공정에서의 파클리탁셀 순도(26.6%)와 거의 유사하였다. 2단계 세척 시 공정 사이 건조 단계가 공정 효율에 미치는 영향은 미미하였으며, 오히려 공정 비용을 높일 수 있었다. 헥산 세척 후 여과를 통해 수득한 시료(cake)를 건조하고 순차적으로 물 세척을 수행한(도 4의 방법 VI) 후 여과로부터 수득한 케이크를 건조하여 HPLC 분석한 크로마토그램을 도 5(G)에 나타내었다. 파클리탁셀 순도는 6.2%로 건조가 없는 공정(도 4의 방법 V)에서의 파클리탁셀 순도(13.8%)보다 대략 2배 낮았다. 2단계 세척 시 공정 사이 건조가 오히려 세척 효율을 저하시켰다.
세척 방법에 따른 파클리탁셀 순도를 비교하여 표 1에 정리하였다.
방법 세척 건조 * 순도(%)
Ⅰ 물 수행하지 않음 10.2
Ⅱ 헥세인 수행하지 않음 4.7
Ⅲ 물 → 헥세인 수행하지 않음 26.6
Ⅳ 물 → 헥세인 수행함 25.1
V 헥세인 → 물 수행하지 않음 13.8
VI 헥 → 물 수행함 6.2
* 2가지 종류의 세척 방법 사이에 건조를 수행함.
표 1에서 확인되는 바와 같이, 두 종류의 세척 사이에 건조 단계가 없는 물 및 헥산 순차적 세척에서 가장 높은 순도(26.6%)를 보였다. 결과적으로, 세척 순서는 1단계 물 세척, 2단계 헥산 세척이 최적이었으며, 두 종류의 세척 사이 건조 단계는 세척 효율 향상에 도움이 되지 않았다. 1단계 세척한 시료를 여과한 후 수득한 케이크를 건조 없이 바로 순차적으로 2단계 세척을 수행함으로써 공정 시간을 단축하고 공정 비용을 절감할 수 있었다. 본 연구에서 개발된 "물 및 헥산의 순차적 세척 공정" 개략도를 도 6에 나타내었다.
3-4. 물 및 헥산 세척 방법의 순차적 수행 후 불순물의 확인
물 및 헥산의 순차적 세척 공정에서 각 단계별 여과액을 HPLC로 분석하였다. 각 시료에 대한 HPLC 분석은 실시예 2에 기재된 바와 같이 수행되었으며, 물 세척 후 여과액과 헥산 세척 후 여과액의 HPLC 크로마토그램을 각각 도 7(A) 도 7(B)에 나타내었다. 도 7(A)에서 극성 불순물이 검출된 것으로 보아 물 세척 전의 시료에 포함되어 있는 극성 불순물(머무름 시간: 1-5 분)이 다량 제거됨을 알 수 있었다. 또한, 여과액에 파클리탁셀(머무름 시간: 20 분)은 거의 존재하지 않았으며, 이를 통해 물 세척 후 여과를 통해 얻은 케이크로 대부분의 파클리탁셀 회수가 가능함을 알 수 있었다. 물 세척의 원리는 물에 대한 파클리탁셀의 불용성(insolubility)과 극성 불순물의 용해성(solubility)을 활용하였기 때문에 높은 파클리탁셀 수율을 얻을 수 있었다. 2단계 헥산 세척 후 여과액의 HPLC 크로마토그램을 도 7(B)에 나타내었다. 헥산 세척으로 시료에 포함되어 있는 비극성 불순물(머무름 시간: 30-35 분)을 매우 효과적으로 제거할 수 있었다. 또한, 여과액에 비극성 불순물이 다량 존재하였으며(검출되었으며), 파클리탁셀은 거의 존재하지 않았다. 이를 통해 헥산 세척 후 여과를 통해 얻은 케이크로 대부분의 파클리탁셀 회수가 가능함을 알 수 있었다.
