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Diese
Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von 4-Aryl-2-butanol.
Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf ein Verfahren zur Herstellung
zwei biologisch aktiver Moleküle
(–)Betuligenol
und (–)Betulosid
mit der allgemeinen Formel (1), wie im folgenden angegeben:
R = H oder Glukose
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Taxol
wird von den Blättern
der Taxus wallichiana isoliert. Taxol, ein mit Sauerstoff hochgesättigtes
Diterpenoid-Molekül
und ein starkes Antikrebsmittel, wurde zuerst von der Stammrinde
der Taxus brevifolia isoliert. Danach wurde es auch von anderen
Taxus-Spezies (Eiben-Spezies) einschließlich der Himalaya-Eibe Taxus
wallichiana isoliert. Verschiedene Arten von Krebs wurden mit Taxol
behandelt und die Ergebnisse in der Behandlung von Ovarial- und
Brustkrebs sind sehr vielversprechend. Taxol wurde kürzlich durch
die Food and Drug Administration der USA für die Behandlung von Ovarial-
und Brustkrebs genehmigt. Taxol ist ein strukturell kompliziertes
und chemisch labiles Molekül,
das spezielle und vorsichtige Extraktions- und Trennvorgänge für seine
Isolation von Pflanzenmaterialien benötigt. Unglücklicherweise sind die meisten
der Arbeiten firmeneigen und wurden nicht veröffentlicht. Die amerikanischen
Entwickler benutzten Alkohol, um Taxol aus der Stammrinde der T.
brevifolia zu extrahieren und bei der Trennung des Taxols von dem
alkoholischen Extrakt wird eine Säulenchromatographie über Silica
bzw. Siliziumdioxid mit 2% Methanol in Chloroform als das Elutionsmittel
benutzt, um eine Mischung von Taxol und Cephalomannin zu ergeben.
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Taxol
kann von der Mischung mit einer Ausbeute von 0,01% entweder durch
wiederholte Säulenchromatographie über Silica
oder durch Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie
getrennt und isoliert werden. Taxol wurde auch von der Himalaya-Eibe
Taxus wallichiana mit einer Ausbeute von 0,02% isoliert. Das Isolationsverfahren
beinhaltet das Extrahieren der Stammrinde mit Methanol, Verteilen
des Methanolextraktes zwischen Wasser und Chloroform und Isolieren
des Taxols aus der chloroformlöslichen
Fraktion durch Chromatographie über
Silicagel (Kieselsäuregel).
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Taxus
wallichiana, die als die Himalaya-Eibe bekannt ist, ist in Indien
erhältlich.
Die Anmelder haben die verschiedenen Teile dieser Pflanze von verschiedenen
Himalaya-Regionen Indiens für
die Isolation von natürlich
auftretenden Analogen des Taxols, seine wichtigen Vorstufen und
andere biologisch aktive Verbindungen untersucht. Im Verlauf der
Untersuchung haben die Anmelder zwei Verbindungen des 4-Aryl-2-butanols, nämlich Betuligenol
mit der Formel C10H14O2, dem Schmelzpunkt 69–70°C, und [α]n +
20° (Cl,
MeOH) und Betulosid mit der Formel C16H24O7, dem Schmelzpunkt
187–188°C, [α]n + 22° (Cl,
MeOH) von den Blättern
der T. wallichiana, isoliert.
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Beide
Verbindungen sind bekannt und sie wurden zuvor von der Pflanze Acer
nikoense isoliert. Kein Isolationsverfahren wurde in der Veröffentlichung
T. Inoue, Y. Ishidate, M. Fujita, M. Kubo, M. Fukushima und M. Nagai,
J. Pharm. Soc. Jpn. 98, 41 (1978): Chem. Abstr. 88, 133254 (1978)
erwähnt.
Jedoch wurde (–)Betuligenol,
ein linksdrehendes Isomer (Lävoisomer)
