-
Taxane
sind biologisch aktive Moleküle,
die der Stoffgruppe der Diterpene zugeordnet werden. Sie sind Sekundärmetabolite,
werden also von Pflanzen produziert, sind aber für deren Wachstum nicht essentiell. Das
weitaus bekannteste und am besten erforschte Taxan ist Paclitaxel
(Markenname Taxol). Es wird als antitumoraler Wirkstoff in der Chemotherapie
eingesetzt und wirkt mit Hilfe eines Mechanismus, der von der Wirkungsweise
anderer Antitumorstoffe abweicht. Es heftet sich an die Mikrotubuli,
Strukturen des Cytoskeletts der Zelle und regt die Polymerisation
von Tubulin-Dimeren zur Bildung von Mikrotubuli an. Dadurch bilden
sich ungewöhnlich
stabile, statische Mikrotubuli, so dass die Zellteilung gehemmt
wird.
-
Aufgrund
dieser Funktion gilt Paclitaxel als ein sehr vielversprechendes
Antikrebsmedikament. Nachdem zunächst
eine außergewöhnlich gute
Wirksamkeit gegen Eierstockkrebs entdeckt wurde und Paclitaxel seit
1992 zu dessen Behandlung eingesetzt wird, folgte die Freigabe zur
Behandlung von Brust- und Lungenkrebs. Effizienz zeigt Paclitaxel
z. B. auch gegen Darmkrebs und Melanome.
-
Dieses
breite Anwendungsgebiet zeigt bereits das große wirtschaftliche Potenzial
der Paclitaxel-Produktion, welches sich in einem jährlichen
Erlös der
weltweiten Taxanproduktion von 3 Milliarden Dollar niederschlägt.
-
Um
den großen
Bedarf zu decken, reicht die Menge an Paclitaxel, die ursprünglich durch
Isolierung aus der Rinde der nordpazifischen Eibe (Taxus brevifolia)
gewonnen wurde, bei weitem nicht mehr aus. Hinzu kommt, dass die
Ausbeute an Taxol aus der Rinde der Eibe sehr gering ist (1 g Taxol/10
kg Rinde). Es ist zudem davon auszugehen, dass der Bedarf an Paclitaxel
aufgrund der Entdeckung immer neuer Anwendungsbereiche weiter steigen
wird.
-
Als
weiterer Punkt ist auch der ökologische
Aspekt von Bedeutung. Taxus brevifolia steht bereits auf der roten
Liste der gefährdeten
Arten.
-
Taxane
wie Paclitaxel können
auch aus anderen Taxus-Arten, wie Taxus baccata, Taxus chinensis oder
Taxus wallichiana, gewonnen werden. Diese Eiben kommen in größerer Zahl
vor und aus ihren Zweigen und Nadeln lassen sich Taxane mit weniger
Aufwand und somit ökonomisch
günstiger
gewinnen. Trotzdem ist eine Deckung des Bedarfs auf diese Weise
unrealistisch, da die Eiben sehr langsam wachsen und Umwelteinflüsse zu einem
fluktuierenden Vorrat an Paclitaxel führen. Auch die vollständig synthetische
Herstellung von Paclitaxel ist seit 1994 möglich. Sie erfordert allerdings
eine große
Anzahl an sehr komplexen Syntheseschritten, und die Ausbeute ist
im Vergleich zum Aufwand sehr gering.
-
Die
vollsynthetische Herstellung von Paclitaxel ist daher weit von einer
wirtschaftlichen Umsetzung entfernt.
-
Als
eine wirtschaftliche Alternative hat sich inzwischen die Paclitaxel-Produktion
in Zellkulturen erwiesen, welche bereits z. B. durch die Firma Phyton
Biotech GmbH industriell realisiert ist. Eine interessante Alternative
hierzu bietet eine biotechnologische Produktion von Baccatin III
und 10-Deacetylbacccatin III in Zellkulturen, da Paclitaxel oder
strukturell ähnliche
Moleküle
mit vergleichbarer oder möglicherweise
besserer zytostatischer Wirkung aus diesen Vorstufen durch Semisynthese
gewonnen werden können.
-
Neben
der eigentlichen fermentativen Produktion der gewünschten
Taxane besteht generell die Herausforderung in der sich anschließenden Isolierung
der sehr niedrig konzentrierten Zielkomponenten (im Bereich von
mg/l) aus einem komplexen Fermentationsgemisch.