공정 합성의 최적화
식물세포 배양으로부터 회수한 식물세포(바이오매스)로부터 고순도의 파클리탁셀을 얻기 위하여 여러 단계의 추출, 전처리 정제, 최종 정제를 거치게 된다. 따라서, 효율적 분리 및 정제 공정 개발은 제품 제조원가 절감 측면에서 매우 중요하다. 전통적 추출은 4회 이상의 추출로 많은 양의 유기 용매가 필요하며 조업 시간이 긴 단점이 있었다. 일반적으로 전처리 정제로부터 얻은 낮은 순도의 시료를 바로 HPLC에 의하여 최종 정제를 진행할 경우 많은 양의 유기용매 사용, 컬럼 패킹 물질(충전제)의 수명 단축, 처리량 감소 등으로 인해 매우 비경제적이며 대량 생산을 위한 공정으로는 적합하지 않다. 따라서, HPLC를 이용한 최종 정제 전에 가급적 높은 순도(50% 이상)의 시료를 제조하여 가능한 불순물을 줄여주는 것이 매우 중요하다. 이에 따라, 본 실시예에서는 공정 효율성뿐만 아니라 공정 편리성(convenient)과 실행 가능성(feasibility)이 담보되는 음압 기반의 그린(green) 캐비테이션 추출 및 분별 침전 기술을 공정 합성에 이용하였다. 따라서, 본 실시예에서는 도 8에 나타낸 것과 같이 음압 캐비테이션 추출, 물/헥산 순차적 세척, 음압 캐비테이션 분별 침전 세 공정만을 이용하여 분리 및 정제를 수행하였을 때의 공정 효율성을 조사하였다.
4-1. 음압 캐비테이션 분별 침전 방법(negative pressure cavitation fractional precipitation)의 도입
도 9(A)에 음압이 없는 전통적 아세톤-펜테인 분별 침전, 도 9(B)에 아세톤-펜테인 음압 캐비테이션 분별 침전, 도 9(C)에 전통적 메탄올-물 분별 침전 및 도 9(D)에 메탄올-물 음압 캐비테이션 분별 침전 공정의 개략도를 나타내었다. 본 발명에서는 도 8의 방법 I과 같이 음압 캐비테이션 추출, 물/헥산 순차적 세척, 음압 캐비테이션 아세톤-펜테인 분별 침전을 수행하거나, 방법 II와 같이 음압 캐비테이션 추출, 물/헥산 순차적 세척, 음압 캐비테이션 메탄올-물 분별 침전을 진행하여, 파클리탁셀의 최종 순도 및 총괄 수율을 확인하였다.
아세톤-펜테인 분별 침전을 위해 미가공 파클리탁셀(순도: 20.47%)을 아세톤에 녹이고(16.7 g 미가공 파클리탁셀/mL 아세톤), 상온에서 아세톤/펜테인 비(v/v)가 1:7이 될 때까지 펜테인을 교반(335 rpm) 하에 한 방울씩 떨어뜨렸다. 침전 온도 5 ℃에서 음압 -200 mmHg를 유지하며 5분간 분별 침전을 수행하였다. 메탄올-물 분별 침전을 위해 미가공 파클리탁셀(순도: 20.47%)을 메탄올에 녹이고(메탄올 내 순수 파클리탁셀 함량: 0.5%, w/v), 상온에서 메탄올/물 비(v/v)가 61.5:38.5이 될 때까지 증류수를 교반(335 rpm) 하에 한 방울씩 떨어뜨렸다. 침전 온도 5 ℃에서 음압 -200 mmHg를 유지하며 15분간 분별 침전을 수행하였다. 각 용매 시스템에서 진공조절기(EYELA NVC-3000, Japan)와 다이아프램 진공 펌프(EYELA NVP-1000, Japan)를 이용하여 침전 용액 내로 음압을 가하였다. 침전 후 침전물을 여과지(185 mm, ADVANTEC)로 감압여과하여 40 ℃에서 24 h 동안 진공오븐(UP-2000, EYELA, Japan)에서 건조하였다. 건조된 침전물의 파클리탁셀 함량은 실시예 2와 동일하게 HPLC로 분석하였다.
도 8의 방법 I에서 수득된 파클리탁셀의 최종 순도 및 총괄 수율은 각각 36.0% 및 61.0%이었고, 방법 II에서 수득된 파클리탁셀의 최종 순도 및 총괄 수율은 각각 31.1% 및 74.2%이었다.
모든 용매 시스템에서 공정 효율성이 낮게 나왔으며, 이는 세척만으로 제거되지 않은 바이오매스 유래 타르 및 왁스 성분에 의해 분별 침전 효율이 떨어졌을 것으로 판단하였다. 타르 및 왁스 성분은 파클리탁셀 분리 및 정제 공정에 많은 악영향을 미쳐 전처리 정제 공정에서 반드시 제거되어야 하며, 이들 성분은 흡착제 처리로 쉽게 제거할 수 있다. 따라서 물/헥산 순차적 세척과 분별 침전 사이에 흡착제 처리 공정을 도입하였다.
