KR100259396B1

KR100259396B1 - 택서스속 식물체로부터 택솔의 대량 추출 정제방법

Info

Publication number: KR100259396B1
Application number: KR1019960002621A
Authority: KR
Inventors: 송봉규; 김진현; 이현수; 홍승서; 임창배; 김광욱; 강인선; 박흥복
Original assignee: 박종헌; 주식회사삼양제넥스
Priority date: 1996-02-03
Filing date: 1996-02-03
Publication date: 2000-07-01
Also published as: KR970061883A

Abstract

본 발명은 택서스속(Taxus genus) 식물체로부터 택솔을 대량으로 추출 정제하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 택솔의 대량 추출 정제방법은 택서스속(Taxus genus) 식물체의 시료를 메탄올로 추출하는 제1용매 추출공정; 전기에서 수득한 메탄올 추출액에 디클로로메탄을 가하여 디클로로메탄 추출액을 수득하는 제2용매 추출공정; 전기에서 수득한 디클로로메탄 추출액을 합성 흡착제로 처리하고 여과시켜 여액을 수득하는 공정; 전기에서 수득한 여액을 헥산에 첨가하여 조정제 택솔을 침전시키는 공정; 전기에서 수득한 조정제 택솔을 메탄올과 정제수 중에서 분별침전시켜 택솔 분말을 수득하는 공정; 및, 전기에서 수득한 택솔 분말을 고속액체 크로마토그래피로 정제하여 정제된 택솔을 얻는 공정을 포함하여 이루어진다. 본 발명에 따른 택솔 대량 추출 정제방법에 의하면, 텍서스속 식물체 시료의 수분함량에 관계없이 추출용매로서 메탄올, 디클로로메탄 및 헥산 3종류의 추출용매만을 사용하고 적은 추출용매량으로 단시간내에 약 99% 이상의 고순도를 지닌 결정성 택솔을 고수율로 추출 정제할 수 있으며, 분별 침전시키기 전에 합성 흡착제를 사용하여 타르 등의 불순물을 제거함으로써 분별침전 공정을 대량으로 수행할 수 있을 뿐만 아니라, 고속액체 크로마토그래피의 효율을 증대시킬 수 있었다.

Description

택서스속 식물체로부터 택솔의 대량 추출 정제방법

본 발명은 택서스속(Taxus genus) 식물체로부터 택솔을 대량으로 추출 정제하는 방법에 관한 것이다. 좀더 구체적으로, 본 발명은 택서스속 식물체의 시료를 메탄올 및 메탄올/디클로로메탄으로 각각 추출한 후, 활성 흡착제를 사용하여 타르 성분을 제거하고 헥산에 침전시킨 다음, 분별침전 및 고속액체 크로마토그래피에 의해 택솔을 정제함으로써, 텍서스속 식물체 시료의 수분함량에 관계없이 적은 양의 추출용매를 사용하여 단시간내에 고순도의 택솔을 높은 회수율로 정제할 수 있는 방법에 관한 것이다.

일반적으로, 택세인(taxane) 계열의 화합물들은 강력한 항종양 효과를 지니는데, 택솔(taxol)은 택세인 고리를 가지는 화합물로서 최초로 알려져 있다. 택솔은 백혈병과 암치료에 상당한 효능을 나타내며 항종양 효과를 지니는 것으로 공지되어 있는데, 최근, 미국립 암센터(NCI:National Cancer Institute)의 임상실험 결과에 따르면, 난소암 환자의 약 30% 이상, 유방암 환자의 약 50% 및 폐암 환자의 약 20% 정도를 치유하는 효과가 있다고 보고되고 있다. 아울러, 택솔과 유사한 구조를 지닌 바카틴 III(baccatin III), 10-디아세틸바카틴 III(10+deacetylbaccatin III), 10-디아세틸택솔(deacetylcephalomannine)은 택솔의 유도체들로 이들 중에는 반합성에 이용되는 중요한 전구체 및 항종양 효과를 지닌 것도 있다.

이들 각 택세인 화합물의 구조를 하기에 나타내었다.

한편, 이러한 택솔을 제조하는 방법으로는 전합성법(全合成法), 반합성법(半合性法) 및 분리법(分離法) 등이 알려져 있다.

