KR20070052599A - 탁산류 함유 물질로부터 13-디하이드록시바카틴 ⅲ 및10-디아세틸파클리탁셀의 추출 및 정제 방법 - Google Patents

탁산류 함유 물질로부터 13-디하이드록시바카틴 ⅲ 및10-디아세틸파클리탁셀의 추출 및 정제 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20070052599A
KR20070052599A KR1020050110407A KR20050110407A KR20070052599A KR 20070052599 A KR20070052599 A KR 20070052599A KR 1020050110407 A KR1020050110407 A KR 1020050110407A KR 20050110407 A KR20050110407 A KR 20050110407A KR 20070052599 A KR20070052599 A KR 20070052599A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
taxus
iii
organic solvent
dihydroxybacatin
diacetylpaclitaxel
Prior art date
Application number
KR1020050110407A
Other languages
English (en)
Other versions
KR100816491B1 (ko
Inventor
표상현
조진숙
김문숙
송봉규
최호준
Original Assignee
주식회사 삼양제넥스
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 삼양제넥스 filed Critical 주식회사 삼양제넥스
Priority to KR1020050110407A priority Critical patent/KR100816491B1/ko
Priority to US11/560,005 priority patent/US7880022B2/en
Publication of KR20070052599A publication Critical patent/KR20070052599A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100816491B1 publication Critical patent/KR100816491B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D305/00—Heterocyclic compounds containing four-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atoms
    • C07D305/14—Heterocyclic compounds containing four-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atoms condensed with carbocyclic rings or ring systems

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Epoxy Compounds (AREA)

Abstract

본 발명은 택서스 속과 같은 탁산류 함유물질로부터 13-디하이드록시바카틴 III 및 10-디아세틸파클리탁셀을 순도 90% 이상, 바람직하게는 순도 99.5% 이상의 고순도로 효율적으로 추출 및 정제하는 방법에 관한 것으로, 이와 같이 얻어진 고순도 13-디하이드록시바카틴 III 및 10-디아세틸파클리탁셀은 항암제인 파클리탁셀 및 도세탁셀의 반합성 전구체로서 유용하다.
13-디하이드록시바카틴 III, 10-디아세틸파클리탁셀, 탁산류, 크로마토그래피, 침전, 추출