4-2. 흡착제 처리(adsorbent treatment)의 도입
바이오매스 유래 타르 성분을 제거하기 위하여, 물 및 헥산 세척으로 얻은 건조된 미가공 추출물(crude extract)을 메틸렌 클로라이드(methylene chloride)에 20%(w/v) 비율로 녹이고 상용 흡착제 실로퓨트(Fuji Silysia Chemical Ltd., Japan)를 첨가하여 흡착 실험을 수행하였다. 흡착제 처리 온도는 40 ℃, 흡착제 처리 시간은 30 분, 미가공 추출물/실로퓨트 비율(crude extract/Sylopute ratio)은 1:1(w/w)이었다. 실로퓨트(Fuji Silysia Chemical Ltd., Japan)의 주성분은 SiO2(>99.8%)이며 표면적, 기공 부피, 세공 직경은 각각 331 m2/g, 1.81 cm3/g, 40-60 nm이다. 흡착제 처리 후 여과지(Whatman Grade 4, 20-25 μm, particle retention, 150 mm diameter)를 이용하여 여과하였으며, 여과액은 40 ℃, 감압 상태에서 건조하였다.
흡착제 처리 전후에서 시료의 HPLC 크로마토그램을 도 10(A)와 도 10(B)에 각각 나타내었다. 흡착제 처리 전의 시료(물/헥산 순차적 세척을 진행한 시료)의 파클리탁셀 순도는 26.6%이었으며, 흡착제 처리 후 시료의 파클리탁셀 순도는 28.9%로 순도 증가는 거의 없었다. 그러나, 흡착제 처리 후 크로마토그램에서 극성 불순물(머무름 시간: 1-5 분)과 비극성 불순물(머무름 시간: 30-35 분)이 다량 제거됨을 확인할 수 있었다. 또한, 흡착제 처리를 통해 짙은 색, 타르 및 왁스 성분도 제거되었다.
4-3. 공정 합성 최적화에 따른 파클리탁셀의 순도 및 수율 확인
음압 캐비테이션 추출, 물/헥산 순차적 세척, 흡착제 처리 및 음압 캐비테이션 분별 침전 공정을 순차적으로 수행하되, 분별 침전 단계에 서로 다른 용매 시스템(아세톤-펜테인, 메탄올-물)으로 2단계 분별 침전을 수행하였을 때 순도 및 수율의 변화를 알아보기 위해 도 11에 나타낸 공정과 같이 4가지 방법으로 실험을 수행하였다. 각 방법에 따른 파클리탁셀의 순도, 수율 및 조업시간은 표 2에 나타내었다.
공정 순도(%) 단계별 수율(%) 총 수율(%) 단계별 조업시간(hr) 총 조업 시간(hr)
도 11의 방법 I
바이오매스 - 100 100 - -
바이오매스 추출 4.4 99.9 99.9 0.17 0.17
물-헥세인 세척 26.6 99.9 99.8 0.5 0.67
흡착제 처리 28.9 93.7 93.5 0.5 1.17
아세톤-펜테인 분별 침전 54.8 98.6 92.2 0.08 1.25
도 11의 방법 II
바이오매스 - 100 100 - -
바이오매스 추출 4.4 99.9 99.9 0.17 0.17
물-헥세인 세척 26.6 99.9 99.8 0.5 0.67
흡착제 처리 28.9 93.7 93.5 0.5 1.17
아세톤-펜테인 분별 침전 54.8 98.6 92.2 0.08 1.25
메탄올-물 분별 침전 67.7 97.4 89.8 0.02 1.27
도 11의 방법 III
바이오매스 - 100 100 - -
바이오매스 추출 4.4 99.9 99.9 0.17 0.17
물-헥세인 세척 26.6 99.9 99.8 0.5 0.67
흡착제 처리 28.9 93.7 93.5 0.5 1.17
메탄올-물 분별 침전 46.9 99.2 92.8 0.02 1.19
도 11의 방법 IV
바이오매스 - 100 100 - -
바이오매스 추출 4.4 99.9 99.9 0.17 0.17
물-헥세인 세척 26.6 99.9 99.8 0.5 0.67
흡착제 처리 28.9 93.7 93.5 0.5 1.17
메탄올-물 분별 침전 46.9 99.2 92.8 0.02 1.19
아세톤-펜테인 분별 침전 65.8 92.1 85.5 0.08 1.27
또한, 도 11의 방법 I 내지 IV의 음압 캐비테이션 추출, 물/헥산 순차적 세척, 음압 캐비테이션 분별 침전을 도입한 분리 및 정제 공정을 기존 문헌 [(1) S. -H. Pyo et al.,"A large-scale purification of paclitaxel from cell cultures of Taxus chinensis," Process Biochem., 39, 1985-1991(2004);(2) Kim, J. -H. et al.,"Comparison of conventional solvent extraction, microwave-assisted extraction, and ultrasound-assisted extraction methods for paclitaxel recovery from biomass," Korean Chem. Eng. Res., 58, 273-279(2020).]에 보고된 파클리탁셀의 분리 및 정제(전처리) 공정과 비교하기 위해, 상기 문헌의 각 방법에 따른 파클리탁셀의 순도, 수율 및 조업시간은 표 3에 나타내었다.
