본 발명은 탁산류 함유물질로부터 13-디하이드록시바카틴 III 및 10-디아세틸파클리탁셀을 순도 90% 이상, 바람직하게는 순도 99.5% 이상의 고순도로 추출 및 정제하는 방법에 관한 것으로, 이와 같이 얻어진 고순도 13-디하이드록시바카틴 III 및 10-디아세틸파클리탁셀은 항암제인 파클리탁셀 및 도세탁셀의 반합성 전구체로서 유용하다.
상기 13-디하이디록시바카틴 III 및 10-디아세틸파클리탁셀은 탁산류 함유 물질로서 대표적인 택서스 속 식물, 예컨대, 주목 나무 또는 주목 나무 세포 배양에 의한 파클리탁셀 생산 시에 파클리탁셀과 함께 생성될 수 있다.
본 발명의 추출 및 정제 방법은 탁산류 함유 물질로부터 추출된 추물출로부터 단일 순상 크로마토그래피 공정에 의하여 파클리탁셀 뿐 아니라, 파클리탁셀 및 도세탁셀의 반합성 전구체로서 유용한 13-디하이디록시바카틴 III 및 10-디아세틸파클리탁셀 활성 분획들을 동시에 분리하고 (도1 및 2 참조), 상기 얻어진 13-디하이디록시바카틴 III 및 10-디아세틸파클리탁셀 활성 분획들을 저압 역상 크로마토 그래피하여, 13-디하이드록시바카틴 III 및 10-디아세틸파클리탁셀을 효율적으로 정제하는 방법을 제공한다.
우선, 본 발명은 탁산류 함유 물질로부터 13-디하이드록시바카틴 III를 추출 및 정제하는 방법을 제공한다. 본 발명의 13-디하이드록시바카틴 III의 추출 및 정제 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(a) 탁산류 함유물질을 유기용매로 추출한 후 농축하는 단계 (원재료 추출 및 농축 단계);
(b) 상기 단계 (a)에서 얻은 농축액에 물과 혼합되지 않는 유기용매를 가하여 분배한 후 유기용매 층을 분리하는 액-액 추출하는 단계 (액-액 추출단계);
(c) 상기 단계 (b)에서 얻은 추출액을 감압 농축한 후, 유기용매에 녹이고, 저압 순상 크로마토그래피를 수행하여, 파클리탁셀, 13-디하이드록시바카틴 III 및 10-디아세틸파클리탁셀 활성 분획을 동시에 얻는 단계 (순상 크로마토그래피에 의한 분획 단계); 및
(d-1) 상기 단계 (c)에서 얻은 순상 크로마토그래피에 의한 13-디하이드록시바카틴 III 활성 분획을 유기용매에 녹이고, 저압 역상 크로마토그래피를 수행하여, 13-디하이드록시바카틴 III 활성 분획을 얻는 단계
이와 같은 추출 및 정제 방법을 거침으로써, 반합성에 충분한 전구체 순도인 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상의 순도로 13-디하이드록시바카틴 III를 얻을 수 있다.
보다 고순도의 13-디하이드록시바카틴 III 를 얻기 위하여, 상기 13-디하이 드록시바카틴 III의 추출 및 정제 방법은 단계 (d-1)의 저압 역상 크로마토그래피 (역상-LPLC) 수행 후, 얻어진 13-디하이드록시바카틴 III 활성 분획을 유기용매, 정제수 또는 이들의 혼합물을 사용하여 침전시켜, 13-디하이드록시바카틴 III 함유 침전물을 얻는 침전 형성 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 상기 단계 (d-1)에서 얻은 13-디하이드록시바카틴 III 활성 분획 또는 침전 형성 단계를 추가로 수행하여 얻은 13-디하이드록시바카틴 III 함유 침전물에 고성능 역상 고속 액체 크로마토그래피 (역상-HPLC)를 수행하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
이와 같은 침전 형성 단계 및/또는 고성능 역상 고속 액체 크로마토그래피 수행 단계를 추가로 수행함으로써, 순도 99.5% 이상의 고순도 13-디하이드록시바카틴 III를 얻을 수 있다.