Description

탁산류 함유 물질로부터 13-디하이드록시바카틴 Ⅲ 및 10-디아세틸파클리탁셀의 추출 및 정제 방법{METHOD FOR SEPARATION AND PURIFICATION OF 13-DEHYDROXYBACCATIN Ⅲ AND 10-DEACETYLPACLITAXEL FROM TAXANS-CONTAINING MATERIALS}
도 1은 본 발명의 13-디하이드록시바카틴 III (13-DHB III), 파클리탁셀 및 10-디아세틸파클리탁셀(10-DAP)의 추출 및 정제 공정을 요약하여 나타낸 개략도이다. [aL/L (Liquid/liquid) 추출; bLPLC (low pressure liquid chromatography): 저압 액상 크로마토그래피)]
도 2a는 본 발명의 실시예 1에서의 추출 건고물 (액액 추출 건고물)에 대한 HPLC 분석 크로마토그램을 나타낸 것이고, 2b 내지 2d는 상기 액액 추출 건고물을 순상 크로마토그래피를 이용하여 분리한 활성 분획들의 HPLC 분석 크로마토그램을 나타낸 것으로, 2b는 13-디하이드록시바카틴 III 활성 분획, 2c는 파클리탁셀 활성 분획, 2d는 10-디아세틸파클리탁셀 활성 분획에 대한 크로마토그램이다.
도 3은 본 발명의 실시예 2에서 실시한 순상 크로마토그래피에 대한 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 실시예 5에서의 정제된 13-디하이드록시바카틴 III의 HPLC 분석 크로마토그램을 나타낸것이다.
도 5는 본 발명의 실시예 7에서의 정제된 10-디아세틸파클리탁셀의 HPLC 분석 크로마토그램을 나타낸 것이다.
본 발명은 탁산류 함유물질로부터 13-디하이드록시바카틴 III 및 10-디아세틸파클리탁셀을 순도 90% 이상, 바람직하게는 순도 99.5% 이상의 고순도로 추출 및 정제하는 방법에 관한 것으로, 이와 같이 얻어진 고순도 13-디하이드록시바카틴 III 및 10-디아세틸파클리탁셀은 항암제로서 유용한 파클리탁셀 및 도세탁셀의 반합성 전구체로 이용 가능하다.
13-디하이드록시바카틴 III 및 10-디아세틸파클리탁셀는 화학반응을 통하여 파클리탁셀 또는 도세탁셀로 전환될 수 있는 전구체이다. 파클리탁셀은 1960년대 미국 국립 암연구소의 항암활성 물질에 대한 대규모 스크린잉 프로그램의 결과물로 이후 난소암, 유방암 등에 가장 중요한 항암물질로 알려져 1992년 미국식품의약국(FDA)의 승인을 받으면서 널리 이용되고 있다. 그러나 이 물질의 공급은 그 함량이 0.02%로 매우 낮은 주목 나무의 수피로부터 분리 정제가 이루어지므로 추출 정제 시 고비용이 요구되고, 또한 자원과 생태계 파괴의 원인이 된다.
이와 같은 문제점을 극복하기 위하여 주목의 잎으로부터 얻은 바카틴 III 또는 10-디아세틸바카틴 III를 이용하여 파클리탁셀을 반합성하는 방법과 주목세포배 양법을 이용한 대량 생산 방법이 이루어졌다.
또한, 13-디하이디록시바카틴 III 및 10-디아세틸파클리탁셀은 파클리탁셀의 중요한 전구체로서 이용될 수 있으며 [Rao KV, Bhakuni RS, JohnsonJ, Oruganti RS., Synthesis and evaluation of some 10-mono- and 2',10-diesters of 10-deacetylpaclitaxel. J. med. Chem., 1995, 38, 3411-3414.; Ojima I, Sun CM, Zucco M, Park YH, Duclos O, Kuduk S, A highly efficient route to taxoter by the β-lactam synthon method. Tetrahedron Lett., 1993, 34, 4149-4152.; Commercon A, Bezard D, Bernard F, Bourzat JD., Improved protection and esterification of a precursor of the Taxotere and taxol side chains. Tetrahedron Lett., 1992, 33, 5185.; Holton R, "Method for preparation of Taxol using an oxazinone." European Patent Application 400, 971(1990), US Patent 5, 015,744(1991); "Method for preparation of taxol using β-lactam." European Patent Application 428,375(1991), US Patent 5, 175,315(1992)], 상기 물질은 주목 또는 주목 세포 배양에 의한 파클리탁셀 생산 시에 파클리탁셀과 함께 생성된다.
13-디하이드록시바카틴 III 및 10-디아세틸파클리탁셀에 대한 추출정제 방법은 문헌에 거의 알려져 있지 않으며, 특히 13-디하이드록시바카틴 III의 경우 그 예를 찾아보기 어렵다. 10-디아세틸파클리탁셀의 경우 미국특허 5,475,120에서 주목으로부터 파클리탁셀과 여러가지 유도체의 추출 및 정제에 관한 방법을 제시하고 있다. 상기 문헌에 제시된 공정은 추출, 분배, 분취스케일(preparative scale)의 C-18(15-35 micron)을 사용한 역상 크로마토그래피를 이용하여 몇 개의 분취액을 얻은 후 각각의 분취액으로부터 파클리탁셀, 10-디아세틸바카틴 III, 10-디아세틸파클리탁셀 등의 유용성분을 정제하는 방법으로, 상기 C-18 수지는 15-35 micron으로서 고가이며, 적용 시료가 추출물로서 C-18 수지를 쉽게 오염시킬 수 있어 그 수명이 짧아지는 단점이 있다. 또한 각 정제 단계별 순도 및 수율에 대한 평가가 없어 공정 효율성을 파악하는데 어려움이 있다.
또한, Erik L. M.등에 의해 (Phytochemistry, 53(2000) 383-389) 여러가지 주목나무 종으로부터 유기용매를 이용한 추출과 고체상추출컬럼(solid phase extraction column)을 이용한 전처리 후 HPLC를 이용하여 파클리탁셀, 10-디아세틸파클리탁셀, 바카틴 III 등의 함량을 분석한 연구결과가 보고 되었으나, 이 방법은 HPLC를 이용한 함량 분석에 적합하고, 유용성분을 서로 분리하기 위하여 적용된 방법이 아니며, 아직까지 10-디아세틸파클리탁셀을 위해 대량 정제하기 위한 상세한 보고는 없는 실정이다.
미국특허 제 6,002,025호 역시 페닐알킬 컬럼(phenylalkyl column)과 분취용 HPLC를 이용하여 순도 50%이상의 10-디아세틸파클리탁셀, 바카틴 III, 파클리탁셀 등의 탁산류 들을 분취함으로써 정제하는 방법으로 주목 또는 배양된 주목세포로부터 추출 및 분리에 관련된 공정이 아니며, 이는 부분정제된 탁산류를 분취용 HPLC를 이용하여 정제하고자 하는 제한적 방법이다.
따라서, 탁산류 함유 물질로부터 고순도의 13-디하이드록시바카틴 III 및 10-디아세틸파클리탁셀을 효율적으로 분리 및 정제하는 기술의 개발이 요구되고 있 다.