공정 순도(%) 단계별
수율(%)		 총 수율(%) 단계별
조업시간
(hr)		 총 조업 시간(hr) 문헌 번호
전통적인 방법 I (1)
바이오매스 - 100 100 - -
바이오매스 추출 0.5-0.7 97-99.0 97.0-99.0 2 2
액-액 추출 6.0-8.8 96.5-99.0 93.6-98.0 1.5 3.5
흡착제 처리 8.8-9.8 95.6 89.5-93.7 0.5 4
헥세인 침전 21.0-27.1 95.2-99.0 85.2-92.7 0.2 4.2
분별 침전 46.5-61.0 81.3 69.3-75.4 14.0-72.0 18.2-76.2
전통적인 방법 II (2)
바이오매스 - 100 100 - -
바이오매스 추출 2.5±0.3 99.2±0.4 99.2 2 2
물 전처리 12.1±1.0 99.4±0.8 98.6 0.2 2.2
액-액 추출 28.6±2.1 98.2±1.7 96.8 1.5 3.7
흡착제 처리 36.8±1.8 93.9±3.1 90.9 0.5 4.2
분별 침전 56.5±1.5 94.8±3.0 86.2 0.2 4.4
전통적인 방법 III (2)
　
바이오매스 - 100 100 - -
바이오매스 추출 2.5±0.3 99.2±0.4 99.2 2 2
물 전처리 12.1±1.0 99.4±0.8 98.6 0.2 2.2
흡착제 처리 30.0±1.2 92.7±2.7 91.4 0.5 2.7
분별 침전 50.0±2.3 96.2±2.0 87.9 0.2 2.9
전통적인 공정에서는 바이오매스 추출 후 액-액 추출, 흡착제 처리, 헥산 침전, 메탄올-물 분별 침전을 순차적으로 수행한 경우(전통적인 방법 I), 시료의 최종 순도, 총괄 수율(overall yield), 조업 시간은 각각 46.5-61.0%, 69.3-75.4%, 18.2-76.2 시간이었다. 단순 물 세척을 도입한 연구에서 액-액 추출이 있는 경우(전통적인 방법 II), 바이오매스 추출과 물 세척 후 액-액 추출, 흡착제 처리, 메탄올-물 분별 침전을 순차적으로 수행한 시료의 최종 순도, 총괄 수율, 조업 시간은 각각 56.5%, 86.2%, 4.4 시간이었다. 또한, 액-액 추출이 없는 경우(전통적인 방법 III), 바이오매스 추출과 물 세척 후 흡착제 처리와 분별 침전을 순차적으로 수행한 시료의 최종 순도, 총괄 수율, 조업 시간은 각각 50.0%, 87.9%, 2.9 시간이었다.