또한, 본 발명은 탁산류 함유 물질로부터 10-디아세틸파클리탁셀을 추출 및 정제하는 방법을 제공한다. 본 발명의 10-디아세틸파클리탁셀의 추출 및 정제 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(a) 탁산류 함유물질을 유기용매로 추출한 후 농축하는 단계 (원재료 추출 및 농축 단계);
(b) 상기 단계 (a)에서 얻은 농축액에 물과 혼합되지 않는 유기용매를 가하여 분배한 후 유기용매 층을 분리하는 액-액 추출하는 단계 (액-액 추출단계);
(c) 상기 단계 (b)에서 얻은 추출액을 감압 농축한 후, 유기용매에 녹이고, 저압 순상 크로마토그래피를 수행하여, 파클리탁셀, 13-디하이드록시바카틴 III 및 10-디아세틸파클리탁셀 활성 분획을 동시에 얻는 단계 (순상 크로마토그래피에 의한 분획 단계); 및
(d-2) 상기 단계 (c)에서 얻은 순상 크로마토그래피에 의한 10-디아세틸파클리탁셀 활성 분획을 유기용매에 녹이고, 저압 역상 크로마토그래피를 수행하여 10-디아세틸파클리탁셀 활성 분획을 얻는 단계.
이와 같은 추출 및 정제 방법을 거침으로써, 반합성에 충분한 전구체 순도인 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상의 순도로 10-디아세틸파클리탁셀을 얻을 수 있다.
보다 고순도의 10-디아세틸파클리탁셀을 얻기 위하여, 상기 단계 (d-2)에서 얻은 10-디아세틸파클리탁셀 활성 분획에 고성능 역상 고속 액체 크로마토그래피를 수행하는 것을 포함하는 10-디아세틸파클리탁셀의 추출 및 정제 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이와 같은 고성능 역상 고속 액체 크로마토그래피 수행 단계를 추가로 수행함으로써, 순도 99.5% 이상의 고순도 10-디아세틸파클리탁셀을 얻을 수 있다.
또한, 본 발명은, 상기 13-디하이드록시바카틴 III의 추출 및 정제 공정과 10-디아세틸파클리탁셀의 추출 및 정제 공정을 동시에 또는 연속적으로 수행하여, 탁산 함유물질로부터 13-디하이드록시바카틴 III 및 10-디아세틸파클리탁셀을 추출 및 정제하는 방법을 제공한다. 본 발명의 추출 및 정제 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(a) 탁산류 함유물질을 유기용매로 추출한 후 농축하는 단계 (원재료 추출 및 농축 단계);
(b) 상기 단계 (a)에서 얻은 농축액에 물과 혼합되지 않는 유기용매를 가하여 분배한 후 유기용매 층을 분리하는 액-액 추출하는 단계 (액-액 추출단계);
(c) 상기 단계 (b)에서 얻은 추출액을 감압 농축한 후, 유기용매에 녹이고, 저압 순상 크로마토그래피를 수행하여, 파클리탁셀, 13-디하이드록시바카틴 III 및 10-디아세틸파클리탁셀 활성 분획을 동시에 얻는 단계 (순상 크로마토그래피에 의한 분획 단계); 및
(d) 상기 단계 (c)에서 얻은 순상 크로마토그래피에 의한 13-디하이드록시바카틴 III 및 10-디아세틸파클리탁셀 활성 분획으로부터 13-디하이드록시바카틴 III 및 10-디아세틸파클리탁셀을 추출 및 정제하는 단계로서,
(d-1) 1) 상기 단계 (c)에서 얻은 순상 크로마토그래피에 의한 13-디하이드록시바카틴 III 활성 분획을 유기용매에 녹이고, 저압 역상 크로마토그래피를 수행하여, 13-디하이드록시바카틴 III 활성 분획을 얻는 단계;
