KR0150347B1 - 결정화에 의한 텍서스속 식물체로 부터 택솔의 정제방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 택서스속(Taxus genus) 식물체로부터 택솔을 정제하는 방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 택서스속 식물체를 전처리하고 용매추출 및 분별침전시켜 조정제 택솔을 분리한 다음, 분별침전 및 결정화에 의해 조정제 택솔을 정제하는 간단한 공정에 의해 높은 회수율로 고순도의 택솔을 경제적으로 정제하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 택서스속 식물체로부터 택솔의 정제방법은 출발물질로서 주목의 건조된 잎 또는 껍질을 분쇄하고 분말화하거나, 혹은 주목의 조직세포를 배양하고 식물세포를 회수하여 얻어진 식물세포의 시료를 사용하며, 택서스속 식물체의 시료에 염화나트륨 수용액을 혼합하여 여과하고 메탄올을 가하여 교반한 후 진공여과하고 여액을 감압농축하는 공정; 농축액에 메틸렌 클로라이드를 가하여 추출하고 정제수를 혼합하여 추출한 후 물층을 제거하고 감압농축하여 얻은 농축액에 혼합용매를 가하고 추출하고 유기층을 제거하여 물층에 다시 메틸-t-부틸 에테르를 가하고 추출하여 물층은 제거하고 감압농축한 후 농축액을 헥산에 첨가하여 침전된 침전물을 원심분리하여 회수하고 건조시켜 조정제 택솔을 추출하는 공정; 조정제 택솔에 메탄올을 가하여 용해시키고 정제수를 가하고 1 내지 2일간 방치한 후 여과하고 여과물을 진공건조시켜 택솔 분말을 수득하는 공정; 및, 택솔 분말을 에틸 아세테이트, 메탄올 및 물의 혼합용매에 용해시키고 0 내지 8℃에서 1 내지 2일간 방치하여 택솔을 결정화시키고 여과하여 여과물을 20 내지 30℃에서 1 내지 3시간 진공건조시키는 공정을 포함한다.

Description

결정화에 의한 택서스속 식물체로부터 택솔의 정제방법

본 발명은 택서스속(Taxus genus) 식물체로부터 택솔을 정제하는 방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 택서스속 식물체를 전처리하고 용매추출 및 분별침전시켜 조정제(粗精製, crude) 택솔을 분리한 다음, 분별침전 및 결정화(crystalization)에 의해 조정제 택솔을 정제하는 간단한 공정에 의해 높은 회수율로 고순도의 택솔을 경제적으로 정제하는 방법에 관한 것이다.

일반적으로, 택세인(taxane)계열의 화합물들은 강력한 항종양 효과를 지니는데, 택솔(taxol)은 택세인 고리를 가지는 화합물로서 최초로 알려져 있다. 택솔은 백혈병과 암치료에 상당한 효능을 나타내며 항종양 효과를 지니는 것으로 공지되어 있는데, 최근, 미국립 암센터(NCI : National Cancer Institute)의 임상실험 결과에 따르면, 난소암 환자의 약 30%이상, 유방암 환자의 약 50% 및 폐암 환자의 약 20%정도를 치유하는 효과가 있다고 보고되고 있다. 아울러, 택솔과 유사한 구조를 지닌 바카틴 Ⅲ(baccatin Ⅲ), 10-디아세틸바카틴Ⅲ(10-deacetylbaccatinⅢ), 10-디아세틸택솔(10-deacetyltaxol), 세파로만닌(cephalomannine) 및 디아세틸세파로만닌(deacetylcephalomannine)은 택솔의 유도체들로 이들 중에는 반합성에 이용되는 중요한 전구체 및 항종양 효과를 지닌 것도 있다.

이들 각 택세인 화합물의 구조를 하기에 나타내었다.

한편, 이러한 택솔을 제조하는 방법으로는 전합성법(全合成法), 반합성법(半合成法) 및 분리법(分離法)등이 알려져 있다.