본 발명의 목적은, 항암제인 파클리탁셀 및 도세탁셀의 반합성 전구체로서 유용하게 사용하기 위하여, 탁산류 함유 물질로부터 고순도의 13-디하이드록시바카틴 III 및 10-디아세틸파클리탁셀을 효율적으로 분리 및 정제하여 대량으로 제공할 수 있는 기술을 제공하는 것이다.
본 발명은 탁산류 함유물질로부터 13-디하이드록시바카틴 III 및 10-디아세틸파클리탁셀을 순도 90% 이상, 바람직하게는 순도 99.5% 이상의 고순도로 추출 및 정제하는 방법에 관한 것으로, 이와 같이 얻어진 고순도 13-디하이드록시바카틴 III 및 10-디아세틸파클리탁셀은 항암제인 파클리탁셀 및 도세탁셀의 반합성 전구체로서 유용하다.
상기 13-디하이디록시바카틴 III 및 10-디아세틸파클리탁셀은 탁산류 함유 물질로서 대표적인 택서스 속 식물, 예컨대, 주목 나무 또는 주목 나무 세포 배양에 의한 파클리탁셀 생산 시에 파클리탁셀과 함께 생성될 수 있다.
본 발명의 추출 및 정제 방법은 탁산류 함유 물질로부터 추출된 추물출로부터 단일 순상 크로마토그래피 공정에 의하여 파클리탁셀 뿐 아니라, 파클리탁셀 및 도세탁셀의 반합성 전구체로서 유용한 13-디하이디록시바카틴 III 및 10-디아세틸파클리탁셀 활성 분획들을 동시에 분리하고 (도1 및 2 참조), 상기 얻어진 13-디하이디록시바카틴 III 및 10-디아세틸파클리탁셀 활성 분획들을 저압 역상 크로마토 그래피하여, 13-디하이드록시바카틴 III 및 10-디아세틸파클리탁셀을 효율적으로 정제하는 방법을 제공한다.
우선, 본 발명은 탁산류 함유 물질로부터 13-디하이드록시바카틴 III를 추출 및 정제하는 방법을 제공한다. 본 발명의 13-디하이드록시바카틴 III의 추출 및 정제 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(a) 탁산류 함유물질을 유기용매로 추출한 후 농축하는 단계 (원재료 추출 및 농축 단계);
(b) 상기 단계 (a)에서 얻은 농축액에 물과 혼합되지 않는 유기용매를 가하여 분배한 후 유기용매 층을 분리하는 액-액 추출하는 단계 (액-액 추출단계);
(c) 상기 단계 (b)에서 얻은 추출액을 감압 농축한 후, 유기용매에 녹이고, 저압 순상 크로마토그래피를 수행하여, 파클리탁셀, 13-디하이드록시바카틴 III 및 10-디아세틸파클리탁셀 활성 분획을 동시에 얻는 단계 (순상 크로마토그래피에 의한 분획 단계); 및
(d-1) 상기 단계 (c)에서 얻은 순상 크로마토그래피에 의한 13-디하이드록시바카틴 III 활성 분획을 유기용매에 녹이고, 저압 역상 크로마토그래피를 수행하여, 13-디하이드록시바카틴 III 활성 분획을 얻는 단계
이와 같은 추출 및 정제 방법을 거침으로써, 반합성에 충분한 전구체 순도인 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상의 순도로 13-디하이드록시바카틴 III를 얻을 수 있다.
보다 고순도의 13-디하이드록시바카틴 III 를 얻기 위하여, 상기 13-디하이 드록시바카틴 III의 추출 및 정제 방법은 단계 (d-1)의 저압 역상 크로마토그래피 (역상-LPLC) 수행 후, 얻어진 13-디하이드록시바카틴 III 활성 분획을 유기용매, 정제수 또는 이들의 혼합물을 사용하여 침전시켜, 13-디하이드록시바카틴 III 함유 침전물을 얻는 침전 형성 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 상기 단계 (d-1)에서 얻은 13-디하이드록시바카틴 III 활성 분획 또는 침전 형성 단계를 추가로 수행하여 얻은 13-디하이드록시바카틴 III 함유 침전물에 고성능 역상 고속 액체 크로마토그래피 (역상-HPLC)를 수행하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
이와 같은 침전 형성 단계 및/또는 고성능 역상 고속 액체 크로마토그래피 수행 단계를 추가로 수행함으로써, 순도 99.5% 이상의 고순도 13-디하이드록시바카틴 III를 얻을 수 있다.
또한, 본 발명은 탁산류 함유 물질로부터 10-디아세틸파클리탁셀을 추출 및 정제하는 방법을 제공한다. 본 발명의 10-디아세틸파클리탁셀의 추출 및 정제 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(a) 탁산류 함유물질을 유기용매로 추출한 후 농축하는 단계 (원재료 추출 및 농축 단계);
(b) 상기 단계 (a)에서 얻은 농축액에 물과 혼합되지 않는 유기용매를 가하여 분배한 후 유기용매 층을 분리하는 액-액 추출하는 단계 (액-액 추출단계);
(c) 상기 단계 (b)에서 얻은 추출액을 감압 농축한 후, 유기용매에 녹이고, 저압 순상 크로마토그래피를 수행하여, 파클리탁셀, 13-디하이드록시바카틴 III 및 10-디아세틸파클리탁셀 활성 분획을 동시에 얻는 단계 (순상 크로마토그래피에 의한 분획 단계); 및
(d-2) 상기 단계 (c)에서 얻은 순상 크로마토그래피에 의한 10-디아세틸파클리탁셀 활성 분획을 유기용매에 녹이고, 저압 역상 크로마토그래피를 수행하여 10-디아세틸파클리탁셀 활성 분획을 얻는 단계.
이와 같은 추출 및 정제 방법을 거침으로써, 반합성에 충분한 전구체 순도인 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상의 순도로 10-디아세틸파클리탁셀을 얻을 수 있다.
보다 고순도의 10-디아세틸파클리탁셀을 얻기 위하여, 상기 단계 (d-2)에서 얻은 10-디아세틸파클리탁셀 활성 분획에 고성능 역상 고속 액체 크로마토그래피를 수행하는 것을 포함하는 10-디아세틸파클리탁셀의 추출 및 정제 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이와 같은 고성능 역상 고속 액체 크로마토그래피 수행 단계를 추가로 수행함으로써, 순도 99.5% 이상의 고순도 10-디아세틸파클리탁셀을 얻을 수 있다.
또한, 본 발명은, 상기 13-디하이드록시바카틴 III의 추출 및 정제 공정과 10-디아세틸파클리탁셀의 추출 및 정제 공정을 동시에 또는 연속적으로 수행하여, 탁산 함유물질로부터 13-디하이드록시바카틴 III 및 10-디아세틸파클리탁셀을 추출 및 정제하는 방법을 제공한다. 본 발명의 추출 및 정제 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(a) 탁산류 함유물질을 유기용매로 추출한 후 농축하는 단계 (원재료 추출 및 농축 단계);
(b) 상기 단계 (a)에서 얻은 농축액에 물과 혼합되지 않는 유기용매를 가하여 분배한 후 유기용매 층을 분리하는 액-액 추출하는 단계 (액-액 추출단계);
(c) 상기 단계 (b)에서 얻은 추출액을 감압 농축한 후, 유기용매에 녹이고, 저압 순상 크로마토그래피를 수행하여, 파클리탁셀, 13-디하이드록시바카틴 III 및 10-디아세틸파클리탁셀 활성 분획을 동시에 얻는 단계 (순상 크로마토그래피에 의한 분획 단계); 및