2) 임의적으로, 상기에서 얻은 역상 크로마토그래피에 의한 13-디하이드록시바카틴 III 활성 분획을 정제수 또는 유기용매를 사용하여 침전시켜, 13-디하이드록시바카틴 III 함유 침전물을 얻는 단계; 및
3) 임의적으로 상기에서 얻은 역상 크로마토그래피에 의한 13-디하이드록시바카틴 III 활성 분획 또는 13-디하이드록시바카틴 III 함유 침전물을 고성능 역상 고속 액체 크로마토그래피를 수행하는 것을 포함하는 13-디하이드록시바카틴 III의 추출 및 정제 단계; 및
(d-2) 1) 상기 단계 (c)에서 얻은 순상 크로마토그래피에 의한 10-디아세틸파클리탁셀 활성 분획을 유기용매에 녹이고, 저압 역상 크로마토그래피를 수행하여 10-디아세틸파클리탁셀 활성 분획을 얻는 단계; 및
2) 임의적으로, 상기에서 얻은 역상 크로마토그래피에 의한 10-디아세틸파클리탁셀 활성 분획에 고성능 역상 고속 액체 크로마토그래피를 수행하는 것을 포함하는 10-디아세틸파클리탁셀의 추출 및 정제 단계를 포함하는 13-디하이드록시바카틴 III 및 10-디아세틸파클리탁셀의 추출 및 정제 단계.
상기한 바와 같은 본 발명의 추출 및 정제 방법을 도 1에 간략하게 도시하였다.
본 발명에 의하는 경우, 항암제로 사용되는 파클리탁셀 분리정제 공정 중에 단일 공정에 의하여 파클리탈셀과 함께 파클리탁셀 또는 도세탁셀의 전구체로 유용한 13-디하이드록시바카틴 III 및 10-디아세틸파클리탁셀을 동시에 분리할 수 있다. 이로 인하여, 이들 유용성분 생산을 위한 추가적인 배양 비용, 추출 및 분리 비용을 절감할 수 있어 경제적이며, 가격이 매우 저렴한 실리카를 이용한 저압 크로마토그래피를 적용하여 경제적으로 산업적 규모의 대량 생산이 가능하다는 이점이 있다. 특히, 본 발명의 저압 역상 크로마토그래피 공정에 C-18 수지를 사용할 수 있으며, 상기 C-18 수지는 약 100 micron이고, 공정 압력이 낮으며, 상대적으로 가격이 저렴하다는 장점을 갖는다. 또한, 저압 역상 크로마토그래피에 사용되는 용매를 후속 공정인 고성능 고속 액체 크로마토그래피의 용매와 같은 종류의 용매를 사용함으로써 설비규모의 감소 및 증류 후 재활용할 수 있는 추가적인 효과를 기대할 수 있다.
또한, 본 발명에 의하는 경우, 파클리탁셀 또는 도세탁셀의 전구체로 유용한 13-디하이드록시바카틴 III 및 10-디아세틸파클리탁셀이 합성에 용이한 순도인 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 99.5% 이상의 고순도 형태로 추출 및 정제가 가능하다는 이점이 있다.
본 발명에 있어서, 13-디하이드록시바카틴 III 및 10-디아세틸파클리탁셀을 수득하기 위한 출발 물질로서 사용된 ‘탁산류 함유 물질’은 택서스속 (Taxus genus) 식물체, 또는 택서스속 식물체에서 유래된 세포를 이용하여 세포 배양된 조직, 세포 또는 배지를 포함하는 세포 배양물을 의미한다. 상기 택서스속 식물체로는 택서스 브레비폴리아(Taxus brevifolia), 택서스 카나덴시스(Taxus canadensis), 택서스 쿠스피다타(Taxus cuspidata), 택서스 바카타(Taxus baccata), 택서스 글로보사(Taxus globosa), 택서스 플로리다나(Taxus floridana), 택서스 월리치아나(Taxus wallichiana), 택서스 메디아(Taxus media) 또는 택서스 치넨시스(Taxus chinensis) 등이 있다.