-
Hierzu
sind aus den Dokumenten
EP
0 690 852 B1 ,
FR
2 903 104 B1 und Foucault und Chevolot (1998, Journal of
Chromatography A, Vol. 808, 3–22)
Flüssig-flüssig-Verteilungschromatographieverfahren
zur Aufreinigung von Taxanen und anderen in der Natur vorkommenden
Substanzen bekannt. Die Trennung erfolgt jeweils bei Raumtemperatur
mit Hilfe nicht miteinander mischbarer, flüssiger Phasen eines Lösungsmittelsystems,
wobei die Eluenten beispielsweise aus Mischungen von Heptan-Ethylacetat-Methanol-Wasser
(
EP 0 690 852 B1 ),
Methylisobutylketon-Aceton-Wasser (
EP 0 690 852 B1 ) oder Heptan, Tetrahydrofuran,
Dimethlyformamid und Wasser (
FR 2 903 104 B1 ) bestehen.
-
In
allen beschriebenen Verfahren liegen die Taxane vor der Chromatographie
mit einem Reinheitsgrad von 90% und mehr vor.
-
Zudem
wird in dem Dokument „Comprehensive
Analytical Chemistry”,
Vol. XXXVIII, aus dem Jahre 2002 auf den Seiten 207 bis 209 offenbart,
dass sich ein hydrodynamisches Flüssig-flüssig-Verteilungschromatographieverfahren
(HSCCC-Verfahren) zur Isolierung von Taxanen aus Nadeln eignet.
Zur Durchführung dieses
Verfahrens sind unter anderem eine komplette Trocknung sowie zwei
hydrodynamische Trennungsschritte mittels Flüssig-Flüssig-Verteilungschromatographie notwendig.
-
Überdies
wird in der
US
2007/0112207 A1 ein weiteres Verfahren zur Aufreinigung
von 13-Dehydroxybaccatin
III und 10-Deacetylpaclitaxel aus taxanhaltigem Material mit einem
Reinheitsgrad von vorzugsweise 99.5% oder mehr beschrieben. In diesem
Verfahren folgt auf den Flüssig-flüssig-Verteilungschromatographieschritt
ein Hochleistungsflüssigkeitschromatographie(HPLC)-Schritt.
-
Es
stellt sich somit die Aufgabe, ein verbessertes Verfahren für die Trennung
und/oder Reinigung von Taxanen bereitzustellen, welches die vorliegenden
Nachteile zumindest teilweise beseitigt und insbesondere in der
Lage ist, bei vielen Anwendungen eine höhere Ausbeute an Taxanen bereitzustellen.
-
Diese
Aufgabe wird durch ein Verfahren nach Anspruch 1 sowie eine Verwendung
nach Anspruch 10 gelöst.
-
Demgemäß wird ein
Verfahren zur Trennung und/oder Reinigung von Taxanen bereitgestellt,
enthaltend mindestens einen Flüssig-flüssig-Verteilungschromatographieschritt,
bzw. die Verwendung von Flüssig-flüssig-Verteilungschromatographie
zur Trennung und/oder Reinigung von Taxanen.
-
Das
erfindungsgemäße Verfahren
und/oder die erfindungsgemäße Verwendung
zeigen dabei überraschenderweise
bei vielen Anwendungen der vorliegenden Erfindung mindestens einen
der folgenden Vorteile:
- – Der Eluensverbrauch ist gegenüber den
bisher verwendeten Chromatographietechniken deutlich niedriger.
- – Es
gibt keine Ablagerungen an einer stationären Phase, daher ist keine
Aufbereitung bzw. Entfernung von störenden Komponenten vorab nötig.
- – Die
Produktwiederfindung ist nahezu quantitativ, da stationäre und mobile
Phase einfach vertauscht werden können.
- – Die
Reinheit der isolierten Taxane ist oftmals so hoch, dass weitere
chromatographische Aufreinigungsschritte entfallen können.
- – Das
Verfahren ist einfach auch im großtechnischen Maßstab durchführbar bzw. übertragbar.
- – Die
Ausbeute an Taxanen ist gegenüber
dem Stand der Technik oftmals stark erhöht, wie im Folgenden noch genauer
ausgeführt
wird.
- – Die
Anzahl an benötigten
Prozessstufen kann gegenüber
dem Stand der Technik meist deutlich vermindert werden.
-
Unter „Flüssig-flüssig-Verteilungschromatographie” im Sinne
der vorliegenden Erfindung wird insbesondere eine Chromatographie
verstanden, bei der folgendermaßen
vorgegangen wird:
Eine bestimmte Menge eines Substanzgemisches
wird mit einer flüssigen
mobilen Phase durch eine zweite stationär gehaltene Phase geleitet.