그러나, 택솔의 복잡한 구조에서 알 수 있듯이, 입수가능한 출발물질을 사용하여 택솔을 합성하는 방법인 전합성법은 경제성이 없고 수율이 매우 낮기 때문에, 산업상 실제적으로 이용하기에는 한계를 지니고 있었다.

한편, 10-디아세틸바카틴Ⅲ 등의 택솔 전구체를 이용하여 택솔을 합성하는 반합성법은 식물체로부터 택솔 전구체를 분리 및 정제하는 과정과 정제된 택솔전구체를 택솔로 변환시키는 다단계 과정이 요구되어 경제성이 떨어진다는 문제점을 지니고 있었다.

따라서, 상기한 문제점으로 인해 택솔 제조방법 중에서도 분리법이 널리 사용되어 왔는데, 이러한 분리법은 식물체로부터 직접 택솔을 분리정제하는 방법으로서, 경제성과 함께 항종양 치료제로서의 효능을 지닌 택솔을 제조할 수 있다는 장점을 지녀, 고순도의 택솔을 효과적으로 분리하기 위한 다양한 시도가 행하여져 왔으며, 이와 관련된 종래의 기술에 대하여는 다음과 같은 여러 가지 문헌에 개시되어 있다.

WO 94/12268호에는 택세인 용질(solute)이 함유된 용액을 반투막(semipermeable membrane) 및 역삼투압(reverse osmosis)장치를 사용하여 정제함으로써, 고순도의 택솔을 분리정제하는 방법에 대하여 개시되어 있다.

그러나, 상기한 분리정제방법은 복잡한 반투막 및 역삼투압 장치를 사용하므로 장치의 운전에 고도의 숙련이 요구되며, 고가의 장치를 사용하기 때문에 경제적으로 택솔을 분리정제할 수 없다는 문제점을 지니고 있었다.

한편, EP 553,780호에는 택서스속 식물체를 건조 및 미분쇄하고 메탄올을 가하여 추출하여 진공농축시킨 다음, 물을 가해 희석하고 시클로헥산을 사용하여 용매추출하고 메틸렌 클로라이드를 가하여 추출하고 용매를 증발시켜 저순도의 조정제 택솔을 얻은 후 조정제 택솔을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 택솔 및 전구체를 분리하는 방법이 개시되어 있다.

또한, WO 92/18492호에는 식물체를 미분쇄하고 에탄올, 메탄올을 가하여 추출하여 농축시킨 다음, 메틸렌 클로라이드 또는 에틸 아세테이트 등을 가하고 분배(partitioning)시켜 물을 가하고 세척하여 저순도의 조정제 택솔을 얻은 후 조정제 택솔을 실리카겔 정규상(normal phase)액체 칼럼으로 정제하는 방법이 개시되어 있다.

WO 92/07842호에는 식물체를 미분쇄하고 에탄올, 클로로포름 및 메탄올을 가하고 추출하여 저순도의 조정제 택솔을 추출한 다음, 조정제 택솔을 역상(reverse phase) 액체 크로마토그래피를 사용하여 정제하는 방법이 개시되어 있다.

WO 94/13827호에는 식물체를 미분쇄하고, 메탄올 및 아세톤의 혼합 추출용매를 가한 다음, 활성탄 또는 목탄을 가하고 추출 및 정제하여 저순도의 조정제 택솔을 추출한 다음, 조정제 택솔을 실리카겔 정규상 액체 칼럼으로 정제하는 방법이 개시되어 있다.

아울러, 일본국 특허공개 평 6-157329호에는 식물체를 미분쇄하고 에틸 아세티이트, 에테르, 아세토니트릴 및 아세톤을 가하여 용매추출함으로써 저순도의 조정제 택솔을 추출하는 방법에 대하여 개시되어 있다.

그러나, 전술한 종래의 분리정제방법은 주로 저순도의 조정제 택솔을 크로마토그래피를 사용하여 정제하는 방법으로서, 전술한 방법은 제조된 조정제 택솔에는 택솔과 구조적으로 유사한 테르페노이드(terpenoid)화합물, 리피드(lipid), 클로로필 및 페놀 등의 복잡한 혼합물이 다량 포함되어 있기 때문에, 크로마토그래피를 수행시 여러 가지의 칼럼을 복합사용하는 다단계 용리(elution)에 의해서도 고순도의 택솔을 대량으로 얻을 수 없는 동시에 크로마토그래피를 수행시 칼럼에 부담을 준다는 문제점을 지니고 있었다.