이하, 상기 공정을 보다 상세하게 설명한다.
(a) 원재료 추출 및 농축 단계
상기 단계 (a)에서 탁산 함유물질에 첨가하는 유기용매로는 메탄올, 에탄올 또는 프로판올 등의 저분자 알코올류 (C1-C4), 또는 디클로로메탄 또는 클로로포름 등의 할로겐화 알칸류 (C1-C2)등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 메탄올을 사용한다. 메탄올을 사용하여 추출하는 경우, 메탄올을 탁산 함유물질의 20 내지 200%(v/w), 바람직하게는 40 내지 140%(v/w)을 가한 후 상온에서 30분간 교반하여 여과하는 과정을 2회 이상 반복하여 파클리탁셀과 탁산 유도체를 추출한다. 상기에서 얻어진 추출액은 35 내지 40℃ 중탕에서 감압증발시켜, 농축액의 부피가 1/5 내지 1/20배, 바람직하게는 1/8 내지 1/12배가 되도록 농축한다. 이하 농축 공정에 있어서는 동일하다.
(b) 액-액 추출 단계
단계 (b)에서는 상기 (a)에서 얻어진 농축물에 물과 혼합되지 않는 유기용매를 10% 내지 50%(v/v), 바람직하게는 20% 내지 30%(v/v) 첨가하고 교반하여 분배시킨 후, 상기 유기용매층을 분리하고, 2회 이상 반복하여 감압농축하고 건조시킨다. 이 때, 첨가되는 유기용매의 양이 10%(v/v) 이하이면 상기 단계의 반복횟수가 증가하고 층분리가 잘 이루어지지 않으며, 50%(v/v) 이상이면 용매 사용량이 많아지고 수득물의 순도가 낮아지는 경향이 있다. 따라서, 상기 추출 단계의 수율, 순도 및 용매 사용량 등을 고려할 때 유기용매를 10% 내지 50%(v/v), 바람직하게는 20% 내지 30%(v/v) 첨가할 수 있다. 물과 혼합되지 않는 유기용매의 예로는 디클로로메탄 또는 클로로포름 등의 할로겐화 알칸류 (C1-C2), 에틸에테르 등의 에테르류, 에틸아세테이트, 부탄올 등을 사용할 수 있으며, 이 단계를 통해 극성 물질을 일부 제거할 수 있다.
(c)
순상
크로마토그래피에 의한 분획 단계
단계 (c)에서는 (b)단계에서 얻은 추출액을 저압 순상 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다. 순상 컬럼 크로마토그래피로 정제하는 경우, 컬럼의 충진 제로서 실리카겔을 사용할 수 있으며, 예컨대, 실리카겔 40(63~200㎛), 실리카겔 60(63~200㎛), 또는 실리카겔 60F254(200~500㎛) 등을 사용할 수 있고 바람직하게는 실리카겔 60을 사용할 수 있다. 전개용매로는 디클로로메탄 또는 클로로포름 등의 할로겐화 알칸류 (C1-C2), 메탄올, 벤젠, 아세톤, 헥산 또는 에틸아세테이트 등의 유기용매, 또는 이들의 혼합용액을 사용할 수 있다. 보다 효과적인 크로마토그래피의 수행을 위하여, 바람직하게는 아이소크래틱(isocratic) 또는 스텝 용출 (step elution) 방법으로 0.5%(v/v) 내지 10%(v/v) 메탄올/디클로로메탄 혼합용액, 더욱 바람직하게는 1.0%(v/v) 내지 5%(v/v) 메탄올/디클로로메탄 혼합용액을 사용할 수 있다. 본 공정에 의하여 파클리탈셀, 13-디하이드록시바카틴 III 및 10-디아세틸파클리탁셀이 동시에 분리된다.