(d) 상기 단계 (c)에서 얻은 순상 크로마토그래피에 의한 13-디하이드록시바카틴 III 및 10-디아세틸파클리탁셀 활성 분획으로부터 13-디하이드록시바카틴 III 및 10-디아세틸파클리탁셀을 추출 및 정제하는 단계로서,
(d-1) 1) 상기 단계 (c)에서 얻은 순상 크로마토그래피에 의한 13-디하이드록시바카틴 III 활성 분획을 유기용매에 녹이고, 저압 역상 크로마토그래피를 수행하여, 13-디하이드록시바카틴 III 활성 분획을 얻는 단계;
2) 임의적으로, 상기에서 얻은 역상 크로마토그래피에 의한 13-디하이드록시바카틴 III 활성 분획을 정제수 또는 유기용매를 사용하여 침전시켜, 13-디하이드록시바카틴 III 함유 침전물을 얻는 단계; 및
3) 임의적으로 상기에서 얻은 역상 크로마토그래피에 의한 13-디하이드록시바카틴 III 활성 분획 또는 13-디하이드록시바카틴 III 함유 침전물을 고성능 역상 고속 액체 크로마토그래피를 수행하는 것을 포함하는 13-디하이드록시바카틴 III의 추출 및 정제 단계; 및
(d-2) 1) 상기 단계 (c)에서 얻은 순상 크로마토그래피에 의한 10-디아세틸파클리탁셀 활성 분획을 유기용매에 녹이고, 저압 역상 크로마토그래피를 수행하여 10-디아세틸파클리탁셀 활성 분획을 얻는 단계; 및
2) 임의적으로, 상기에서 얻은 역상 크로마토그래피에 의한 10-디아세틸파클리탁셀 활성 분획에 고성능 역상 고속 액체 크로마토그래피를 수행하는 것을 포함하는 10-디아세틸파클리탁셀의 추출 및 정제 단계를 포함하는 13-디하이드록시바카틴 III 및 10-디아세틸파클리탁셀의 추출 및 정제 단계.
상기한 바와 같은 본 발명의 추출 및 정제 방법을 도 1에 간략하게 도시하였다.
본 발명에 의하는 경우, 항암제로 사용되는 파클리탁셀 분리정제 공정 중에 단일 공정에 의하여 파클리탈셀과 함께 파클리탁셀 또는 도세탁셀의 전구체로 유용한 13-디하이드록시바카틴 III 및 10-디아세틸파클리탁셀을 동시에 분리할 수 있다. 이로 인하여, 이들 유용성분 생산을 위한 추가적인 배양 비용, 추출 및 분리 비용을 절감할 수 있어 경제적이며, 가격이 매우 저렴한 실리카를 이용한 저압 크로마토그래피를 적용하여 경제적으로 산업적 규모의 대량 생산이 가능하다는 이점이 있다. 특히, 본 발명의 저압 역상 크로마토그래피 공정에 C-18 수지를 사용할 수 있으며, 상기 C-18 수지는 약 100 micron이고, 공정 압력이 낮으며, 상대적으로 가격이 저렴하다는 장점을 갖는다. 또한, 저압 역상 크로마토그래피에 사용되는 용매를 후속 공정인 고성능 고속 액체 크로마토그래피의 용매와 같은 종류의 용매를 사용함으로써 설비규모의 감소 및 증류 후 재활용할 수 있는 추가적인 효과를 기대할 수 있다.
또한, 본 발명에 의하는 경우, 파클리탁셀 또는 도세탁셀의 전구체로 유용한 13-디하이드록시바카틴 III 및 10-디아세틸파클리탁셀이 합성에 용이한 순도인 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 99.5% 이상의 고순도 형태로 추출 및 정제가 가능하다는 이점이 있다.
본 발명에 있어서, 13-디하이드록시바카틴 III 및 10-디아세틸파클리탁셀을 수득하기 위한 출발 물질로서 사용된 ‘탁산류 함유 물질’은 택서스속 (Taxus genus) 식물체, 또는 택서스속 식물체에서 유래된 세포를 이용하여 세포 배양된 조직, 세포 또는 배지를 포함하는 세포 배양물을 의미한다. 상기 택서스속 식물체로는 택서스 브레비폴리아(Taxus brevifolia), 택서스 카나덴시스(Taxus canadensis), 택서스 쿠스피다타(Taxus cuspidata), 택서스 바카타(Taxus baccata), 택서스 글로보사(Taxus globosa), 택서스 플로리다나(Taxus floridana), 택서스 월리치아나(Taxus wallichiana), 택서스 메디아(Taxus media) 또는 택서스 치넨시스(Taxus chinensis) 등이 있다.
이하, 상기 공정을 보다 상세하게 설명한다.
(a) 원재료 추출 및 농축 단계
상기 단계 (a)에서 탁산 함유물질에 첨가하는 유기용매로는 메탄올, 에탄올 또는 프로판올 등의 저분자 알코올류 (C1-C4), 또는 디클로로메탄 또는 클로로포름 등의 할로겐화 알칸류 (C1-C2)등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 메탄올을 사용한다. 메탄올을 사용하여 추출하는 경우, 메탄올을 탁산 함유물질의 20 내지 200%(v/w), 바람직하게는 40 내지 140%(v/w)을 가한 후 상온에서 30분간 교반하여 여과하는 과정을 2회 이상 반복하여 파클리탁셀과 탁산 유도체를 추출한다. 상기에서 얻어진 추출액은 35 내지 40℃ 중탕에서 감압증발시켜, 농축액의 부피가 1/5 내지 1/20배, 바람직하게는 1/8 내지 1/12배가 되도록 농축한다. 이하 농축 공정에 있어서는 동일하다.
(b) 액-액 추출 단계
단계 (b)에서는 상기 (a)에서 얻어진 농축물에 물과 혼합되지 않는 유기용매를 10% 내지 50%(v/v), 바람직하게는 20% 내지 30%(v/v) 첨가하고 교반하여 분배시킨 후, 상기 유기용매층을 분리하고, 2회 이상 반복하여 감압농축하고 건조시킨다. 이 때, 첨가되는 유기용매의 양이 10%(v/v) 이하이면 상기 단계의 반복횟수가 증가하고 층분리가 잘 이루어지지 않으며, 50%(v/v) 이상이면 용매 사용량이 많아지고 수득물의 순도가 낮아지는 경향이 있다. 따라서, 상기 추출 단계의 수율, 순도 및 용매 사용량 등을 고려할 때 유기용매를 10% 내지 50%(v/v), 바람직하게는 20% 내지 30%(v/v) 첨가할 수 있다. 물과 혼합되지 않는 유기용매의 예로는 디클로로메탄 또는 클로로포름 등의 할로겐화 알칸류 (C1-C2), 에틸에테르 등의 에테르류, 에틸아세테이트, 부탄올 등을 사용할 수 있으며, 이 단계를 통해 극성 물질을 일부 제거할 수 있다.
(c) 순상 크로마토그래피에 의한 분획 단계
단계 (c)에서는 (b)단계에서 얻은 추출액을 저압 순상 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다. 순상 컬럼 크로마토그래피로 정제하는 경우, 컬럼의 충진 제로서 실리카겔을 사용할 수 있으며, 예컨대, 실리카겔 40(63~200㎛), 실리카겔 60(63~200㎛), 또는 실리카겔 60F254(200~500㎛) 등을 사용할 수 있고 바람직하게는 실리카겔 60을 사용할 수 있다. 전개용매로는 디클로로메탄 또는 클로로포름 등의 할로겐화 알칸류 (C1-C2), 메탄올, 벤젠, 아세톤, 헥산 또는 에틸아세테이트 등의 유기용매, 또는 이들의 혼합용액을 사용할 수 있다. 보다 효과적인 크로마토그래피의 수행을 위하여, 바람직하게는 아이소크래틱(isocratic) 또는 스텝 용출 (step elution) 방법으로 0.5%(v/v) 내지 10%(v/v) 메탄올/디클로로메탄 혼합용액, 더욱 바람직하게는 1.0%(v/v) 내지 5%(v/v) 메탄올/디클로로메탄 혼합용액을 사용할 수 있다. 본 공정에 의하여 파클리탈셀, 13-디하이드록시바카틴 III 및 10-디아세틸파클리탁셀이 동시에 분리된다.