der Verbindung der Formel 1, bei der R = H ist, durch die Anmelder
von den Blättern
der Taxus wallichiana isoliert. Nun sind die Anmelder fähig, das
rechtsdrehende Isomer (Dextroisomer) von (–)Betuligenol zu isolieren,
welches die Verbindung der Formel 1 ist, bei der R = H ist. Das
Verfahren der Isolierung von (–)Betuligenol
von den Blättern
der Taxus wallichiana beinhaltet die Extraktion von Blättern mit
Methanol. Die Isolation von (–)Betuligenol
mit einer Ausbeute von 0,05% aus dem Methanolextrakt wurde durch
Verteilen des Methanolextraktes zwischen Wasser und Chloroform und
Chromatographie der chloroformlöslichen
Fraktion über
Silicagel erreicht (S. K. Chattopadhyay, V. K. Tripathi, R. S. Thakur,
R. P. Sharma und S. P. Jain, Indian J. Chem. 33B, 409–411 (1994)).
Die Verbindung der Formel 1, bei der R = Glukose ist, wurde zuvor
nicht isoliert von den Blättern
der T. wallichiana, obwohl sein linksdrehendes Isomer, Betulosid,
vorher durch die Anmelder von den Blättern der oben genannten Pflanze
isoliert wurde (S. K. Chattopadhyay et al., Indian, J. Chem. 33B,
409–411
(1994)). Das Verfahren der Isolation von Betulosid besteht aus der
Extraktion der Blätter
von T. wallichiana mit Methanol, Verteilen des Methanolextraktes
zwischen Wasser und Ethylacetat und einer Säulenchromatographie der Ethylacetatfraktion,
um Betulosid mit einer Ausbeute von 0,04% zu ergeben. Nun wurde
kürzlich
berichtet, daß beide
Verbindungen der Formel (1), bei der R = H oder Glukose ist, auf
bedeutungsvolle Weise anti-entzündliche
Eigenschaften durch Verringerung der Stickoxid(NO)-Erzeugung aufweisen
(S. Fushiya, Y. Kabe, Y. Ikegaya und F. Takano, Planta Medica 64, 598–602 (1998)).
Ent zündliche
Makrophagen spielen eine Schlüsselrolle
bei einem entzündlichen
Prozeß durch
Absondern einer großen
Menge von Mediatoren, die den Initialisierungsvorgang der Entzündung steuern.
Stickoxid (NO) ist einer der kritischen Mediatoren, die durch induzierbare
NO-Synthase in entzündlichen Makrophagen
erzeugt werden, wenn sie durch bakterielle Produkte wie beispielsweise
Lipopolysaccharid (LPS) und einigen Cytokinen stimuliert werden.
Stickoxid (NO), das durch induzierbare NO-Synthase erzeugt wird, spielt eine Rolle
in einer nichtspezifischen Immunabwehr gegen Tumore, parasitische
Pilze, Bakterien und Protozoen. Zudem ist NO dafür bekannt, für die Druckerniedrigung
(Hypotonie), die in dem Endotoxinschock beobachtet wird, verantwortlich
zu sein. Die Aktivierung von entzündlichen Makrophagen, die zu
der Erzeugung von großen
Mengen von NO führt,
wird als kritisch für
die lethale Toxizität
betrachtet. Glucocorticoid und die Immunantwort unterdrückende Mittel
hemmen die NO-Erzeugung stark. Nun wurde kürzlich berichtet, daß Verbindungen
der Formel (1), bei denen R = H oder Glukose ist, auch die NO-Erzeugung
unterdrücken. Da
NO einer der kritischen Mediatoren bei einer Entzündung ist,
besitzen beide Verbindungen der Formel (1), bei der R = H oder Glukose
ist, wesentliche anti-entzündliche
Eigenschaften durch Unterdrücken
der Erzeugung von NO.
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In
M. S. Y. Khan et. al., Planta Medica, ISSN 0032-0943, 1976, 30,
82–85
wird die Isolation von phenolischen Bestandteilen, unter anderem
von Betulosid und Betuligenol, aus TAXUS BACCATA-Blättern
beschrieben.
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Während der
durch die Anmelder durchgeführten
chemischen Untersuchung der Blätter
der T. wallichiana, die von verschiedenen Teilen Indiens gesammelt
waren, waren die Anmelder fähig,
zwei Moleküle
der 4-Aryl-2-butanol-Verbindungen der Formel (1) zu isolieren, bei
der, falls R = H ist, die Verbindung (–)Betuligenol ist, und bei
der, falls R = Glukose ist, die Verbindung (–)Betulosid ist, mit Ausbeuten
von 0,2 bzw. 0,2%. Folglich könnten
die Blätter
der Taxus wallichiana eine brauchbare Quelle für die obengenannten zwei wichtigen
Moleküle
sein.
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Folglich
ist Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Erzeugung von 4-Aryl-2-butanolen
der unten gezeigten allgemeinen Formel (1)
R = H oder Glukose
anzugeben,
welches
die Nachteile der früheren
Verfahren vermeidet.
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Diese
Aufgabe wird gelöst
durch ein Verfahren nach Anspruch 1.
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Weiterbildungen
der Erfindung sind in den Unteransprüchen angegeben.