(d)
역상
크로마토그래피에 의한 13-
디하이드록시바카틴
III 및 10-
디아세틸파클리탁셀의
추출 및 정제 단계
단계 (d)에서는 단계 (c)에서 얻은 13-디하이드록시바카틴 III 및 10-디아세틸파클리탁셀 활성 분획을 농축 후 건조시키고, 역상 컬럼 크로마토그래피를 수행하여, 상기 각각의 활성분획으로부터 13-디하이드록시바카틴 III 및 10-디아세틸파클리탁셀을 고순도 및 고수율로 정제할 수 있다.
(d-1) 13-
디하이드록시바카틴
III의 추출 및 정제
13-디하이드록시바카틴 III 활성 분획으로부터의 13-디하이드록시바카틴 III의 추출 및 정제 공정은 다음과 같다.
1) 단계 (c)에서 얻은 13-디하이드록시바카틴 III 활성 분획에 저압 역상 컬 럼 크로마토그래피를 수행하며, 이 경우 컬럼의 충진제로는 통상적인 소수성 수지로서 63~200㎛ ODS (Octadecylsilylated, C18), C8 또는 C4 등을 사용할 수 있다. 전개용매로는 메탄올, 에탄올, 프로판올 등의 알코올류 (C1-C6), 아세토니트릴 등의 유기용매, 정제수 또는 이들의 혼합용액을 사용할 수 있다. 보다 효과적인 크로마토그래피 수행을 위하여, 바람직하게는, 아이소크래틱(isocratic) 또는 스텝 용출 (step elution) 방법으로 20%(v/v) 내지 90%(v/v) 메탄올/정제수 혼합용액, 바람직하게는 50.0%(v/v) 내지 75%(v/v) 메탄올/정제수 혼합용액을 사용할 수 있다.
2) 임의적으로, 상기 역상 컬럼 크로마토그래피에 의하여 얻은 13-디하이드록시바카틴 III 활성 분획을 35~40℃ 물중탕에서 감압증발하여 농축 및 건조하여 건고물을 회수하여 유기 용매에 용해시킨 후, 상기 건고물 용해에 사용된 유기 용매 부피의 1 내지 20배, 바람직하게는 3 내지 10배의 침전 형성 용매를 가하여 침전을 형성한 후 여과하는 공정을 수행할 수 있다. 상기 건고물 용해에 사용되는 유기용매로서 테트라하이드로퓨란, 디클로로메탄, 클로로포름 등의 할로겐화 알칸류 (C1~C2), 메탄올, 에탄올 또는 프로판올 등의 저분자 알코올류(C1~C4), 케톤류, 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 테트라하이드로퓨란을 사용 할 수 있다. 상기 침전 형성 용매는 C4 내지 C8의 알칸류 등의 유기 용매, 정제수 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있으며, 침전 형성 용매의 첨가량이 상기 유기 용매의 부피의 1배 이하인 경우에는 침전이 잘 형성되지 않으며, 20배 이상인 경우에는 용매 사용량이 과다하고 여과시간이 많아지는 문제가 발생한다.
침전시간 및 저장온도는 특별히 한정되지 않으며, 침전은 1일 내지 5일, 바람직하게는 1일 내지 2일간 방치하여 수행할 수 있고, 저장 온도는 35℃ 이하 바람직하게는 -20 ℃ 내지 15℃로 할 수 있다. 일반적으로, 침전형성은 1 내지 2일이 지나면 완료되는데, 35℃이상의 온도에서는 침전 형성이 잘 일어나지 않고 시료의 변성이 야기될 수 있으며, -20 ℃ 이하의 온도에서는 불순물의 침전이 유발되어 순도가 낮아지는 문제점이 있다.