그러나, 택솔의 복잡한 구조에서 알 수 있듯이, 입수가능한 출발물질을 사용하여 택솔을 합성하는 방법인 전합성법은 경제성이 없고 수율이 매우 낮기 때문에, 산업상 실제적으로 이용하기에는 한계를 지니고 있었다.

한편, 10-디아세틸바카틴 III 등의 택솔 전구체를 이용하여 택솔을 합성하는 반합성법은 식물체로부터 택솔 전구체를 분리 및 정제하는 과정과 정제된 택솔전구체를 택솔로 변환시키는 다단계 과정이 요구되어 경제성이 떨어진다는 문제점을 지니고 있었다.

따라서, 상기한 문제점으로 인해 택솔 제조방법 중에서도 분리법이 널리 사용되어 왔는데, 이러한 분리법은 식물체로부터 직접 택솔을 분리정제하는 방법으로서, 경제성과 함께 항종양 치료제로서의 효능을 지닌 택솔을 제조할 수 있다는 장점을 지녀, 고순도의 택솔을 효과적으로 분리하기 위한 다양한 시도가 행하여져 왔으며, 이와 관련된 종래의 기술에 대하여는 다음과 같은 여러가지 문헌에 개시되어 있다:

WO 94/12268호에는 택세인 용질(solute)이 함유된 용액을 반투막(semipermeable membrane) 및 역삼투압(reverse osmosis) 장치를 사용하여 정제함으로써, 고순도의 택솔을 분리정제하는 방법에 대하여 개시되어 있다.

그러나, 상기한 분리정제방법은 복잡한 반투막 및 역삼투압 장치를 사용하므로 장치의 운전에 고도의 숙련이 요구되며, 고가의 장치를 사용하기 때문에 경제적으로 택솔을 분리정제할 수 없다는 문제점을 지니고 있었다.

한편, EP 553,780호에는 택서스속 식물체를 건조 및 미분쇄하고 메탄올을 가하여 추출하여 진공농축시킨 다음, 물을 가해 희석하고 시클로헥산을 사용하여 용매추출하고 메틸렌 클로라이드를 가하여 추출하고 용매를 증발시켜 저순도의 조정제 택솔을 얻은 후 조정제 택솔을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 택솔 및 전구체를 분리하는 방법이 개시되어 있다.

또한, WO 92/18492호에는 식물체를 미분쇄하고 메탄올을 가하여 추출하여 농축시킨 다음, 메틸렌 클로라이드 또는 에틸 아세테이트 등을 가하고 분배(partitioning)시켜 물을 가하고 세척하여 저순도의 조정제 택솔을 얻은 후 조정제 택솔을 실리카겔 정규상(normal phase) 액체 컬럼으로 정제하는 방법이 개시되어 있다.

WO 92/07842호에는 식물체를 미분쇄하고 에탄올, 클로로포름 및 메탄올을 가하고 추출하여 저순도의 조정제 택솔을 추출한 다음, 조정제 택솔을 역상(reverse phase) 액체 크로마토그래피를 사용하여 정제하는 방법이 개시되어 있다.

WO 94/13827호에는 식물체를 미분쇄하고 에탄올, 메탄올 및 아세톤의 혼합 추출용매를 가한 다음, 활성탄 또는 목탄을 가하고 추출 및 정제하여 저순도의 조정제 택솔을 추출한 다음, 조정제 택솔을 실리카겔 정규상 액체 컬럼으로 정제하는 방법이 개시되어 있다.

아울러, 일본국 특허공개 평 6-157329호에는 식물체를 미분쇄하고 에틸 아세테이트, 에테르, 아세토니트릴 및 아세톤을 가하여 용매추출함으로써 저순도의 조정제 택솔을 추출하는 방법에 대하여 개시되어 있다.

그러나, 전술한 종래의 추출 정제방법은 주로 저순도의 조정제 택솔을 크로마토그래피를 사용하여 정제하는 방법으로서, 전술한 방법으로 제조된 조정제 택솔에는 택솔과 구조적으로 유사한 테르페노이드(terpenoid) 화합물, 리피드(lipid), 클로로필 및 페놀 등의 복잡한 혼합물이 다량 포함되어 있기 때문에, 크로마토그래피를 수행시 여러가지의 컬럼을 복합사용하는 다단계 용리(elution)에 의해서도 고순도의 택솔을 대량으로 얻을 수 없는 동시에 크로마토그래피를 수행시 컬럼에 부담을 준다는 문제점을 지니고 있었다.