또한, 종래의 분리정제방법에서는 추출된 조정제 택솔의 순도가 낮으므로 크로마토그래피를 수행시 용매에 대한 시료의 용해도가 떨어져 택솔의 회수량 및 정제효율이 나쁘고 수율이 떨어지며,주로 액상의 택솔이 얻어져 결정성 택솔을 얻기 위해서는 부수적인 결정화 과정이 요구된다는 문제점을 지녀, 상기한 종래의 택솔 분리정제방법은 산업상 실제적으로 사용하는데에는 한계를 지니고 있었다.

결국, 본 발명의 목적은 택서스속 식물체 시료로부터 고순도의 결정성 택솔을 분별침전 및 역상 칼럼 크로마토그래피에 의해 경제적이면서 고수율로 정제할 수 있는 방법을 제공함에 있다.

이하, 본 발명에 따른 택솔의 정제방법을 공정별로 보다 상세히 설명하고자 한다.

본 발명에 있어서, 택솔을 수득하기 위한 출발물질로서 택서스속 식물체 시료는 주목의 건조된 잎 또는 껍질(외피)을 분쇄하고 분말화하거나, 혹은 주목의 조직세포를 발효조에서 배양하고 식물세포를 회수하여 얻어진 식물세포의 케이크상 시료를 사용하며, 전기 방법에 의해 수득한 어떠한 물질도 본 발명에 따른 택솔을 정제방법에 효율적으로 이용될 수 있다. 또한, 본 발명에서 택서스속 식물체로는 택서스 브레비폴리아(Taxus brevifolia), 택서스 카나덴시스(Taxus canadensis), 택서스 쿠스피다타(Taxus cuspidata), 택서스 바카타(Taxus baccata), 택서스 글로보사(Taxus globosa), 택서스 플로리다나(Taxus floridana), 택서스 월리치아나(Taxus wallichiana), 택서스 메디아(Taxus media) 및 택서스 치넨시스(Taxus chinensis)등이 가능하다.

[제1공정]

1차 용매추출

택서스속 식물체의 케이크상 시료에 염화나트륨 수용액을 가하고 혼합하여 여과한 다음, 메탄올을 가하고 10 내지 30분간 교반하여 진공여과하고 여액을 30 내지 40℃에서 감압농축한다. 이때, 염화나트륨 수용액의 첨가량은 케이크상 시료에 대하여 50 내지 200%(v/w)인 것이 바람직하고, 메탄올의 첨가량은 케이크상 물질에 대하여 50 내지 200%(v/w)인 것이 바람직하며, 메탄올 첨가 및 진공여과조작은 필요에 따라 수회 반복가능하다. 또한, 감압농축시 압력은 15 내지 40in·Hg로 유지하는 것이 바람직하며, 감압농축은 케이크상 물질에 대한 농축액의 부피가 30 내지 100%(v/w)가 될 때까지 이루어지는 것이 바람직하다. 한편, 전기한 여액의 감압농축시 온도를 40℃이상으로 유지할 경우에는 택솔 및 택솔 유도체의 에피머화(epimerization)가 촉진되어 고순도의 택솔을 얻을 수 없게 된다.