반면, 음압 추출, 물/헥산 순차적 세척, 흡착제 처리, 음압 아세톤-펜테인 분별 침전을 순차적으로 수행한 경우(도 11의 방법 I), 시료의 최종 순도, 총괄 수율, 조업 시간은 각각 54.8%, 92.2%, 1.25 시간이었다. 기존의 세 가지 전통적 방법들과 비교할 경우 최종 순도는 -10.2-17.8%의 증감률을 보였으며, 총괄 수율은 4.9-33.0% 증가하였으며, 조업 시간은 56.9-98.4% 단축되었다. 음압 캐비테이션 추출, 물 및 헥산 순차적 세척, 흡착제 처리, 아세톤-펜테인 및 메탄올-물을 이용한 연속 음압 분별 침전을 순차적으로 수행한 경우(도 11의 방법 II), 시료의 최종 순도, 총괄 수율, 조업 시간은 각각 67.7%, 89.8%, 1.27 시간이었다. 기존의 세 가지 전통적 방법들과 비교할 경우 최종 순도는 11.0-45.6%, 총괄 수율은 2.2-29.6% 증가하였으며, 조업 시간은 56.2-98.3% 단축되었다. 음압 캐비테이션 추출, 물/헥산 순차적 세척, 흡착제 처리, 음압 메탄올-물 분별 침전을 수행한 경우(도 11의 방법 III), 시료의 최종 순도, 총괄 수율, 조업 시간은 각각 46.9%, 92.8%, 1.19 시간이었다. 기존의 세 가지 전통적 방법들과 비교할 경우 최종 순도는 -23.1-0.9%의 증감률을 보였고, 총괄 수율은 5.6-33.9% 증가하였으며, 조업 시간은 59.0-98.4% 단축되었다. 음압 캐비테이션 추출, 물/헥산 순차적 세척, 흡착제 처리, 메탄올-물 및 아세톤-펜테인을 이용한 연속 음압 분별 침전을 진행한 경우(도 11의 방법 IV), 시료의 최종 순도, 총괄 수율, 조업 시간은 각각 65.8%, 85.5%, 1.27 시간이었다. 기존의 세 가지 전통적 방법들과 비교할 경우 최종 순도는 7.9-41.5% 증가하였으며, 총괄 수율은 -2.7-23.4% 증감률을 보였으며, 조업 시간은 56.2-98.3% 단축되었다.
결과적으로, 흡착제 처리 공정 도입으로 바이오매스 유래 타르 성분을 효과적으로 제거함으로써 고순도, 고수율의 파클리탁셀을 얻을 수 있었다. 특히, 본 발명을 통해 개발된 음압 캐비테이션 기반 추출, 물 및 헥산 순차적 세척, 흡착제 처리, 아세톤-펜테인 및 메탄올-물을 이용한 연속 음압 캐비테이션 분별 침전 과정을 거친 공정(도 11의 방법 II)에서 최종 순도, 총괄 수율 및 조업 시간 모두 획기적으로 개선하였다. 파클리탁셀의 분리/정제를 위한 기존의 공정에 비해 파클리탁셀 순도, 수율, 조업 시간 측면에서 매우 효과적임을 알 수 있었다. 즉, 본 연구에서 개발한 공정을 통하여 파클리탁셀 분리/정제를 위한 공정 효율(순도, 수율, 조업 시간)을 개선할 뿐만 아니라 공정을 획기적으로 단축할 수 있었다.

Claims (17)

  1. 다음의 a) 내지 f) 단계를 포함하는 파클리탁셀의 분리 및 정제 방법:
    a) 파클리탁셀을 포함하는 택서스속(Taxus genus) 식물체 유래 바이오매스(biomass)를 수득하는 단계;
    b) 상기 바이오매스를 유기용매와 혼합하고 음압 캐비테이션을 도입하여 파클리탁셀 미가공 추출물(crude extract)을 수득하는 단계;
    c) 상기 파클리탁셀 미가공 추출물에 물을 첨가하여 교반 및 세척한 후 여과하여 여과물(cake)을 수득하는 단계;
    d) 상기 여과물(cake)에 헥산을 첨가하여 교반 및 세척하는 단계;
    e) 흡착제를 처리하는 단계; 및
    f) 음압 캐비테이션을 도입하여 분별 침전을 수행하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 a) 단계의 바이오매스는 택서스속 식물체, 이의 세포, 이의 세포 조각(cell debris) 및 이의 세포 배양액으로 이루어진 군에서 선택한 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 파클리탁셀의 분리 및 정제 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 b) 단계의 유기용매는 C1 내지 C4의 알코올 및 물로 이루어진 군에서 선택한 1종 이상이고, 상기 바이오매스와 유기용매는 1:1 내지 1:6(w/v) 비율로 혼합되는 것을 특징으로 하는 파클리탁셀의 분리 및 정제 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 b) 단계는 -50 mmHg 내지 -300 mmHg의 음압을 가하여 캐비테이션 버블을 발생시키는 것을 특징으로 하는 파클리탁셀의 분리 및 정제 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 b) 단계는 0 ℃내지 30 ℃에서 20분 이하의 시간 동안 1회 수행되는 것을 특징으로 하는 파클리탁셀의 분리 및 정제 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 c) 단계는 미가공 추출물과 물의 비율이 1:5 내지 1:60(w/v)이 되도록 물을 첨가하여 0 ℃ 내지 30 ℃에서 5분 내지 60분 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 