Entsprechend ihrer unterschiedlich starken Wechselwirkungen mit
der stationären
Phase treten die Substanzen zeitversetzt aus und können so
getrennt werden. Während
jedoch bei der Flüssigchromatographie
die stationäre
Phase aus einem gepackten Festbett in einer Säule besteht, handelt es sich
bei der Flüssig-flüssig-Verteilungschromatographie
um eine zweite nicht mischbare flüssige Phase, die durch geeignete
Vorrichtungen, wie z. B. einen Rotor durch Zentrifugalkraft stationär gehalten
wird.
-
Grundsätzlich wird
bei der Flüssig-flüssig-Verteilungschromatographie
(CCC) zwischen hydrodynamischen (HSCCC) und hydrostatischen (CPC,
centrifugal partition chromatography = hydrostatische Flüssig-flüssig-Verteilungschromatographie)
Geräten
unterschieden. Während
bei der hydrostatischen Bauform meist Edelstahl-Rotoren mit einem
verbundenen System aus Kammern und Kanälen verwendet werden, bestehen hydrodynamische
Rotoren in den meisten Fällen
aus einem beidseitig offenen, inerten Teflonschlauch, der in der
Form einer Spule gewickelt ist. Mehrere solcher exzentrisch gelagerten
Spulen drehen sich gleichzeitig um ihre eigene Achse und um die
zentrale Achse des Apparates, wodurch sich insgesamt für flüssige Volumenelemente
im Schlauch eine Planetenbahn ergibt. Durch das variable Kraftfeld
kommt es zu Entmischungs- und Mischungsvorgängen in der Säule.
-
Neuere
Entwicklungen gehen dahin, die Flüssig-flüssig-Verteilungschromatographie
(CCC) kontinuierlich durchzuführen.
Dabei werden dann die beiden Phasen quasi im Gegenstrom geführt und
man erreicht (z. B. mit mehreren Rotoren) eine kontinuierliche Abtrennung
statt eines zeitversetzten Austritts.
-
Unter „Taxanen” im Sinne
der vorliegenden Erfindung werden insbesondere – ohne darauf beschränkt zu sein – eine oder
mehrere der folgenden Verbindungen verstanden: 10-Deacetyl-Baccatin III, Baccatin
III, Docetaxel, Cephalomannin und Paclitaxel.
-
Diese
Stoffe haben die folgenden Strukturen:
-
-
-
-
-
-
Obwohl
es sich bei Docetaxel um kein natürlich vorkommendes Taxan handelt,
kann die effektive Reinigung von Taxanen gemäß der vorliegenden Erfindung
z. B. bei einem integrierten Produktionsverfahren auch für dieses
und ähnliche
semisynthetische Taxane von großer
Bedeutung sein.
-
Unter „Trennung
und/oder Reinigung” im
Sinne der vorliegenden Erfindung wird insbesondere verstanden, dass
in der zu chromatographierenden Ausgangslösung bzw. -suspension der Anteil
der zu isolierenden Taxane ≤ 50%,
bevorzugt ≤ 25%,
noch bevorzugt ≤ 10%,
ferner bevorzugt ≤ 5%
noch bevorzugt ≤ 2%,
sowie am meisten ≤ 1%
beträgt.
Der Term „≤ X%” ist dabei
so zu verstehen, dass der Gewichtsanteil der Taxane am Gesamtgewicht
der zu chromatographierenden Stoffe ≤ X% beträgt (d. h. das Lösemittel
ist nicht mitzurechnen).
-
Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird die mindestens eine Flüssig-flüssig-Verteilungschromatographie
mit mindestens einem Eluens, welches einen ET(30)-Wert
von ≤ 51
aufweist sowie mindestens einem zweiten Eluens, welches einen ET(30)-Wert von ≥ 51 aufweist, durchgeführt.
-
Unter „ET(30)-Wert” wird die Polarität eines
Lösemittels
verstanden, wobei sich im Rahmen der vorliegenden Erfindung auf
die Werte bezogen wird, welche in Reichart; Dimroth Fortschr. Chem.
Forsch. 1969, 11, 1–73,
Reichart Angew. Chem. 1979, 91, 119–131 sowie zitiert in March,
Advanced Organic Chemistry, 4. Auflage, J. Wiley & Sons, 1992, Tabelle
10.13, S. 361 veröffentlicht
worden sind.