[제2공정]

2차 용매추출 및 침전

전기 공정으로부터 수득한 감압농축된 농축액에 메틸렌 클로라이드를 가하여 추출하고 추출액 중에 존재하는 수용성 불순물을 제거하기 위하여 정제수를 혼합하고 추출하여 물층을 제거하고 20 내지 40℃에서 감압농축시킨 다음, 농축액에 메틸-t-부틸 에테르(methyl-t-byutyl ether), 헥산 및 염화 세틸피리디늄(cetylpyridinium chloride)의 혼합용매를 가하고 추출하여 유기층을 제거하고 물층에 다시 메틸-t-부틸 에테르를 가하고 추출하여 물층은 제거하고 20 내지 40℃에서 감압농축한 후 농축액을 헥산에 첨가하여 침전된 침전물을 원심분리하여 회수하고 건조시켜 조정제 택솔을 얻는다. 이때, 물층에 존재하는 수용성 불순물을 제거하기 위하여 감압농축하기 전의 메틸-t-부틸 에테르에 정제수를 가하고 혼합하여 추출한 다음, 물층을 제거하는 공정이 추가로 포함될 수 있으며, 조정제 택솔의 순도를 높이기 위하여 원심분리하고 건조된 침전물에 메틸렌 클로라이드를 가하고 용해시킨 다음, 헥산을 첨가하여 침전시키고 원심분리하여 침전물을 회수한 후 건조시키는 공정이 추가로 포함될 수 있다. 또한, 메틸렌 클로라이드의 첨가량은 제1공정에서 얻은 농축액에 대하여 20 내지 100%(v/v)인 것이 바람직하고, 정제수의 첨가량은 5 내지 20%(v/v)인 것이 바람직하며, 혼합용매의 첨가량은 50 내지 100%(v/v)인 것이 바람직하다. 이때, 농축액으로부터 택솔 및 택솔 유도체를 효과적으로 추출하기 위하여는 용매의 극성을 조절하는 것이 요구되는데, 이를 위해서는 전기한 혼합용매 중의 각 용매의 혼합비는 메틸-t-부틸 에테르 : 헥산 : 염화 세틸피리디늄이 부피로 2 : 2 : 1로 유지하는 것이 바람직하다. 또한, 유기층이 제거된 물층에 첨가된 메틸-t-부틸 에테르의 첨가량은 제1공정에서 얻은 농축액에 대하여 40 내지 60%(v/v)인 것이 바람직하다. 아울러, 상기 공정에서 각 유기용매와 정제수의 첨가조작은 필요에 따라 수회 반복가능하고, 감압농축시 압력은 15 내지 30in·Hg로 유지하는 것이 바람직하며, 감압농축은 제1공정에서 얻은 농축액에 대한 최종 농축액의 부피가 0.5 내지 5%(v/v)가 될 때까지 이루어지는 것이 바람직하다. 또한, 헥산의 첨가량은 농축액에 대하여 300 내지 500%(v/v)인 것이 바람직하다.

아울러, 상기한 조정제 택솔의 추출공정에서는 조정제 택솔의 순도를 향상시키기 위하여 필요한 경우에는 용매의 첨가, 진공여과 및 침전조작 등이 수회 반복될 수 있다.

[제3공정]

분별침전

전기공정으로부터 수득한 조정제 택솔에 메탄올을 가하여 조정제 택솔을 용해시키고 정제수를 가한 다음, 택솔의 결정이 균일하게 석출되도록 저속으로 교반시키면서 0 내지 8℃의 저온에서 1 내지 2일간 방치하여 여과하고 여과물을 30 내지 40℃에서 1 내지 3시간 진공건조하여 택솔 분말을 수득한다. 이때, 택솔의 순도를 높이기 위하여 여과물에 10 내지 60%의 메탄올 수용액을 가하여 여과물에 용해된 수용성 불순물을 제거하는 공정이 추가로 포함될 수 있다. 또한, 메탄올 첨가량은 조정제 택솔에 대하여 800 내지 1,600%(v/w)인 것이 바람직하고, 정제수의 첨가량은 조정제 택솔에 대하여 300 내지 1,200%(v/w)인 것이 바람직하며, 정제수의 첨가는 소량씩 나누어 첨가하는 것이 바람직하다. 아울러, 상기 공정은 필요에 따라 수회 반복가능하나, 후속공정인 결정화공정의 수행시 택솔의 회수량 및 정제효율을 증가시키기 위하여, 약 85%이상의 순도를 지닌 택솔을 얻을 수 있도록 2회 분별침전하는 것이 바람직하다.