또한, 종래의 추출 정제방법에서는 추출된 조정제 택솔의 순도가 낮으므로 크로마토그래피를 수행시 용매에 대한 시료의 용해도가 떨어져 택솔의 회수량 및 정제효율이 나쁘고 수율이 떨어지며, 주로 액상의 택솔이 얻어져 결정성 택솔을 얻기 위해서는 부수적인 결정화 과정이 요구된다는 문제점을 지녀, 상기한 종래의 택솔 추출 정제방법은 산업상 실제적으로 사용하는데에는 한계를 지니고 있었다.

상기한 종래의 택솔 추출 정제방법의 문제점들을 해결하기 위하여 본 발명자들은 예의 연구를 거듭하여 개선된 택솔의 추출 정제방법을 개발하고 이미 특허출원한 바 있다. 즉, 택서스속 식물체 시료를 전처리하여 메탄올, 메틸렌 클로라이드, 메틸-t-부틸 에테르/헥산/염화 세틸피리디늄 혼합용매 및 메틸-t-부틸 에테르로 순차적으로 추출농축하여 수득한 농축액을 헥산에 첨가하여 침전시키고, 침전물을 원심분리하여 건조 회수하는 공정을 포함하는 텍서스속 식물체로부터 조정제 택솔을 추출하는 방법(참조:대한민국 특허출원 제95-10455호), 전기 특허출원 제95-10455호의 조정제 택솔의 추출방법에 의해 수득한 조정제 택솔을 메탄올과 물 중에서 분별침전시켜 택솔 결정을 수득하는 분별침전에 의한 택솔의 정제방법(참조:대한민국 특허출원 제95-10456호), 전기 특허출원 제95-10456호의 분별침전에 의한 택솔의 정제방법에 의해 수득한 택솔 분말을 에틸 아세테이트, 메탄올 및 물의 혼합용매로 결정화시킴으로써 택솔을 정제하는 결정화에 의한 택솔의 정제방법(참조:대한민국 특허출원 제95-10457호), 그리고 전기 특허출원 제95-10456호의 분별침전에 의한 택솔의 정제방법에 의해 수득한 택솔 분말을 유기 용매 중에 용해시켜 역상 크로마토그래피로 정제함으로써 택솔을 정제하는 크로마토그래피에 의한 택솔의 정제방법(참조:대한민국 특허출원 제95-10458호)을 특허출원한 바 있다.

그러나, 이러한 택솔의 추출 정제방법들은 텍서스속 식물체 시료의 수분함량이 정제 택솔의 순도 및 회수율에 영향을 주고, 타르 등의 불순물이 분별침전공정을 방해하기 때문에, 시료의 수분함량을 조절하고 여러가지 추출용매를 사용하여 다단계 추출을 수행하여야만 했다. 그에 따라 추출공정의 단계, 추출용매의 종류 및 그 사용량이 많아져서 추출시간이 길어지고, 고속액체 크로마토그래피에 의한 정제공정시 주입되는 시료의 순도가 낮아서 컬럼의 효율이 저하되는 등 여러가지 문제점이 발생하였다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 텍서스속 식물체의 시료를 수분함량에 관계없이 적은 양의 추출용매를 사용하여 단시간 내에 99% 이상의 고순도 택솔을 고수율로 수득할 수 있는 택솔의 대량 추출 정제방법을 제공함에 있다.

상기 본 발명의 목적은,

(i) 택서스속(Taxus genus) 식물체의 시료를 메탄올로 추출하는 제1용매 추출공정;

(ii) 전기에서 수득한 메탄올 추출액에 디클로로메탄을 가하여 디클로로메탄 추출액을 수득하는 제2용매 추출공정;

(iii) 전기에서 수득한 디클로로메탄 추출액을 합성 흡착제로 처리하고 여과시켜 여액을 수득하는 공정;

(iv) 전기에서 수득한 여액을 헥산에 첨가하여 조정제 택솔을 침전시키는 공정;

(v) 전기에서 수득한 조정제 택솔을 메탄올과 정제수 중에서 분별침전시켜 택솔 분말을 수득하는 공정; 및

(vi) 전기에서 수득한 택솔 분말을 고속액체 크로마토그래피 정제하여 정제된 택솔을 얻는 공정을 포함하는 텍서스속 식물체로부터 택솔의 대량 추출 정제방법에 의해 달성된다.