-
Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird die mindestens eine Flüssig-flüssig-Verteilungschromatographie
mit mindestens einem Eluens, welches einen ET(30)-Wert
von ≤ 45
aufweist sowie mindestens einem zweiten Eluens, welches einen ET(30)-Wert von ≥ 51 aufweist, durchgeführt.
-
Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird die mindestens eine Flüssig-flüssig-Verteilungschromatographie
mit mindestens einem Eluens, welches einen ET(30)-Wert
von ≤ 45
aufweist, mindestens einem zweiten Eluens, welches einen ET(30)-Wert von ≥ 51 aufweist sowie einem weiteren
Eluens, ausgewählt
aus einem kurzkettigen (C ≤ 5)
Alkohol oder Keton chloriertem Kohlenwasserstoff oder Tetrahydrofuran.
In letzterem Eluens haben meist die Taxane eine gute Löslichkeit.
-
Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung können
eines oder mehrere der vorliegenden Eluenssysteme zum Einsatz kommen:
-
Dreistoffsysteme:
-
- Alkan/Alkohol/Wasser
- Alkan/Alkohol/Acetonitril,
- Alkan/Alkohol/Ethylenglykol
- Alkan/Keton/Wasser
- Chlorierter Kohlenwasserstoff/Alkohol/Wasser
- Chlorierter Kohlenwasserstoff/Keton/Wasser
- Ethylacetat/Alkohol/Wasser
- Ethylacetat/Keton/Wasser
- Ethylacetat/Keton/Ethylenglykol
- Toluol/Alkohol/Wasser
- Butanol/Propanol/Wasser
- Butanol/Ethanol/Wasser
- Butanol/Metanol/Wasser
- Ether/Alkohol/Wasser
- Ether/Keton/Wasser
- Toluol/Keton/Wasser
- Cyclohexan/Keton/Wasser
- Cyclohexan/Keton/Ethylenglycol
- Methyl-Isobutyl-Keton/Aceton/Wasser
-
Vierstoffsysteme:
-
- Alkan/Ethylacetat/Alkohol/Wasser
- Alkan/Ethylacetat/Acetonitril/Wasser
- Alkan/Ethylacetat/Acetonitril/Alkohol
-
Dabei
bedeuten „Alkane”, „Alkohole” etc. bevorzugt
die folgenden Verbindungen:
- Alkane: lineare und verzweigte
C5 bis C9 Alkane,
bevorzugt ausgewählt
aus der Gruppe enthaltend Pentan, Hexan, Heptan, Oktan oder Mischungen
daraus:
- Alkohole: lineare und verzweigte C1 bis
C6 Monoalkohole, bevorzugt ausgewählt aus
der Gruppe enthaltend Methanol, Ethanol, 1-Propanol, 2-Propanol,
1-Butanol, 2-Butanol oder Mischungen daraus:
- Chlorierte Kohlenwasserstoffe: Mono, Di- oder Polysubstituierte
C1 bis C3 Chloralkane
bevorzugt ausgewählt aus
der Gruppe enthaltend Tetrachlormethan, Chloroform, Dichlormethan,
Dichlorethan oder Mischungen daraus.
- Ether: Ether zweier (unabhängig
voneinander ausgewählter)
linearer und verzweigte C2 bis C6 Alkane, bevorzugt Diisopropylether und/oder
Diethylether
- Ketone: lineare und verzweigte C3 bis
C8 Ketone, bevorzugt Aceton und/oder Methyl-ethyl-Keton
-
Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird die mindestens eine Flüssig-flüssig-Verteilungschromatographie
bei einer Temperatur von ≤ 50°C durchgeführt. Dies
hat sich in der Praxis besonders bewährt, weil so insbesondere keine
Zersetzungs- oder andere Reaktionen der zu isolierenden Taxane beobachtet
werden können.
Besonders bevorzugt wird die mindestens eine Flüssig-flüssig-Verteilungschromatographie
bei einer Temperatur von ≤ 40°C, noch bevorzugt ≤ 35°C durchgeführt.
-
Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird vor der mindestens einen Flüssig-flüssig-Verteilungschromatographie
mindestens ein Auftrennungsschritt durchgeführt, ausgewählt aus mindestens einer der
folgenden Techniken: Festbettadsorption, Extraktion, Expanded-Bed-Adsorption, in-situ-Adsorption,
Ultrafiltration
-
Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
enthält
der mindestens eine Auftrennungsschritt eine Festbettabsorption,
wobei als Absorbens ein Polystyrol und/oder Poly(meth)acryl(ester)-Absorbens verwendet wird.