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Vorteil
der Erfindung ist, daß das
Verfahren höherer
Ausbeuten jeder dieser Verbindungen im Vergleich zu dem bekannten
Verfahren (0,05 bzw. 0,04%) ergibt.
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Ein
anderer Vorteil der Erfindung ist, daß das Verfahren die Benutzung
der chromatographischen Trennung vermeidet und den Prozeß kosteneffektiv
gestaltet.
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Weitere
Merkmale und Zweckmäßigkeiten
ergeben sich aus der Beschreibung von Ausführungsformen der Erfindung.
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Demgemäß gibt die
Erfindung ein Verfahren zu Herstellung von 4-Aryl-2-butanolen der
unten angegebenen allgemeinen Formel (1)
R = H oder Glukose
aus
den Blättern
der Taxus wallichiana an, mit: (a) Entfetten luftgetrockneter, pulverisierter
Blätter
mit aliphatischen Kohlenwasserstoff-Lösungsmitteln, (b) Extrahieren
der entfetteten Blätter
mit chlorierten Lösungsmitteln und
polaren Lösungsmitteln
sukzessiv bei Raumtemperatur, (c) Konzentrieren der im chlorierten
Lösungsmittel löslichen
Fraktion auf einen Rückstand
und Behandeln des Rückstands
mit einer wäßrigen Lösung von
Alkali und Extrahieren mit einem chlorierten Lösungsmittel, (d) Ansäuern der
Alkalischicht mit Mineralsäure
und Extrahieren mit Ethylacetat und Konzentrieren der Ethylacetat-Phase
derart, daß sich
eine Verbindung der Formel 1 mit R = H ergibt, (e) Konzentrieren
der Fraktion des polaren Lösungsmittels
aus dem Schritt (b) auf einen Rückstand
und Behandeln der Rückstandes
mit einer wäßrigen Lösung von
Alkali und Extrahieren mit chloriertem Lösungsmittel, und (f) Ansäuern der
Alkali-Phase mit Mineralsäure
und Extrahieren mit Ethylacetat derart, daß sich eine Verbindung der
Formel 1 mit R = Glukose ergibt.
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In
einer Ausführungsform
sind die in dem Schritt (a) benutzten aliphatischen Kohlenwasserstoff-Lösungsmittel
von Petrolether (60–80°C) und Hexan
ausgewählt.
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In
einer anderen Ausführungsform
sind die in dem Schritt (b) benutzten chlorierten Lösungsmittel
von Chloroform und Dichlormethan ausgewählt.
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In
einer anderen Ausführungsform
sind die in dem Schritt (b) benutzten chlorierten Lösungsmittel
von Chloroform und Dichlormethan ausgewählt.
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In
einer weiteren anderen Ausführungsform
sind die in dem Schritt (b) benutzten polaren Lösungsmittel von Methanol, Ethanol,
Acetonitril, Aceton und Ethylacetat ausgewählt.
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In
einer weiteren Ausführungsform
sind die in den Schritten (c) und (f) benutzten Alkali von Natriumhydroxid
und Kaliumhydroxid ausgewählt.
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In
einer weiteren anderen Ausführungsform
sind die in den Schritten (d) und (f) zum Ansäuern benutzten Mineralsäuren von
Salzsäure
und Schwefelsäure
ausgewählt.
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Die
Erfindung wird in den unten angegebenen Beispielen detailliert beschrieben,
welche zur Veranschaulichung der Erfindung angegeben sind.
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Beispiel 1
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Luftgetrocknete,
pulverisierte Blätter
(1 kg) von Taxus wallichiana wurden durch Perkolieren bei Raumtemperatur
mit Petrolether (5 Liter × 3)
für drei
Tage entfettet. Die entfetteten Blätter wurden mit Chloroform
(5 Liter × 3)
und Ethylacetat (5 Liter × 3)
sukzessive für
drei Tage extrahiert. Die Chloroform- und Ethylacetatextrakte wurden
derart konzentriert, daß sie
30 g bzw. 20 g Chloroform- und Ethylacetatkonzentrat ergaben. Das Chloroformkonzentrat
(30 g) wurde in 1n Natriumhydroxidlösung (1 Liter) durch Rühren aufgelöst und mit
Dichlormethan (1 Liter × 3)
extrahiert. Die wäßrige Alkalischicht
wurde mit 1n Salzsäure
angesäuert
und mit Ethylacetat (500 ml × 3)
extrahiert. Die Ethylacetatschicht wurde mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat
getrocknet und derart konzentriert, daß sich ein Rückstand
ergab, von dem eine Verbindung der Formel 1 (R = H) auskristallisierte;
sie wurde gefiltert, um die reine Verbindung der Formel 1 (R = H)(2g), Schmelzpunkt
69–70°C, [α]n + 20° (Cl,
MeOH) zu ergeben.