[제4공정]

결정화

전기공정으로부터 수득한 택솔 분말을 에틸 아세테이트, 메탄올 및 물의 혼합용매에 용해시키고 0 내지 8℃의 저온에서 1 내지 2일간 방치하여 택솔을 결정화시킨 다음, 여과하여 혼합용매를 제거하고 여과물을 20 내지 30℃에서 1 내지 3시간 진공건조시켜 본 발명의 택솔 결정을 수득한다. 이때, 혼합용매의 사용량은 택솔 분말에 대하여 500 내지 800%(v/w)인 것이 바람직하며, 택솔 분말을 효과적으로 재결정화시키기 위한 혼합용매중의 각 용매의 혼합비는 에틸 아세테이트, 메탄올 및 물이 부피비로 3 : 5 : 3이 되도록 유지하는 것이 바람직하다. 본 공정에 의하면, 약 98%이상의 순도를 지닌 결정성 택솔을 90%이상의 고수율로 정제할 수 있게 된다.

[정량분석법]

전기공정으로부터 수득한 택솔의 순도 및 회수율을 측정하기 위하여, 고속 액체크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 하기 표1의 조건에서 정량분석한다.

상기한 본 발명의 택솔 정제방법에 의하면, 택서스속 식물체로부터 약 98%이상의 순도를 지닌 결정성 택솔을 90%이상의 고수율로 간단한 공정에 의해 얻을 수 있게 된다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

[실시예 1]

주목의 건조된 잎 또는 껍질로부터 얻은 시료로부터 택솔의 분리정제

주목의 건조된 잎 또는 껍질을 분쇄하고 분말화하여 얻은 케이크상 시료 200g에 10% 염화나트륨 수용액 200㎖를 가하고 혼합하여 여과한 다음, 메탄올 200㎖를 가하고 20분간 교반하여 진공여과하였으며, 다시 메탄올 200㎖씩 3회 가하고 20분간 교반하여 진공여과하였다. 여액을 25in·Hg의 압력 및 40℃의 온도에서 감압농축하여 100㎖로 농축액을 얻은 다음, 메틸렌 클로라이드 20㎖를 3회 가하여 추출하고 정제수 10㎖를 혼합하여 추출한 다음, 물층을 제거하고 15in·Hg의 압력 및 30℃의 온도에서 감압농축하였다. 농축액의 25㎖의 메틸-t-부틸 에테르, 25㎖의 헥산 및 12.5㎖의 염화 세틸피리디늄으로 구성된 혼합용매를 가하고 추출하여 유기층을 제거하고 물층에 다시 12.5㎖의 메틸-t-부틸 에테르를 4회 가하고 추출하여 물층은 제거하고 20in·Hg의 압력 및 30℃의 온도에서 1㎖로 감압농축하였다. 전기 농축액을 4㎖의 헥산에 첨가하여 침전된 침전물을 원심분리하여 회수한 다음, 건조시켜 순도 30%의 조정제 택솔을 얻었다. 조정제 택솔 1g에 메탄올 12.5㎖를 가하여 조정제 택솔을 용해시키고 교반하면서 정제수 4.2㎖를 소량씩 나누어 첨가한 다음, 교반시키면서 4℃에서 2일간 방치하여 직경 0.45㎛의 필터를 사용하여 여과하고 여과물을 35℃에서 2시간 진공건조하는 조작을 2회 반복하여 순도 85%의 택솔 분말을 수득하였다. 택솔 분말 100㎎을 에틸 아세테이트 1.5㎖, 메탄올 2.5㎖ 및 물 1.5㎖로 이루어진 혼합용매에 용해시키고 4℃에서 1일간 방치하여 택솔을 결정화시킨 다음, 0.45㎛의 필터로 여과하여 혼합용매를 제거하고 여과물을 25℃에서 2시간 진공건조시켜 본 발명의 택솔 결정을 수득하였다. 얻어진 택솔을 고속 액체 크로마토그래피를 사용하여 정량분석한 결과, 택솔의 순도는 98%, 수율은 90%인 것으로 밝혀졌다.