Diese Materialien haben sich in der Praxis besonders bewährt, da
diese oftmals eine hohe bzw. hoch selektive Absorption gegenüber Taxanen
aufweisen. Besonders bevorzugte Beispiele (auch wenn diese Erfindung
nicht darauf beschränkt
ist) sind kommerziell erhältliche
Ionenaustauscherharze wie Amberlite, insbesondere Amberlite XAD- 4, XAD-7HP, XAD-16,
XAD-761, oder Diaion HP2MG und HP20 oder Sepabeads SP 207 und SP
850 sowie Mischungen davon.
-
Gemäß einer
alternativen aber ebenso bevorzugten Ausführungsform enthält der mindestens
eine Auftrennungsschritt eine Extraktion.
-
Bevorzugt
wird dabei eine Extraktion mit mindestens einem Lösemittel
durchgeführt,
welches einen ET(30)-Wert von ≥ 31 aufweist
(und natürlich
eine Mischungslücke
mit Wasser besitzt). Insbesondere bevorzugte Lösemittel, die sich in der Praxis
bewährt
haben, sind aus gewählt
aus der Gruppe enthaltend 3-Pentanon, n-Butanol, n-Pentanol, Hexanol,
Oktanol, Toluol, Benzylalkohol, Ethylacetat, Dimethylphtalat, Methylbenzoat,
Butylacetat, MTBE, Chloroform, Dichlormethan, 1,2-Dichlorethan,
Diethylether, Nitromethan, sowie Mischungen davon.
-
Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung erfolgt zwischen dem mindestens einem
Auftrennungsschritt und der mindestens einen Flüssig-flüssig-Verteilungschromatographie eine Aufkonzentrierung.
-
Diese
kann bevorzugt direkt thermisch durch Eindampfen erfolgen oder alternativ
mit Hilfe von Membranen in Form von Ultrafiltration bzw. Evaporation.
-
Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird das Verfahren zur Trennung und/oder
Reinigung von Taxanen eingesetzt, welche aus Zellsuspensionen gewonnen
werden.
-
Überraschenderweise
ist das vorliegende Verfahren insbesondere bei vielen Anwendungen
einsetzbar, bei denen die Taxane nicht synthetisch, sondern aus
Zellsuspensionen (z. B. durch Fermentation) gewonnen werden.
-
Die
grundsätzliche
Methodik der Gewinnung von Taxanen durch Fermentation geeigneter
Zellen ist im Stand der Technik bekannt. Angeführt werden sollen hier z. B. „Enhanced
production of paclitaxel by semi-continous batch process in suspension
cuilture of Taxus chinensis”,
Hyung-Kyoon Choi et al., Enzyme and Microbial Technology (29), pp.
583–586,
2001, sowie ”Enhanced
Taxol Production and Release in Taxus chinensis Cell suspension
cultures with selected organic Solvents and Sucrose”, Chuangui
Wang et al. Biotechnol. Prog. 17, 89–94, 2001 sowie die darin zitierte
Literatur, welche sämtlich
durch Zitierung hiermit inkorporiert werden.
-
Gemäß einer
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Trennung und/oder Reinigung
von Taxanen bereitgestellt, umfassend die folgenden Schritte:
- a) Fermentation einer Zellsuspension, ggf.
kontinuerlich, bevorzugt wie oben beschrieben
- b) mindestens ein Auftrennungsschritt, ausgewählt aus
Festbettadsorption, Extraktion, Expanded-Bed-Adsorption, in-situ-Adsorption,
Ultrafiltration, bevorzugt wie oben erläutert,
- c) optional eine Aufkonzentrierung, bevorzugt wie oben erläutert.
- d) mindestens eine Flüssig-flüssig-Verteilungschromatographie
gemäß der vorliegenden
Erfindung
- e) optional eine Konfektionierung, z. B. durch Trocknung und/oder
Kristallisation
-
Wie
bereits erläutert,
bezieht sich diese Erfindung ebenfalls auf eine Verwendung von Flüssig-flüssig-Verteilungschromatographie
zur Trennung und/oder Reinigung von Taxanen, wobei hierfür die bereits
erläuterten
Ausführungsformen
ggf. ebenfalls zum Einsatz kommen können und somit übertragbar
sind.
-
Eine
weitere Ausführungsform
der Erfindung bezieht sich auf eine Verwendung eines erfindungsgemäßen Verfahrens
und/oder einen Einsatz der erfindungsgemäßen Verwendung zur großtechnischen
Isolierung von Taxanen.