이하, 본 발명에 따른 택솔의 대량 추출 정제방법을 공정별로 보다 상세히 설명하고자 한다.

본 발명에 따라 추출 정제된 택솔을 수득하기 위한 출발물질로서 사용되는 텍서스속 식물체 시료는 주목의 건조된 잎 또는 껍질(외피)을 미분쇄하여 분말화하거나, 또는 주목의 조직세포를 발효조에서 배양하고 식물세포를 회수하여 얻어진 식물세포의 케이크상 시료를 사용하며, 전기 방법에 의해 수득한 어떠한 물질도 본 발명에 따른 택솔의 추출 정제방법에 효율적으로 이용될 수 있다. 또한, 본 발명에서 텍서스속 식물체로는 택서스 브레비폴리아(Taxus brevifolia), 택서스 카나덴시스(Taxus canadensis), 택서스 쿠스피다타(Taxus cuspidata), 택서스 바카타(Taxus baccata), 택서스 글로보사(Taxus globosa), 택서스 플로리다나(Taxus floridana), 택서스 월리치아나(Taxus wallichiana), 택서스 메디아(Taxus media) 및 택서스 치넨시스(Taxus chinensis) 등이 가능하다.

[제1공정]

[메탄올 추출공정]

텍서스속 식물체의 시료에 메탄올을 가하고, 상온에서 약 20분 내지 1시간 동안, 바람직하게는 약 30 내지 40분간 교반한 후 여과하여 메탄올 추출액을 수득한다. 이때, 메탄올은 예를 들면 95%(v/v) 메탄올을 사용할 수 있으며, 시료를 전기 메탄올에 약 20 내지 약 200%(w/v), 바람직하게는 약 40 내지 약 140%(w/v), 보다 바람직하게는 약 100%(w/v)의 비율로 첨가된다. 추출 조작은 필요에 따라 3회 이상, 바람직하게는 4회 반복한다. 이어서, 매추출 조작으로부터 수득한 메탄올 추출액을 합친 후, 약 20 내지 40℃의 온도 및 1 내지 30mmHg의 압력에서 감압농축시킨다. 감압농축은 농축액의 부피가 농축시키기 전 메탄올 추출액의 약 20 내지 30%로 될 때까지 수행한다. 감압농축시의 온도가 40℃ 이상일 때에는, 택솔 및 택솔 유도체의 에피머화(epimerization)가 촉진되어 바람직하지 않다.

[제2공정]

[메탄올/디클로로메탄 추출공정]

전기 메탄올 추출공정으로부터 수득한 농축 메탄올 추출액에 디클로로메탄을 가하고, 상온에서 약 10 내지 20분간 교반하여 방치한 다음, 메탄올층을 제거하여 디클로로메탄 추출액을 수득한다. 이때, 추출 조작은 필요에 따라 2회 이상, 바람직하게는 3회 반복하여 수득한 추출액을 합친다. 디클로로메탄은 매 추출시마다 전기 농축 메탄올 추출액에 부피비로 약 10 내지 50%, 바람직하게는 약 20 내지 30%의 양으로 첨가된다.

[제3공정]

[흡착제 처리공정]

전기 공정으로부터 수득한 디클로로메탄 추출액 중에는 후속되는 분별침전공정에서 방해요인으로 작용하는 타르 등의 불순물이 존재하기 때문에, 이를 제거하기 위하여 합성 흡착제로 처리한다. 즉, 전기 메탄올/디클로로메탄 추출공정으로부터 수득한 디클로로메탄 추출액에 합성 흡착제를 전기 디클로로메탄 추출액의 건고 중량의 약 10 내지 200%, 바람직하게는 약 30 내지 100%, 보다 바람직하게는 약 50%의 양으로 첨가한 다음, 약 30 내지 40℃의 온도에서 약 10 내지 40분, 바람직하게는 약 20 내지 30분간 교반시킨 후 여과하여 여액을 수득한다. 이때, 수율을 높이기 위해서는 전기 합성 흡착제로 처리하여 여과한 후, 여과물은 다시 적정량의 디클로로메탄으로 수차례 세척하고, 수득한 각각의 세척액은 전기 여액에 합친다. 본 발명에 사용될 수 있는 합성 흡착제로서는 백토(白土, active clay), 활성탄 등을 들 수 있으나, 가장 바람직하게는 백토를 사용한다. 이어서, 합친 여액을 약 30 내지 40℃의 온도 및 1 내지 30mmHg의 압력에서 감압농축 시킨다. 감압농축은 최종 농축액의 부피가 합성 흡착제로 처리하기 전 디클로로메탄 용액의 부피의 약 150% 내지 200%로 될 때까지 수행한다.