파클리탁셀의 분리 및 정제 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 d) 단계는 여과물과 헥산의 비율이 1:150 내지 1:170(w/v)이 되도록 헥산을 첨가하여 0 ℃ 내지 30 ℃에서 10분 내지 20분 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 파클리탁셀의 분리 및 정제 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 c) 단계와 d) 단계 사이에 여과물을 건조하는 단계를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 파클리탁셀의 분리 및 정제 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 e) 단계의 흡착제는 상기 d) 단계 이후에 수득되는 미가공 파클리탁셀 추출물:흡착제의 비율이 1:0.5 내지 1:2.5(w/w)가 되도록 처리하여 20 ℃ 내지 60 ℃에서 20분 내지 60분 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 파클리탁셀의 분리 및 정제 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 f) 단계는 상기 e) 단계 이후에 수득되는 미가공 파클리탁셀 추출물을 수용성 유기용매와 혼합하고 펜테인 또는 물을 첨가한 후 음압 캐비테이션을 도입하는 것을 특징으로 하는 파클리탁셀의 분리 및 정제 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 수용성 유기용매는 C1 내지 C4의 알코올 및 아세톤으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종을 포함하고, 상기 펜테인은 수용성 유기용매와 펜테인의 비율이 1:3 내지 1:9(v/v)가 될 때까지 첨가하며, 상기 물은 수용성 유기용매와 물의 비율이 10:90 내지 80:20(v/v)가 될 때까지 첨가하는 것을 특징으로 하는 파클리탁셀의 분리 및 정제 방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 음압 캐비테이션 도입은 -50 mmHg 내지 -300 mmHg의 음압을 가하여 0 ℃ 내지 30 ℃에서 1분 내지 10분 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 파클리탁셀의 분리 및 정제 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 f) 단계는 2회 수행되는 것을 특징으로 하는 파클리탁셀의 분리 및 정제방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 f) 단계는:
    f-1) 상기 e) 단계 이후에 수득되는 미가공 파클리탁셀 추출물을 수용성 유기용매와 혼합하고 펜테인을 첨가한 후 음압 캐비테이션을 도입하여 1차 분별 침전을 수행하고, 1차 분별 침전 후 수득되는 미가공 파클리탁셀 추출물을 수용성 유기용매와 혼합하고 물을 첨가한 후 음압 캐비테이션을 도입하여 2차 분별 침전을 수행하거나; 또는
    f-2) 상기 e) 단계 이후에 수득되는 미가공 파클리탁셀 추출물을 수용성 유기용매와 혼합하고 물을 첨가한 후 음압 캐비테이션을 도입하여 1차 분별 침전을 수행하고, 1차 분별 침전 후 수득되는 미가공 파클리탁셀 추출물을 수용성 유기용매와 혼합하고 펜테인을 첨가한 후 음압 캐비테이션을 도입하여 2차 분별 침전을 수행하는 것을 특징으로 하는 파클리탁셀의 분리 및 정제방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 f-1) 및 f-2) 단계에서 펜테인을 첨가하는 경우, 상기 수용성 유기용매는 C1 내지 C4의 알코올 및 아세톤으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종을 포함하고, 상기 펜테인은 수용성 유기용매와 펜테인의 비율이 1:3 내지 1:9(v/v)가 될 때까지 첨가하는 것을 특징으로 하는 파클리탁셀의 분리 및 정제 방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 f-1) 및 f-2) 단계에서 물을 첨가하는 경우, 상기 수용성 유기용매는 C1 내지 C4의 알코올 및 아세톤으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종을 포함하고, 상기 물은 수용성 유기용매와 물의 비율이 10:90 내지 80:20(v/v)가 될 때까지 첨가하는 것을 특징으로 하는 파클리탁셀의 분리 및 정제 방법.
  17. 제14항에 있어서, 상기 f-1) 및 f-2) 단계에서 음압 캐비테이션 도입은 -50 mmHg 내지 -300 mmHg의 음압을 가하여 0 ℃ 내지 30 ℃에서 1분 내지 10분 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 파클리탁셀의 분리 및 정제 방법.
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