-
Die
vorgenannten sowie die beanspruchten und in den Ausführungsbeispielen
beschriebenen erfindungsgemäß zu verwendenden
Bauteile unterliegen in ihrer Größe, Formgestaltung,
Materialauswahl und technischen Konzeption keinen besonderen Ausnahmebedingungen,
so dass die in dem Anwendungsgebiet bekannten Auswahlkriterien uneingeschränkt Anwendung
finden können.
-
Weitere
Einzelheiten, Merkmale und Vorteile des Gegenstandes der Erfindung
ergeben sich aus den Unteransprüchen
sowie aus der nachfolgenden Beschreibungen der zugehörigen Zeichnungen,
in denen – beispielhaft – Ausführungsbeispiele
des erfindungsgemäßen Verfahrens
dargestellt sind. In den Zeichnungen zeigt:
-
1 ein
Elutionsprofil der Trennung der einzelnen Taxane nach der Flüssig-Flüssig-Verteilungschromatographie
bei „Reversed
Phase” Elution
nach vorheriger Adsorption und Aufkonzentrierung
-
2 ein
3D-Elutionsprofil der Trennung einzelner Taxane nach der Flüssig-Flüssig-Verteilungschromatographie
bei „Dual-mode” Elution
ohne vorherigen Auftrennungsschritt
-
Die
Figuren beziehen sich auf die entsprechenden Beispiele I und II,
in denen nachfolgend – rein
illustrativ – ein
erfindungsgemäßes Trenn-
und Reinigungsverfahren beschrieben ist.
-
Beispiel I: Aufreinigung eines Zellkulturüberstandes
durch Adsorption, Aufkonzentrierung und einfache FCPC-Trennung:
-
Für das erfindungsgemäße Beispiel
wurde folgende Zellkultur verwendet, wie aus Tabelle I zu sehen: Tabelle
I
| Zellkulturmedium: | modifziertes
Gamborg B5-2 |
| Zellen: | Taxus
baccata |
| Kultivierungszeit: | 20
Tage |
-
Nach
der Kultivierung wurden die Zellen und Zellreste mit S&S 595 Filterpapier
(110 mm) abfiltriert, von dem erhaltenen Überstand wurden 50 ml zur Aufreinigung
verwendet.
-
Da
in diesem Überstand
die Konzentrationen der Taxane im Vergleich zu üblichen Literaturwerten zu gering
waren, wurden künstlich
folgende Taxane zugegeben, wie in Tabelle II zu sehen: Tabelle
II
| 10-Deacetylbaccatin
III [mg] | 0,95 | (Acros
Organics, 95%) |
| Baccatin
III [mg] | 1 | (MP
Biotech, 98%) |
| Docetaxel
[mg] | 0,3 | (Sigma, >= 97%) |
| Paclitaxel
[mg] | 0,2 | (Sigma, >= 97%, semisynthetisch) |
| Cephalomannin | 0,3 | (Sigma, >= 97%) |
-
Der
derart angereicherte Überstand
wird eine Stunde lang bei 25°C
gerührt,
bei kurzzeitigem Einsatz von Ultraschall (10 sec). Danach wird ungelöstes Paclitaxel
(sehr geringe Löslichkeit)
abzentrifugiert (4000 U/min, 5 min). Diese ersten Schritte sind
nicht Teil des Verfahrens und dienen nur dazu, eine Ausgangslösung zu
erstellen, die in etwa einem Zellkulturüberstand eines Produktionsstammes
entspricht.
-
Zur
Kontrolle wurden mehrere Proben gezogen und per HPLC vermessen.
-
HPLC-Messungen:
-
Sämtliche
HPLC-Messungen wurden wie folgt durchgeführt:
Der apparative Aufbau
ist in Tabelle III aufgeführt: Tabelle
III
| Anlage: | – Pumpe:
Merck Hitachi L 7100 mit Gradientenmodul |
| | – Autosampler:
Merck Hitachi L 7250 (programmierbar) |
| | – Säulenofen:
Merck L 7360 |
| | – Interface:
Merck Hitachi D 7000 |
| | – UV-Detektor:
Merck Hitachi L 7400 |
| Säule: | MultoHigh
Phenyl-5 (CS), 250 × 4
mm |
| mobile
Phase: | Wasser (Millipore)/Acetonitril (Gradient
grade, Fisher Scientific) Gradientenfahrweise von 70/30 bis 20/80 |
| |
-
Der
Volumenstrom betrug 1,5 ml/min bei einer Temperierung von 25°C. Gemessen
wurde bei einer Wellenlänge
von 232 nm. Das Injektionsvolumen betrug 20 μl.