[제4공정]

[디클로로메탄/헥산 침전공정]

전기 공정에서 수득한 디클로로메탄 농축액을 부피비로 약 500 내지 1,500%, 바람직하게는 약 700 내지 1,200%, 보다 바람직하게는 약 1,000% 양의 헥산에 첨가하여 침전시킨 다음, 침전을 여과하여 조정제 택솔을 수득한다. 여기서, “조정제 택솔”은 택솔 순도가 약 23% 이상되는 택솔 함유 물질을 의미한다.

[제5공정]

[분별침전공정]

전기 공정으로부터 수득한 조정제 택솔을 메탄올에 약 1 내지 10%(w/v)의 농도로 용해시켜 수득한 조정제 택솔의 용액에 정제수를 가한 다음, 택솔의 결정이 균일하게 석출되도록 -20 내지 10℃의 저온에서 1 내지 3일간 방치하여 분별침전시킨 후 여과하여 수득한 여과물을 20 내지 40℃에서 1 내지 3시간 진공건조하여 택솔 분말을 수득한다. 이때, 택솔의 순도를 높이기 위하여 여과물에 10 내지 60%(v/v)의 메탄올 수용액 또는 헥산을 가하여 여과물에 용해된 수용성 불순물을 제거하는 공정을 추가로 포함시킬 수 있다. 정제수는 전기 조정제 택솔의 용액에 부피비로 약 30 내지 80%의 양으로 첨가되며, 정제수는 소량씩 나누어 첨가하는 것이 바람직하다. 본 분별침전공정은 필요에 따라 수회 반복가능하나, 후속되는 고속액체 크로마토그래피 공정의 수행시 컬럼에 부담을 최소화하는 동시에 회수량 및 정제효율을 증가시키기 위하여, 약 85% 이상의 순도를 지닌 택솔을 얻을 수 있도록 2회 이상 분별침전공정을 수행할 수도 있다.

[제6공정]

[고속액체 크로마토그래피 공정]

본 발명에 따른 택솔의 정제방법에 있어서, 고속액체 크로마토그래피(HPLC) 공정은 먼저 소수성 수지 컬럼, 예를 들면 ODS(octadecylsilylated, C₁₈)컬럼을 사용하여 비극성 물질을 제거하는 소수성 수지 컬럼 고속액체 크로마토그래피 단계와 실리카 컬럼을 사용하여 극성 불순물을 제거하는 실리카 컬럼 고속액체 크로마토그래피 단계의 2단계로 이루어진다.

먼저, 소수성 수지 컬럼 고속액체 크로마토그래피 단계는 전기 분별침전공정으로부터 수득한 택솔 분말을 유기용매에 용해시켜 소수성 수지 컬럼, 예를 들면 OSD(octadecylsilylated, C₁₈) 컬럼 고속액체 크로마토그래피에 주입(loading)시킨 다음, 메탄올과 물의 혼합용매를 용리액으로 사용하여 용출시키면서 자외선(UV) 검출기로 227nm에서의 흡광도를 측정하여 택솔의 검출 여부를 확인하고, 택솔이 검출되기 시작한 분획부터 택솔이 검출되지 않는 분획 직전까지의 분획들을 분취한 후, 농축 건조하여 후속되는 실리카 컬럼 고속액체 크로마토그래피 단계에 제공한다. 이때, 유기용매로서는 디메틸설폭사이드(DMSO) 또는 메탄올이 사용될 수 있으며, 전기 분별침전공정에서 수득한 택솔 분말은 전기 유기용매에 약 0.5 내지 10%(w/v), 바람직하게는 약 1 내지 2%(w/v)의 농도로 용해시킨다. 용리액으로 사용되는 메탄올과 물 혼합용매의 혼합비는 부피비로 약 1:0.3 내지 1:0.8, 바람직하게는 1:0.4 내지 1:0.7, 보다 바람직하게는 약 1:0.5 내지 1:0.6으로 조절한다. 시료는 고속액체 크로마토그래피 펌프를 약 3-5cm/분의 유속으로 조절하여 50-150mg/ml(메탄올)의 주입량으로 주입된다.