3) 임의적으로, 상기에서 얻은 역상 크로마토그래피에 의한 13-디하이드록시바카틴 III 활성 분획 또는 13-디하이드록시바카틴 III 침전물을 고속 액체 크로마토그래피에 의하여 정제하는 공정을 수행할 수 있다. 상기 고속 액체 크로마토그래피는 비극성 불순물의 제거가 가능한 통상적인 소수성 수지로서 5 내지 100㎛, 바람직하게는 10 내지 50㎛ ODS (Octadecylsilylated, C18), C8 또는 C4 등을 충전한 것일 수 있다. 전개용매로는 메탄올, 에탄올, 프로판올 등의 알코올류 (C1-C4), 아세토니트릴 등의 유기용매, 정제수 또는 이들의 혼합용액을 사용할 수 있으며, 바람직하게는, 50 내지 75%(v/v) 메탄올/정제수 혼합용액를 사용할 수 있다.
상기의 방법에 의하여 13-디하이드록시바카틴 III를 추출 및 정제하는 경우, 순도 99.5% 이상의 고순도 13-디하이드록시바카틴 III을 수율 61.7% 내지 79.9%의 고수율로 얻을 수 있다.
이 공정을 사용하여 수득할 수 있는 13-디하이드록시바카틴 III의 순도 및 회수율 범위를 표1에 나타내었다.
|
건고물의 순도(%) |
회수율(%) |
출발 13-디하이드록시바카틴 III 함유물질 |
0.01-0.05 |
100 |
메탄올 추출 |
0.05-0.5 |
93-97 |
액액 추출 |
1.0-9.0 |
94-96 |
순상칼럼크로마토그래피 |
10-35 |
95-97 |
역상칼럼크로마토그래피 |
65-90 |
95-97 |
테트라하이드로퓨란/헥산 침전 |
90-99 |
85-95 |
역상고속액체크로마토그래피 |
99.5-99.9 |
92-96 |
총 |
99.5-99.9 |
61.7-79.9 |
(d-2) 10-
디아세틸파클리탁셀의
추출 및 정제
단계 (c) 단계에서 얻은 10-디아세틸파클리탁셀 활성 분획으로부터 10-아세틸파클리탁셀을 추출 및 정제하는 공정은 다음과 같다.
1) 단계 (c) 단계에서 얻은 10-디아세틸파클리탁셀 활성 분획을 35 내지 40℃ 물중탕에서 감압증발하여 건조시키고, 저압 역상 컬럼 크로마토그래피를 수행한다. 저압 역상 컬럼 크로마토그래피의 컬럼 충진제로는 통상적인 소수성 수지로서 63~200㎛ ODS (Octadecylsilylated, C18), C8 또는 C4 등을 사용할 수 있다. 전개용매로는 메탄올, 에탄올, 프로판올 등의 C1-C6의 알코올류, 아세토니트릴 등의 유기용매, 정제수 또는 이들의 혼합용액을 사용할 수 있다. 보다 효과적인 크로마토그래피의 수행을 위하여, 바람직하게는 아이소크래틱(isocratic) 또는 스텝 용출 (step elution) 방법으로 20%(v/v) 내지 90%(v/v), 바람직하게는 50.0%(v/v) 내지 75%(v/v)의 메탄올/정제수 혼합용액을 사용할 수 있다.
2) 임의적으로, 상기의 역상 크로마토그래피에 의하여 얻은 10-디아세틸파클리탁셀 활성분획을 35 내지 40℃ 물중탕에서 감압증발하여 건조시키고, 고성능 고속액체 크로마토그래피를 수행할 수 있다. 상기 고성능 고속 액체 크로마토그래피는 비극성 불순물의 제거가 가능한 통상적인 소수성 수지로서 5 내지 100㎛, 바람직하게는 10 내지 50㎛ ODS (Octadecylsilylated, C18), C8 또는 C4 등을 충전한 것일 수 있다. 전개용매로는 메탄올, 에탄올, 프로판올 등의 알코올류, 아세토니트릴 등의 유기용매, 정제수 또는 이들의 혼합용액을 사용할 수 있다. 보다 효과적인 크로마토그래피의 수행을 위하여, 바람직하게는 전개용매로서 50 내지 75%(v/v) 메탄올/정제수 혼합 용액을 사용할 수 있다.