-
Die
Messung des angereicherten Kultur-Überstands ergab folgende Ergebnisse
(Tabelle V) Tabelle
V
| TAXAN | Konzentration
[mg/l] | Flächenanteil
UV | Gesamtmassenanteil |
| 10-Deacetylbaccatin: | 19,5 | 2,16% | 0,066% |
| Baccatin
III: | 23,8 | 1,98% | 0,081% |
| Docetaxel: | 4,39 | 0,28% | 0,015% |
| Cephalomannin: | 5,67 | 0,36% | 0,019% |
| Paclitaxel: | 0,49 | 0,066% | 0,002% |
| | | | |
| Medium | ca.
29500 | 95,15% | 99,82% |
-
Dabei
spiegelt die „Konzentration
des Mediums” die
Summe aller gelöster
Medienbestandteile wieder und wurde durch vollständiges Eindampfen und Einwiegen
des Überstands
erhalten.
-
Als
erster Aufreinigungsschritt wurde eine Absorption an XAD-7HP (Aldrich)
vorgenommen. Das XAD-7HP wurde vor der ersten Benutzung je zweimal
mit Wasser und Methanol gewaschen.
-
Überstand
(ca. 50 ml) und Adsorbens (0,8 g trocken) wurden 12 Std. bei 25°C gerührt, danach
wurde über
S&S 595 (10 mm)
Filterpapier abgenutscht.
-
Es
wurden erneut zwei HPLC-Messungen von dem abgereicherten Überstand
vorgenommen. Die Ergebnisse sind in Tabelle VI aufgeführt: Tabelle
VI
| | Konzentration | | | |
| TAXAN | [mg/l] | Flächenanteil
UV | Gesamtmassenanteil | adsorbiert |
| 10-DAB: | 0,144 | 0,018% | 0,00054% | 99,3% |
| Bac
III: | 0,063 | 0,006% | 0,00023% | 99,7% |
| Docetaxel: | 0 | 0,000% | 0,00000% | 100,0% |
| Cephal.: | 0 | 0,000% | 0,00000% | 100,0% |
| Paclitaxel: | 0,005 | 0,001% | 0,00000% | 99,0% |
| | | | | |
| Medium: | ca.
29500 | 99,975% | 99,99923% | |
-
Das
Adsorbens wurde in einer Porzellanhutsche auf Filterpapier 2 × mit je
10 ml Wasser (Millipore) gespült
und sorgfältig
abgenutscht. Anschließend
wurde eine Desorption in Methanol (versetzt mit 0,1% Essigsäure) durchgeführt. Dazu
wurde das Adsorbens 3 × mit
je ca. 15 ml Methanol versetzt, ca. 1 Stunde gerührt und dann abgenutscht. Das
Desorbens wurde gesammelt und anschließend durch Abdampfen des Methanols bis
zu einem Volumen von ca. 10 ml aufkonzentriert.
-
Anschließend wurde
eine Flüssig-Flüssig-Verteilungschromatographie
durchgeführt:
Der
apparative Aufbau und die Durchführung
der Chromatographie sind in Tabelle VII aufgeführt Tabelle
VII
| Anlage: | Rotor: | Alphacrom
Kromaton 201 |
| | | Nennvolumen:
200 ml |
| | | 20 Scheiben
mit je 66 Kammern = 1320 Kammern |
| | Pumpe: | Alpha 200 |
| | Injektion: | 6-gort-Ventil
mit 10 ml Schleife |
| | Detektion | Fraktionierung/HPLC |
| Phasensystem: | n-Heptan/Ethylacetat/Methanol/Wasser
1:2:1:1 |
| Rotordrehzahl: | 1400
U/min | Volumenstrom: | 10
ml/min |
| Fraktionierung: | 10
ml | |
| Modus: | „Reversed
Phase”/descending
(mobile Phase: polare Phase – Wasser/Methanol) |
| Probe: | Die aufkonzentrierte
Taxanlösung
(Methanol) wurde durch Zugabe von Wasser, Ethylacetat und n-Heptan
auf die Zusammensetzung der mobilen Phase gebracht. Von dieser Lösung wurden
dann in einem Lauf 10 ml getrennt |
| Druckverlust: | ca. 35 bar |
| Laufzeit: | 30 Minuten |
| Ausgetretene
stationäre
Phase [ml] | 70 ml |
| stat. Phasenverhältnis | 0,65 |
-
Zur
besseren HPLC-Detektion wurden alle Fraktionen im Anschluss in Wasser/Acetonitril-Gemisch (70/30) umgelöst durch
vollständiges
Eindampfen bei bis zu 4 mbar und 35°C.