(d) 역상 크로마토그래피에 의한 13- 디하이드록시바카틴 III 및 10- 디아세틸파클리탁셀의 추출 및 정제 단계
단계 (d)에서는 단계 (c)에서 얻은 13-디하이드록시바카틴 III 및 10-디아세틸파클리탁셀 활성 분획을 농축 후 건조시키고, 역상 컬럼 크로마토그래피를 수행하여, 상기 각각의 활성분획으로부터 13-디하이드록시바카틴 III 및 10-디아세틸파클리탁셀을 고순도 및 고수율로 정제할 수 있다.
(d-1) 13- 디하이드록시바카틴 III의 추출 및 정제
13-디하이드록시바카틴 III 활성 분획으로부터의 13-디하이드록시바카틴 III의 추출 및 정제 공정은 다음과 같다.
1) 단계 (c)에서 얻은 13-디하이드록시바카틴 III 활성 분획에 저압 역상 컬 럼 크로마토그래피를 수행하며, 이 경우 컬럼의 충진제로는 통상적인 소수성 수지로서 63~200㎛ ODS (Octadecylsilylated, C18), C8 또는 C4 등을 사용할 수 있다. 전개용매로는 메탄올, 에탄올, 프로판올 등의 알코올류 (C1-C6), 아세토니트릴 등의 유기용매, 정제수 또는 이들의 혼합용액을 사용할 수 있다. 보다 효과적인 크로마토그래피 수행을 위하여, 바람직하게는, 아이소크래틱(isocratic) 또는 스텝 용출 (step elution) 방법으로 20%(v/v) 내지 90%(v/v) 메탄올/정제수 혼합용액, 바람직하게는 50.0%(v/v) 내지 75%(v/v) 메탄올/정제수 혼합용액을 사용할 수 있다.
2) 임의적으로, 상기 역상 컬럼 크로마토그래피에 의하여 얻은 13-디하이드록시바카틴 III 활성 분획을 35~40℃ 물중탕에서 감압증발하여 농축 및 건조하여 건고물을 회수하여 유기 용매에 용해시킨 후, 상기 건고물 용해에 사용된 유기 용매 부피의 1 내지 20배, 바람직하게는 3 내지 10배의 침전 형성 용매를 가하여 침전을 형성한 후 여과하는 공정을 수행할 수 있다. 상기 건고물 용해에 사용되는 유기용매로서 테트라하이드로퓨란, 디클로로메탄, 클로로포름 등의 할로겐화 알칸류 (C1~C2), 메탄올, 에탄올 또는 프로판올 등의 저분자 알코올류(C1~C4), 케톤류, 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 테트라하이드로퓨란을 사용 할 수 있다. 상기 침전 형성 용매는 C4 내지 C8의 알칸류 등의 유기 용매, 정제수 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있으며, 침전 형성 용매의 첨가량이 상기 유기 용매의 부피의 1배 이하인 경우에는 침전이 잘 형성되지 않으며, 20배 이상인 경우에는 용매 사용량이 과다하고 여과시간이 많아지는 문제가 발생한다.
침전시간 및 저장온도는 특별히 한정되지 않으며, 침전은 1일 내지 5일, 바람직하게는 1일 내지 2일간 방치하여 수행할 수 있고, 저장 온도는 35℃ 이하 바람직하게는 -20 ℃ 내지 15℃로 할 수 있다. 일반적으로, 침전형성은 1 내지 2일이 지나면 완료되는데, 35℃이상의 온도에서는 침전 형성이 잘 일어나지 않고 시료의 변성이 야기될 수 있으며, -20 ℃ 이하의 온도에서는 불순물의 침전이 유발되어 순도가 낮아지는 문제점이 있다.
3) 임의적으로, 상기에서 얻은 역상 크로마토그래피에 의한 13-디하이드록시바카틴 III 활성 분획 또는 13-디하이드록시바카틴 III 침전물을 고속 액체 크로마토그래피에 의하여 정제하는 공정을 수행할 수 있다. 상기 고속 액체 크로마토그래피는 비극성 불순물의 제거가 가능한 통상적인 소수성 수지로서 5 내지 100㎛, 바람직하게는 10 내지 50㎛ ODS (Octadecylsilylated, C18), C8 또는 C4 등을 충전한 것일 수 있다. 전개용매로는 메탄올, 에탄올, 프로판올 등의 알코올류 (C1-C4), 아세토니트릴 등의 유기용매, 정제수 또는 이들의 혼합용액을 사용할 수 있으며, 바람직하게는, 50 내지 75%(v/v) 메탄올/정제수 혼합용액를 사용할 수 있다.
상기의 방법에 의하여 13-디하이드록시바카틴 III를 추출 및 정제하는 경우, 순도 99.5% 이상의 고순도 13-디하이드록시바카틴 III을 수율 61.7% 내지 79.9%의 고수율로 얻을 수 있다.
이 공정을 사용하여 수득할 수 있는 13-디하이드록시바카틴 III의 순도 및 회수율 범위를 표1에 나타내었다.
건고물의 순도(%) 회수율(%)
출발 13-디하이드록시바카틴 III 함유물질 0.01-0.05 100
메탄올 추출 0.05-0.5 93-97
액액 추출 1.0-9.0 94-96
순상칼럼크로마토그래피 10-35 95-97
역상칼럼크로마토그래피 65-90 95-97
테트라하이드로퓨란/헥산 침전 90-99 85-95
역상고속액체크로마토그래피 99.5-99.9 92-96
총 99.5-99.9 61.7-79.9
(d-2) 10- 디아세틸파클리탁셀의 추출 및 정제
단계 (c) 단계에서 얻은 10-디아세틸파클리탁셀 활성 분획으로부터 10-아세틸파클리탁셀을 추출 및 정제하는 공정은 다음과 같다.
1) 단계 (c) 단계에서 얻은 10-디아세틸파클리탁셀 활성 분획을 35 내지 40℃ 물중탕에서 감압증발하여 건조시키고, 저압 역상 컬럼 크로마토그래피를 수행한다. 저압 역상 컬럼 크로마토그래피의 컬럼 충진제로는 통상적인 소수성 수지로서 63~200㎛ ODS (Octadecylsilylated, C18), C8 또는 C4 등을 사용할 수 있다. 전개용매로는 메탄올, 에탄올, 프로판올 등의 C1-C6의 알코올류, 아세토니트릴 등의 유기용매, 정제수 또는 이들의 혼합용액을 사용할 수 있다. 보다 효과적인 크로마토그래피의 수행을 위하여, 바람직하게는 아이소크래틱(isocratic) 또는 스텝 용출 (step elution) 방법으로 20%(v/v) 내지 90%(v/v), 바람직하게는 50.0%(v/v) 내지 75%(v/v)의 메탄올/정제수 혼합용액을 사용할 수 있다.
2) 임의적으로, 상기의 역상 크로마토그래피에 의하여 얻은 10-디아세틸파클리탁셀 활성분획을 35 내지 40℃ 물중탕에서 감압증발하여 건조시키고, 고성능 고속액체 크로마토그래피를 수행할 수 있다. 상기 고성능 고속 액체 크로마토그래피는 비극성 불순물의 제거가 가능한 통상적인 소수성 수지로서 5 내지 100㎛, 바람직하게는 10 내지 50㎛ ODS (Octadecylsilylated, C18), C8 또는 C4 등을 충전한 것일 수 있다. 전개용매로는 메탄올, 에탄올, 프로판올 등의 알코올류, 아세토니트릴 등의 유기용매, 정제수 또는 이들의 혼합용액을 사용할 수 있다. 보다 효과적인 크로마토그래피의 수행을 위하여, 바람직하게는 전개용매로서 50 내지 75%(v/v) 메탄올/정제수 혼합 용액을 사용할 수 있다.