본 발명에 의하면, 비교적 단순한 공정으로 순도 99.5% 이상의 고순도 10-디아세틸파클리탁셀을 수율 72.6% 내지 84.1%의 고수율로 얻을 수 있다.
이 공정에서 수득할 수 있는 10-디아세틸파클리탁셀의 순도 및 회수율 범위를 표2에 나타내었다.
|
건고물의 순도(%) |
회수율(%) |
출발 10-디아세틸파클리탁셀 함유물질 |
0.01-0.05 |
100 |
메탄올 추출 |
0.05-0.5 |
93-97 |
액액 추출 |
1.0-9.0 |
94-96 |
순상칼럼크로마토그래피 |
10-35 |
95-97 |
역상칼럼크로마토그래피 |
75-95 |
95-97 |
역상고속액체크로마토그래피 |
99.5-99.9 |
92-96 |
총 |
99.5-99.9 |
72.6-84.1 |
상기 단계 (c)에서 분리된 파클리탁셀의 순도 및 회수율은 표 3의 조건에서 HPLC를 사용하여 정량분석하여 계산한 것이다.
기기 |
휴렛펙커드 1090 HPLC |
컬럼 |
쿠로실(Curosil) PFP 4.6x250 mm |
컬럼온도 |
35℃ |
이동상 |
아세토나이트릴:물 (35-65%(v/v) 농도구배) |
유속 |
1ml/분 |
주입량 |
10ul |
검출기 |
UV(227nm) |
이하, 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 제한되지 않는다.
실시예
1: 식물 세포배양액의 유기용매 추출 및
액액
추출
대한민국 특허공개공보 제 2005-0069891호에 기재된 바와 같이, 택서스 치넨시스(Taxus chinensis) 유래 세포주 (SYG-1, KCTC-0232BP)를 배양하여 얻은 식물 세포 50kg에 메탄올 55L를 가하고 상온에서 30분간 교반하여 여과하는 과정을 4회 반복하여 메탄올 추출액을 얻은 후 감압 농축하여 약 10L까지 농축하였다. 여기에 디클로로메탄 2800ml을 가하고 120 rpm 으로 30분간 교반하여 분배시키고, 디클로로메탄층을 분리한 후, 35 내지 40℃ 물중탕에서 감압증발하여 건조시켜, 순도 2.7% 13-디하이드록시바카틴 III, 순도 4.2% 10-디아세틸파클리탁셀 및 순도 5.8% 파클리탁셀을 포함하는 액액추출 건고물 385 g을 얻었다.
실시예
2:
순상
컬럼
크로마토그래피,
아이소크래틱용출
, 스텝용출
상기 실시예 1에서 얻어진 건고물 중 300 g을 4000 ml 디클로로메탄으로 녹인 후 여과하여, 1.5%(v/v) 메탄올/디클로로메탄으로 채워진 실리카겔 60N (Timely사, Japan)이 충진된 직경 19 cm, 길이 90 cm 스테인레스 스틸로 만든 칼럼에 1.5%(v/v) 메탄올/디클로로메탄으로 용매의 변화없이 지속적으로 용출하는 아이소크래틱 방법으로 적용하였다. 용출용매로서 1.5%(v/v) 메탄올/디클로로메탄을 이용하여 13-디하이드록시바카틴 III와 파클리탁셀을 용출시키고, 5.0%(v/v) 메탄올/디클로로메탄을 용출용매로 10-디아세틸파클리탁셀을 스텝 용출시켜 각각의 활성 분획을 얻었으며, 그 분석 결과는 하기의 표 4와 같다.