실리카 컬럼 고속액체 크로마토그래피 단계는 전기 ODS컬럼 고속액체 크로마토그래피 단계에서 분취한 택솔 함유 분획을 실리카 컬럼에 주입하고, 디클로로메탄과 메탄올의 혼합용액을 용리액으로 사용하여 용출시키면서 자외선 검출기로 227nm에서의 흡광도를 측정하여 택솔의 검출 여부를 확인하여 택솔이 검출되기 시작한 분획부터 택솔이 검출되지 않는 분획 직전까지의 분획들을 분취한 후, 농축 건조시켜 본 발명의 택솔 결정을 수득한다. 용리액으로 사용되는 디클로로메탄과 메탄올 혼합용액의 혼합비는 부피비로 약 100:0.5 내지 100:2, 바람직하게는 약 100:1 내지 100:1.5, 보다 바람직하게는 약 100:1.2이다. 시료는 고속액체 크로마토그래피 펌프를 약 3-5cm/분의 유속으로 조절하여 약 50-150mg/ml(CH₂Cl₂)의 주입량으로 주입된다. 실리카 컬럼 고속액체 크로마토그래피로부터 용출된 택솔 함유 분획은 회전 증발기(rotary evaporator) 및 진공건조기 등의 통상적인 건조장치를 사용하여 진공건조시킨다. 본 공정에 의하면, 약 99% 이상의 순도를 지닌 결정성 택솔을 90% 이상의 고수율로 정제할 수 있다.

[정량분석법]

본 발명의 택솔 정제방법에 따라 텍서스속 식물체의 시료로부터 수득한 택솔의 순도 및 회수율은 고속액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 하기 표 1의 조건에서 정량분석하였다.

[표 1]

상기한 본 발명의 택솔 정제방법에 의하면, 텍서스속 식물체로부터 약 99% 이상의 순도를 지닌 결정성 택솔을 90% 이상의 고수율로 간단한 공정에 의해 얻을 수 있게 된다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

[실시예 1]

[주목세포의 조직배양에 의해 얻은 시료로부터 택솔의 추출 정제]

주목세포의 조직배양으로부터 얻은 식물세포 시료 10kg에 메탄올 10리터를 가하고, 상온에서 30분간 교반한 후 여과하여 메탄올 추출액을 수득하였다. 이와 같은 추출 조작을 3회 더 반복한 후, 수득한 메탄올 추출액을 합치고, 약 30mmHg의 압력 및 약 35℃의 온도에서 감압농축하여 약 8리터의 농축액을 얻었다. 얻어진 농축액 중의 택솔의 순도는 약 0.24%이고, 회수율은 100%이었다. 수득한 농축액 8리터에 디클로로메탄 약 2리터를 가하고, 상온에서 약 15분간 교반하여 방치한 후 메탄올층을 제거하였다. 이와 같은 추출 조작을 2회 더 반복하였다. 이와 같이 하여 수득한 디클로로메탄 추출액 6리터 중의 택솔의 순도는 약 2.4%이고, 회수율은 100%이었다. 이어서, 전기 디클로로메탄 추출액을 30mmHg의 압력 및 35℃의 온도에서 완전히 감압건고시키고, 수득한 건고물 중 10g을 취하여 디클로로메탄 56ml를 가하여 용해시킨 후, 합성 흡착제로서 백토(active clay, F-1:水澤化學, 日本國) 약 5g을 첨가하고, 약 40℃의 온도에서 약 20분간 교반하고, 여과하여 여과물을 얻고, 여과물은 다시 새로운 디클로로메탄 약 285ml로 세척하였다. 수득한 여액을 전기 여액과 합친 다음, 약 20mmHg의 압력 및 약 35℃의 온도에서 약 100ml로 될 때까지 감압농축시켰다. 수득한 농축액 중의 택솔의 순도는 약 3.1%이고, 회수율은 약 97%이었다. 그런 다음, 농축액 100ml를 헥산 약 1,000ml에 서서히 적가하여 침전시켜 순도 약 23%의 조정제 택솔을 얻었다(회수율 95%).