본 발명에 의하면, 비교적 단순한 공정으로 순도 99.5% 이상의 고순도 10-디아세틸파클리탁셀을 수율 72.6% 내지 84.1%의 고수율로 얻을 수 있다.
이 공정에서 수득할 수 있는 10-디아세틸파클리탁셀의 순도 및 회수율 범위를 표2에 나타내었다.
건고물의 순도(%) 회수율(%)
출발 10-디아세틸파클리탁셀 함유물질 0.01-0.05 100
메탄올 추출 0.05-0.5 93-97
액액 추출 1.0-9.0 94-96
순상칼럼크로마토그래피 10-35 95-97
역상칼럼크로마토그래피 75-95 95-97
역상고속액체크로마토그래피 99.5-99.9 92-96
총 99.5-99.9 72.6-84.1
상기 단계 (c)에서 분리된 파클리탁셀의 순도 및 회수율은 표 3의 조건에서 HPLC를 사용하여 정량분석하여 계산한 것이다.
기기 휴렛펙커드 1090 HPLC
컬럼 쿠로실(Curosil) PFP 4.6x250 mm
컬럼온도 35℃
이동상 아세토나이트릴:물 (35-65%(v/v) 농도구배)
유속 1ml/분
주입량 10ul
검출기 UV(227nm)　
이하, 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 제한되지 않는다.
실시예 1: 식물 세포배양액의 유기용매 추출 및 액액 추출
대한민국 특허공개공보 제 2005-0069891호에 기재된 바와 같이, 택서스 치넨시스(Taxus chinensis) 유래 세포주 (SYG-1, KCTC-0232BP)를 배양하여 얻은 식물 세포 50kg에 메탄올 55L를 가하고 상온에서 30분간 교반하여 여과하는 과정을 4회 반복하여 메탄올 추출액을 얻은 후 감압 농축하여 약 10L까지 농축하였다. 여기에 디클로로메탄 2800ml을 가하고 120 rpm 으로 30분간 교반하여 분배시키고, 디클로로메탄층을 분리한 후, 35 내지 40℃ 물중탕에서 감압증발하여 건조시켜, 순도 2.7% 13-디하이드록시바카틴 III, 순도 4.2% 10-디아세틸파클리탁셀 및 순도 5.8% 파클리탁셀을 포함하는 액액추출 건고물 385 g을 얻었다.
실시예 2: 순상 컬럼 크로마토그래피, 아이소크래틱용출 , 스텝용출
상기 실시예 1에서 얻어진 건고물 중 300 g을 4000 ml 디클로로메탄으로 녹인 후 여과하여, 1.5%(v/v) 메탄올/디클로로메탄으로 채워진 실리카겔 60N (Timely사, Japan)이 충진된 직경 19 cm, 길이 90 cm 스테인레스 스틸로 만든 칼럼에 1.5%(v/v) 메탄올/디클로로메탄으로 용매의 변화없이 지속적으로 용출하는 아이소크래틱 방법으로 적용하였다. 용출용매로서 1.5%(v/v) 메탄올/디클로로메탄을 이용하여 13-디하이드록시바카틴 III와 파클리탁셀을 용출시키고, 5.0%(v/v) 메탄올/디클로로메탄을 용출용매로 10-디아세틸파클리탁셀을 스텝 용출시켜 각각의 활성 분획을 얻었으며, 그 분석 결과는 하기의 표 4와 같다.
실험번호 활성분획 순도(%) 회수율(%)
A 13-디하이드록시바카틴 III 21.5 97.5
B 10-디아세틸파클리탁셀 26.0 97.8
C 파클리탁셀 32.5 98.0
실시예 3: 13- 디하이드록시바카틴 III의 정제
실시예 3-1. 저압 역상 컬럼 크로마토그래피, 아이소크래틱 용출
상기 실시예2의 실험번호 A의 활성분획을 35 내지 40℃ 물중탕에서 감압증발하여 건조시키고, 70%(v/v) 메탄올/정제수에 용해시킨 후, ODS를 충진한 저압 역상 액체크로마토그래피에 62%(v/v) 메탄올/정제수를 전개용매로 사용하여 이소크래틱 방법으로 크로마토그래피하여, 13-디하이드록시바카틴 III 순도가 81%인 활성분획을 수율 97.5%로 얻었다.
실시예 3-2. 테트라하이드로퓨란 / 헥산 침전
상기 실시예 3-1에서 얻어진 활성분획을 감압농축 및 건조하여 얻은 건고물을 이용하여 테트라하이드로퓨란/헥산 침전 공정을 0°C에서 24시간 수행하였다. 건고물을 동일량의 테트라하이드로퓨란(THF)에 용해시키고, 테트라하이드로퓨란에 대한 헥산 비율을 4.5 내지 6.5로 하고, 테트라하이드로퓨란 10 ml에 대한 시료의 양을 0.5g 내지 2.5g으로 하여 침전 공정을 수행하여, 아래의 표 5와 같은 결과를 얻었다.
실험 번호 출발물질 THF (ml) 헥산 (ml) 침전
순도 (%) 시료의 양 (g) 순도 (%) 수율 (%)
D 81 1.0 10 45 99.1 87.0
E 81 1.0 10 55 99.0 92.8
F 81 1.0 10 65 97.0 93.0
G 81 0.5 10 55 99.2 90.2
H 81 1.5 10 55 98.3 93.5
I 81 2.5 10 55 94.5 94.6
실시예 3-3. 고성능 역상 고속액체크로마토그래피
상기 실시예 3-2의 실험번호 E의 침전물을 40℃ 물중탕에서 감압증발하여 건조시키고, 80%(v/v) 메탄올/정제수에 용해시킨 후, ODS를 충진한 역상 고속액체크로마토그래피에 65%(v/v) 메탄올/정제수를 전개용매로 사용하여 이소크래틱 방법으로 크로마토그래피하여, 순도 99.5%의 13-디하이드록시바카틴 III을 96.5%의 수율로 얻었다.
실시예 4: 10- 디아세틸파클리탁셀의 정제
실시예 4-1. 저압 역상 컬럼 크로마토그래피, 아이소크래틱용출
상기 실시예 2의 실험번호 B의 활성분획을 35℃ 물중탕에서 감압증발하여 건조시키고, 70%(v/v) 메탄올/정제수에 용해시킨 후, ODS를 충진한 저압 역상 액체크로마토그래피에 62%(v/v) 메탄올/정제수를 전개용매로 사용하여 이소크래틱 방법으로 크로마토그래피하여, 순도 90.5%의 10-디아세틸파클리탁셀 활성 분획을 93.3%의 수율로 얻었다.
실시예 4-2. 고성능 역상 고속액체크로마토그래피
실시예 4-1의 활성분획을 40℃ 물중탕에서 감압증발하여 건조시키고, 80%(v/v) 메탄올/정제수에 용해시킨 후 ODS를 충진한 역상 고속액체크로마토그래피에 65%(v/v) 메탄올/정제수를 전개용매로 사용하여 이소크래틱 방법으로 크로마토그래피하여, 순도 99.8%의 10-디아세틸파클리탁셀을 수율 89%로 얻었다.
본 발명은 13-디하이드록시바카틴 III 및 10-디아세틸파클리탁셀의 정제 방법에 관한 것으로, 본 발명의 방법에 의하는 경우, 99.5% 이상의 고순도의 13-디하이드록시바카틴 III 및 10-디아세틸파클리탁셀을 얻을 수 있다. 이들 물질은 파클리탁셀 및 도세탁셀의 반합성 전구체로 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 정제 방법은 추출과 저압 순상 및 역상 크로마토그래피를 통해 순도 80% 이상으로 정제할 수 있으며, 테트라하이드로퓨란/헥산 침전 또는 고성능 고속 액체 크로마토그래피를 통하여 종래의 기술에 비해 효율적으로 정제함으로써 고수율, 고순도의 13-디하이드록시바카틴 III 및 10-디아세틸파클리탁셀을 생산하는데 유용하다.