-
1 zeigt
eine graphische Darstellung der Trennung der einzelnen Taxane; die
genauen Daten sind in den Tabellen VIII und IX aufgeführt: Tabelle VIII
| Fraktion: | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 |
| nach
Min.: | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 | 19 | 20 |
| 10-DAB [UV-Fläche]: | 1913 | 371510 | 256819 | 11958 | 542 | 524 | 975 | 0 |
| Bac
III [UV-Fläche]: | 0 | 0 | 0 | 1938 | 113013 | 377399 | 107964 | 6689 |
| Docet. [UV-Fläche]: | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Cephal. [UV-Fläche]: | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Pacli
[UV-Fläche]: | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Alle
Verunreinigungen [UV-Fläche]: | | 184383 | 40438 | 4365 | 16848 | 11323 | 11144 | 32390 |
Tabelle IX
| Fraktion: | 17 | 18 | 19 | 20 | 21 | 22 | 23 | 24 | 25 |
| nach
Min.: | 22 | 23 | 24 | 25 | 26 | 27 | 28 | 29 | 30 |
| 10-DAB [UV-Fläche]: | 0 | 0 | 0 | 158 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Baccatin
III [UV-Fläche]: | 0 | 0 | 953 | 0 | 0 | 676 | 0 | 0 | 0 |
| Docetaxel [UV-Fläche]: | 240 | 6191 | 16687 | 40433 | 15937 | 2351 | 245 | 0 | 0 |
| Cephal. [UV-Fläche]: | 0 | 8510 | 25660 | 50845 | 20044 | 2689 | 605 | 0 | 0 |
| Paclitaxel [UV-Fläche]: | 0 | 580 | 2611 | 1337 | 3826 | 9153 | 2869 | 877 | 0 |
| Alle
Verunreinigungen [UV-Fläche]:: | | 24034 | 45206 | 28820 | 33872 | 90549 | 35664 | 42429 | |
-
Man
sieht, dass es durch die Verwendung der Flüssig-flüssig-Chromatographie möglich ist,
auch bei stark verunreinigten Proben und geringer Taxan-Konzentration
eine nahezu quantitative Trennung der einzelnen Taxane durchzuführen. Insbesondere
das 10-Deacetylbaccatin III sowie das Baccatin III konnten in einer Taxan-Reinheit
von jeweils 99,7% und einer Gesamtverfahrens-Ausbeute von > 95% bzw. > 97% erhalten werden.
-
Die
Durchführung
der Flüssig-flüssig-Chromatographie
gemäß diesem
Beispiel bringt mit dem einfachen Elutionsmodus vor allem eine schnelle
Trennung bei geringem Lösemittelverbrauch.
Da Heptan und Ethylacetat ausschließlich als stationäre Phase
verwendet werden, ist der Verbrauch dieser Lösemittel besonders gering.
-
Beispiel II: Aufreinigung eines Zellkulturüberstandes
durch direkte Aufkonzentrierung und „Dual Mode” FCPC-Trennung:
-
Analog
zu Beispiel I wurde ein mit Taxanen angereicherter Kulturüberstand,
allerdings ohne Cephalomannin, erstellt.
-
Es
wurde ohne vorherigen Aufreinigungsschritt direkt aufkonzentriert
bis auf eine Baccatin III-Konzentration von ca. 100 mg/l und dann
sofort 1:1 mit Methanol (+0,1% Essigsäure) verdünnt, um mangelnder Löslichkeit
der Taxane vorzubeugen und gleichzeitig eine Injektionslösung für die FCPC
zu erhalten, die etwa der mobilen Phase entsprach.
-
Ein
FCPC-Trennlauf wurde mit der in Tabelle VII beschriebenen Anlage
mit dem gleichen Phasensystem bei gleicher Drehzahl und gleichem
Volumenstrom durchgeführt,
lediglich der Modus wurde so verändert, dass
nach 25 Minuten „Reversed
Phase” Trennung
die Phasen umgeschaltet wurden und die organische Phase anschließend als
mobile Phase eingesetzt wurde, um Paclitaxel weiter von Docetaxel
abzutrennen.
-
Wie
in dem 3D-Elutionsprofil in 2 zu erkennen
ist, können
dadurch nicht nur 10-Deacetylbaccatin und Baccatin III mit vergleichbaren
Taxanreinheiten wie in Beispiel 1 gewonnen werden, sondern auch
Docetaxel und Paclitaxel.