수득한 조정제 택솔 중 1g을 취하고 메탄올 약 28.75ml를 가하여 조정제 택솔을 용해시키고, 교반하면서 정제수 17.25ml를 소량씩 나누어 첨가하고, 4℃에서 2일간 방치한 다음, 직경 0.45μ의 필터를 사용하여 여고하고, 여과물을 35℃에서 2시간 진공건조하여 순도 70%의 택솔 분말 299mg을 수득하였다(회수율 91%). 택솔 분말 299mg을 메탄올 3ml에 용해시켜 ODS C₁₈컬럼(Φ50×500mm) 고속액체 크로마토그래피에 주입시킨 다음, 메탄올과 물의 65:35(v/v) 혼합용액을 용리액으로 사용하고, 하기 표 2의 조건에서 용출시키면서 자외선 검출기로 택솔의 존재 여부를 검출한 결과, 체류시간(R_t) 40 내지 47분의 분획에서 택솔이 검출되어 이들 분획을 분취하였다. 분취한 택솔 함유 분획 중의 택솔의 순도는 90%이고, 회수율은 약 90%이었다. ODS컬럼 고속액체 크로마토그래피에서 분취한 택솔함유 분획을 약 10mmHg의 진공 및 약 35℃의 온도에서 감압건고시키고, 수득한 건고물 중 209.3mg을 취하여 디클로로메탄 2ml에 용해시켜 다시 실리카 컬럼 고속액체 크로마토그래피에 주입시킨 다음, 디클로로메탄과 메탄올의 100:1.2(v/v) 혼합용액을 용리액으로 사용하고, 하기 표 3의 조건에서 용출시키면서 자외선 검출기로 택솔 존재 여부를 검출한 결과, 체류시간(R_t) 40 내지 70분의 분획에서 택솔이 검출되었으며, 이들 분획을 분취하여 회전 증발기 및 진공건조기를 사용하여 진공건조시켜 본 발명의 택솔 결정 170.5mg을 수득하였다(회수율 90%). 얻어진 택솔을 고속액체 크로마토그래피를 사용하여 정량분석한 결과, 택솔의 순도는 99.5%이었다.

[표 2]

[표 3]

[실시예 2]

[주목의 잎 또는 껍질로부터 얻은 시료로부터 택솔의 추출정제]

주목의 건조된 잎 또는 껍질을 분쇄하고 분말화하여 얻은 시료를 사용하는 것을 제외하고는, 전기 실시예 1과 동일한 방법으로 실시하여 택솔 결정을 수득하였다. 얻어진 택솔을 고속액체 크로마토그래피를 사용하여 정량분석한 결과, 택솔의 순도는 99.6, 수율 96%인 것으로 밝혀졌다.

[실시예 3 내지 4]

메탄올 추출공정에서 메탄올의 양을 32리터로 하고, 교반시간을 40분으로 연장한 것을 제외하고는, 전기 실시예 1 및 2와 동일한 방법으로 실시하여 정제 택솔을 수득하였다. 얻어진 정제 택솔을 고속액체 크로마토그래피를 사용하여 정량분석한 결과, 택솔의 순도는 모두 99.6%이었다.

[실시예 5 내지 6]

메탄올/디클로로메탄 추출공정에서 디클로로메탄의 양을 4리터로 하고, 교반시간을 20분으로 연장한 것을 제외하고는, 전기 실시예 1 및 2와 동일한 방법으로 실시하여 정제 택솔을 수득하였다. 얻어진 정제 택솔을 고속액체 크로마토그래피를 사용하여 정량분석한 결과, 택솔의 순도는 각각 99.5% 및 96%이었다.

[실시예 7 내지 8]

고속액체 크로마토그래피 수행전 택솔 분말을 용해시키기 위한 유기용매로서 메탄올 대신에 DMSO를 사용하는 것을 제외하고는, 전기 실시예 1 내지 2와 동일한 방법으로 실시하여 택솔 결정을 수득하였다. 얻어진 택솔을 고속액체 크로마토그래피를 사용하여 정량분석한 결과, 택솔의 순도는 모두 99%이었으며, 수율은 각각 91% 및 92%인 것으로 밝혀졌다.