Claims (24)

  1. (a) 탁산류 함유물질을 유기용매로 추출한 후 농축하는 단계;
    (b) 상기 단계 (a)에서 얻은 농축액에 물과 혼합되지 않는 유기용매를 가하여 분배한 후 유기용매 층을 분리하는 액-액 추출하는 단계;
    (c) 상기 단계 (b)에서 얻은 추출액을 감압 농축한 후, 유기용매에 녹이고, 저압 순상 크로마토그래피를 수행하여, 파클리탁셀, 13-디하이드록시바카틴 III 및 10-디아세틸파클리탁셀 활성 분획을 동시에 얻는 단계; 및
    (d-1) 상기 단계 (c)에서 얻은 순상 크로마토그래피에 의한 13-디하이드록시바카틴 III 활성 분획을 유기용매에 녹이고, 저압 역상 액체 크로마토그래피를 수행하여, 13-디하이드록시바카틴 III 활성 분획을 얻는 단계를 포함하는 13-디하이드록시바카틴 III의 추출 및 정제 단계를 포함하는,
    탁산류 함유 물질로부터의 13-디하이드록시바카틴 III의 추출 및 정제 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단계 (d-1)의 저압 역상 액체 크로마토그래피 수행한 이후에,
    상기 저압 역상 액체 크로마토그래피에서 얻어진 13-디하이드록시바카틴 III 활성 분획을 유기용매, 정제수 또는 이들의 혼합물을 사용하여 침전시켜, 13-디하이드록시바카틴 III 함유 침전물을 얻는 단계; 또는
    고성능 역상 고속 액체 크로마토그래피를 수행하는 단계를 추가로 포함하거 나, 또는
    상기 두 단계 모두를 추가로 포함하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 침전물을 얻는 단계가,
    역상 크로마토그래피에 의한 13-디하이드록시바카틴 III 활성 분획을 테트라하이드로퓨란, C1 내지 C4의 알코올류, C1 내지 C2의 할로겐화 알칸류, 및 케톤류로 이루어진 군 중에서 선택된 유기 용매, 또는 이들의 혼합물을 용매로 사용하여 용해시키고,
    얻어진 용액에 C4 내지 C8의 알칸류, 정제수 및 이들의 혼합물로 이루어진 군 중에서 선택된 물질을 상기 13-디하이드록시바카틴 III 활성 분획의 용해를 위하여 사용된 용매의 부피의 1 내지 20 배로 첨가하여 침전을 형성시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탁산류 함유 물질이 택서스 브레비폴리아(Taxus brevifolia), 택서스 카나덴시스(Taxus canadensis), 택서스 쿠스피다타(Taxus cuspidata), 택서스 바카타(Taxus baccata), 택서스 글로보사(Taxus globosa), 택서스 플로리다나(Taxus floridana), 택서스 월리치아나(Taxus wallichiana), 택서스 메디아(Taxus media) 및 택서스 치넨시스(Taxus chinensis)로 이루어진 군 중에서 선택된 택서스속 식물체, 또는 상기 택서스속 식물체로부터 유래된 세포, 조직 또는 세포 배양물인 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 유기용매가 C1 내지 C4의 저분자 알코올류 및 할로겐화 알칸류 (C1-C2)로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (b)의 유기용매가 물과 혼합되지 않는 유기용매로서 할로겐화 알칸류 (C1-C2), 에테르류, 에틸아세테이트 및 부탄올로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (c)의 순상 크로마토그래피의 전개 용매가 할로겐화 알칸류 (C1-C2), 메탄올, 벤젠, 아세톤, 헥산 및 에틸아세테이트로 구성되는 군으로부터 선택된 1종 이상의 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 역상 크로마토그래피의 전개용매가 C1 내지 C4의 알코올류, 아세토니트릴 및 정제수로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 것인 방법.
  9. (a) 탁산류 함유물질을 유기용매로 추출한 후 농축하는 단계;
    (b) 상기 단계 (a)에서 얻은 농축액에 물과 혼합되지 않는 유기용매를 가하여 분배한 후 유기용매 층을 분리하는 액-액 추출하는 단계;
    (c) 상기 단계 (b)에서 얻은 추출액을 감압 농축한 후, 유기용매에 녹이고, 저압 순상 크로마토그래피를 수행하여, 파클리탁셀, 13-디하이드록시바카틴 III 및 10-디아세틸파클리탁셀 활성 분획을 동시에 얻는 단계; 및
    (d-2) 상기 단계 (c)에서 얻은 순상 크로마토그래피에 의한 10-디아세틸파클리탁셀 활성 분획을 유기용매에 녹이고, 저압 역상 액체 크로마토그래피를 수행하여 10-디아세틸파클리탁셀 활성 분획을 얻는 단계를 포함하는 10-디아세틸파클리탁셀의 추출 및 정제 단계를 포함하는,
    탁산류 함유 물질로부터 10-디아세틸파클리탁셀의 추출 및 정제 방법.
  10. 제9항에 있어서, (d-2)의 저압 역상 액체 크로마토그래피 수행 후, 얻어진 10-디아세틸파클리탁셀 활성 분획에 고성능 역상 고속 액체 크로마토그래피를 수행하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  11. 제9항 또는 10항에 있어서, 상기 탁산류 함유 물질이 택서스 브레비폴리아(Taxus brevifolia), 택서스 카나덴시스(Taxus canadensis), 택서스 쿠스피다타(Taxus cuspidata), 택서스 바카타(Taxus baccata), 택서스 글로보사(Taxus globosa), 택서스 플로리다나(Taxus floridana), 택서스 월리치아나(Taxus wallichiana), 택서스 메디아(Taxus media) 및 택서스 치넨시스(Taxus chinensis) 로 이루어진 군 중에서 선택된 택서스속 식물체, 또는 상기 택서스속 식물체로부터 유래된 세포, 조직 또는 세포 배양물인 방법.
  12. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 단계 (a)의 유기용매가 C1 내지 C4의 저분자 알코올류 및 할로겐화 알칸류 (C1-C2)로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 것인 방법.
  13. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 단계 (b)의 유기용매가 물과 혼합되지 않는 유기용매로서, 할로겐화 알칸류 (C1-C2), 에테르류, 에틸아세테이트 및 부탄올로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 것인 방법.
  14. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 단계 (c)의 순상 크로마토그래피의 전개 용매가 할로겐화 알칸류 (C1-C2), 메탄올, 벤젠, 아세톤, 헥산 및 에틸아세테이트로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 것인 방법.
  15. 제9항 또는 제10항에 있어서 상기 역상 크로마토그래피의 전개용매가 C1 내지 C4의 알코올류, 아세토니트릴 및 정제수로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 것인 방법.
  16. (a) 탁산류 함유물질을 유기용매로 추출한 후 농축하는 단계;
    (b) 상기 단계 (a)에서 얻은 농축액에 물과 혼합되지 않는 유기용매를 가하여 분배한 후 유기용매 층을 분리하는 액-액 추출하는 단계;
    (c) 상기 단계 (b)에서 얻은 추출액을 감압 농축한 후, 유기용매에 녹이고, 저압 순상 크로마토그래피를 수행하여, 파클리탁셀, 13-디하이드록시바카틴 III 및 10-디아세틸파클리탁셀 활성 분획을 동시에 얻는 단계; 및
    (d) 상기 단계 (c)에서 얻은 순상 크로마토그래피에 의한 13-디하이드록시바카틴 III 및 10-디아세틸파클리탁셀 활성 분획으로부터 13-디하이드록시바카틴 III 및 10-디아세틸파클리탁셀을 추출 및 정제하는 단계로서,
    (d-1) 상기 단계 (c)에서 얻은 순상 크로마토그래피에 의한 13-디하이드록시바카틴 III 활성 분획을 유기용매에 녹이고, 저압 역상 크로마토그래피를 수행하여, 13-디하이드록시바카틴 III 활성 분획을 얻는 단계를 포함하는 13-디하이드록시바카틴 III의 추출 및 정제 단계; 및
    (d-2) 상기 단계 (c)에서 얻은 순상 크로마토그래피에 의한 10-디아세틸파클리탁셀 활성 분획을 유기용매에 녹이고, 저압 역상 크로마토그래피를 수행하여 10-디아세틸파클리탁셀 활성 분획을 얻는 단계를 포함하는 10-디아세틸파클리탁셀의 추출 및 정제 단계를 포함하는 13-디하이드록시바카틴 III 및 10-디아세틸파클리탁셀의 추출 및 정제 단계를 포함하는,
    탁산류 함유 물질로부터 13-디하이드록시바카틴 III 및 10-디아세틸파클리탁셀의 동시 추출 및 정제 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 단계 (d-1)의 저압 역상 액체 크로마토그래피 수행 이후에,
    상기 저압 역상 액체 크로마토그래피에서 얻어진 13-디하이드록시바카틴 III 활성 분획을 유기용매, 정제수 또는 이들의 혼합물을 사용하여 침전시켜, 13-디하이드록시바카틴 III 함유 침전물을 얻는 단계, 또는
    고성능 역상 고속 액체 크로마토그래피를 수행하는 단계를 추가로 포함하거나,
    또는 상기 두 단계 모두를 추가로 포함하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 침전물을 얻는 단계가,
    역상 크로마토그래피에 의한 13-디하이드록시바카틴 III 활성 분획을 테트라하이드로퓨란, ㅂC1 내지 C4의 알코올류, C1 내지 C2의 할로겐화 알칸류, 케톤류로 이루어진 군 중에서 선택된 유기 용매, 또는 이들의 혼합물을 용매로 사용하여 용해시키고,
    얻어진 용액에 C4 내지 C8의 알칸류, 정제수 및 이들의 혼합물로 이루어진 군 중에서 선택된 물질을 상기 13-디하이드록시바카틴 III 활성 분획의 용해를 위하여 사용된 용매의 부피의 1 내지 20 배로 첨가하여 침전을 형성시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  19. 제16항에 있어서, (d-2)의 저압 역상 액체 크로마토그래피 수행 후, 얻어진 10-디아세틸파클리탁셀 활성 분획에 고성능 역상 고속 액체 크로마토그래피를 수행하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  20. 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탁산류 함유 물질이 택서스 브레비폴리아(Taxus brevifolia), 택서스 카나덴시스(Taxus canadensis), 택서스 쿠스피다타(Taxus cuspidata), 택서스 바카타(Taxus baccata), 택서스 글로보사(Taxus globosa), 택서스 플로리다나(Taxus floridana), 택서스 월리치아나(Taxus wallichiana), 택서스 메디아(Taxus media) 및 택서스 치넨시스(Taxus chinensis)로 이루어진 군 중에서 선택된 택서스속 식물체, 또는 상기 택서스속 식물체로부터 유래된 세포, 조직 또는 세포 배양물인 방법.
  21. 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 유기용매가 C1 내지 C4의 저분자 알코올류 및 할로겐화 알칸류 (C1-C2)로 구성되는 군으로부터 선택된 1종 이상의 것인 방법.
  22. 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (b)의 유기용매가 물과 혼합되지 않는 유기용매로서 할로겐화 알칸류 (C1-C2), 에테르류, 에틸아세테이트 및 부탄올로 구성되는 군으로부터 선택된 1종 이상의 것인 방법.
  23. 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (c)의 순상 크로마토그래피의 전개 용매가 할로겐화 알칸류 (C1-C2), 메탄올, 벤젠, 아세톤, 헥산 및 에틸아세테이트로 구성되는 군으로부터 선택된 1종 이상의 것인 방법.
  24. 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 역상 크로마토그래피의 전개용매가 C1 내지 C4의 알코올류, 아세토니트릴 및 정제수로 구성되는 군으로부터 선택된 1종 이상의 것인 방법.
KR1020050110407A 2005-11-17 2005-11-17 탁산류 함유 물질로부터 13-디하이드록시바카틴 ⅲ 및10-디아세틸파클리탁셀의 추출 및 정제 방법 KR100816491B1 (ko)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020050110407A KR100816491B1 (ko) 2005-11-17 2005-11-17 탁산류 함유 물질로부터 13-디하이드록시바카틴 ⅲ 및10-디아세틸파클리탁셀의 추출 및 정제 방법
US11/560,005 US7880022B2 (en) 2005-11-17 2006-11-15 Method for separation and purification of 13-dehydroxybaccatin III and 10-deacetylpaclitaxel from taxans-containing materials