[실시예 2]

주목의 조직배양에 의해 얻은 시료로 부터의 추출

주목의 조직세포를 발효조에서 배양하고 식물세포를 회수하여 얻은 케이크상 시료를 사용하는 것을 제외하고는, 전기 실시예1과 동일한 방법으로 실시하여 택솔 결정을 수득하였다. 얻어진 택솔을 고속 액체크로마토그래피를 사용하여 정량분석한 결과, 택솔을 순도는 98%, 수율은 90%인 것으로 밝혀졌다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명의 정제방법에 의해 택서스속 식물체로부터 약 98%이상의 고순도를 지닌 결정성 택솔을 결정화공정에 의해 경제적이면서도 약 90%이상의 고수율로 분리정제할 수 있다는 것이 확인되었다.

Claims (3)

1. (ⅰ)택서스속(Taxus genus))식물체의 시료에 염화나트륨 수용액을 혼합하여 여과하고 메탄올을 가하여 10 내지 30분간 교반한 후 진공여과하고 여액을 30 내지 40℃에서 감압농축하는 공정; (ⅱ)전기 공정에서 수득한 농축액에 메틸렌 클로라이드를 가하여 추출하고 정제수를 혼합하여 추출한 후 물층을 제거하고 20 내지 40℃에서 감압농축하여 얻은 농축액에 메틸-t-부틸 에테르, 헥산, 염화 세틸피리디늄이 2 : 2 : 1(v/v/v)인 혼합용매를 가하고 추출하여 유기층을 제거하고 물층에 다시 메틸-t-부틸 에테르를 가하고 추출하여 물층은 제거하고, 다시 메틸-t-부틸 에테르에 정제수를 혼합하여 추출하고 물층은 제거하여 20 내지 40℃에서 감압농축하는 공정; (ⅲ)전기 공정에서 수득한 농축액을 헥산에 첨가하여 침전된 침전물을 원심분리하여 회수하고 건조시키고 메틸렌 클로라이드를 다시 가하고 용해시켜 헥산에 첨가하고 침전시켜 원심분리한 후 침전물을 건조시켜 조정제 택솔을 추출하는 공정; 및, (ⅳ)전기 공정에서 수득한 조정제 택솔에 메탄올이 조정제 택솔에 대하여 800 내지 1,600%(v/w)가 첨가되어 조정제 택솔을 용해시키고, 정제수를 조정제 택솔에 대하여 300 내지 1,200%(v/w)가 되도록 첨가하여 0 내지 8℃에서 1 내지 2일간 방치하고 여과한 다음, 여과물에 10 내지 60%의 메탄올 수용액을 가하여 여과물을 세척하고, 30 내지 40℃에서 1 내지 3시간 진공건조시켜 택솔 분말을 수득하는 공정; (ⅴ)전기 공정에서 수득한 택솔 분말을 전기 분말에 대하여 500 내지 800%(v/w)인 에틸 아세테이트 : 메탄올 : 물 = 3 : 5 :3 (v/v/v)에 용해시키고, 0 내지 8℃에서 1 내지 2일간 방치하여 택솔을 결정화시킨 후 여과하고 여과물을 20 내지 30℃에서 1 내지 3시간 진공건조시키는 공정을 포함하는 택서스속 식물체로부터 택솔의 정제방법.
2. 제1항에 있어서, 택서스속 식물체의 시료는 주목의 건조된 잎 또는 껍질을 분쇄하고 분말화하여 얻은 시료, 또는 주목의 조직세포를 배양하여 얻은 시료르 사용하는 것을 특징으로 하는 택서스속 식물체로부터 택솔의 정제방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 택서스속 식물체로는 택서스 브레비폴리아(Taxus brevifolia), 택서스 카나덴시스(Taxus canadensis), 택서스 쿠스피다타(Taxus cuspidata), 택서스 바카타(Taxus baccata), 택서스 글로보사(Taxus globosa), 택서스 플로리다나(Taxus floridana), 택서스 월리치아나(Taxus wallichiana), 택서스 메디아(Taxus media) 및 택서스 치넨시스(Taxus chinensis)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 택서스속 식물체로부터 택솔의 정제방법.