[비교실시예 1]

[합성 흡착제가 택솔의 회수율 및 순도에 미치는 영향]

전기 실시예 1과 동일한 방법으로 실시하되, 메탄올 및 디클로로메탄으로 2차에 걸쳐서 추출한 후 수득한 디클로로메탄 용액을 백토로 처리하지 않고 헥산 중에 침전시킨 후 바로 분별침전시켜서 택솔 분말을 수득하였다. 얻어진 택솔을 고속액체 크로마토그래피를 사용하여 정량분석한 결과, 택솔의 순도는 40%인 것으로 나타났다.

상기 본 발명의 각 실시예 및 비교실시예로부터 보듯이, 합성 흡착제로 처리하지 않은 경우 합성 흡착제로 처리했을 때 보다 분별침전 후 순도가 크게 떨어지는 택솔이 얻어지는 것은 메탄올 및 디클로로메탄으로 추출한 추출액 중에 타르 등의 불순물이 존재하여 분별침전을 방해하기 때문으로 보인다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명에 따른 택솔의 대량 추출 정제방법에 의하면, 텍서스속 식물체 시료의 수분함량에 관계없이 추출용매로서 메탄올, 디클로로메탄 및 헥산 3종류의 추출용매만을 사용하고 적은 추출용매량으로 단시간에 약 99% 이상의 고순도를 지닌 결정성 택솔을 고수율로 추출 정제할 수 있으며, 분별침전시키기 전에 합성 흡착제를 사용하여 타르 등의 불순물을 제거함으로써 분별침전 공정을 대량으로 수행할 수 있을 뿐만 아니라, 고속액체 크로마토그래피의 효율을 증대시킬 수 있었다.

Claims

(i) 택서스속 식물체의 시료에 메탄올을 20∼200%(w/v) 가하여 추출하는 제1용매 추출 단계; (ii) 상기 (i)단계에서 얻은 메탄올 추출액에 디클로로메탄을 부피비로 10∼50% 첨가하고, 메탄올 층을 제거하여 디클로로메탄 추출액을 얻는 제2용매 추출 단계; (iii) 상기 (ii)단계에서 얻은 디클로로메탄 추출액을 백토로 처리하고 여과시키는 단계; (iv) 상기 (iii)단계에서 얻은 여액을 헥산에 첨가하여 조정제 택솔을 침전시키는 단계; (v) 상기 (iv)단계에서 얻은 조정제 택솔을 메탄올과 정제수 중에서 분별침전시켜 택솔 분말을 수득하는 공정; 및 (vi) 상기 (v)단계에서 얻은 택솔 분말을 고속액체 크로마토그래피로 정제하여 정제된 택솔을 얻는 공정으로 이루어지는, 텍서스속 식물체로부터 택솔을 대량으로 추출 정제하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 텍서스속 식물체의 시료가 주목의 잎 또는 껍질을 분쇄하고 분말화하여 얻은 시료 또는 택서스속 식물의 조직 세포를 배양하여 얻은 시료를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 (iii) 단계의 백토 처리 공정이 상기 (ii) 단계에서 얻은 디클로로메탄 추출액과 백토의 혼합물을 30∼40℃에서 교반하는 것으로 이루어지는 방법.
제1항에 있어서, 상기 (iv) 단계의 침전 공정이 상기 (iii) 단계에서 얻은 여액을 부피비로 500∼1500%의 헥산에 적가하고 침전을 여과하는 것으로 이루어지는 방법.
제1항에 있어서, 상기 (v) 단계의 분별침전 공정이 상기 (iv) 단계에서 얻은 침전을 메탄올에 1∼10%(w/v)로 용해시킨 용액에 부피비로 30∼80%의 정제수를 소량씩 나누어 첨가하고 -20∼10℃에서 1∼3일간 방치하는 것으로 이루어지는 방법.
제1항에 있어서, 상기 고속액체 크로마토그래피 정제공정이 1차로 소수성 수지 컬럼 고속액체 크로마토그래피를 사용하여 비극성 불순물을 제거하고, 이어서 실리카 컬럼을 사용하여 극성 불순물을 제거하는 2단계 공정으로 이루어지는 방법.
제6항에 있어서, 상기 소수성 수지 컬럼 고속액체 크로마토그래피가 ODS(octadecylsilyated, C18) 컬럼인 방법.