실험번호 |
활성분획 |
순도(%) |
회수율(%) |
A |
13-디하이드록시바카틴 III |
21.5 |
97.5 |
B |
10-디아세틸파클리탁셀 |
26.0 |
97.8 |
C |
파클리탁셀 |
32.5 |
98.0 |
실시예
3: 13-
디하이드록시바카틴
III의 정제
실시예
3-1. 저압
역상
컬럼
크로마토그래피,
아이소크래틱
용출
상기 실시예2의 실험번호 A의 활성분획을 35 내지 40℃ 물중탕에서 감압증발하여 건조시키고, 70%(v/v) 메탄올/정제수에 용해시킨 후, ODS를 충진한 저압 역상 액체크로마토그래피에 62%(v/v) 메탄올/정제수를 전개용매로 사용하여 이소크래틱 방법으로 크로마토그래피하여, 13-디하이드록시바카틴 III 순도가 81%인 활성분획을 수율 97.5%로 얻었다.
실시예
3-2.
테트라하이드로퓨란
/
헥산
침전
상기 실시예 3-1에서 얻어진 활성분획을 감압농축 및 건조하여 얻은 건고물을 이용하여 테트라하이드로퓨란/헥산 침전 공정을 0°C에서 24시간 수행하였다. 건고물을 동일량의 테트라하이드로퓨란(THF)에 용해시키고, 테트라하이드로퓨란에 대한 헥산 비율을 4.5 내지 6.5로 하고, 테트라하이드로퓨란 10 ml에 대한 시료의 양을 0.5g 내지 2.5g으로 하여 침전 공정을 수행하여, 아래의 표 5와 같은 결과를 얻었다.
실험 번호 |
출발물질 |
THF (ml) |
헥산 (ml) |
침전 |
순도 (%) |
시료의 양 (g) |
순도 (%) |
수율 (%) |
D |
81 |
1.0 |
10 |
45 |
99.1 |
87.0 |
E |
81 |
1.0 |
10 |
55 |
99.0 |
92.8 |
F |
81 |
1.0 |
10 |
65 |
97.0 |
93.0 |
G |
81 |
0.5 |
10 |
55 |
99.2 |
90.2 |
H |
81 |
1.5 |
10 |
55 |
98.3 |
93.5 |
I |
81 |
2.5 |
10 |
55 |
94.5 |
94.6 |
실시예
3-3. 고성능
역상
고속액체크로마토그래피
상기 실시예 3-2의 실험번호 E의 침전물을 40℃ 물중탕에서 감압증발하여 건조시키고, 80%(v/v) 메탄올/정제수에 용해시킨 후, ODS를 충진한 역상 고속액체크로마토그래피에 65%(v/v) 메탄올/정제수를 전개용매로 사용하여 이소크래틱 방법으로 크로마토그래피하여, 순도 99.5%의 13-디하이드록시바카틴 III을 96.5%의 수율로 얻었다.
실시예
4: 10-
디아세틸파클리탁셀의
정제
실시예
4-1. 저압
역상
컬럼
크로마토그래피,
아이소크래틱용출
상기 실시예 2의 실험번호 B의 활성분획을 35℃ 물중탕에서 감압증발하여 건조시키고, 70%(v/v) 메탄올/정제수에 용해시킨 후, ODS를 충진한 저압 역상 액체크로마토그래피에 62%(v/v) 메탄올/정제수를 전개용매로 사용하여 이소크래틱 방법으로 크로마토그래피하여, 순도 90.5%의 10-디아세틸파클리탁셀 활성 분획을 93.3%의 수율로 얻었다.
실시예
4-2. 고성능
역상
고속액체크로마토그래피
실시예 4-1의 활성분획을 40℃ 물중탕에서 감압증발하여 건조시키고, 80%(v/v) 메탄올/정제수에 용해시킨 후 ODS를 충진한 역상 고속액체크로마토그래피에 65%(v/v) 메탄올/정제수를 전개용매로 사용하여 이소크래틱 방법으로 크로마토그래피하여, 순도 99.8%의 10-디아세틸파클리탁셀을 수율 89%로 얻었다.