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020050110407A KR100816491B1 (ko) 2005-11-17 2005-11-17 탁산류 함유 물질로부터 13-디하이드록시바카틴 ⅲ 및10-디아세틸파클리탁셀의 추출 및 정제 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20070052599A true KR20070052599A (ko) 2007-05-22
KR100816491B1 KR100816491B1 (ko) 2008-03-24

Family

ID=38041813

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020050110407A KR100816491B1 (ko) 2005-11-17 2005-11-17 탁산류 함유 물질로부터 13-디하이드록시바카틴 ⅲ 및10-디아세틸파클리탁셀의 추출 및 정제 방법

Country Status (2)

Country Link
US (1) US7880022B2 (ko)
KR (1) KR100816491B1 (ko)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102008031208B4 (de) * 2008-07-03 2010-03-25 Technische Universität Dortmund Prozess zur großtechnischen Produktion von Taxanen
EP2358693A4 (en) * 2008-11-20 2012-04-18 Reddys Lab Ltd Dr PREPARATION OF DOCETAXEL
CN103828619B (zh) * 2014-03-31 2015-05-13 东北林业大学 一种促进喜树生长和喜树碱含量增加的方法
KR101726728B1 (ko) * 2015-07-28 2017-04-14 주식회사 삼양바이오팜 고분자 담체 함유 약학 조성물의 유연물질 분석 방법
CN109942515A (zh) * 2019-04-28 2019-06-28 云南汉德生物技术有限公司 一种提取10-去乙酰基紫杉醇的方法
CN111675679A (zh) * 2020-07-08 2020-09-18 云南汉德生物技术有限公司 一种高效分离纯化10-脱乙酰基紫杉醇的方法

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5256801A (en) 1992-08-14 1993-10-26 Napro Biotherapeutics, Inc. Processes of converting taxanes into 10-deacetylbaccatin III
US5279949A (en) * 1992-12-07 1994-01-18 Board Of Trustees Operating Michigan State University Process for the isolation and purification of taxol and taxanes from Taxus spp
US5585946A (en) * 1994-08-19 1996-12-17 Vivitek Co., Ltd. Virtual image display system with reduced ambient reflection and low radiation
WO1996034973A1 (en) 1995-04-29 1996-11-07 Samyang Genex Co., Ltd. A method for mass production of taxol from taxus genus plant
US6481851B1 (en) * 1995-09-20 2002-11-19 Videotronic Systems Adjustable contrast reflected display system
US6104424A (en) * 1995-09-20 2000-08-15 Videotronic Systems Foldable eye contact components for a dual mode display
US6379009B1 (en) * 1996-04-24 2002-04-30 James L. Fergason Conjugate optics projection display with image enhancement
US6066748A (en) * 1997-12-17 2000-05-23 Han; Man Woo Process of extracting TAXOL® from taxus cuspidata
US5913591A (en) * 1998-01-20 1999-06-22 University Of Washington Augmented imaging using a silhouette to improve contrast
ES2215395T3 (es) * 1998-08-18 2004-10-01 Bristol-Myers Squibb Company Procedimiento para la preparacion de c-4 desacetiltaxanos.
US6878832B2 (en) * 2000-11-13 2005-04-12 Lahu Saiji Isolation of taxanes
US6881852B2 (en) * 2002-02-05 2005-04-19 Dabur India Limited Process of purification of paclitaxel and docetaxel
KR100555767B1 (ko) * 2002-12-30 2006-03-03 주식회사 삼양제넥스 파클리탁셀 함유물질로부터 파클리탁셀의 추출 정제 방법
US7259268B2 (en) * 2003-12-31 2007-08-21 Samyang Genex Corporation Method for purification of paclitaxel from paclitaxel-containing materials

Also Published As

Publication number Publication date
KR100816491B1 (ko) 2008-03-24
US20070112207A1 (en) 2007-05-17
US7880022B2 (en) 2011-02-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU768026B2 (en) Isolation and purification of paclitaxel and other related taxanes by industrial preparative low pressure chromatography on a polymeric resin column
US20080076936A1 (en) Purification of Taxanes and Taxane Mixtures Using Polyethyleneimine-Bonded Resins
KR100816491B1 (ko) 탁산류 함유 물질로부터 13-디하이드록시바카틴 ⅲ 및10-디아세틸파클리탁셀의 추출 및 정제 방법
AU760242B2 (en) Method for high yield extraction of paclitaxel from paclitaxel-containing material
US9926287B2 (en) Purification of taxanes
JP2965168B2 (ja) イチイ属植物からのタキソールの大量生産方法
US7169307B2 (en) Process for the extraction of paclitaxel and 9-dihydro-13-acetylbaccatin III from Taxus
US6878832B2 (en) Isolation of taxanes
US6229027B1 (en) Process for manufacturing paclitaxel and 13-acetyl-9-dihydrobaccatin IV
US7259268B2 (en) Method for purification of paclitaxel from paclitaxel-containing materials
KR100624104B1 (ko) 파클리탁셀 함유물질로부터 파클리탁셀의 정제방법
KR100555767B1 (ko) 파클리탁셀 함유물질로부터 파클리탁셀의 추출 정제 방법
KR100259396B1 (ko) 택서스속 식물체로부터 택솔의 대량 추출 정제방법
KR100259395B1 (ko) 택서스속 식물체로부터 택솔의 대량 추출 정제방법

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
G170 Publication of correction
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20121130

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20131209

Year of fee payment: 7

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20141217

Year of fee payment: 8

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20151228

Year of fee payment: 9

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20161202

Year of fee payment: 10

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20171213

Year of fee payment: 11

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20181205

Year of fee payment: 12

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20191216

Year of fee payment: 13