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Das
Ethylacetatkonzentrat (20 g), das wie oben beschrieben aus dem entfetteten
Pflanzenmaterial durch Extraktion mit Ethylacetat erhalten wurde,
wurde in 1n Natriumhydroxidlösung
(1 Liter) durch Rühren aufgelöst und mit
Dichlormethan (1 Liter × 3)
extrahiert. Die wäßrige Alkalischicht
wurde mit 1n Salzsäure
angesäuert
und mit Ethylacetat (500 ml × 3)
extrahiert. Die Ethylacetatschicht wurde mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem
Natriumsulfat getrocknet und konzentriert, um die Verbindung der
Formel 1 (R = Glukose) zu ergeben, welche aus einer Aceton-Methanol-Mischung
als farblose Nadeln (2 g), Schmelzpunkt 187–188°C, [α]n +
22° (Cl,
MeOH) wieder auskristallisierte.
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Beispiel 2
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Luftgetrocknete,
pulverisierte Blätter
(1 kg) der Taxus wallichiana wurden durch Perkolation bei Raumtemperatur
mit Hexan (5 Liter × 3)
für drei
Tage entfettet. Die entfetteten Blätter wurden mit Dichlormethan
(5 Liter × 3)
und Methanol (5 Liter × 3)
sukzessive für
drei Tage extrahiert. Die Dichlormethan- und Methanolextrakte wurden
derart konzentriert, daß sich
30 g bzw. 20 g Dichlormethan- und Methanolkonzentrat ergab. Das Dichlormethankonzentrat
(30 g) wurde in 1n Kaliumhydroxidlösung (1 Liter) durch Rühren aufgelöst und mit Chloroform
(1 Liter × 3)
extrahiert.
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Die
wäßrige Alkalischicht
wurde mit 1n Schwefelsäure
angesäuert
und mit Ethylacetat (500 ml × 3) extrahiert.
Die Ethylacetatschicht wurde mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem
Natriumsulfat getrocknet und derart konzentriert, daß sich ein
Rückstand
ergab, von dem eine Verbindung der Formel 1 (R = H) auskristallisierte.
Sie wurde gefiltert, um die reine Verbindung der Formel 1 (R = H)(2g),
Schmelzpunkt 69–70°C, [α]n + 22° (Cl,
MeOH) zu ergeben.
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Das
Methanolkonzentrat (20 g), das wie oben erwähnt aus dem entfetteten Pflanzenmaterial
durch Extrahieren mit Methanol erhalten wurde, wurde in 1n Kaliumhydroxidlösung (1
Liter) durch Rühren
aufgelöst
und mit Chloroform (1 Liter × 3)
extrahiert. Die wäßrige Schicht
wurde mit 1n Schwefelsäure
angesäuert
und mit Ethylacetat (500 ml × 3)
extrahiert. Die Ethylacetatschicht wurde mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat
getrocknet und derart konzentriert, daß sich eine Verbindung der
Formel 1 (R = Glukose) ergab, welche aus einer Aceton-Methanol-Mischung als farblose
Nadeln (2 g), Schmelzpunkt 187–188°C, [α]n + 22° (Cl,
MeOH) kristallisierte.
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Vorteile:
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- 1. Entfetten der Blätter mit aliphatischen Kohlenwasserstofflösungsmitteln
entfernt die fetthaltigen Materialien, Chlorophyllsubstanzen, welche
die Isolierung der oben genannten Verbindungen stören. Die
Verbindungen konnten auf einfache Weise von den entfetteten Materialien
durch Ausschließen
von wiederholten chromatographischen Trennungsvorgängen isoliert
werden.
- 2. Die selektive Alkaliverteilung während des Extraktionsvorganges
extrahiert nur die oben genannten zwei Moleküle, wobei alle anderen störenden Materialien
zurückgelassen
werden. Folglich macht dies das Verfahren einfach und kommerziell
rentabel.
- 3. Die Verbindungen konnten ohne Verwenden jeglicher chromatographischer
Säulen
von Silicagel oder Aluminiumoxid isoliert werden. Folglich wird
das Verfahren zur Herstellung der zwei Verbindungen einfach, kosteneffektiv
und kommerziell rentabel durch Verringern der Kosten von Adsorbern
und zusätzlichen
Volumina von Lösungsmitteln
für seine
chromatographische Trennungs- und Reinigungsvorgänge.
wobei R = H oder Glukose ist, aus den Blättern der Taxus wallichiana, mit den Schritten: 
